引物組合物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是分支桿菌鑒定技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，涉及引物組 合物及其用途，更具體的，本發(fā)明涉及引物組合物、試劑盒及其在對待測分支桿菌進(jìn)行菌種 鑒定中的用途，構(gòu)建待測分支桿菌ITS區(qū)域核酸測序文庫的方法，對待測分支桿菌進(jìn)行菌 種鑒定的方法、系統(tǒng)，以及同時(shí)對多個(gè)待測分支桿菌樣本進(jìn)行菌種鑒定的方法和系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 分枝桿菌是好氧的細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌生物類屬，其在感染宿主后存活在單核細(xì)胞和巨噬 細(xì)胞的內(nèi)體區(qū)室（endosomalcompartments)中。結(jié)核桿菌（Mycobacteriumtuberculosis) 為革蘭氏陽性細(xì)菌中分枝桿菌屬（mycobacterium)的一個(gè)成員，而非結(jié)核性分枝桿菌 (mycobacteriumotherthantuberculosis)是分枝桿菌屬中除了結(jié)核桿菌以外細(xì)菌的統(tǒng) 稱。其中的鳥型結(jié)核菌（Mycobacteriumaviumcomplex)廣泛的自艾滋病患的檢體被分離 到后，非結(jié)核性分枝桿菌才受到重視。非結(jié)核性分枝桿菌在環(huán)境中普遍存在且種類繁多，目 前超過九十余種。
[0003] 結(jié)核分枝桿菌（M.tuberculosis)及其復(fù)合群傳染了世界人口的大約三分之一， 約17億人患結(jié)核病（Kochi，A.，結(jié)核（Tubercle)72 :1-6(1991))，在世界范圍內(nèi)使更多 人喪生（每年大約3百萬）（發(fā)病率與死亡率周報(bào)（MorbidityandMortalityWeekly Report) 42 :961-964 (1993));其它治病性分枝桿菌如鳥分枝桿菌（M.avium)復(fù)合體（MAC)、 副結(jié)核分枝桿菌（M.paratuberculosis)、潰瘍分枝桿菌（M.ulcerans)、麻風(fēng)分枝桿菌 (M.leprae)、堪薩斯分枝桿菌（M.kansasii)、海分枝桿菌（M.marinum)、瑪爾摩爾分枝桿 菌（M.malmoense)和偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合體也是常見的病原體（參見：Wayne，L.G.，臨床微 生物學(xué)綜述（Clin.Micro.Rev.)5 :1-25(1992)或Falkinham，J.O.，臨床微生物學(xué)綜述 9 : 177-215(199)關(guān)于不同分枝桿菌病原體的綜述），主要易感者是慢性呼吸道疾患（C0PD、肺 結(jié)核殘余空洞、矽肺、支氣管擴(kuò)張癥、肺囊性纖維化等）和免疫抑制特別是AIDS患者。鳥分 枝桿菌復(fù)合群（Mycobacteriumavium)在所有晚期AIDS患者的幾乎半數(shù)中引起傳播性疾 ?。∟ightingale，S.D?等人，傳染病雜志（Jour.Infect.Dis.) 165:1082-1085 (1992))。世 界衛(wèi)生組織估計(jì)，到2000年為止感染人免疫缺陷病毒（HIV)的人數(shù)將超過4千萬（世界衛(wèi) 生組織（文件WH0/GPA/CNP/EVA/93. 1)全球AIDS計(jì)劃（1993))。副結(jié)核分枝桿菌（鳥分枝 桿菌的一個(gè)亞種）在反芻動(dòng)物中引起副結(jié)核病，引起農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)（例如，牛奶和牛肉）每 年損失，耗費(fèi)了大量的社會(huì)費(fèi)用。
[0004]人類分枝桿菌疾病包括結(jié)核病（由結(jié)核分枝桿菌M.tuberculosis引起）、麻瘋 ?。ㄓ陕榀偡种U菌M.leprae引起）、Bairnsdale潰瘍?。ㄓ蓾兎种U菌M.ulcerans 引起）和由海分枝桿菌（Emarinum)、堪薩斯分枝桿菌（M.kansasii)、瘰病分枝桿菌 (M.scrofulaceum)、蘇爾加分枝桿菌（M.szulgai)、蟾蜍分枝桿菌（M.xenopi)、偶發(fā)分枝桿 菌（M.fortuitum)、龜分支桿菌（M.chelonei)、嗜血分枝桿菌（M.haemophilum)和胞內(nèi)分枝 桿菌（M.intracellulare)引起的各種感染。證據(jù)顯示，非結(jié)核性分枝桿菌所引發(fā)的院內(nèi)傳 染正逐步增加，且所導(dǎo)致的狀況已由無害的移生轉(zhuǎn)變成具侵害性的感染。此外，非結(jié)核性分 枝桿菌亦可造成微生物檢體的污染而導(dǎo)致不必要的治療及可能有害的診斷步驟。分析菌株 的種類及檢體來源可協(xié)助確認(rèn)菌群的重要性，一旦懷疑發(fā)生突發(fā)（out-break)或假性群突 發(fā)，分析技術(shù)應(yīng)可迅速確認(rèn)來源及確定適當(dāng)?shù)目刂拼胧?br>[0005] 因此，目前結(jié)核分枝桿菌鑒定、與非結(jié)核分枝桿菌的鑒別，受到廣泛關(guān)注，成為研 究熱點(diǎn)，越來越多的從基因?qū)用?，采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行研究及產(chǎn)品研發(fā)，不僅突破了結(jié) 核與非結(jié)核自身生長時(shí)間長、條件苛刻的局限，甚至比優(yōu)化過的液體培養(yǎng)時(shí)間更短。
[0006] 然而，目前的分枝桿菌鑒定方法仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0008] 現(xiàn)今比較常見的針對某特定區(qū)域的Q-PCR鑒定菌種技術(shù)，基因芯片核酸探針雜交 技術(shù)等等分子生物學(xué)技術(shù)都已得到廣泛運(yùn)用，但是同時(shí)由于芯片雜交技術(shù)原理及熒光信號 對Q-PCR技術(shù)的限制，兩者成本都不低，一次反應(yīng)檢測的種類非常有限。
[0009] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于提出一種成本低、效率高、敏感度高、方便快捷且一次反應(yīng)能夠鑒別多種菌種的分支桿 菌菌種鑒定方法。具體地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，基于基因?qū)用?，分枝桿菌16S-23SrRNA轉(zhuǎn)錄間隔 區(qū)，即分支桿菌的ITS區(qū)域，高度保守，其序列和長度依菌種不同差異較大，因而，發(fā)明人 采用該分枝桿菌特定區(qū)域--ITS區(qū)域，進(jìn)行對結(jié)核性分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌的鑒 另IJ，具體地，其通過設(shè)計(jì)獲得在不同分枝桿菌之間的同源性非常高的特異性引物（SEQID NO: 1-4)，對待測樣本的分枝桿菌特定區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增并測序，經(jīng)比對一次反應(yīng)即可對同一樣 本中存在的多種分枝桿菌進(jìn)行鑒別，具有敏感度高、方便全面、快速的優(yōu)點(diǎn)。
[0010] 因而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明首先提供了一種引物組合物。根據(jù)本發(fā)明的 實(shí)施例，該引物組合物包含：第一引物組，所述第一引物組的核酸序列如SEQIDN0:1-2所 示；以及第二引物組，所述第二引物組的核酸序列如SEQIDNO: 3-4所示。發(fā)明人驚奇地發(fā) 現(xiàn)，本發(fā)明的引物組合物能夠特異性識別分枝桿菌特定區(qū)域--ITS區(qū)域，并且該引物組合 物在不同分枝桿菌之間的同源性高，對各種分支桿菌菌種均適用，能夠有效用于分支桿菌 菌種鑒定，尤其是對結(jié)核性分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌的鑒別。進(jìn)而，利用本發(fā)明的引物 組合物對包含ITS區(qū)域的待測分支桿菌核酸樣本進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增，一步即能夠?qū)崿F(xiàn)分支 桿菌ITS區(qū)域核酸的富集，進(jìn)而測序后，能夠有效獲得待測分支桿菌核酸樣本ITS區(qū)域的核 酸序列，經(jīng)過比對分析即可容易地實(shí)現(xiàn)對待測分支桿菌的菌種鑒定，而并不受待測分支桿 菌菌種的限制，并且，一次反應(yīng)即可對同一樣本中存在的多種分枝桿菌進(jìn)行鑒別，成本低、 效率高、敏感度高、方便、快速，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可重復(fù)性好。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該試 劑盒包含前面所述的引物組合物。如前所述，本發(fā)明的引物組合物能夠特異性識別分枝桿 菌ITS區(qū)域，并且該引物組合物在不同分枝桿菌之間的同源性高，對各種分支桿菌菌種均 適用，能夠有效用于分支桿菌菌種鑒定，尤其是對結(jié)核性分枝桿菌和非結(jié)核性分枝桿菌的 鑒別，因而，本發(fā)明的試劑盒能夠有效用于分支桿菌菌種鑒定尤其是結(jié)核性分枝桿菌和非 結(jié)核性分枝桿菌的鑒別，并且，利用本發(fā)明的試劑盒，通過對待測分支桿菌樣本進(jìn)行擴(kuò)增、 測序和比對分析，一次即能夠?qū)崿F(xiàn)待測分支桿菌ITS區(qū)域核酸的富集并有效獲得待測分支 桿菌核酸樣本ITS區(qū)域的核酸序列，實(shí)現(xiàn)對待測分支桿菌的菌種鑒定，而并不受待測分支 桿菌菌種的限制，并且，一次反應(yīng)即可對同一樣本中存在的多種分枝桿菌進(jìn)行鑒別，成本 低、效率高、敏感度高、方便、快速，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可重復(fù)性好。
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