一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子診斷領(lǐng)域，具體涉及基于與結(jié)直腸癌相關(guān)的基因 PCDHB3而開發(fā) 得到的一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)最常見的腫瘤之一，每年的新發(fā)病例數(shù)超過百萬，死 亡人數(shù)超過60萬。在中國，結(jié)直腸癌死亡率為7. 25/10萬，僅次于肺癌、肝癌、胃癌和食管 癌。近年來，隨著我國人民生活水平的提高，膳食結(jié)構(gòu)改變、缺乏運動、吸煙等因素，結(jié)直腸 癌發(fā)病率呈上升趨勢，特別是在沿海經(jīng)濟發(fā)達的大中城市，結(jié)直腸癌發(fā)病率已達到甚至超 過西方發(fā)達國家的平均水平，成為惡性腫瘤死亡的重要原因，嚴重危害我國人民健康。
[0003] nCC/AJCC將結(jié)直腸癌??Μ分期分為I-IV四期。其中I期癌腫未穿出深肌層，沒 有發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；II期癌腫侵犯漿膜層，亦可侵入漿膜外或腸外周圍組織，但尚能整塊 切除，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；III期癌腫侵犯腸壁全層或未侵犯全層，但伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；IV期癌 腫伴有遠處器官轉(zhuǎn)移、局部廣泛浸潤或淋巴結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移，不能根治性切除。
[0004] 在臨床治療中，結(jié)直腸癌m、iv期患者由于發(fā)生了淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移，往往預(yù)后較 差；并且即使同是處于結(jié)直腸癌I-II期的病人，其臨床預(yù)后也不一樣，表現(xiàn)為手術(shù)及輔助 治療后患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)或生存的時間不同，導(dǎo)致預(yù)后差異明顯。然而，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展 是一個涉及多步驟、多基因的復(fù)雜過程。由于腫瘤異質(zhì)性的存在，臨床工作中常常遇到病理 分期相同而預(yù)后差異明顯的情況。因此，尋找新的輔助診斷和/或判斷預(yù)后的分子指標，作 為對結(jié)直腸癌1'匪病理分期系統(tǒng)的有益補充已成為研宄重點。
[0005] PCDHB3 基因（protocadherin^ 3，Gene ID :56132)作為 PCDH 家族中 β 亞家族的 一份子，其編碼的蛋白質(zhì)由6個胞外cadherin結(jié)構(gòu)域和一次跨膜結(jié)構(gòu)組成。對P⑶H家族 的研宄表明，該類蛋白主要涉及胚胎時期胎兒形態(tài)發(fā)生發(fā)育和成人大腦中的選擇性神經(jīng)連 接的維持。一些腫瘤研宄曾報道PCDH家族分子在癌癥中的功能，如在Wilm' s腫瘤中發(fā)現(xiàn) 所有PCDH基因存在啟動子高度甲基化；PCDHlO在多種腫瘤中由于被高度甲基化而表達沉 默，被認為是一個潛在的抑癌基因；PCDH24在結(jié)直腸癌HCTl 16細胞系中可以導(dǎo)致細胞接觸 抑制，從而在體外實驗中完全阻滯腫瘤形成，而這種作用可能是通過負調(diào)控fct通路而達 到的，但目前尚無 PCDHB3的有關(guān)報道。因此，明確PCDHB3與結(jié)直腸癌診斷和/或預(yù)后之間 的關(guān)系，可能對結(jié)直腸癌個體化治療具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0008] 一種用于結(jié)直腸癌輔助診斷和/或預(yù)后判斷的試劑盒，所述試劑盒包括試劑A、試 劑B、試劑C或試劑D中的至少一種：
[0009] 試劑A :用于檢測K：DHB3基因表達水平的引物對，為以下引物中的任意一對：
[0010] 引物I :其序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
[0011] 引物 2 :其序列如 SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 所示；
[0012] 引物 3 :其序列如 SEQ ID NO: 15 和 SEQ ID NO: 16 所示；
[0013] 引物 4:其序列如 SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 所示；
[0014] 引物 5 :其序列如 SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO:20 所示；
[0015] 引物 6 :其序列如 SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 所示；
[0016] 引物 7 :其序列如 SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24 所示；
[0017] 引物 8 :其序列如 SEQ ID NO:25 和 SEQ ID NO:26 所示；
[0018] 引物 9 :其序列如 SEQ ID NO:27 和 SEQ ID NO:28 所示；
[0019] 引物 10 :其序列如 SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30 所示；
[0020] 引物 11 :其序列如 SEQ ID N0:31 和 SEQ ID N0:32 所示；
[0021] 引物 12 :其序列如 SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34 所示；
[0022] 引物 13 :其序列如 SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36 所示；
[0023] 引物 14 :其序列如 SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38 所示；
[0024] 引物 15 :其序列如 SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40 所示；
[0025] 試劑B :用于檢測K：DHB3基因甲基化水平的引物對，為以下引物中的任意一對：
[0026] 引物 16 :其序列如 SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示；
[0027] 引物 17 :其序列如 SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42 所示；
[0028] 試劑C :用于檢測K：DHB3基因甲基化水平的兩對引物，其序列分別如SEQ ID N0:9 和 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12 所示；
[0029] 試劑D :用于檢測K：DHB3蛋白含量的試劑。
[0030] 所述用于檢測K：DHB3基因表達水平的引物是指用于在PCR中合成K：DHB3基因 cDNA鏈的PCR引物。
[0031] 所述用于檢測K：DHB3基因甲基化水平的引物是指用于在MSP、BSP中合成K：DHB3 基因啟動子甲基化島DNA鏈的PCR引物。
[0032] 所述用于檢測K：DHB3蛋白含量的試劑包括抗K：DHB3蛋白的抗體。
[0033] 通過實驗發(fā)現(xiàn)：與正常腸上皮組織相比，PO)HB3 (protocadherin β 3，Gene ID : 56132)蛋白在腫瘤細胞中呈低水平表達，P⑶ΗΒ3啟動子在腫瘤細胞中呈高度甲基化；因 此，對腸上皮組織中PCDHB3表達水平和其啟動子甲基化水平的檢測可用于結(jié)直腸癌的檢 測；
[0034] 所述的低水平表達是指腫瘤細胞內(nèi)rcDHB3mRNA及蛋白表達水平低于正常對照； 所述的高度甲基化是指在腫瘤細胞內(nèi)PCDHB3啟動子CpG堿基甲基化程度高于正常對照；所 述的腫瘤細胞為TNM I-IV期結(jié)直腸癌病人腫瘤組織細胞。
[0035] 通過實驗也發(fā)現(xiàn)：P⑶HB3在腫瘤細胞高水平表達指示良好預(yù)后；P⑶HB3在腫瘤細 胞核膜表達指示良好預(yù)后。因此，對PCDHB3表達水平及PCDHB3是否在核膜中表達的檢測 可用于結(jié)直腸癌的預(yù)后判斷。
[0036] 所述的高水平表達是指H-SCORE評分多1. 57 ;H-SC0RE指免疫組織化學(xué)染色強 度X陽性率；所述的核膜表達是指在腫瘤細胞核膜上有PCDHB3免疫組織化學(xué)染色；良好 預(yù)后具體為腫瘤細胞核膜表達POTHB3病人總生存期、無進展生存期比腫瘤細胞核膜不表 達TCDHB3病人長。所述腫瘤細胞為TNM III-IV期結(jié)直腸癌病人腫瘤組織細胞。
[0037] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：
[0038] 本發(fā)明通過對結(jié)直腸癌進行差異表達基因篩選，發(fā)現(xiàn)了位于人類染色體5q31的 P⑶HB3是一個與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的基因。K：DHB3的mRNA和蛋白表達水平在結(jié)直腸癌病 人的腫瘤組織中顯著下調(diào)，而該下調(diào)與基因啟動子區(qū)域CpG堿基高度甲基化密切相關(guān)。同 時，在TNM III-IV期結(jié)直腸癌病人中的預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，PCDHB3在腫瘤細胞高水平表達或腫 瘤細胞核膜表達指示良好預(yù)后。基于上述發(fā)