一種y型探針組及其應用、方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及核酸檢測領域，特別是指一種Y型探針組，本發(fā)明還涉及一種Y型探針組在核酸檢測的應用和方法，以及核酸檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]目前國內(nèi)外針對出核酸檢測主要有PCR和基因芯片等方法，這些方面一般都存在操作過程極為復雜，并且由于過程的復雜性等，造成檢測的可重復性差，另外，還存在檢測耗時長的問題，因此，一直為實驗室研究人員所詬病，急需對此進行結(jié)果，以提高檢測的效率，降低檢測的成本，提高檢測的穩(wěn)定性，便捷性等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的之一在于提供了一種Y型探針組，結(jié)構合理，適于進行核酸的快速檢測。
[0004]本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的:
一種Y型探針組，包括探針A和探針B，所述探針A的中部與探針B的3’末端2-4個堿基的互補，優(yōu)選3個，另外，根據(jù)探針的功能，所述探針A和所述探針B均為單鏈。
[0005]進一步，所述探針A與所述探針B能夠同時與待檢測核酸序列結(jié)合。
[0006]進一步，所述探針A與所述探針B同時與待檢測核酸序列結(jié)合后，三者整體呈Y型。
[0007]進一步，所述探針A與所述探針B均與待檢測核酸序列有不少于10個的堿基互補配對。
[0008]進一步，所述探針B未與所述探針A以及待檢測核酸序列結(jié)合的區(qū)域中間，有一段酶切位點的互補序列。
[0009]從而，在沒有待檢核酸檢測序列(Targer)存在的情況下，所述探針A和所述探針B在37°C不能結(jié)合，而當有Target存在時，所述探針A和所述探針B各自都有10個以上堿基和Target互補配對結(jié)合,在Target介導下,B的3’末端3個堿基和A互補配對,在聚合酶存在的情況下引發(fā)擴增反應，因為所述探針A上有一段酶切位點的互補序列，所以擴增的片段在中間有酶切位點，可被切刻酶識別，從而在有切割酶存在的情況下，會切斷雙鏈中的一條鏈，而在切口處聚合酶繼續(xù)擴增，延伸，繼續(xù)被切，循環(huán)往復，實現(xiàn)擴增反應，可以得到大量的切割下來的單鏈片段。
[0010]本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種Y型探針組的應用。
[0011]所述Y型探針組在核酸檢測中的應用。
[0012]本發(fā)明的另一目的在于提供了一種基于Y型探針組的核酸檢測方法，操作簡便，檢測迅速，而且結(jié)果可靠穩(wěn)定。
[0013]一種基于Y型探針組的核酸檢測方法，利用所述Y型探針組、擴增以及膠體金檢測進行。
[0014]所述于Y型探針組的核酸檢測方法，通過將所述Y型探針組與待檢測序列結(jié)合，使所述探針B在聚合酶的作用下，沿探針A進行擴增形成雙鏈，擴增的片段在中間有酶切位點，可被切刻酶識別，從而切斷雙鏈中的一條鏈，在切口處聚合酶繼續(xù)擴增，延伸，繼續(xù)被切，循環(huán)往復，實現(xiàn)擴增反應，然后通過對被切割下來的片段進行膠體金檢測，并觀察結(jié)果。
[0015]所述于Y型探針組的核酸檢測方法，包括以下步驟:
制備反應液；
制備膠體金；
制備膠體金-核酸偶聯(lián)物；
檢測。
[0016]其中，制備反應液包括:將探針A、探針B、待檢測核酸序列加入反應緩沖液中，混勻，37°C條件下擴增反應；
其中，制備膠體金包括:向容器中加入100 ml 0.01%的HAuCl4溶液，攪拌加熱至沸騰后，加入4 ml 1%枸櫞酸鈉，溶液變?yōu)榫萍t色后，繼續(xù)煮沸10分鐘，停止加熱繼續(xù)攪拌15分鐘，得到膠體金溶液，膠體金溶液4°C避光保存。
[0017]其中，制備膠體金-核酸偶聯(lián)物包括:
(I)取10倍濃縮的金納米顆粒900 L，加入100 L超純水溶解的巰基修飾的DNA，充分混勻。
[0018](2) 4 °C反應 24 小時。
[0019](3)用10%的BSA進行封閉，逐滴加入10%的BSA約100 L，加邊震蕩，使BSA的終濃度為1%，充分混勻。
[0020](4) 4 °C封閉 4 小時。
[0021](5)加入1.5 M的NaCl溶液和1%的SDS溶液，緩慢滴加，邊加邊震蕩，使NaCl的終濃度為150 mmol/L, SDS的終濃度為0.01%。充分混勻。
[0022](6) 4 °C老化 24 小時。
[0023](7) 4 °C離心，12，000 rpm, 20分鐘，棄上清。沉淀用金重懸液重懸,重復離心2-3次，棄上清，留沉淀。
[0024](8)用I mL金重懸液重懸核酸-金標記物沉淀，得到反應液C，4 1:保存?zhèn)溆谩?br>[0025]其中，檢測包括:將上述反應液C加入2微升AuNP-核酸偶聯(lián)物，轉(zhuǎn)移到試紙條上，加入40微升的上樣緩沖液，進行檢測，檢測反應時間為30-90min，觀察。
[0026]作為本發(fā)明的另一個目的，還提供了一種基于Y型探針組的核酸檢測試劑盒，操作方便，適合推廣。
[0027]一種基于所述Y型探針組的核酸檢測試劑盒，包括:具有粘性的底板；硝酸纖維素膜粘貼在所述底板的中部；所述硝酸纖維素膜上劃有跟Click Azide片段互補的核酸，作為檢測線，和Click CHCH核酸，作為質(zhì)控線；金標墊粘貼在所述硝酸纖維素膜的一側(cè)的底板上，所述金標墊與所述硝酸纖維素膜之間有2-3_的重疊；吸水紙粘貼在所述硝酸纖維素膜的另一側(cè)的底板上，所述吸水紙與所述硝酸纖維素膜之間有2-3_的重疊；樣品墊，粘貼在所述底板上，所述樣品墊與所述金標墊之間有2-3mm的重疊。
[0028]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的所述Y型探針組，結(jié)構特殊，能實現(xiàn)在沒有Target存在時不結(jié)合,有Target實現(xiàn)結(jié)合,并在聚合酶的作用下實現(xiàn)擴增等，結(jié)構設計合理，方便進行核酸檢測，本發(fā)明的檢測方法操作簡單，特異性好，對樣本的要求低，可以用于實際樣品的定量檢測；靈敏度高，對核酸的檢測限為20 PM，不需要使用復雜的儀器，使用普通的讀卡儀就能讀數(shù)，本發(fā)明的試劑盒操作簡單，檢測迅速。
【附圖說明】
[0029]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0030]圖1為本發(fā)明所述的基于Y型探針的核酸檢測方法的原理圖；
圖2為本發(fā)明所述的基于Y型探針的核酸檢測方法的靈敏度實驗結(jié)果圖；
圖3為本發(fā)明所述的基于Y型探針的核酸檢測方法的特異性實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0031]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例