專利名稱：水解酶、編碼它們的核酸及其制備和應(yīng)用方法
水解酶、編碼它們的核酸及其制備和應(yīng)用方法
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權(quán)利要求
1.分離的、合成的或重組的核酸，其包括(a)，編碼至少一種多肽的核酸(多核苷酸)，其中所述核酸包括與下列具有至少約 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,95%、96%、97%、98%、99%、或更大、或完全的(100%)序列同一性的序列(i)SEQID N0:1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO :13,SEQ ID NO :15,SEQ ID NO :17,SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :22 或 SEQ ID NO :23，或(ii)SEQID NO :1的核酸，其具有編碼一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、 九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十個、二十一個、二十二個、二十三個、二十四個或更多個或所有的如表3、表4、表9、表10、表 11、表16或表23中所示的氨基酸變化(或其等同變化)的一個或多個核苷酸變化(或其等同變化)，其中所述(i)或(ii)的核酸編碼至少一種具有水解酶活性的多肽，或者編碼能產(chǎn)生水解酶特異性抗體的多肽或肽(充當表位或免疫原的多肽或肽)，(b)，(a)的核酸(多核苷酸)，其中所述序列同一性如下測定(A)通過用序列比較算法進行分析或通過視覺檢查，或(B)在至少約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、 850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550 或更多個殘基的區(qū)域內(nèi)，或在cDNA、轉(zhuǎn)錄物(mRNA)或基因的全長區(qū)域內(nèi)，(c)，(a)或(b)的核酸(多肽)，其中所述序列比較算法是BLAST第2.2. 2版算法，其中過濾設(shè)置被設(shè)置為blastall-p blastp-d "nr pataa"-F F，并且所有其它選項被設(shè)置為默認值，(d)，核酸(多核苷酸)，其編碼至少一種具有水解酶活性的多肽或多肽，其中所述核酸包括在嚴格條件下與(a)、(b)或(c)的核酸的互補序列雜交的序列，其中所述嚴格條件包括在約65°C的溫度下在0. 2X SSC中洗滌約15分鐘的洗滌步驟，(e)，核酸(多核苷酸)，其編碼至少一種具有水解酶活性例如脂肪酶、飽和酶、棕櫚酸酶和/或硬脂酸酶活性的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO :2的序列或其酶促活性片段， 具有至少一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十個、二十一個、二十二個、二十三個、二十四個或更多個或所有的如表3、表4、表9、表10、表11、表16或表23中所示的氨基酸變化(或其等同變化)，(f)，核酸(多核苷酸)，其編碼至少一種具有水解酶活性的多肽，其中所述多肽包括 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、 SEQ ID NO 14,SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18 或 SEQ ID NO 20 的序列或其酶促活性片段，(g)，(A)，(a)至(f)任一項的并且編碼多肽的核酸(多核苷酸)，所述多肽具有至少一個保守性氨基酸置換并且保留其水解酶活性，或(B)，(g) (A)的核酸，其中所述所述至少一個保守性氨基酸置換包括用另一類似特征的氨基酸置換氨基酸；或者，保守性置換包括用另一脂肪族氨基酸替換脂肪族氨基酸；用蘇氨酸替換絲氨酸或反之亦然；用另一酸性殘基替換酸性殘基；用另一含有酰胺基團的殘基替換含有酰胺基團的殘基；用另一堿性殘基交換堿性殘基；或用另一芳香族殘基替換芳香族殘基，(h)，(a)至(g)任一項的、編碼多肽的核酸(多核苷酸)，所述多肽具有水解酶活性但缺少信號序列，(i), (a)至(h)任一項的、編碼多肽的核酸(多核苷酸)，所述多肽具有水解酶活性，進一步包括異源序列，(j)，(i)的核酸(多核苷酸)，其中所述所述異源序列包括編碼下列的序列或由編碼下列的序列組成㈧異源信號序列；(B)，(A)的序列，其中所述異源信號序列得自異源酶；或者(C)標記、表位、靶向肽、可切割序列、可檢測部分或酶，或(k)，核酸序列(多核苷酸)，其與(a)至(j)任一項的序列充分(完全)互補。
2.權(quán)利要求1的分離的、合成的或重組的核酸，其中所述水解酶活性包括脂肪酶活性， 飽和酶、硬脂酸酶或棕櫚酸酶活性，其中任選地，所述飽和酶活性包括選擇性地水解至少60 %、61 %、62 %、63 %、64 %、 65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%, 80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%, 95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的飽和脂肪酸酯，其中任選地，水解的酯可以是飽和脂肪酸和甘油、傘形醇或其它醇的酯，其中任選地，所述棕櫚酸酶活性包括選擇性地水解脂肪酸，以使至少60^^61^^62%. 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的水解的脂肪酸是棕櫚酸，或其中任選地，所述硬脂酸酶活性包括選擇性地水解脂肪酸，以使至少60^^61^^62%. 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的水解的脂肪酸是硬脂酸。
3.權(quán)利要求1的分離的、合成的或重組的核酸，其中所述水解酶活性包括(a)水解三?；视统啥；视秃陀坞x脂肪酸，或者水解三?；视统蓡熙；视秃陀坞x脂肪酸，或水解二?；视统蓡熙；视秃陀坞x脂肪酸，或水解單?；视统捎坞x脂肪酸和甘油，或包括水解三酰基甘油(TAG)、二?；视?DAG)或單?；视?MAG)，(b)從二?；视突騿熙；视秃陀坞x脂肪酸合成三?；视停?c)合成1，3-二棕櫚酰-2-油酰甘油(POP) ,1,3- 二硬脂酰-2-油酰甘油(SOS)、1-棕櫚酰-2-油酰-3-硬脂酰甘油(POS)或1-油酰-2，3- 二肉豆蔻酰甘油(OMM)、長鏈多不飽和脂肪酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)，(d)水解酶活性，其是三?；视?TAG)、二?；视?DAG)或單酰基甘油(MAG)位置特異性的，其中任選地所述水解酶活性是Sn2-特異性的、Snl-或Sn3_特異性的，(e)水解酶活性，其是脂肪酸特異性的，其中任選地所述脂肪酸是棕櫚酸、硬脂酸或其它飽和脂肪酸，(f)通過水解、醇解、酯化、酯交換或相互酯化來修飾油，(g)水解酶活性，其是區(qū)域特異性或化學(xué)選擇性的，其中任選地所述水解酶活性包括合成對映異構(gòu)體純的手性產(chǎn)物，或(h)合成傘形基脂肪酸(FA)酯。
4.權(quán)利要求1的分離的、合成的或重組的核酸，其中所述水解酶活性是熱穩(wěn)定的，其中任選地所述多肽在包括約-100°C至約-80°C、約-80°C至約-40°C、約_40°C至約-20°C、 約-20°C至約0°C、約0°C至約5°C、約5°C至約15°C、約15°C至約25°C、約25°C至約37°C、約 37°C至約 45"C、約 45°C至約 55"C、約 55°C至約 70°C、約 70°C至約 75"C、約 75°C至約 85"C、 約85"C至約90"C、約90"C至約95 V、約95 V至約100°C、約100 V至約105°C、約105°C至約 110°C、約 110°C 至約 120°〇溫度范圍內(nèi)或者951、961、971、981、991、1001、1011、 102 "C >103 "C>104 "C>105 "C>106 "C>107 "C>108 "C>109 "C>110 °C、111 "C>112 "C>113 "C、 114°C、115°C或更高的溫度的條件下保持脂肪酶活性。
5.權(quán)利要求1的分離的、合成的或重組的核酸，其中所述水解酶活性是耐熱的，其中任選地所述多肽在暴露于約-10(TC至約-80°c、約-80°c至約-40°c、約_40°C至約-20°C、 約-20°C至約0°C、約0°C至約5°C、約5°C至約15°C、約15°C至約25°C、約25°C至約37°C、約 37°C至約 45"C、約 45°C至約 55"C、約 55°C至約 70°C、約 70°C至約 75"C、約 75°C至約 85"C、 約85°C至約90"C、約90"C至約95°C、約95°C至約100°C、約100V至約105°C、約105°C至約 110°C、約 110°C至約 120°C范圍內(nèi)的溫度或者 95"C、96°C、97°C、98°C、99°C、100°C、101°C、 102 "C >103 "C >104 "C >105 "C >106 "C >107 "C >108 "C >109 "C >110 °C、111 "C >112 "C >113 °C> 114°C、115°C或更高的溫度后保持水解酶活性。
6.表達盒、載體或克隆運載體，其包括包含如權(quán)利要求1中所示序列的核酸，其中任選地所述克隆運載體包括病毒載體、質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌體或人工染色體，其中任選地所述病毒載體包括腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺伴隨病毒載體，并且任選地所述克隆運載體包括細菌人工染色體(BAC)、質(zhì)粒、噬菌體Pl衍生的載體(PAC)、酵母人工染色體(YAC)或哺乳動物人工染色體(MAC)。
7.轉(zhuǎn)化的細胞，其包括包含如權(quán)利要求1中所示序列的核酸、或者如權(quán)利要求6中所示的表達盒、載體或克隆運載體，其中任選地所述細胞是細菌細胞、哺乳動物細胞、真菌細胞、 酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞。
8.轉(zhuǎn)基因非人動物，其包括如權(quán)利要求1中所示的序列，其中任選地所述動物是小鼠。
9.轉(zhuǎn)基因植物，其包括如權(quán)利要求1中所示的序列，其中任選地所述植物是玉米植株、 高粱植株、馬鈴薯植株、番茄植株、小麥植株、油料種子植株、油菜籽植株、大豆植株、水稻植株、大麥植株、草或煙草植株。
10.轉(zhuǎn)基因種子，其包括如權(quán)利要求1中所示的序列，其中任選地所種子是水稻、玉米種子、小麥仁、含油種子、油菜籽、大豆種子、棕櫚仁、向日葵種子、芝麻種子、水稻、大麥、花生或煙草植物種子。
11.分離的、合成的或重組的多肽，其包括序列，該序列(a)，與下列具有至少約 50%、51 %、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%, 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更大、或具有 100% (完全的)序列同一性(i)SEQID NO :2的氨基酸序列，或其酶促活性片段，并且具有至少一個、二個、三個、 四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、 十七個、十八個、十九個、二十個、二十一個、二十二個、二十三個、二十四個或更多個或所有的如表3、表4、表9、表10、表11、表16或表23中所示的氨基酸變化(或其等同變化)，或(ii)SEQID N0:2、SEQ ID NO :4、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO :10, SEQ ID NO :12,SEQ ID NO : 14、SEQ ID NO :16,SEQ ID NO :18 或 SEQ ID NO :20 的氨基酸序列，或其酶促活性片段，其中所述⑴或(ii)的多肽和肽具有水解酶活性，或者所述多肽和肽能產(chǎn)生水解酶特異性抗體(充當表位或免疫原的多肽或肽)，(b)，(a)的多肽和肽，其中所述序列同一性如下測定(A)通過用序列比較算法進行分析或通過視覺檢查，或(B))在至少約 20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、150、200、 250,300或更多個氨基酸殘基的區(qū)域內(nèi)，或者在所述多肽或肽或酶的全長內(nèi)，和/或在其酶促活性子序列(片段)內(nèi)，(c)，(b)的多肽和肽，其中所述序列比較算法是BLAST第2.2. 2版算法，其中過濾設(shè)置被設(shè)置為blastall-p blastp-d "nr pataa"-F F，并且所有其它選項被設(shè)置為默認值；(d)，由權(quán)利要求1的核酸編碼的氨基酸序列，其中所述多肽具有(i)水解酶活性，或 ( )具有免疫原活性，因為它能產(chǎn)生與具有(a)的序列和/或其酶促活性子序列(片段) 的多肽特異性結(jié)合的抗體；(e),(a)至(d)任一項的氨基酸序列，并且包括至少一個保守性氨基酸殘基置換，并且所述多肽或肽保留水解酶活性；(f)，(e)的氨基酸序列，其中所述保守性置換包括用另一脂肪族氨基酸替換脂肪族氨基酸；用蘇氨酸置換絲氨酸或反之亦然；用另一酸性殘基替換酸性殘基；用另一含有酰胺基團的殘基替換含有酰胺基團的殘基；用另一堿性殘基交換堿性殘基；或用另一芳香族殘基替換芳香族殘基，或其組合，(g),(f)的氨基酸序列，其中所述脂肪族殘基包括丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或其合成等同物；所述酸性殘基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物；所述含有酰胺基團的殘基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成等同物；所述堿性殘基包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸或其合成等同物；或者，所述芳香族殘基包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或其合成等同物；(h)，(a)至(f)任一項的多肽，其具有水解酶活性但缺少信號序列，(i)，(a)至(h)任一項的多肽，其具有水解酶活性，進一步包括異源序列，(j)，⑴的多肽，其中所述所述異源序列包括下列序列或由下列序列組成㈧異源信號序列；⑶，(A)的序列，其中所述異源信號序列得自異源酶；和/或(C)標記、表位、靶向肽、可切割序列、可檢測部分或酶，或(m)，包括由權(quán)利要求1的核酸編碼的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求11的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述水解酶活性包括脂肪酶活性，飽和酶、硬脂酸酶或棕櫚酸酶活性，其中任選地，所述飽和酶活性包括選擇性地水解至少60 %、61 %、62 %、63 %、64 %、.95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或100 %的飽和脂肪酸酯，其中任選地，所述水解的酯可以是飽和脂肪酸和甘油、傘形醇或其它醇的酯，其中任選地，所述棕櫚酸酶活性包括選擇性地水解脂肪酸，以使至少60%、61 %、62%、 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%所述水解的脂肪酸是棕櫚酸，或其中任選地，所述硬脂酸酶活性包括選擇性地水解脂肪酸，以使至少60^^61^^62%. 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%,94%,95%,96%,97%,98%,99% orl00%所述水解的脂肪酸是硬脂酸。
13.權(quán)利要求11的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述水解酶活性包括(a)水解三?；视统啥；视秃陀坞x脂肪酸，或者水解三?；视统蓡熙；视秃陀坞x脂肪酸，或水解二?；视统蓡熙；视秃陀坞x脂肪酸，或水解單酰基甘油成游離脂肪酸和甘油，或包括水解三?；视?TAG)、二酰基甘油(DAG)或單?；视?MAG)，(b)從二?；视突騿熙；视秃陀坞x脂肪酸合成三?；视?，(c)合成1，3-二棕櫚酰-2-油酰甘油(POP) ,1,3- 二硬脂酰-2-油酰甘油(SOS)、1-棕櫚酰-2-油酰-3-硬脂酰甘油(POS)或1-油酰-2，3- 二肉豆蔻酰甘油(OMM)、長鏈多不飽和脂肪酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸(DHA)或二十碳五烯酸(EPA)，(d)水解酶活性，其是三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)或單?；视?MAG)位置特異性的，其中任選地所述水解酶活性是Sn2-特異性的、Snl-或Sn3_特異性的，(e)水解酶活性，其是脂肪酸特異性的，其中任選地所述脂肪酸是棕櫚酸、硬脂酸或其它飽和脂肪酸，(f)通過水解、醇解、酯化、酯交換或相互酯化來修飾油，(g)水解酶活性，其是區(qū)域特異性或化學(xué)選擇性的，其中任選地所述水解酶活性包括合成對映異構(gòu)體純的手性產(chǎn)物，或(h)合成傘形基脂肪酸(FA)酯。
14.權(quán)利要求11的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述水解酶活性是熱穩(wěn)定的，其中任選地所述多肽在包括約-100°C至約-80°C、約-80°C至約-40°C、約_40°C至約-20°C、 約-20°C至約0°C、約0°C至約5°C、約5°C至約15°C、約15°C至約25°C、約25°C至約37°C、約 37°C至約 45"C、約 45°C至約 55"C、約 55°C至約 .70°C、約 70°C至約 75"C、約 75°C至約 85"C、 約85"C至約90"C、約90"C至約95 V、約95 V至約100°C、約100 V至約105°C、約105°C至約 110°C、約 110°C至約 120°C溫度范圍內(nèi)或者 95°C、96°C、97°C、98°C、99°C、10(TC、10rC、 102 "C >103 "C >104 "C >105 "C >106 "C >107 "C >108 "C >109 "C >110 °C、111 "C >112 "C >113 °C> 114°C、115°C或更高的溫度的條件下保持脂肪酶活性。
15.權(quán)利要求11的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述水解酶活性是耐熱的，其中任選地所述多肽在暴露于約-100°C至約-80°C、約-80°C至約-40°C、約_40°C至約-20°C、 約-20°C至約0°C、約0°C至約5°C、約5°C至約15°C、約15°C至約25°C、約25°C至約37°C、約 37°C至約 45"C、約 45°C至約 55"C、約 55°C至約 70°C、約 70°C至約 75"C、約 75°C至約 85"C、約85°C至約90 V、約90 V至約95°C、約95°C至約100°C、約100 V至約105°C、約105°C至約 110°C、約 110°C至約 120°C 范圍內(nèi)的溫度或者 95"C、96°C、97°C、98°C、99°C、100°C、101°C、 102 "C >103 "C >104 "C >105 "C >106 "C >107 "C >108 "C >109 "C >110 °C、111 "C >112 "C >113 °C> 114°C、115°C或更高的溫度后保持水解酶活性。
16.權(quán)利要求11的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述水解酶活性包括每毫克蛋白約100至約1000單位范圍內(nèi)、每毫克蛋白約500至約750單位范圍內(nèi)、每毫克蛋白約500 至約1200單位范圍內(nèi)、或每毫克蛋白約750至約1000單位范圍內(nèi)的約37°C下的比活性。
17.權(quán)利要求11的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述多肽包含至少一個糖基化位點，其中任選地所述糖基化是N-連接的糖基化，并且任選地所述多肽在巴斯德畢赤酵母 (P. pastoris)或粟酒裂殖酵母(S. pombe)中表達后被糖基化。
18.權(quán)利要求11的分離的、合成的或重組的多肽，其中所述多肽在包括PH3. 0、約？!1 3. 5、約 pH 4. 0、約 pH 4. 5、約 pH 5. 0、約 pH 5. 5、約 pH 6. 0、約 pH 6. 5、約 pH 7. 0、約 pH 7. 5、約 pH 8. Oj^JpH 8. 5、約 pH 9. Oj^JpH 9. 5、約 pH 10. Oj^JpH 10. 5、約 pH 11. OjApH 11. 5、約pH 12. 0或更大pH的條件下保留水解酶活性。
19.蛋白制劑，其包括如權(quán)利要求11中所示的多肽，其中所述蛋白質(zhì)制劑包括液體、固體或凝膠。
20.異源二聚體，其包括如權(quán)利要求11中所示的多肽和第二結(jié)構(gòu)域，其中任選地所述第二結(jié)構(gòu)域是多肽，并且所述異源二聚體是融合蛋白，或者所述第二結(jié)構(gòu)域是表位或標記。
21.同源二聚體，其包括如權(quán)利要求11中所示的多肽。
22.固定化多肽，其中所述多肽包括如權(quán)利要求11中所示的序列或其子序列，其中任選地所述多肽被固定化在細胞、金屬、樹脂、聚合物、陶瓷、玻璃、微電極、石墨顆粒、珠子、凝膠、板、陣列或毛細管上。
23.陣列，其包括(i)如權(quán)利要求11中所示的固定化多肽。
24.分離的、合成的或重組的抗體，其與如權(quán)利要求11中所示的多肽特異性地結(jié)合，其中任選地所述抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
25.雜交瘤，其包括與如權(quán)利要求11中所示的多肽特異性地結(jié)合的抗體。
26.食品、飼料、食品補充物、飼料補充物、飲食助劑或食品組合物，其包括如權(quán)利要求 11中所示的多肽或其子序列，其中任選地所述多肽被糖基化。
27.食用酶遞送基質(zhì)，其包括如權(quán)利要求11中所示的多肽，其中任選地所述遞送基質(zhì)包括丸粒，并且任選地所述多肽被糖基化，或者所述多肽具有耐熱的或熱穩(wěn)定的水解酶活性。
28.產(chǎn)生重組多肽的方法，其包括如下步驟(a)提供與啟動子可操作地連接的核酸， 其中所述核酸包括如權(quán)利要求1中所示的序列；和(b)在允許所述多肽表達的條件下表達步驟(a)的核酸，從而產(chǎn)生重組多肽，其中任選地所述方法進一步包括用步驟(a)的核酸轉(zhuǎn)化宿主細胞，隨后表達步驟(a) 的核酸，從而在轉(zhuǎn)化細胞中產(chǎn)生重組多肽。
29.鑒定具有水解酶活性的多肽的方法，其包括下列步驟(a)提供如權(quán)利要求11中所示的多肽；(b)提供水解酶底物；和(C)將所述多肽與步驟(b)的底物接觸并檢測底物量的減少或反應(yīng)產(chǎn)物量的增加，其中底物量的減少或反應(yīng)產(chǎn)物量的增加檢測出具有水解酶活性的多肽，其中任選地所述底物是脂肪酸、三?；视?TAG)、二酰基甘油(DAG)或單?；视?MAG)。
30.增加水解酶多肽的耐熱性或熱穩(wěn)定性的方法，所述方法包括糖基化水解酶多肽，其中所述多肽包括如權(quán)利要求11中所示的多肽的至少30個連續(xù)氨基酸，從而增加所述水解酶多肽的耐熱性或熱穩(wěn)定性，其中任選地所述水解酶比活性在大于約-100°C至約115°C的范圍內(nèi)的溫度下是熱穩(wěn)定的或耐熱的。
31.洗滌劑組合物，其包括如權(quán)利要求11中所示的多肽，其中所述多肽包括水解酶活性，其中任選地所述水解酶是非表面活性水解酶或表面活性水解酶，或者任選地所述水解酶被配制成非水液體組合物、鑄造固體、顆粒形式、微粒形式、壓縮片、凝膠形式、粉末、凝膠、水凝膠、脂質(zhì)體、氣溶膠、糊或漿形式。
32.洗滌物體的方法，其包括下列步驟(a)提供包括具有水解酶活性的多肽的組合物，其中所述多肽包括如權(quán)利要求11中所示的多肽；(b)提供物體；和(c)在所述組合物可洗滌所述物體的條件下，將步驟(a)的多肽與步驟(b)的物體接觸。
33.立體選擇性地水解2-取代酸的酯的外消旋混合物的方法，其包括下列步驟(a)提供如權(quán)利要求11中所示的水解酶，其中所述水解酶是立體選擇性的；(b)提供組合物，其包括2-取代酸的酯的外消旋混合物；和(c)在步驟(b)的所述多肽能選擇性地水解所述酯的條件下，使步驟(a)的多肽與步驟 (b)的組合物接觸，其中任選地所述水解酶被固定化，并且任選地所述2-取代酸包括2-芳氧基取代的酸、R-2- (4-羥基苯氧基)丙酸或2-芳基丙酸，其中任選地所述2-取代酸包括酮洛芬。
34.組合物，其包括如權(quán)利要求11中所示的水解酶、權(quán)利要求35的變體水解酶、或由權(quán)利要求37的方法所產(chǎn)生的酶，其中任選地所述組合物是食品、飼料、食品補充物、飼料補充物、飲食助劑或食品組合物，并且其中任選地所述食品、飼料、食品補充物、飼料補充物、飲食助劑或食品組合物進一步包括包含脂肪或者脂肪和無或極少水解酶的營養(yǎng)基料，或者任選地所述水解酶通過膽汁鹽激活，或者任選地所述食品、飼料、食品補充物、飼料補充物、飲食助劑或食品組合物進一步包括牛奶基嬰兒配方，或者任選地所述水解酶能水解長鏈脂肪酸。
35.產(chǎn)生核酸變體的方法，所述核酸變體編碼具有水解酶活性的多肽，所述方法包括下列步驟(a)提供如權(quán)利要求1中所示的模板核酸；和(b)修飾、缺失或添加所述模板序列中的一個或多個核苷酸，或其組合，產(chǎn)生所述模板核酸的變體，其中任選地所述方法進一步包括表達所述變體核酸以產(chǎn)生變體水解酶多肽，并且任選地所述修飾、添加或缺失通過包括易錯PCR、改組、寡核苷酸定向突變、裝配 PCR、有性PCR誘變、體內(nèi)誘變、盒式誘變、遞歸整體誘變、指數(shù)整體突變、位點特異性誘變、 基因位點飽和誘變^1(GSSMsm)、合成連接重裝配(SLR或GeneReassembly)和其組合在內(nèi)的方法引入，或者所述修飾、添加或缺失通過包括重組、回歸序列重組、硫代磷酸酯修飾的DNA 誘變、含有尿嘧啶模板的誘變、缺口雙重誘變、點錯配修復(fù)誘變、修復(fù)缺陷型宿主株誘變、化學(xué)誘變、放射誘變、缺失誘變、限制選擇誘變、限制純化誘變、人工基因合成、整體誘變、嵌合核酸多聚體生成和其組合在內(nèi)的方法引入。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述方法被迭代重復(fù)直至(a),(i)產(chǎn)生水解酶，其具有與由所述模板核酸編碼的多肽相比改變的或不同的活性或改變的或不同的穩(wěn)定性其中任選地所述變體水解酶多肽是耐熱的，并在暴露于高溫后保持一些活性，或者任選地所述變體水解酶多肽相比由所述模板核酸編碼的水解酶具有增加的糖基化，或者任選地所述變體水解酶多肽在高溫下具有水解酶活性，其中所述由所述模板核酸編碼的水解酶在高溫下不具有活性，( )產(chǎn)生水解酶編碼序列，其具有與所述模板核酸相比改變的密碼子使用， 其中任選地所述方法被迭代重復(fù)直至產(chǎn)生水解酶基因，所述水解酶基因具有比所述模板核酸更高或更低的信息表達水平或穩(wěn)定性，或(iii)產(chǎn)生水解酶，其具有改變的底物特異性或底物優(yōu)先性，其中任選地所述變體水解酶的底物特異性或底物優(yōu)先性包括從油中優(yōu)先或增加的棕櫚酸水解，或者所述變體水解酶的底物特異性或底物優(yōu)先性包括從油中優(yōu)先或增加的硬脂酸水解，或者所述變體水解酶的底物特異性或底物優(yōu)先性包括從油中優(yōu)先或增加的棕櫚酸和硬脂酸水解，或(b),(a)的水解酶，其中所述變體具有至少一個、二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、 二十個、二十一個、二十二個、二十三個、二十四個或更多個或所有的如表3或表4中所示的氨基酸殘基變化(或其等同變化)。
37.制備具有改變的底物特異性或底物優(yōu)先性的酶的方法，其包括(a)提供如權(quán)利要求11中所示的親本水解酶；和(b)對所述親本水解酶產(chǎn)生至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多個氨基酸殘基修飾，其中任選地所述氨基酸殘基修飾對應(yīng)于如表3或表4中所示的對SEQ ID N0:2的氨基酸序列突變(或其等同突變)，從而產(chǎn)生具有改變的底物特異性或底物優(yōu)先性的酶，其中任選地所述改變的底物特異性或底物優(yōu)先性包括優(yōu)先或增加的棕櫚酸水解， 其中任選地所述改變的底物特異性或底物優(yōu)先性包括優(yōu)先或增加的硬脂酸水解， 其中任選地所述改變的底物特異性或底物優(yōu)先性包括優(yōu)先的脂肪酸水解，其中任選地所述脂肪酸是飽和脂肪酸，其中任選地所述脂肪酸是亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸或硬脂酸。
38.脂肪酶，其包括如SEQID NO :2中所示的氨基酸序列但還包括(a)至少一個氨基酸殘基修飾 A48C ；D49R ；D61A ；D61E ；R72E ；R72K ；V83M ；R85Y ；E95K ； E116A ；E116I ；E116L ；E116N ；E116Q ；E116R ；E116T ；E116V ；S133A ；A144I ；E149H ；A150I ； I151G ；I151A ；P162G ；P162K ；V163R ；D164R ；R172H ；R172L ；A225S,或其等同修飾，或其組合；(b)至少一個密碼子修飾(GCG)35 (GCT) ； (GGC) 45 (GGA) ； (GCG) 92 (GCT)、 (GTG)102 (GTT) ； (AGC)108 (AGT) ； (CTG)117 (CTT) ； (CTG)124 (TTG) ； (CGG)126 (AGG)； (GTC) 128 (GTG) ； (AGT) 133 (TCT) ； (TTC) 135 (TTT) ； (GTG) 183 (GTT) ； (ACC) 188 (ACG)，或其等同修飾，或其組合；或(c)，(a)的脂肪酶，其進一步包括至少一個密碼子修飾(GCG)35 (GCT) ； (GGC) 45 (GGA)； (GCG) 92(GCT)、(GTG)102 (GTT) ； (AGC)108 (AGT) ； (CTG)117 (CTT) ； (CTG)124 (TTG)； (CGG)126 (AGG) ； (GTC)128 (GTG) ； (AGT)133 (TCT) ； (TTC)135 (TTT) ； (GTG)183 (GTT)； (ACC) 188 (ACG)，或其等同修飾，或其組合。
39.脂肪酶，其包括如SEQID NO :2中所示的氨基酸序列但還包括至少一個氨基酸殘基修飾 I20L ；V62S ；G77P ；V83C ；D88H ；Y113G ；E116T ；E116G ；H140K ；K146S ；I167S ；L180E ； E194M ；A211Q ；S212Y ；G215C ；G215V ；G215W ；A218H ；A218S ；V223A ；A225M ；A225Q,或其等同修飾，或其組合。
40.權(quán)利要求38或39的脂肪酶，其中所述新脂肪酶的底物特異性或底物優(yōu)先性包括與 “親本”SEQ ID NO :2相比優(yōu)先或增加的脂肪酸水解，其中任選地所述脂肪酸是亞麻酸、亞油酸、油酸、棕櫚酸或硬脂酸。
41.化妝品或面霜，其包括權(quán)利要求38或權(quán)利要求39的脂肪酶或如權(quán)利要求11中所示的多肽。
42.藥品、脂質(zhì)體、藥片、膠囊、制劑或藥物遞送劑，其包括權(quán)利要求38或權(quán)利要求39的脂肪酶或如權(quán)利要求11中所示的酶。
全文摘要
提供的是水解酶，包括脂肪酶、飽和酶、棕櫚酸酶和/或硬脂酸酶，編碼它們的多核苷酸以及制備和使用這些多核苷酸和多肽的方法。另外提供的是多肽，例如酶，其具有水解酶活性，例如，脂肪酶、飽和酶、棕櫚酸酶和/或硬脂酸酶活性，以及制備低飽和或低反式脂肪油的方法，諸如低飽和或低反式脂肪動物或植物油，例如大豆油或油菜油。
文檔編號C07H21/00GK102197043SQ200980142971
公開日2011年9月21日 申請日期2009年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月29日
發(fā)明者N·R·巴頓, A·布埃諾, J·昆卡, T·希契曼, K·A·克蘭, J·里昂, M·L·米勒, M·A·沃爾, C·L·G·戴頓 申請人:維萊尼姆公司