專利名稱：一種從總核糖核酸中有效分離全長、完整信使核糖核酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種從總核糖核酸中有效分離全長、完整信使核糖核酸的方法。
背景技術：
在分子生物學和分子遺傳學的研究中，盡管許多涉及核糖核酸(RNA)的分析研究可以用總RNA樣品來做，但是在諸如構建反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸(cDNA)文庫、檢測稀有信使核糖核酸(mRNA)、S1核酸酶作圖、體外翻譯等的研究中必須采用高質(zhì)量的全長、完整mRNA樣品。因此，mRNA的分離純化是從事分子生物學研究所必須掌握的基本方法之一。
在真核細胞的總RNA中，核糖體核糖核酸(rRNA)、轉(zhuǎn)移核糖核酸(tRNA)等占了95％以上，而mRNA只占1～5％。由于絕大多數(shù)真核細胞的mRNA的3′端均有長度不等的多聚腺苷酸[Poly(A)]尾端，可與寡聚脫氧胸苷[Oligo(dT)]形成氫鍵，因而可以用Oligo(dT)纖維素親和色譜法將mRNA分離純化出來(Sambrook J，et al.Molecular Cloning aLaboratory Manual.2nd ed..New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，)。
用Oligo(dT)纖維素親和色譜法分離mRNA首先是由Aviv和Leder 1972年建立的(Aviv H，Leder P..Purification of biolgically active globin messenger RNA by chromatographyon oligothmisylic acid-cellulose.Proc Natl.Acad.Sci.U.SA.，1972，691408-1412.)，盡管后來對這一基本方法作過一些小修改，但其基本原理和基本操作并沒有改變。
目前mRNA的分離方法有2種一種是直接從生物組織或細胞的裂解物中分離mRNA，另一種是從總RNA樣品中分離mRNA。
mRNA易受核糖核酸酶(RNase)降解，而RNase又極為“頑固”不易滅活。因此要從總RNA樣品中分離出高質(zhì)量的全長、完整mRNA，必須
(1)對所用試劑、溶液、用具等進行嚴格的RNase滅活處理；
(2)在操作中小心避免外源性RNase對試劑、溶液、用具等的污染；
(3)對總RNA樣品中殘留的內(nèi)源性RNase活性作有效的抑制或滅活處理。
目前市場上有各種mRNA分離試劑盒供應，這些試劑盒的主要特點是用微粒狀的Oligo(dT)吸附劑代替纖維狀的Oligo(dT)纖維素，用旋轉(zhuǎn)柱法(Spin-column protocol)取代傳統(tǒng)的柱色譜法(Chromatography column protocol)，并為用戶準備好了分離mRNA用的全套試劑和材料，因而簡化了操作步驟，縮短了分離時間，提高了工作效率。例如Qiagen公司的mRNA分離試劑盒用的吸附劑是將Oligo(dT)連接在聚苯乙烯膠粒上，成小珠狀，商品名為Oligotex。該試劑盒的分離方法是(1)溶解用無RNase的水溶解總RNA；(2)變性加入由pH7.5的2mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸(HCl)和2mmol/L乙二胺四乙酸(ETDA)和1mol/L NaCl和2g/L十二烷基硫酸鈉組成的吸附緩沖液，再加入吸附劑Oligotex，然后于70℃水浴處理3分鐘；(3)吸附從70℃水浴中取出變性樣品，放室溫下靜置10分鐘；(4)洗滌用由pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.15mol/LNaCl組成的洗滌緩沖液洗滌Oligotex 2次；(5)洗脫用預熱至70℃的pH7.5的5mmol/LTris-HCl洗脫緩沖液，洗脫吸附在Oligotex上的mRNA(OligotexTM Handbook Qiagen，July1999.)。
盡管試劑盒給mRNA分離工作帶來許多方便，但仍有不足之處(1)mRNA分離得率不高；(2)價格昂貴，這對于需大批量分離mRNA的實驗室來說是難于承受的。
此外，目前普遍采用的總RNA分離方法，例如TRIZOL法和“一步法”(ChomzynskiP.，Sacchi N..Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal.Biochem.，1987，162156-159.)等，在其分離到的總RNA中常常殘留有內(nèi)源性RNase活性，因而常常造成mRNA分離的失敗。因此，在本技術領域需要一種mRNA得率高、成本低廉并能有效抑制和消除總RNA樣品中可能存在的內(nèi)源性RNase活性，確保能夠分離到全長、完整mRNA的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種mRNA得率高、成本低廉，并能有效抑制和消除總RNA樣品中的內(nèi)源性RNase活性，確保能夠分離到全長、完整mRNA的方法。
本發(fā)明的技術特征在于(1)用十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉作為RNase抑制劑，使用于總RNA溶解和mRNA分離的各個步驟中；(2)在洗滌中使用了兩種加有十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉的緩沖液，比較徹底地洗去了mRNA以外的其他RNA，提高了mRNA的純度，并且有效地除去了可能存在的RNase活性，從而可以使用較廉價的Oligo(dT)纖維素作吸附劑，達到高得率、低成本地從總RNA樣品中成功分離全長、完整的mRNA，實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明一種從總核糖核酸(英文縮寫Total RNA)中有效分離全長、完整信使核糖核酸(英文縮寫mRNA)的方法，包括(1)溶解，(2)變性，(3)吸附，(4)洗滌，(5)洗脫5個步驟，為了更清楚說明本發(fā)明技術特征，下面分別對5個步驟詳細說明。
(1)溶解；把總核糖核酸干燥品溶解在含有0.5～5g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉的無核糖核酸酶的水中，然后測定水中總核糖核酸的濃度，并用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總核糖核酸的質(zhì)量，當觀察到18S核糖體核糖核酸(英文縮寫rRNA)帶和28S rRNA帶清晰，且兩者亮度比為1∶2時，則可進行下一步驟。
所述的十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉的含量最好為1g/L，所述的變性瓊脂糖凝膠電泳檢測可以采用通常使用的方法，例如甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測或乙二醛-二甲基亞砜變性瓊脂糖凝膠電泳檢測法等。
(2)變性把上述檢測合格的總核糖核酸水溶液放在60～70℃水浴中處理3～25分鐘，以破壞核糖核酸的二級結構，使其多聚腺苷酸[英文縮寫Poly(A)]尾端裸露出來，立即置冰浴或冰鹽浴中冷卻至4～10℃。
所述的水浴溫度最好是65℃，處理時間最好是20分鐘，冷卻時間要求不是很嚴格，根據(jù)冷卻浴的溫度而異，只要冷卻至4～10℃即可。
(3)吸附在上述經(jīng)過變性的總核糖核酸溶液中加入與之等體積的吸附緩沖液，然后吸附劑按1mg總核糖核酸3～150mg濕重(最好120mg濕重)的比例加入，用親和色譜法吸附總核糖核酸中的信使核糖核酸。
所述的吸附緩沖液組成為pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(即Tris-HCl)和1～10mmol/L乙二胺四乙酸(即EDTA)和0.8～1.2mol/L氯化鈉(即NaCl)和0.5～5g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉，最好的組成是pH7.5的20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和2mmol/L乙二胺四乙酸和1mol/L氯化鈉和1g/L十二烷基硫酸鈉(即英文縮寫SDS)或十二烷基磺酸鈉。
所述的吸附劑是寡聚脫氧胸苷[英文縮寫Oligo(dT)]共價連接在載體上形成的物質(zhì)，例如寡聚脫氧胸苷連接在纖維素上成纖維狀，即商品名為Oligo(dT)纖維素的物質(zhì)或寡聚脫氧胸苷連接在聚苯乙烯膠粒上，成小珠狀，商品名為Oligotex的物質(zhì)等，所述的吸附劑還可以是具有寡聚脫氧胸苷一樣功能的、能與信使核糖核酸3′端的多聚腺苷酸通過氫鍵結合的物質(zhì)連接在載體上形成的物質(zhì)，例如聚尿苷酸-葡聚糖凝膠，即商品名為Poly(U)-Sephadex的物質(zhì)。
所述的親和色譜法是通常使用的方法，例如批量分離法、旋轉(zhuǎn)柱法、柱色譜法等，也可以批量分離法和旋轉(zhuǎn)柱法聯(lián)用。
所述的吸附可以采用靜置吸附，也可以水平振蕩吸附，例如可采用室溫下以50～80r/min水平振蕩30～60分鐘。
(4)洗滌上述吸附步驟完成后，分離去液相，固相的吸附劑先用平衡緩沖液洗滌，然后再用洗滌緩沖液洗滌，以除去吸附劑上信使核糖核酸以外的其它核糖核酸和可能存在的RNase活性，洗滌后分離去液相。
所述的平衡緩沖液的組成是pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和0.5～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.4～0.6mol/L氯化鈉和0.5～5g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉，最好的組成是pH7.5的10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和1mmol/L乙二胺四乙酸和0.5mol/L氯化鈉和1g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉。
所述的洗滌緩沖液的組成是pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和0.5～10mmo1/L乙二胺四乙酸和0.1～0.2mol/L氯化鈉和0.5～5g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉，最好的組成是pH7.5的10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和1mmol/L乙二胺四乙酸和0.15mol/L氯化鈉和1g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉。
平衡緩沖液與洗滌緩沖液的用量和洗滌次數(shù)沒有嚴格限制，用量少了可多洗幾次，用量多了可少洗幾次，用量多一些，洗滌次數(shù)多一些，也可以，但用量太多或洗滌次數(shù)太多，既浪費溶劑也浪費時間，還可能會造成mRNA的損失。最好按1mg總核糖核酸0.5-1mL平衡緩沖液或洗滌緩沖液的比例，洗滌2～3次。
所述的分離去液相的方法是采用通常的方法，例如離心、過柱、過濾等，根據(jù)所用的親和色譜法不同，可以采用不同的方法，例如采用旋轉(zhuǎn)柱法或批量分離法或批量分離法和旋轉(zhuǎn)柱法結合的方法時可以采用離心分離去液相。
(5)洗脫用室溫至70℃，最好是65℃的洗脫緩沖液把吸附在吸附劑上的信使核糖核酸洗脫出來，然后收集含有信使核糖核酸的洗脫緩沖液。
所述的洗脫緩沖液的組成是pH7.0～8.0的5～20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和0～5mmol/L 乙二胺四乙酸和0～1g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉，最好的組成是pH7.5的10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和1mmol/L乙二胺四乙酸。
洗脫緩沖液的用量和洗脫次數(shù)根據(jù)所用親和色譜而有所不同，對批量分離法和旋轉(zhuǎn)柱法按1mg核糖核酸60～100μL洗脫緩沖液的比例，對柱色譜法用量要多一些。洗脫的次數(shù)最好2～3次。含有信使核糖核酸洗脫液的收集方法采用通常的方法，可以過柱分離，可以離心分離，也因所用色譜法而異。
本發(fā)明所述的總核糖核酸可以來自(1)人體組織或細胞，(2)動物組織或細胞，(3)植物組織或細胞，(4)其它真核生物組織或細胞，通過TRIZOL試劑法或酸性-硫氰酸胍-酚-氯仿法即“一步法”或其它分離方法沉淀得到。
本發(fā)明所用的水和溶液，除三羥甲基氨基甲烷(英文縮寫Tris)溶液外，均需加入焦碳酸二乙脂(英文縮寫DEPC)至1g/L處理過夜，然后高壓滅菌。Tris溶液需用無RNase的Tris、水及容器配制，然后高壓滅菌。
本發(fā)明所用的吸附劑需用0.1mol/L的NaOH懸浮洗滌離心5～7次，然后用平衡緩沖液懸浮洗滌離心5～7次，直至上清液pH為7.5。
上述對本發(fā)明所用水、試劑、容器和吸附劑的要求及處理方法均是本領域?qū)嶒灢僮骰镜囊蠛头椒?，不是本發(fā)明的特有技術。
本發(fā)明一種從總核糖核酸中有效分離全長、完整信使核糖核酸的方法，由于采用了如下的特征技術(1)在總RNA溶解、mRNA吸附、洗滌、洗脫的分離過程中都使用了十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉作為RNase的抑制劑，有效抑制了RNA樣品中可能存在的內(nèi)源性RNase活性，使之不會對mRNA造成破壞；(2)在洗滌過程中采用了兩種加有十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉的緩沖液，首先使用平衡緩沖液，在該溶液條件下，mRNA能牢固保留在吸附劑上，而把mRNA以外的其它RNA洗脫出來，接著使用洗滌緩沖液，把與吸附劑非特異性結合的mRNA以外的其它RNA洗脫出來，這樣提高了mRNA分離的純度，并去除了可能存在的RNase活性，這樣使本發(fā)明能夠采用比較廉價的寡聚脫氧胸苷纖維素，即商品名Oligo(dT)纖維素的吸附劑，實現(xiàn)從總RNA中有效分離出全長、完整的mRNA
本發(fā)明具有如下優(yōu)點
(1)成本低廉分離成本僅為3.4～5.0元/μgmRNA，
(2)mRNA得率高mRNA分離得率穩(wěn)定在20～50μg/mg總RNA，因來自不同組織的總RNA樣品而異；
(3)質(zhì)量保證能有效抑制總RNA樣品中可能存在的內(nèi)源性RNase活性，確保能夠分離到全長、完整的mRNA，且重復性好，所得的mRNA可直接或作適當純化后用于NorthernBlots雜交分析、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)，S1酶切分析、體外翻譯等；
(4)適用范圍廣可用于不同種類的真核mRNA的分離，特別適用于從內(nèi)源性RNase活性高的哺乳動物組織或細胞中提取的總RNA中分離純化mRNA。
本發(fā)明與Qiagen公司的mRNA分離試劑盒的分離效果比較見下表


圖1
小鼠的mRNA電泳圖譜(2μg/泳道)；
M分子質(zhì)量標準；
mRNA來源1.腦，2.心，3.肝，4.肺，5.脾，6.腎，7.睪丸，8骨骼肌。
圖2
小鼠mRNANorthernBlots雜交圖譜(mRNA 2μg/泳道)；
mRNA來源1.腦，2.心，3.肝，4.肺，5.脾，6.腎，7.睪丸，8.骨骼肌。
用DIG標記的β-actin探針(8ng/mL)雜交結果。
圖3
RT-PCR擴增G3PDH基因片段(1.2kb)；
用小鼠肝mRNA為模版，模版用量1.905ng；2.452ng；3.181ng；4.90ng；5.18ng。
圖4
人的mRNA電泳圖譜(2μg/泳道)；
M分子質(zhì)量標準；
mRNA來源1.腦，2.心，3.肝，4.肺，5.脾，6.胃，7.睪丸，8.骨骼肌。
圖5
人mRNA Northern Blots雜交圖譜(mRNA 2μg/泳道)；
mRNA來源1.腦，2.心，3.肝，4.肺，5.脾，6.胃，7.睪丸，8.骨骼肌。
用DIG標記的β-actin探針(8ng/mL)雜交結果。
圖6
RT-PCR擴增p53基因片段(1.0kb)；
人肝mRNA為模版，模版量1.30ng，2.185ng，3.925ng。
具體實施例方式
下面的實施例是舉例說明本發(fā)明，而不是進行限定。
實施例1從小鼠組織分離的總RNA中分離純化mRNA。A所需試劑和材料
1.小鼠8種組織(腦、心、肝、肺、脾、腎、睪丸、骨骼肌)的總RNA(用“一步法”分離)。
2.無RNase水(加有1g/L SDS)。
3.吸附緩沖液pH7.5的20mmol/L Tris-HCl和2mmol/L EDTA和1mol/L NaCl和1g/L SDS。
4.平衡緩沖液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.5mol/L NaCl和1g/L SDS 。
5.洗滌緩沖液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.15mol/L NaCl和1g/L SDS。
6.洗脫緩沖液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA。
說明上述溶液除Tris外，均需加入DEPC(焦碳酸二乙酯)至1g/L處理過夜，然后高壓滅菌。Tris溶液需用無RNase的Tris、水及容器配制，然后高壓滅菌。
7.Oligo(dT)-Cellulose Type 7(Pharmacia公司產(chǎn)品)稱取320毫克Oligo(dT)纖維素，加入0.1mol LNaOH浸泡10～20分鐘，12000r/min離心3分鐘去上清，再用0.1mol/L NaOH懸浮洗滌離心5次，然后用平衡緩沖液懸浮洗滌離心7次，直至上清pH為7.5，最后將Oligo(dT)纖維素懸浮在平衡緩沖液中備用。
8.旋轉(zhuǎn)柱(MSK-100，Axygen)。B實驗操作
1.將沉淀干燥出來的小鼠總RNA溶解在加有SDS的無RNase水中，取樣測定總RNA濃度，并進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢查總RNA的質(zhì)量，如果質(zhì)量合格(18S rRNA和28SrRNA帶清晰，且亮度比為1∶2)則可用于mRNA分離，反之則不可用。
2.取500μL總RNA(濃度2mg/mL)到1.5mL離心管中，放65℃水浴中處理20分鐘使RNA變性，然后立即放冰浴中冷卻10分鐘。
3.加入500μL吸附緩沖液混勻，按1mg總RNA加入120mg濕重的量加入Oligo(dT)纖維素，在室溫下水平振蕩(50～80r/min)60分鐘吸附mRNA。
4.室溫下，12000r/min離心3分鐘去上清。
5.加入0.7mL平衡緩沖液懸浮洗滌Oligo(dT)纖維素，12000r/min離心3分鐘去上清。共洗滌3次。
6.再加入0.7mL洗滌緩沖液懸浮洗滌2次，12000r/min離心3分鐘去上清。
7.用0.7mL洗滌緩沖液將Oligo(dT)纖維素全部洗至旋轉(zhuǎn)柱中，10000r/min離心1分鐘除去洗滌緩沖液。
8.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5mL管中，向柱內(nèi)加入80μL洗脫緩沖液(65℃預熱)，靜置1分鐘，在10000r/min離心30秒，收集洗脫出來的mRNA。
9.再加入80μL洗脫緩沖液(65℃預熱)到柱子內(nèi)，進行第二次洗脫。
10.將2次洗脫出來的mRNA合并，放-70℃保存。
11.結果
a.經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，用本發(fā)明方法分離到的8種小鼠組織mRNA的大小主要集中在0.5～8.0kb(千堿基對)范圍內(nèi)，無降解現(xiàn)象(見圖1)。
b.用DIG標記的β-actin探針進行Northern Blots雜交分析，結果顯示β-actm雜交帶清晰銳利(見圖2)，說明本發(fā)明分離到的mRNA是全長、完整的。
c.用分離到的小鼠肝mRNA作為模版進行G3PDH基因的RT-PCR擴增獲得良好結果(見圖3)，說明本發(fā)明分離出的mRNA完整、質(zhì)量高。
實施例2從人體組織分離的總RNA中分離純化mRNA。A所需試劑和材料
1.人體8種組織(腦、心、肝、肺、脾、胃、睪丸、骨骼肌)的總RNA(用TRIZOL試劑分離)。
2.無RNase水(加有1g/L SDS)。
3.吸附緩沖液pH7.5的20mmol/L Tris-HCl和2mmol/L EDTA和1mol/LNaCl和1g/L SDS。
4.平衡緩沖液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.5mol/L NaCl和1g/L SDS。
5.洗滌緩沖液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.15mol/L NaCl和1g/L SDS。
6.洗脫緩沖液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA。
說明上述溶液除Tris外，均需加入DEPC(焦碳酸二乙酯)至1g/L處理過夜，然后高壓滅菌。Tris溶液需用無RNase的Tris、水及容器配制，然后高壓滅菌。
7.Oligo(dT)-Cellulose Type 7(Pharmacia公司的產(chǎn)品)稱取320毫克Oligo(dT)纖維素，加入0.1mol/L NaOH浸泡10～20分鐘，12000r/min離心3分鐘去上清，再用0.1mol/L NaOH懸浮洗滌離心5次，然后用平衡緩沖液懸浮洗滌離心7次，直至上清pH為7.5，最后將Oligo(dT)纖維素懸浮在平衡緩沖液中備用。
8.旋轉(zhuǎn)柱(MSK-100，Axygen)。B實驗操作
1.將沉淀干燥出來的人體總RNA溶解在加有SDS的無RNase水中，取樣測定總RNA濃度，并進行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。如果總RNA質(zhì)量合格(18S rRNA和28S rRNA帶清晰，且亮度比為1∶2)則可用于mRNA分離，反之則不可用。
2.取500μL總RNA(濃度2mg/mL)到1.5mL離心管中，放65℃水浴中處理20分鐘使RNA變性，然后立即放冰浴中冷卻10分鐘。
3.加入500μL吸附緩沖液混勻，按1mg總RNA加入120mg濕重的量加入Oligo(dT)纖維素，在室溫下水平振蕩(50～80r/min)60分鐘吸附mRNA。
4.室溫下，12000r/mim離心3分鐘去上清。
5.加入0.7mL平衡緩沖液懸浮洗滌Oligo(dT)纖維素，12000r/min離心3分鐘去上清。共洗滌3次。
6.再加入0.7mL洗滌緩沖液懸浮洗滌2次，12000r/min離心3分鐘去上清。
7.用0.7mL洗滌緩沖液將Oligo(dT)纖維素全部洗至旋轉(zhuǎn)柱中，10000r/min離心1分鐘除去洗滌緩沖液。
8.將旋轉(zhuǎn)柱轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5mL管中，加入80μL洗脫緩沖液(65℃預熱)，靜置1分鐘，在10000r/min離心30秒，收集洗脫出來的mRNA。
9.再加入80μL洗脫緩沖液(65℃預熱)到柱子內(nèi)，進行第二次洗脫。
10.將2次洗脫出來的mRNA合并，放-70℃保存。
11.結果
a.經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，用本發(fā)明方法分離到的8種人體組織mRNA的大小主要集中在0.5～8.0kb范圍內(nèi)，無降解現(xiàn)象(見圖4)。
b.用DIG標記的β-actin探針進行Northern Blots雜交分析，結果顯示β-actin雜交帶清晰銳利(見圖5)，說明分離到的mRNA是全長、完整的。
c.用分離到的人肝mRNA作為模版進行p53基因的RT-PCR擴增獲得良好結果(見圖6)，說明本發(fā)明分離出的mRNA完整、質(zhì)量高。
權利要求
1、一種從總核糖核酸中有效分離全長、完整信使核糖核酸的方法，包括5個步驟
(1)溶解把總核糖核酸干燥品溶解在含0.5～5g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉的無核糖核酸酶的水中，然后測定水中總核糖核酸濃度，并用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總核糖核酸的質(zhì)量，當觀察到18S核糖體核糖核酸帶和28S核糖體核糖核酸帶清晰，且兩者亮度比為1∶2時，則可進行下一步驟；
(2)變性把上述檢測合格的總核糖核酸水溶液放入60～70℃水浴中處理3～25分鐘，以破壞核糖核酸的二級結構，使其多聚腺苷酸尾端裸露出來，立即置冰浴或冰鹽浴中冷卻至4～10℃；
(3)吸附在上述經(jīng)過變性的總核糖核酸溶液中加入與之等體積的吸附緩沖液，然后吸附劑按1mg總核糖核酸3～150mg濕重的比例加入，用親和色譜法吸附總核糖核酸中的信使核糖核酸；所述的吸附緩沖液組成為pH70～8.0的5～100mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和1～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.8～1.2mol/L氯化鈉和0.5～5g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉，所述的吸附劑是寡聚脫氧胸苷，即英文縮寫為Oligo(dT)的物質(zhì)，共價連接在載體上形成的物質(zhì)或具有寡聚脫氧胸苷一樣功能的、能與信使核糖核酸3′端的多聚腺苷酸通過氫鍵結合的物質(zhì)連接在載體上形成的物質(zhì)；
(4)洗滌上述吸附步驟完成后，分離去液相，固相的吸附劑先用平衡緩沖液洗滌，然后再用洗滌緩沖液洗滌，以除去吸附劑上信使核糖核酸以外的其他核糖核酸和可能存在的核糖核酸酶活性，洗滌后分離去液相；所述的平衡緩沖液的組成是pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和0.5～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.4～0.6mol/L氯化鈉和0.5～5g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉；所述的洗滌緩沖液的組成是pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和0.5～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.1～0.2mol/L氯化鈉和0.5～5g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉；
(5)洗脫用室溫～70℃的洗脫緩沖液把吸附在吸附劑上的信使核糖核酸洗脫出來，然后收集含有信使核糖核酸的洗脫緩沖液；所述的洗脫緩沖液的組成是pH7.0～8.0的5～20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和0～5mmol/L乙二胺四乙酸和0～1g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉。
2、根椐權利要求1所述的一種從總核糖核酸中有效分離全長、完整信使核糖核酸的方法，其特征在于
(1)所述的溶解步驟中總核糖核酸溶解在含1g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉的無核糖核酸酶的水中；
(2)所述的變性步驟中總核糖核酸水溶液放入65℃水浴中處理20)分鐘；
(3)所述的吸附步驟中
①吸附劑按1mg總核糖核酸120mg濕重的比例加入；
②所述的親和色譜法是指批量分離法和或旋轉(zhuǎn)柱法或柱色譜法；
③所述的吸附緩沖液組成是pH7.5的20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和2mmol/L乙二胺四乙酸和1mol/L氯化鈉和1g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉；
④所述的吸附劑是寡聚脫氧胸苷-纖維素，即商品名為Oligo(dT)纖維素的物質(zhì)，或是寡聚脫氧胸苷連接在聚苯乙烯膠粒上，即商品名為Oligotex的物質(zhì)，或是寡聚尿苷酸-葡聚糖凝膠，即商品名為Poly(U)-Sephadex的物質(zhì)；
⑤所述的吸附采用室溫下以50～80r/min水平振蕩30～60分鐘的水平振蕩吸附；
(4)所述的洗滌步驟中，所述的平衡緩沖液按1mg總核糖核酸0.5～1mL的比例加入，其組成是pH7.5的10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和1mmol/L乙二胺四乙酸和0.5mol/L氯化鈉和1g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉；所述的洗滌緩沖液按1mg總核糖核酸0.5～1mL的比例加入，其組成是pH7.5的10mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和1mmol/L 乙二胺四乙酸和0.15mol/L氯化鈉和1g/L十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉；
(5)所述的洗脫步驟中，用65℃的洗脫緩沖液把吸附在吸附劑上的信使核糖核酸洗脫出來；所述的洗脫緩沖液組成是pH7.5的10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸和1mmol/L乙二胺四乙酸。
3、根椐權利要求1所述的一種從總核糖核酸中有效分離全長、完整信使核糖核酸的方法，其特征在于
(1)所述的親和色譜法是批量分離法和或旋轉(zhuǎn)柱法或柱色譜法；
(2)所述的吸附劑是寡聚脫氧胸苷-纖維素，即商品名為Oligo(dT)纖維素的物質(zhì)，或是寡聚脫氧胸苷連接在聚苯乙烯膠粒上，即商品名為Oligotex的物質(zhì)，或是寡聚尿苷酸-葡聚糖凝膠，即商品名為Poly(U)-Sephadex的物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從總核糖核酸(Total RNA)中有效分離全長、完整信使核糖核酸(mRNA)的方法。其特征在于用十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉作為核糖核酸酶(RNase)抑制劑，在溶解總RNA的溶液中和在分離mRNA用的溶液系統(tǒng)中均加入十二烷基硫酸鈉或十二烷基磺酸鈉以防止RNase對mRNA的降解，并通過兩種緩沖液洗滌以除去mRNA以外的其它RNA和可能存在的RNase活性，從而有效地分離出全長、完整的mRNA分子。本發(fā)明方法成本低廉、mRNA得率高，特別適用于從內(nèi)源性RNase活性高的哺乳動物細胞或組織中抽提的總RNA中分離純化mRNA。
文檔編號C07H1/06GK1475493SQ0213456
公開日2004年2月18日 申請日期2002年8月16日 優(yōu)先權日2002年8月16日
發(fā)明者葉志華, 梁培華, 郭俊, 張向陽, 丁野青, 丁達明, 梁建慶, 姚志海, 杜綱國, 高冬梅 申請人:深圳市君軒生物技術有限公司, 廣東省微生物研究所