分子量參照，以5V/cm的電場強(qiáng)度于0. 5XTBE電泳緩沖液中電泳 30min，電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析，待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出426bp 的條帶，則判定為金黃色葡萄球菌陽性；如待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出284bp的條帶， 則判定為沙門氏菌陽性；如待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出151bp的條帶，則判定為大腸 桿菌陽性。
[0027] 實施例3
[0028] (1)無菌操作取草莓樣品10g放入無菌均質(zhì)袋（內(nèi)含100mL無菌生理鹽水）中，在 均質(zhì)儀上拍打混勻，取1. 〇mL樣液無菌操作涂于LB肉湯固體平板，37°C恒溫培養(yǎng)24h。在 無菌條件下將單菌落分別挑入各滅菌離心管中，分別加50 yL Lysis Buffer細(xì)胞裂解液， 80°C水浴裂解20min，1000r/min離心10min，取上清作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)模板液；
[0029] (2)將待檢樣品菌體制備的基因組DNA模板添加到檢測試劑盒中，試劑盒內(nèi) 各組分組成及濃度為：檢測金黃色葡萄球菌的引物2.0 ymol/L，檢測沙門氏菌的引物 2. 0 ymol/L，檢測大腸桿菌的引物2. 0 ymol/L，硫酸鎂2. 0 ymol/L，脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)0? 25 y mol/L，10X聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)反應(yīng)緩沖液5. 0 y L，水生棲熱菌（Taq) DNA 聚合酶3. 0U，用滅菌無離子水補足體積至50.0 yL。各致病菌DNA模板各3 yL。在聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增儀上孵育，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性3min;95°C 變性3〇8,59°0退火3〇8,72°0延伸3〇8,32個循環(huán) ；721：終延伸1〇111111，結(jié)束聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)擴(kuò)增；
[0030] (3)取擴(kuò)增后的產(chǎn)物5yL點樣于1%瓊脂糖凝膠，其中含0. 5yg/mL嗅化乙錠， 以1000bp Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照，以5V/cm的電場強(qiáng)度于0. 5XTBE電泳緩沖液中電泳 30min，電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析，待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出426bp 的條帶，則判定為金黃色葡萄球菌陽性；如待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出284bp的條帶， 則判定為沙門氏菌陽性；如待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出151bp的條帶，則判定為大腸 桿菌陽性。
[0031] 實施例4
[0032] (1)無菌操作取西紅柿樣品lOg放入無菌均質(zhì)袋（內(nèi)含lOOmL無菌生理鹽水）中， 在均質(zhì)儀上拍打混勻，取1. OmL樣液無菌操作涂于LB肉湯固體平板，37°C恒溫培養(yǎng)24h。在 無菌條件下將單菌落分別挑入各滅菌離心管中，分別加50 yL Lysis Buffer細(xì)胞裂解液， 80°C水浴裂解20min，1000r/min離心10min，取上清作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)模板液；
[0033] (2)將待檢樣品菌體制備的基因組DNA模板添加到檢測試劑盒中，試劑盒內(nèi) 各組分組成及濃度為：檢測金黃色葡萄球菌的引物1.5ymol/L，檢測沙門氏菌的引物 1. 5 ymol/L，檢測大腸桿菌的引物1. 5 ymol/L，硫酸鎂1. 5 ymol/L，脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)0? 2 y mol/L，10X聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)反應(yīng)緩沖液5. 0 y L，水生棲熱菌（Taq)DNA 聚合酶2. 0U，用滅菌無離子水補足體積至50.0 yL。各致病菌DNA模板各3 yL。在聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增儀上孵育，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性3min;95°C 變性3〇8,59°0退火3〇8,72°0延伸3〇8,32個循環(huán) ；721：終延伸1〇111111，結(jié)束聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)擴(kuò)增；
[0034] (3)取擴(kuò)增后的產(chǎn)物5 y L點樣于1 %瓊脂糖凝膠，其中含0. 5 y g/mL嗅化乙錠， 以1000bp Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照，以5V/cm的電場強(qiáng)度于0. 5XTBE電泳緩沖液中電泳 30min，電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析，待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出426bp 的條帶，則判定為金黃色葡萄球菌陽性；如待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出284bp的條帶， 則判定為沙門氏菌陽性；如待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出151bp的條帶，則判定為大腸 桿菌陽性。
[0035] 金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌常規(guī)檢測方法與本專利申請的檢測方法的 對比
[0036]
【主權(quán)項】
1. 生鮮果蔬食品中致病菌檢測試劑盒，其特征在于：各組分組成及濃度為：⑴檢測金 黃色葡萄球菌的引物：上游引物5'-TGC GAA ACA TCC ACG ACA TA-3'，下游引物5'-CGT ITG TGC TGA ITT CCC TAC-3'，濃度為0. 5~2. Oymol/L⑵檢測沙門氏菌的引物：上游引 物5'-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3'，下游引物 5'-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3'，濃度為0. 5~2. Oymol/L，⑶檢測大腸桿菌的引物：上游引物5'-GGC GGA TAA GAC ITC GGCTA-3'，下游引物 5'-CGT ITT GGC ACT AIT TGC CC-3'，濃度 0.5 ~2.0ymol/ L，⑷鎂鹽，濃度為1. 0~2. 0 y mol/L，（5)脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP)，濃度為0. 15~ 0? 25 ymol/L，(6) 10X聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)反應(yīng)緩沖液5. 0 y L，(7)水生棲熱菌（Taq)DNA 聚合酶1. 0~3. 0U，用滅菌無離子水補足體積至50. 0 y L。
2. 生鮮果蔬食品中致病菌檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于： (1) 無菌操作取樣品放入無菌均質(zhì)袋（內(nèi)含100mL無菌生理鹽水）中在均質(zhì)儀上拍 打混勻，取1. OmL樣液無菌操作涂于LB肉湯固體平板，37°C恒溫培養(yǎng)24h，在無菌條件下將 單菌落分別挑入各滅菌離心管中，分別加50 y LLysis Buffer細(xì)胞裂解液，80°C水浴裂解 20min，1000r/min離心10min，取上清作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)模板液； (2) 將待檢樣品菌體制備的基因組DNA模板添加到檢測試劑盒中，試劑盒內(nèi)各組分組 成及濃度為：檢測金黃色葡萄球菌的引物〇. 5~2. 0 ymol/L，檢測沙門氏菌的引物0. 5~ 2. 0 y mol/L，檢測大腸桿菌的引物0. 5~2. 0 y mol/L，鎂鹽1. 0~2. 0 y mol/L，脫氧核糖 核苷三磷酸（dNTP) 0. 15~0. 25 y mol/L，10 X聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)反應(yīng)緩沖液5. 0 y L， 水生棲熱菌（Taq) DNA聚合酶1. 0~3. 0U，用滅菌無離子水補足體積至50. 0 y L，各致病菌 DNA模板各3 yL，按現(xiàn)有技術(shù)，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增儀（Thermo Scientific，型號： Arktik)上孵育，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)循環(huán)參數(shù)為95°C預(yù)變性3min;95°C變性30s，59°C 退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)32次；72°C終延伸10min，結(jié)束聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增； (3) 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，取擴(kuò)增后的產(chǎn)物5yL點樣于1%瓊脂糖凝 膠，其中含〇. 5 y g/mL嗅化乙錠，以1000bp Marker為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照，以5V/cm的電場強(qiáng) 度于0. 5XTBE電泳緩沖液中電泳30min，電泳結(jié)果用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照和分析，待檢 樣品與陽性對照同時擴(kuò)增出426bp的條帶，則判定為金黃色葡萄球菌陽性；待檢樣品與陽 性對照同時擴(kuò)增出284bp的條帶，則判定為沙門氏菌陽性；待檢樣品與陽性對照同時擴(kuò)增 出151bp的條帶，貝1」判定為大腸桿菌陽性。
【專利摘要】生鮮果蔬食品中致病菌檢測試劑盒，各組分組成及濃度為：⑴檢測金黃色葡萄球菌的引物⑵檢測沙門氏菌的引物⑶檢測大腸桿菌的引物⑷鎂鹽⑸脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)⑹10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)反應(yīng)緩沖液⑺水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶，滅菌無離子水補足體積至50.0μL。檢測方法(1)取樣品放入無菌均質(zhì)袋中，取上清作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)模板液；(2)將待檢樣品菌體制備的基因組DNA模板添加到檢測試劑盒中；(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發(fā)明針對生鮮果蔬食品中主要致病菌，一次可檢測金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌三種致病菌，檢測時間由常規(guī)檢測的3-5天，縮短為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測的30小時以內(nèi)，省時省力，節(jié)約檢測成本。
【IPC分類】C12R1-19, C12R1-445, C12Q1-68, C12Q1-10, C12R1-42, C12Q1-14
【公開號】CN104673887
【申請?zhí)枴緾N201410669703
【發(fā)明人】胡文忠, 馮可, 鄒宇, 姜愛麗, 何煜波, 陳晨
【申請人】大連民族學(xué)院
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2014年11月21日