通過優(yōu)化培養(yǎng)基調(diào)節(jié)重組蛋白的半乳糖基化的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及：制備半乳糖基化受控的靶重組蛋白的方法或控制靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中增加表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的滲透壓的步驟；制備半乳糖基化受控的靶重組蛋白的方法或控制靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中向表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中補(bǔ)充天冬酰胺的步驟；制備半乳糖基化受控的靶重組蛋白的方法或控制靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中增加表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的滲透壓和向其中補(bǔ)充天冬酰胺的步驟；和通過所述方法制備的半乳糖基化受控制的靶重組蛋白。
【專利說明】
通過優(yōu)化培養(yǎng)基調(diào)節(jié)重組蛋白的半乳糖基化的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法或調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半 乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)期間增加表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的 滲透壓；制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法或調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半乳糖基化的方 法，包括在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)期間向表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中補(bǔ)充天冬酰胺； 制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法或調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)期間增加表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液的滲透壓，和向其中補(bǔ)充天冬 酰胺；以及由所述方法制備的半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體是結(jié)合抗原，籍此干擾抗原的作用或除去抗原的蛋白。由于已知治療性抗體 市場具有意義重大的潛能，人們對抗體的有效表達(dá)和大規(guī)模制備進(jìn)行了大量的研究。產(chǎn)生 抗體的關(guān)鍵點(diǎn)之一在所制備的抗體群的均一性。具體地說，制備單克隆抗體時(shí)，糖型分布對 于恒定和可再現(xiàn)的單克隆抗體(生產(chǎn)）至關(guān)重要。然而，許多不同的變量可影響所產(chǎn)生的單 克隆抗體的糖基化情況，因此，需要開發(fā)能恒定控制所制備的抗體群的糖基化和抗體異構(gòu) 體的含量的方法。
[0003] 商品化生產(chǎn)單克隆抗體的重要問題之一是恒定維持每批次中所產(chǎn)生的單克隆抗 體的質(zhì)量。雖然在單克隆抗體的生產(chǎn)過程中有許多質(zhì)量屬性，但抗體的半乳糖基化可能是 其中最重要的質(zhì)量之一。這是因?yàn)橐阎肴樘腔绊懷a(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)過程， 即，單克隆抗體的最高作用方式(M0A)。半乳糖基化的建立是利用半乳糖作為半乳糖基化鏈 式反應(yīng)的組成單元，通過半乳糖基轉(zhuǎn)移酶將半乳糖連接于緊鄰的N-乙酰葡糖胺糖?？刂瓢?乳糖基化的方法的例子包括將錳或半乳糖加入培養(yǎng)溶液的方法等（美國專利申請公布號 2012-0276631 )，但仍需要開發(fā)控制抗體的半乳糖基化的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 技術(shù)問題
[0005] 在這些情況下，本發(fā)明人作出了大量努力以開發(fā)有效控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)期間，所 制備的重組蛋白的半乳糖基化的方法，所述動(dòng)物細(xì)胞能產(chǎn)生該重組蛋白。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)通過在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)期間增加動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的滲透壓，或在特定時(shí)間點(diǎn)補(bǔ)充天冬酰 胺能有效調(diào)節(jié)重組蛋白的半乳糖基化。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)在增加動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的 滲透壓的同時(shí)補(bǔ)充天冬酰胺，可以控制半乳糖基化而不會隨著滲透壓的增加，酸性抗體異 構(gòu)體的含量降低，籍此完成了本發(fā)明。
[0006] 技術(shù)方案
[0007] 本發(fā)明的目的是提供制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法，包括在動(dòng)物細(xì) 胞的培養(yǎng)過程中，增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的滲透壓。
[0008] 本發(fā)明的另一目的是提供調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞 的培養(yǎng)過程中，增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的滲透壓。
[0009] 本發(fā)明的還有另一目的是提供制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法，包括 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，向表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中補(bǔ)充天冬酰胺。
[0010] 本發(fā)明的還有另一目的是提供調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，向表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中補(bǔ)充天冬酰胺。
[0011] 本發(fā)明的還有另一目的是提供制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法，包括 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的滲透壓，和向其中 補(bǔ)充天冬酰胺。
[0012] 本發(fā)明的還有另一目的是提供調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的滲透壓，和向其中補(bǔ)充天 冬酰胺。
[0013] 本發(fā)明的還有另一目的是提供由上述方法制備的靶重組蛋白。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0015] 本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于可將靶重組蛋白的半乳糖含量有效調(diào)節(jié)至所需范圍。此 外，同時(shí)采用增加滲透壓和加入天冬酰胺的本發(fā)明方法具有調(diào)節(jié)酸性抗體異構(gòu)體(酸性變 體)以及半乳糖含量的作用。因此，本發(fā)明方法可有效用于制備所需的抗體群。
[0016] 附圖簡述
[0017 ]圖1是阿達(dá)木單抗(ada 1 imumab)生物類似物的表達(dá)載體的示意圖。
[0018]圖2顯示在補(bǔ)料-分批培養(yǎng)期間，注射氯化鈉(NaCl)水溶液的時(shí)間點(diǎn)。
[0019] 圖3顯示在補(bǔ)料-分批培養(yǎng)期間，補(bǔ)充天冬酰胺的時(shí)間點(diǎn)。
[0020] 最佳方式
[0021] 為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明一方面提供制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方 法，包括在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的滲透 壓。
[0022] 具體地說，以上方法是制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法，包括在動(dòng)物 細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)的特定時(shí)日增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的滲 透壓。
[0023] 在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)是補(bǔ)料分批培養(yǎng)，但不限于此。
[0024] 本文所用的術(shù)語"補(bǔ)料分批培養(yǎng)"是指這樣一種細(xì)胞培養(yǎng)，其中從基礎(chǔ)培養(yǎng)基或生 產(chǎn)培養(yǎng)基開始初步細(xì)胞培養(yǎng)，在繼續(xù)培養(yǎng)的同時(shí)，在細(xì)胞生長期或抗體產(chǎn)生期的任何時(shí)間 向培養(yǎng)物中連續(xù)或不連續(xù)地加入補(bǔ)料培養(yǎng)基。
[0025] 本文所用的術(shù)語"細(xì)胞培養(yǎng)基"或"培養(yǎng)基"是指細(xì)胞在人工體外環(huán)境中（多細(xì)胞機(jī) 體或組織的外部），用于維持、生長、增殖或擴(kuò)增的營養(yǎng)物溶液。可為培養(yǎng)特定細(xì)胞優(yōu)化細(xì)胞 培養(yǎng)基，例如為支持細(xì)胞生長而制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，或?yàn)榇龠M(jìn)單克隆抗體產(chǎn)生而制備的生 產(chǎn)培養(yǎng)基，和通過高濃度地濃縮營養(yǎng)物而制備的濃縮培養(yǎng)基。營養(yǎng)物和培養(yǎng)基組分是指構(gòu) 成細(xì)胞培養(yǎng)基的組分，在本發(fā)明中它們可以互換使用。
[0026] 具體地講，"基礎(chǔ)培養(yǎng)介質(zhì)"或"基礎(chǔ)培養(yǎng)基"是指能夠支持細(xì)胞的最低生長的培養(yǎng) 基。基礎(chǔ)培養(yǎng)基不僅提供標(biāo)準(zhǔn)的無機(jī)鹽，例如，鋅、鐵、鎂、鈣、鉀，還提供微量元素、維生素、 能量來源、緩沖劑和氨基酸?；A(chǔ)培養(yǎng)基的例子包括Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、 基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle(BME)、RPMI1640、F-10和F-12,但不限于此。
[0027] 此外，具體而言，術(shù)語"細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)培養(yǎng)基"或"生產(chǎn)培養(yǎng)基"是指為優(yōu)化單克隆 抗體的表達(dá)而用于生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基。生產(chǎn)培養(yǎng)基的組成可以與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同或不 同，而當(dāng)它是不同的時(shí)，可通過濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基或?qū)⑻囟ńM分添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基來制備生 產(chǎn)培養(yǎng)基。
[0028] 本文所用的術(shù)語"補(bǔ)料培養(yǎng)基"和"加料培養(yǎng)基"可以是指特定的營養(yǎng)物或多種營 養(yǎng)物構(gòu)成的培養(yǎng)基，它們均是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的濃縮組分?？梢愿鶕?jù)待培養(yǎng)的細(xì)胞，制備各異的 補(bǔ)料培養(yǎng)基組分和濃度。
[0029] 在上述培養(yǎng)過程中，細(xì)胞生長期是指細(xì)胞在接種后快速增長的時(shí)期。以中國倉鼠 卵巢(CH0)細(xì)胞為例，已知在35°C至37°C的溫度下和在7.0至7.3的pH下，細(xì)胞數(shù)量增加最活 躍。在本發(fā)明中，在細(xì)胞生長期的培養(yǎng)參數(shù)為36.5°C，pH 7.1或pH 7.0。
[0030]術(shù)語"接種"是指將細(xì)胞播種到提供用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中。具體地，培養(yǎng)基可 以在轉(zhuǎn)移細(xì)胞之前提供，或者可以在細(xì)胞轉(zhuǎn)移到細(xì)胞生物反應(yīng)器中的同時(shí)提供。在大規(guī)模 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，傳統(tǒng)做法是預(yù)先提供培養(yǎng)基，將溫度和氧飽和度維持在預(yù)定范圍內(nèi)之后， 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入生物反應(yīng)器。
[0031] 術(shù)語"抗體生產(chǎn)期"是指某一時(shí)期，在此期間，應(yīng)用工藝變化以優(yōu)化單克隆抗體的 生產(chǎn)。具體地說，優(yōu)化生產(chǎn)的工藝變化可包括降低溫度、溶氧改變和培養(yǎng)基改變的全部。
[0032] 本發(fā)明確認(rèn)，表達(dá)重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生的重組蛋白的半乳糖基化的改變程 度可以隨著增加培養(yǎng)基滲透壓的時(shí)間點(diǎn)而變。即，當(dāng)滲透壓在培養(yǎng)期間逐漸增加時(shí)，與其中 滲透壓沒有增加的組相比，半乳糖基化的程度差異不顯著。與此相反，當(dāng)滲透壓在培養(yǎng)過程 中的特定時(shí)間點(diǎn)增加，G0F含量顯著增加，從而證實(shí)可調(diào)節(jié)半乳糖基化，特別是，可以防止或 減少半乳糖基化。
[0033] 此外，在本發(fā)明中，優(yōu)選在表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的主培養(yǎng)過程中，進(jìn)行增加 滲透壓的步驟，但并不限于此。
[0034] 本文所用的術(shù)語"主培養(yǎng)"是指其中完成單克隆抗體的實(shí)際生產(chǎn)的培養(yǎng)步驟。它是 以單個(gè)小瓶的細(xì)胞開始的培養(yǎng)過程的最后步驟，主培養(yǎng)完成后，所產(chǎn)生的單克隆抗體進(jìn)行 純化。可將主培養(yǎng)與所謂的"種子培養(yǎng)"區(qū)分，后者的目的是逐步增加培養(yǎng)物體積。
[0035] 增加滲透壓的步驟可以在動(dòng)物細(xì)胞的主培養(yǎng)過程的特定培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)執(zhí)行;具體地 說，以第〇日作為主培養(yǎng)起始日，在第1天到第10天的主培養(yǎng)過程中的任一培養(yǎng)日；更具體地 說，以第〇日作為主培養(yǎng)起始日，在第1天、第4天、第7天和第10天中的任一培養(yǎng)日；更具體地 說，以第〇日作為主培養(yǎng)起始日，在第4天或第7天，但不限于此。
[0036] 此外，在表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，增加滲透壓的步驟可以執(zhí)行 一次。
[0037]此外，可以進(jìn)行增加滲透壓的步驟，從而使得培養(yǎng)溶液的最終滲透壓在460m0sm/ kg到500m0sm/kg的范圍內(nèi)，更具體地說，在460m0sm/kg到480m0sm/kg的范圍內(nèi)，但不限于 此。培養(yǎng)溶液中的最終滲透壓是指在培養(yǎng)終止時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)的滲透壓，但不特別限于此。 [0038]此外，增加滲透壓的步驟可以在培養(yǎng)溶液中（實(shí)現(xiàn)）目標(biāo)滲透壓增加在400m0sm/kg 到440m0sm/kg的范圍內(nèi)，更具體地說，在430m0sm/kg到440m0sm/kg的范圍內(nèi)，但不限于此。 在培養(yǎng)溶液中的目標(biāo)滲透壓增加是指有待在執(zhí)行滲透壓的步驟的時(shí)間點(diǎn)增加到的滲透壓 水平，但不特別限定于此。
[0039] 另外，可以采用選自下組的至少一種方法來實(shí)施滲透壓的增加:將氯化鈉或氯化 鉀補(bǔ)充到動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液中的方法和將葡萄糖加入培養(yǎng)溶液的方法，更具體地說，采用 將氯化鈉補(bǔ)充至培養(yǎng)溶液的方法，但不限于此。
[0040] 可通過在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中，在特定一天將4M氯化鈉水溶液加入培養(yǎng)溶液來實(shí) 施將氯化鈉補(bǔ)充至培養(yǎng)溶液中的方法，從而將滲透壓增加至一定程度，但不限于此。當(dāng)通過 加入氯化鈉水溶液來增加培養(yǎng)溶液中的滲透壓，甚至進(jìn)一步的細(xì)胞中的滲透壓時(shí)，它導(dǎo)致0 半乳糖苷酶活性增加，因此可能抑制了單克隆抗體的半乳糖基化。
[0041 ]本文所用的術(shù)語"培養(yǎng)肉湯"或"培養(yǎng)基"是指含有培養(yǎng)細(xì)胞的液體，其容納在搖瓶 或生物反應(yīng)器中。培養(yǎng)肉湯和培養(yǎng)基可互換使用。此外，可根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的存在來區(qū)分培養(yǎng) 溶液和培養(yǎng)基。
[0042] 本文所用的"重組蛋白"可以是抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
[0043] 本文所用的術(shù)語"單克隆抗體"是指可由含有抗體編碼序列的細(xì)胞形成并識別特 定抗原的抗體。
[0044] 本發(fā)明的抗體可優(yōu)選包括本領(lǐng)域常規(guī)使用的所有治療性抗體，特別是阿達(dá)木單 抗，但不限于此。
[0045] 此外，上述抗體是同時(shí)包括全長抗體和抗體片段的概念，抗體片段的例子包括所 有的Fv、Fab、Fab '、F(ab'）2、Fd，等等。Fv包括二硫鍵穩(wěn)定的Fv(dsFv)和單鏈Fv(scFv)兩種 形式。Fd是指包含在Fab中的重鏈組成部分。
[0046] 可表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞可以包括能夠表達(dá)該重組蛋白的原生型或轉(zhuǎn)染細(xì) 胞，但不限于此。出于本發(fā)明的目的，動(dòng)物細(xì)胞能夠表達(dá)作為要調(diào)節(jié)半乳糖含量的對象的重 組蛋白，例如，中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(CH0)或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(NS0)，但不限于此。
[0047] 此外，為調(diào)節(jié)單克隆抗體的半乳糖基化，可以包括優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的濃 度，和進(jìn)一步補(bǔ)料優(yōu)化的培養(yǎng)基。
[0048] 即，根據(jù)半乳糖基化的修飾需求程度來調(diào)節(jié)上述單克隆抗體的半乳糖基化的方法 可以在確定所需單克隆抗體的半乳糖基化范圍并分析所處理的細(xì)胞系表達(dá)的單克隆抗體 的半乳糖基化后，同時(shí)應(yīng)用。
[0049] 具體地說，修飾的例子可以體現(xiàn)為操作生物反應(yīng)器以便產(chǎn)生半乳糖基化受調(diào)節(jié)的 單克隆抗體，所述修飾的例子可包括優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)，例如溶氧(D0)，酸度(pH)、培養(yǎng)溫度，攪 拌等。具體地說，在現(xiàn)有方法中，其中在細(xì)胞生長期，在36.5 °C與30 %溶氧和pH 7.0下進(jìn)行 培養(yǎng)，在抗體生產(chǎn)期，在30 °C與30 %溶氧和pH 7.0下進(jìn)行培養(yǎng)；如果分別將溫度改變到28 °C，溶氧改變至20%和酸度改變至pH 6.9后進(jìn)行培養(yǎng)，證實(shí)了調(diào)節(jié)單克隆抗體的半乳糖基 化是可能的。
[0050] 此外，為調(diào)節(jié)半乳糖基化，可濃縮有待使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。具體地說，可以使用不 含有動(dòng)物來源組分的培養(yǎng)基，和可優(yōu)化為補(bǔ)料分批培養(yǎng)開發(fā)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以便調(diào)節(jié)單克隆 抗體的半乳糖基化。具體地說，當(dāng)在主培養(yǎng)中利用通過濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基，例如0.8-倍或1.4-倍制備的培養(yǎng)基時(shí)，可能調(diào)節(jié)單克隆抗體的半乳糖基化。
[0051] 此外，可優(yōu)化補(bǔ)料培養(yǎng)基以調(diào)節(jié)半乳糖基化。在本發(fā)明中，通過調(diào)節(jié)補(bǔ)料培養(yǎng)基的 濃度和優(yōu)化加入該補(bǔ)料培養(yǎng)基的金屬組分的濃度來降低半乳糖基化。
[0052] 通過上述方法制備的靶重組蛋白的半乳糖基化可以采用Q-T0F或UPLC裝置，通過 N-聚糖分布分析來檢測。N-聚糖分布分析提供各種信息，包括G0F含量，半乳糖基化指數(shù) (GI)，非糖基化重鏈(NGHC)，非巖藻糖基化(afucosylation) %，高甘露糖含量等，在本發(fā)明 中，主要提及G0F含量改變。
[0053] 另外，本發(fā)明的方法可以是制備半乳糖基化降低的抗體群。即，其是可以應(yīng)用于制 備抗體群的方法，在分析由經(jīng)處理的細(xì)胞系表達(dá)的單克隆抗體的半乳糖基化之后，所述抗 體群的半乳糖基化水平低于分析值。
[0054]本文所用的術(shù)語"抗體群"是指包括可以具有各種聚糖含量的抗體的這樣一組抗 體，出于本發(fā)明的目的，抗體群是指半乳糖基化受調(diào)節(jié)的抗體組，包括目標(biāo)比例的半乳糖基 化的抗體。
[0055] 本發(fā)明的另一方面提供調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞培 養(yǎng)過程中，增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的滲透壓。
[0056] 該方法和各術(shù)語都與上述解釋的相同。
[0057]具體地說，該方法可包括在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的特定日，增加表達(dá)靶重組蛋白 的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的滲透壓，具體的細(xì)節(jié)與上述解釋的相同。
[0058]本發(fā)明的還有另一方面提供了制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法，包括 在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，將天冬酰胺補(bǔ)充到表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液 中。
[0059] 描述的術(shù)語與上述解釋的相同。
[0060] 在本發(fā)明中，可以確認(rèn)，當(dāng)在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，將天冬酰胺補(bǔ)充到表達(dá)靶重 組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中時(shí)，可調(diào)節(jié)該靶重組蛋白的半乳糖基化。
[0061] 具體地說，可采用天冬酰胺濃縮液或含天冬酰胺的培養(yǎng)基的形式加入天冬酰胺。
[0062] 此外，可以在表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)過程的特定時(shí)間 點(diǎn)，多次進(jìn)行天冬酰胺的補(bǔ)充。具體地說，以第〇日作為主培養(yǎng)起始日，可在第4天到第10天 進(jìn)行天冬酰胺的補(bǔ)充;更具體地說，以第〇日作為主培養(yǎng)起始日，在第4天、第7天和第10天均 進(jìn)行天冬酰胺的補(bǔ)充，籍此逐步增加培養(yǎng)溶液中天冬酰胺的濃度。
[0063] 當(dāng)單次補(bǔ)充天冬酰胺時(shí)，存在以下缺陷，即，培養(yǎng)溶液中NH4+的濃度迅速升高，由此 細(xì)胞生長變得延遲，最后導(dǎo)致最終蛋白的表達(dá)水平降低。然而，當(dāng)按照本發(fā)明，在補(bǔ)料中采 用分劑量加入天冬酰胺時(shí)，產(chǎn)生的優(yōu)點(diǎn)是可以產(chǎn)生所需量的蛋白，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)半乳糖基 化而沒有上述缺點(diǎn)產(chǎn)生。
[0064] 可以進(jìn)行天冬酰胺的補(bǔ)充，從而在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)液中天冬酰胺的最終濃度可在 27.6mM到33.6mM的范圍內(nèi)。
[0065] 具體地說，可補(bǔ)充天冬酰胺，從而使得動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中天冬酰胺的最終濃 度可以是33.6mM;例如，可以補(bǔ)充天冬酰胺，從而使得動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中天冬酰胺的最 終濃度可以進(jìn)一步增加6mM至18mM;更具體地說，可以通過依次加入濃度為6mM、12mM和18mM 的天冬酰胺來補(bǔ)充天冬酰胺三次，但不限于此。
[0066] 當(dāng)將該方法應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，它誘導(dǎo)銨離子(NH4+)的產(chǎn)生，從而增加細(xì)胞中銨離 子的濃度。因此，反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)的pH增加和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活性降低，和由此可抑 制單克隆抗體的半乳糖基化。
[0067]此外，如上所述，為調(diào)節(jié)單克隆抗體的半乳糖基化，可以包括優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)，基礎(chǔ) 培養(yǎng)基的濃度，和進(jìn)一步補(bǔ)料優(yōu)化的培養(yǎng)基。
[0068] 即，根據(jù)半乳糖基化的修飾需求程度來調(diào)節(jié)上述單克隆抗體的半乳糖基化的方法 可以在確定所需單克隆抗體的半乳糖基化范圍并分析細(xì)胞系表達(dá)的單克隆抗體的半乳糖 基化后，同時(shí)應(yīng)用。
[0069] 本發(fā)明的另一方面提供調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞的 培養(yǎng)過程中，將天冬酰胺補(bǔ)充到表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中。
[0070] 所述方法和術(shù)語與上述解釋的相同。
[0071] 本發(fā)明的另一方面提供制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法，包括在動(dòng)物 細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的滲透壓和將天冬酰胺 補(bǔ)充到該培養(yǎng)溶液中。
[0072]所述的術(shù)語與上述解釋的相同。
[0073] 在本發(fā)明中，確認(rèn)了在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，當(dāng)將天冬酰胺加入表達(dá)靶重組蛋 白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中，同時(shí)增加該動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的滲透壓，酸性抗體異構(gòu)體 的含量(其可以隨著滲透壓的增加而降低）隨著加入天冬酰胺所致半乳糖基化的降低而增 加。
[0074] 在上述方法中，滲透壓的增加和天冬酰胺的補(bǔ)充可以同時(shí)或依次進(jìn)行。例如，可以 通過，例如補(bǔ)充氯化鈉的方法來增加培養(yǎng)溶液中的滲透壓，隨后補(bǔ)充天冬酰胺;或者，可以 先補(bǔ)充天冬酰胺，然后通過加入氯化鈉或其類似物來增加培養(yǎng)溶液中的滲透壓;或者可以 同時(shí)采用補(bǔ)充天冬酰胺和增加培養(yǎng)溶液中的滲透壓。
[0075] 特別是，可以通過應(yīng)用上述方法來增加滲透壓。
[0076] 可以增加滲透壓從而使得培養(yǎng)溶液中的最終滲透壓在460m0sm/kg到500m0sm/kg 的范圍內(nèi)，可以補(bǔ)充天冬酰胺，從而補(bǔ)充的天冬酰胺將動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中天冬酰胺的 最終濃度調(diào)節(jié)在27.6mM至33.6mM的范圍內(nèi)。
[0077]此外，重組蛋白可以是抗體，特別是單克隆抗體，通過上述方法制備的抗體群中酸 性抗體異構(gòu)體的含量可以得到調(diào)節(jié)，同時(shí)通過本發(fā)明方法可以調(diào)節(jié)靶重組抗體的半乳糖基 化。即，半乳糖基化可以隨著滲透壓的增加而降低，同時(shí)可以通過加入天冬酰胺來增加酸性 抗體異構(gòu)體的含量，它可以隨著滲透壓的增加而減少。
[0078]因此，上述方法的優(yōu)點(diǎn)在于，能夠調(diào)節(jié)靶抗體群的半乳糖基化，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)靶抗 體群的酸性抗體異構(gòu)體的含量。
[0079] 酸性抗體異構(gòu)體是一種抗體異構(gòu)體?？贵w異構(gòu)體是指這樣一種抗體，其中具有主 要活性的該抗體的部分氨基酸因脫氨基或氧化作用而改性，包括酸性抗體異構(gòu)體和堿性抗 體異構(gòu)體。實(shí)例包括其中氨基酸中的天冬酰胺通過脫氨作用轉(zhuǎn)化為天冬氨酸的抗體異構(gòu) 體，其中甲硫氨酸通過氧化作用轉(zhuǎn)化成硫酸甲硫氨酸的抗體異構(gòu)體，等等。另外，當(dāng)谷氨酸 存在于重鏈N末端時(shí)，其中谷氨酸通過形成五邊形環(huán)而轉(zhuǎn)變成焦谷氨酸的抗體異構(gòu)體包括 在內(nèi)。
[0080] 可通過色譜法等來分析這些抗體異構(gòu)體，在本發(fā)明中，可采用陽離子交換樹脂色 譜進(jìn)行分析。根據(jù)單克隆抗體的本身的特性，酸性的、主要的和堿性的抗體異構(gòu)體的含量變 化很大。單克隆抗體的荷電抗體異構(gòu)體(荷電變體)的含量可以根據(jù)表達(dá)該單克隆抗體的細(xì) 胞系的培養(yǎng)條件(培養(yǎng)參數(shù)，生產(chǎn)培養(yǎng)基等)而有所不同。因此，上述方法的優(yōu)點(diǎn)在于，它能 夠調(diào)節(jié)所需的半乳糖含量，同時(shí)將酸性抗體異構(gòu)體的含量調(diào)節(jié)到所需的范圍內(nèi)。
[0081] 發(fā)明詳述
[0082] 下文將參考以下實(shí)施例來更詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而，這些實(shí)施例僅是出于說明 的目的，本發(fā)明不應(yīng)受限于這些實(shí)施例。
[0083] 實(shí)施例1:因人工增加滲透壓而調(diào)節(jié)半乳糖基化
[0084]有各種方法能夠在補(bǔ)料-分批培養(yǎng)的過程中增加培養(yǎng)溶液的滲透壓，例如，將過量 的葡萄糖加入培養(yǎng)溶液、將氯化鈉水溶液加入培養(yǎng)溶液的方法，等等。在本發(fā)明中，作為提 高滲透壓的代表性方法，采用將4M氯化鈉水溶液加入培養(yǎng)溶液的方法。
[0085] 制備方法和培養(yǎng)基組成解釋
[0086] 在本發(fā)明中，要采用增加培養(yǎng)溶液的滲透壓或加入天冬酰胺的單克隆抗體是阿達(dá) 木單抗生物類似物抗體，阿達(dá)木單抗生物類似物是雅培公司(Abbott)開發(fā)的用于治療類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎和克羅恩病的治療劑。參照美國專利6,090,382中公開的阿達(dá)木單抗抗體的重 鏈和輕鏈的氨基酸序列，經(jīng)由PCR通過擴(kuò)增產(chǎn)生阿達(dá)木單抗生物類似物DNA，利用由LG生命 科學(xué)有限公司（LG Life Sciences Ltd.)開發(fā)的載體dpGL3CUCBin的啟動(dòng)子制備口〇8_ Am2.77_v5.4(圖1)，然后將其轉(zhuǎn)染入CH0-DXB11細(xì)胞系，從而制備能夠表達(dá)阿達(dá)木單抗生物 類似物的細(xì)胞系。由LG生命科學(xué)有限公司開發(fā)的p⑶CBin是韓國專利號10-1038126(新型雜 合啟動(dòng)子和包含該啟動(dòng)子的重組載體)中公開的載體之一。
[0087] 本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基是三種不同類型的，基礎(chǔ)培養(yǎng)基、生產(chǎn)培養(yǎng)基(主培養(yǎng)基） 和補(bǔ)料培養(yǎng)基(附加培養(yǎng)基）。
[0088] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基是用于種子培養(yǎng)目的的培養(yǎng)基。生產(chǎn)培養(yǎng)基是在種子培養(yǎng)后，為主要 抗體產(chǎn)生(主培養(yǎng))而進(jìn)行的培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基，可以通過濃縮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的一種或多 種特定組分或添加一種或多種新組分來制備。在本發(fā)明中，1.4-倍濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基用作 生產(chǎn)培養(yǎng)基。補(bǔ)料培養(yǎng)基是這樣一種培養(yǎng)基，加入該培養(yǎng)基的目的是在培養(yǎng)過程中促進(jìn)細(xì) 胞生長和增加抗體表達(dá)量。在本發(fā)明中，3.3-倍濃縮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基用作補(bǔ)料培養(yǎng)基?；A(chǔ)培 養(yǎng)基、生產(chǎn)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基均是Iscove改良的Dulbecco培養(yǎng)基（MDM)的改良培養(yǎng)基， 培養(yǎng)基的組成示于下表1。
[0089][表1]基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成
[0091]本發(fā)明中使用的抗體生產(chǎn)方法是利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的方法，動(dòng)物細(xì)胞 的培養(yǎng)是使得動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長并通過特定處理(例如，降低溫度)使得動(dòng)物細(xì)胞表 達(dá)抗體的方法。培養(yǎng)方法各異，包括分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)等等，本 發(fā)明用于培養(yǎng)阿達(dá)木生物類似物細(xì)胞系的培養(yǎng)方法是補(bǔ)料分批培養(yǎng)。分批補(bǔ)料培養(yǎng)是以下 述方式進(jìn)展的培養(yǎng)方法，即，在培養(yǎng)期間的特定時(shí)日加入附加的培養(yǎng)基至少一次或兩次，同 時(shí)進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)。
[0092]實(shí)施例中采用的補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法通常是在培養(yǎng)期間的第1天、第4天、第7天和第 10天，進(jìn)一步加入附加的培養(yǎng)基4次，加入量對應(yīng)于目前培養(yǎng)溶液體積的5%。
[0093] 實(shí)施例1.1:滲透壓增加時(shí)間點(diǎn)導(dǎo)致的半乳糖基化改變
[0094]利用250mL搖瓶，在真實(shí)的30ml規(guī)模上進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)的補(bǔ)料策 略和加入氯化鈉水溶液的時(shí)間點(diǎn)與圖2所示相同。培養(yǎng)肉湯的起始滲透壓為320m0sm/kg，通 過補(bǔ)料4M氯化鈉(NaCl)水溶液將滲透壓人工提高到430m0ms/kg，由此得到最終滲透壓為 450m0ms/kg。關(guān)于附加培養(yǎng)基，在培養(yǎng)的第1天進(jìn)行第一補(bǔ)料，然后每3天作進(jìn)一步的補(bǔ)料， 總共4次補(bǔ)料。在這4次補(bǔ)料中，4M氯化鈉水溶液一次加入或以分開的劑量四次加入(培養(yǎng)期 間滲透壓逐漸增加）以增加培養(yǎng)液的滲透壓。培養(yǎng)完成后，分析單克隆抗體的表達(dá)量和半乳 糖基化，結(jié)果列于下表2中。
[0095]表2.滲透壓增加時(shí)間點(diǎn)導(dǎo)致的抗體質(zhì)量改變
[0097] *G0F( % ) =G0F/(G0F+G1F+G2F)
[0098]因此，如表2所示，按照補(bǔ)料4M氯化鈉水溶液的時(shí)間點(diǎn)，單克隆抗體的半乳糖基化 有差異。在搖瓶培養(yǎng)的情況下，不易直接調(diào)整培養(yǎng)過程中的溶氧(D0)和酸度(pH值），因此， 不同實(shí)驗(yàn)條件間的G0F可能沒有很大的差異。然而，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以直接 調(diào)節(jié)溶氧和酸度，因而G0F的差異得以最大化。
[0099] 實(shí)施例1.2:滲透壓增加范圍變化導(dǎo)致的單克隆抗體的半乳糖基化改變 [0100]實(shí)施例1.1表明，單克隆抗體的半乳糖基化可根據(jù)增加培養(yǎng)液的滲透壓的時(shí)間點(diǎn) 而改變。當(dāng)在附加培養(yǎng)基的第2次補(bǔ)料(培養(yǎng)的第4天)和第3次補(bǔ)料(培養(yǎng)的第7天)進(jìn)行氯化 鈉水溶液的補(bǔ)料時(shí)，G0F最大程度增加。此外，進(jìn)行利用搖瓶的二次分批補(bǔ)料培養(yǎng)，以檢查培 養(yǎng)液中滲透壓的增加水平差異對于單克隆抗體的半乳糖基化的影響。培養(yǎng)初始階段的滲透 壓為320m0sm/kg，按照滲透壓的目標(biāo)增加量，以類似于初級搖瓶培養(yǎng)的方式，在培養(yǎng)的第4 天或第7天將各種量的4M氯化鈉水溶液加入培養(yǎng)溶液來進(jìn)行培養(yǎng)，分析單克隆抗體的表達(dá) 量和半乳糖基化。
[0101]表3.滲透壓增加范圍差異導(dǎo)致的抗體質(zhì)量改變
[0103] *G0F( % ) =G0F/(G0F+G1F+G2F)
[0104]根據(jù)培養(yǎng)溶液的滲透壓增加水平，單克隆抗體的半乳糖基化看來根據(jù)滲透壓的增 加水平而改變。當(dāng)在培養(yǎng)期間，培養(yǎng)肉湯的滲透壓升高至480m0sm/kg或更高時(shí)，G0F的含量 反而降低。即，為最大程度增加單克隆抗體的G0F含量，滲透壓有一適當(dāng)?shù)姆秶ㄅ囵B(yǎng)期間， 增加至最高400m0sm/kg到480m0sm/kg)。
[0105] 實(shí)施例1.3:生物反應(yīng)器中的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)
[0106] 基于初級和次級搖瓶培養(yǎng)的結(jié)果，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行的確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了滲 透壓增加條件下導(dǎo)致單克隆抗體半乳糖基化的改變。
[0107] 在第2次補(bǔ)料(培養(yǎng)的第4天)時(shí)通過將4M氯化鈉(NaCl)水溶液加入工作體積為1L 的1.4L生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)液，有目的地將滲透壓分別增加到440m0sm/kg、500m0sm/kg和 523m0sm/kg之后，進(jìn)行培養(yǎng)。
[0108] 表4.生物反應(yīng)器中滲透壓增加范圍差異導(dǎo)致的抗體質(zhì)量改變
[0110] *G0F( % ) =G0F/(G0F+G1F+G2F)
[0111 ] 當(dāng)在第2次補(bǔ)料，滲透壓增加至500m0sm/kg更高時(shí)（最終滲透壓為549m0sm/kg和 567m0sm/kg)，G0F含量反而降低。在生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)中，其中滲透壓在第2次補(bǔ)料時(shí)增加至 440m0sm/kg，G0F含量為71.8%。
[0112] 實(shí)施例2:加入天冬酰胺在培養(yǎng)溶液中產(chǎn)生過量的銨離子
[0113] 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表4)，當(dāng)過量的天冬酰胺加入培養(yǎng)溶液時(shí)，培養(yǎng)溶液中的銨離子 (NH4+)濃度顯著增加?？赏ㄟ^添加過量的天冬酰胺來增加培養(yǎng)溶液中的銨離子濃度的方法 來間接調(diào)節(jié)單克隆抗體的半乳糖基化。
[0114] 表5.培養(yǎng)液中加入天冬酰胺導(dǎo)致的銨增加情況
[0116] 實(shí)施例2.1:加入天冬酰胺濃縮液的補(bǔ)料-分離培養(yǎng)
[0117] 利用250mL搖瓶，以實(shí)際的30mL規(guī)模進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)。補(bǔ)料-分批培養(yǎng)的補(bǔ)料策 略和加入氯化鈉水溶液的時(shí)間點(diǎn)與圖3所示相同。天冬酰胺濃縮液制備成200mM的濃度。注 入附加培養(yǎng)基的時(shí)間點(diǎn)是培養(yǎng)的第1天、第4天、第7天和第10天，并在從第2次補(bǔ)料的時(shí)間點(diǎn) (培養(yǎng)的第4天)起的每次補(bǔ)料時(shí)加入天冬酰胺濃縮液(總共3次）。培養(yǎng)完成后，分析表達(dá)量 和單克隆抗體的半乳糖化。
[0118] 表6.加入天冬酰胺導(dǎo)致單克隆抗體的半乳糖基化的改變
[0120] *G0F( % ) =G0F/(G0F+G1F+G2F)
[0121] 隨著天冬酰胺通過補(bǔ)料加入培養(yǎng)溶液中，GOF含量增加。隨著天冬酰胺濃度的增 加，培養(yǎng)溶液中NH4+的最終濃度增加。在IX生產(chǎn)培養(yǎng)基中通過注射天冬酰胺所致的G0F含量 增加范圍要大于在1.4X生產(chǎn)培養(yǎng)基中的。當(dāng)天冬酰胺在培養(yǎng)開始時(shí)一次性全部加入，順+濃 度變得比培養(yǎng)開始時(shí)高，從而延緩細(xì)胞生長，并最終降低了最終抗體的表達(dá)量。因此，采用 在補(bǔ)料時(shí)分劑量加入天冬酰胺的方法。
[0122] 實(shí)施例2.2:補(bǔ)料含有過量天冬酰胺的附加培養(yǎng)基
[0123] 在利用生物反應(yīng)器的補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，與搖瓶補(bǔ)料分批培養(yǎng)不同的是，不單獨(dú)制 備天冬酰胺濃縮液，但包含在附加培養(yǎng)基中。基于在補(bǔ)料時(shí)補(bǔ)充額外的6mM天冬酰胺的方 案，制備含有120mM天冬酰胺的額外培養(yǎng)基，并用其進(jìn)行補(bǔ)料。在工作體積為1L的1.4L生物 反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，并分析單克隆抗體的表達(dá)量和半乳糖基化。
[0124] 表7.利用加入過量天冬酰胺的附加培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)
[0126]利用加入過量天冬酰胺的附加培養(yǎng)基的批次顯示G0F含量增加10.2%?？紤]到加 入過量天冬酰胺的培養(yǎng)溶液中的NH4+濃度增加了9.9mM，確認(rèn)單克隆抗體的半乳糖基化的降 低是由于培養(yǎng)溶液中NH4+濃度的變化。加入過量天冬酰胺的培養(yǎng)溶液中的滲透壓濃度增加 了58m0sm/kg〇
[0127] 實(shí)施例3:滲透壓增加和加入天冬酰胺的組合
[0128] 在補(bǔ)料分批培養(yǎng)過程中，可以通過有目的地增加滲透壓或加入天冬酰胺來增加單 克隆抗體的G0F。檢測了滲透壓的增加和加入天冬酰胺的組合對單克隆抗體的半乳糖基化 和荷電抗體異構(gòu)體(荷電變體)的影響。
[0129] 實(shí)施例3.1:在生物反應(yīng)器中同時(shí)增加滲透壓和加入天冬酰胺的實(shí)驗(yàn)
[0130] 通過同時(shí)增加滲透壓與加入天冬酰胺，在工作體積為1L的1.4L生物反應(yīng)器中進(jìn)行 補(bǔ)料-分批培養(yǎng)。在同時(shí)增加滲透壓和加入天冬酰胺的生物反應(yīng)器的情況中，考慮到加入天 冬酰胺增加滲透壓的作用（向附加培養(yǎng)基中加入120mM天冬酰胺），培養(yǎng)液的滲透壓增加至 最高423m0sm/kg。培養(yǎng)結(jié)束后，分析單克隆抗體的表達(dá)量和半乳糖基化情況。
[0131] 表8.在生物反應(yīng)器中同時(shí)增加滲透壓和加入天冬酰胺導(dǎo)致半乳糖基化的改變
[0133] 在兩種不同的情況，即，僅施加滲透壓的情況和施加滲透壓和天冬酰胺的組合的 情況之間，G0F的差異并不大，但G0F含量進(jìn)一步增加。當(dāng)將天冬酰胺加入培養(yǎng)液，酸性抗體 異構(gòu)體的百分比（酸性變體)相比于未加入天冬酰胺的培養(yǎng)液降低(表6和7)。然而，當(dāng)滲透 壓和天冬酰胺的組合加入培養(yǎng)肉湯時(shí)，酸性抗體異構(gòu)體(酸性變體)反而增加。
[0134] 為增加 G0F含量，可采用諸如增加滲透壓、加入天冬酰胺和加入天冬酰胺的同時(shí)增 加滲透壓等方法。特別是，為了提高荷電（抗體)分布中酸性抗體異構(gòu)體(酸性變體）的百分 比以及G0F含量，采用同時(shí)增加滲透壓和加入天冬酰胺的策略看來更有用。
[0135] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可采用其它具體的形式實(shí)施本發(fā)明，而不脫離本發(fā)明精 神或?qū)嵸|(zhì)性特征。描述的實(shí)施方式在所有方面都應(yīng)認(rèn)為僅是說明性的而非限制性。因此，本 發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而非前面的描述表明。落在權(quán)利要求的等效范圍的含義和范圍 之內(nèi)的所有改變應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中的 特定時(shí)日，增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的滲透壓。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過補(bǔ)料-分批培養(yǎng)進(jìn)行所述培養(yǎng)。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以第0日作為主培養(yǎng)的起始日，在主培養(yǎng)的第 1天到第10天之間的任一日進(jìn)行滲透壓的增加。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以第0日作為主培養(yǎng)的起始日，在第1天、第4 天、第7天和第10天中的任一日進(jìn)行滲透壓的增加。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，以第0日作為主培養(yǎng)的起始日，在第4天或第7 天進(jìn)行滲透壓的增加。6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，增加滲透壓，從而調(diào)節(jié)培養(yǎng)溶液的最終滲透 壓在460m0sm/kg到500m0sm/kg的范圍內(nèi)。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過至少一種選自下組的方法實(shí)施滲透壓的 增加:將氯化鈉或氯化鉀補(bǔ)充入動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的方法，和將葡萄糖加入培養(yǎng)溶液的 方法。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述重組蛋白是抗體。9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法是為了制備半乳糖基化降低的抗體 群。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的過程 中，滲透壓的增加進(jìn)行一次。11. 一種調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程中的特定 時(shí)日，增加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的滲透壓。12. -種制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，向 表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中補(bǔ)充天冬酰胺。13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述天冬酰胺是天冬酰胺濃縮液或含天冬 酰胺的培養(yǎng)基。14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，在表達(dá)靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)過程 中，在培養(yǎng)過程的特定時(shí)間點(diǎn)，多次進(jìn)行天冬酰胺的補(bǔ)充。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，以第0日作為主培養(yǎng)的起始日，在第4天到 第10天進(jìn)行天冬酰胺的補(bǔ)充。16. 如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，以第0日作為主培養(yǎng)的起始日，在第4天、第 7天和第10天進(jìn)行天冬酰胺的補(bǔ)充。17. 權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，通過補(bǔ)充天冬酰胺進(jìn)行天冬酰胺的補(bǔ)充，從 而將動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中天冬酰胺的最終濃度調(diào)節(jié)在27.6mM到33.6mM的范圍內(nèi)。18. 權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，通過補(bǔ)充天冬酰胺進(jìn)行天冬酰胺的補(bǔ)充，從 而將動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中天冬酰胺的最終濃度調(diào)節(jié)為33.6mM。19. 權(quán)利要求12或17所述的方法，其特征在于，通過補(bǔ)充天冬酰胺3次進(jìn)行天冬酰胺的 補(bǔ)充，從而將動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中天冬酰胺的最終濃度順序調(diào)節(jié)為6mM、12mM和18mM。20. -種調(diào)節(jié)靶重組蛋白的半乳糖基化的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，向表達(dá)該 靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中補(bǔ)充天冬酰胺。21. -種制備半乳糖基化受調(diào)節(jié)的靶重組蛋白的方法，包括在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，增 加表達(dá)該靶重組蛋白的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)溶液的滲透壓，和向該培養(yǎng)溶液中補(bǔ)充天冬酰胺。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，同時(shí)或順次進(jìn)行滲透壓的增加和補(bǔ)充天冬 酰胺。23. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，通過至少一種選自下組的方法實(shí)施滲透壓 的增加:將氯化鈉或氯化鉀補(bǔ)充入動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液的方法，和將葡萄糖加入培養(yǎng)溶液 的方法。24. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，增加滲透壓，從而調(diào)節(jié)培養(yǎng)溶液的最終滲 透壓在460m0sm/kg到500m0sm/kg的范圍內(nèi)。25. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，天冬酰胺的補(bǔ)充是為了補(bǔ)充天冬酰胺，從 而將動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)溶液中天冬酰胺的最終濃度調(diào)節(jié)在27.6mM到33.6mM的范圍內(nèi)。26. 如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述重組蛋白是抗體。27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法是為了調(diào)節(jié)所述靶重組抗體的半 乳糖基化和調(diào)節(jié)所述方法制備的抗體群中酸性抗體異構(gòu)體(酸性變體)的含量。
【文檔編號】C12N5/071GK106029871SQ201580006724
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年1月29日
【發(fā)明人】丁俊, 宋元碩, 李俊億, 金淵哲
【申請人】株式會社Lg生命科學(xué)