專利名稱：華支睪吸蟲乳酸脫氫酶，其編碼核酸及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明描述了一種新的多肽——華支睪吸蟲乳酸脫氫酶，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的應用。
背景技術(shù)：
華支睪吸蟲是人畜共患病，成蟲寄生在肝膽管內(nèi)，成蟲會破壞膽道上皮和粘膜下血管，并產(chǎn)生分泌排泄抗原，引起膽管和膽管周圍的炎癥反應，導致膽管局限性擴張和膽管上皮細胞增生。一些抗原成分還能夠通過膽管上皮細胞進入肝組織，引起炎癥反應和肝功能損傷。長期的嚴重感染會導致纖維組織增生和肝細胞的萎縮變性，甚至引起癌變、腹水和肝硬化。華支睪吸蟲占據(jù)膽管，使得膽汁流出不暢，易合并細菌感染和出現(xiàn)膽石癥。
華支睪吸蟲病的防治主要依靠綜合防治措施。在流行區(qū)強化對人群的普查普治，并加強疫苗的研制，以減少傳染源和保護易感人群。目前，華支睪吸蟲病防治研究的重點集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標、致病的分子機理研究。
脫氫酶類是生物體內(nèi)氧化還原反應中重要的催化劑之一，在生物體內(nèi)的氧化產(chǎn)能、解毒以及某些生理活動(如Cori循環(huán))中起著很重要的作用，在生產(chǎn)實踐中也應用廣泛，因而，對脫氫酶類的研究相當多。其中，L2乳酸脫氫酶作為具有多形性的同工酶的典型代表，在酶的生物學研究、臨床檢驗以及病理與治療機制的研究中意義重大，因此，研究其催化反應的微觀機理具有重要的理論價值和實際意義。
乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)主要存在于動物的肌肉中。該酶的分子中含有四個亞基(subun it)，分子量130000～145000。LDH實際上是一個具有五種分子形態(tài)的同工酶族，其中有兩種形態(tài)分別由同一種亞基組成，這兩種LDH是主要分布于心肌中的H4和主分布于骨骼肌中的M4；另三種LDH分別由混合亞基組成，它們分別為H3M、H2M 2和HM3。在任何形態(tài)的LDH中，每一個H或M亞基均含一個具有催化功能的活性中心[Laidler K.J，Bunting P.S.The chemical kinetics of enzyme action.LondonOxfordUniversity Press，1973342.]。對于混合亞基的四聚體，如H3M，它的催化動力學性質(zhì)與3∶1的H4、M4的混合物是相同的，這表明不同種類LDH分子中相同亞基的活性中心非常相似，并且每個亞基上的催化反應之間沒有顯著的相互作用[Anderson V.E，LaReau R.D.J.Chem.Soc，1998，1103695-3697]。
E.Silverstein等[Laidler K.J，Bunting P.S.The chemical kinetics of enzymeaction.LondonOxford University Press，1973342.]證實該反應按如下機理進行，即酶(E)總是首先與輔酶(NAD+)結(jié)合為二元復合物。與此同時，酶的構(gòu)象發(fā)生改變，然后再結(jié)合底物L2乳酸(S)進行反應。反應時先釋放出產(chǎn)物丙酮酸(P)，然后酶與還原輔酶(NADH)分離，反應中生成的H+首先轉(zhuǎn)移到酶的殘基(His2195)上，反應后再由酶釋放出去，完成催化反應。
1994年Ranganathan等[Ranganathan S，Gready J.E.J.Chem.Soc Faraday Trans，1994，90(14)2047-2056.]在研究LDH催化丙酮酸還原反應的過渡態(tài)及其中的電荷分布時，發(fā)現(xiàn)在所有的過渡態(tài)中，底物22位羰基均呈質(zhì)子化態(tài)，而HR尚未與底物成鍵，這說明反應應該是H+轉(zhuǎn)移先于H-轉(zhuǎn)移的分步機理，且其計算結(jié)果顯示限速步驟是H-轉(zhuǎn)移這一步。后來，A ndrés等[Andros J，Moliner V，Krechl J，et.al.J.Chem.Soc Perkin Trans2，19951551-1558.]再次使用PM 3和AM 1兩種方法對過渡態(tài)結(jié)構(gòu)進行研究，所得結(jié)論完全一樣，并且他們所得躍遷矢量(transition vector)和反應路徑表明H+和H-的轉(zhuǎn)移在動力學上同步(kineticallycoupled)，但在動態(tài)學上不同步(dynamicallyuncoupled)，亦即，H+和H-應該是同時向底物移動的，但是當H+已經(jīng)與底物成鍵時，H-卻仍在反應途中。不久前，Ranganathan等使用QM^MM計算(quan tum m echan ical and mo lecu lar mechan icalcalcu lat ion s)方法又對反應的勢能面進行了探討，結(jié)果雖然支持分步機理，但卻是H-在H+之前轉(zhuǎn)移到底物上。在他們的計算中，QM計算部分仍然是采用半經(jīng)驗的AM1方法。
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，從華支睪吸蟲中分離了編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶DNA，并表達純化了華支睪吸蟲乳酸脫氫酶，并進一步揭示了基于此多核苷酸與多肽的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供分離的新的多肽——華支睪吸蟲乳酸脫氫酶以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供針對本發(fā)明的多肽——華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抗體。
本發(fā)明的另一個目的是提供了抑制本發(fā)明多肽表達的多核苷酸。
本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明的多肽應用于篩選華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抑制劑；或者用于肽指紋圖譜鑒定。
本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明的核酸分子作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列的應用。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測華支睪吸蟲的試劑盒，其含有特異性檢測華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的引物、抗體或多肽本身。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于預防華支睪吸蟲病的疫苗，其含有華支睪吸蟲乳酸脫氫酶或編碼該酶的多核苷酸的真核表達載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于治療華支睪吸蟲病的藥物組合物，其含有用本發(fā)明多肽篩選出的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抑制劑。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明涉及一種分離的多肽，該多肽是華支睪吸蟲源的，它包含具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段或衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。更佳地，該多肽不含信號肽序列。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明還涉及一種分離的多核苷酸，它包含選自下組的一種核苷酸序列或其變體(a)編碼具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸；更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中211-1194位的序列；和(b)具有SEQ ID NO1中1-1358位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明還涉及一種能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明的第四方面，提供了抑制本發(fā)明多肽表達的多核苷酸。
在本發(fā)明的第五方面，提供本發(fā)明的多肽和編碼序列的用途。例如，利用多肽應用于篩選華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抑制劑，所篩選出的抑制劑以安全有效劑量與藥物上可接受的賦型劑組成治療華支睪吸蟲病的藥物組合物；或者用于肽指紋圖譜鑒定。利用編碼序列或其片段作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列的應用。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種檢測華支睪吸蟲的試劑盒，其含有特異性檢測華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的引物、抗體或多肽本身。
在本發(fā)明的第七方面，提供一種用于預防華支睪吸蟲病的疫苗，其含有華支睪吸蟲乳酸脫氫酶或編碼該酶的多核苷酸的真核表達載體。
在本發(fā)明的第八方面，提供一種用于治療華支睪吸蟲病的藥物組合物，其含有用本發(fā)明多肽篩選出的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抑制劑。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，例如，利用本發(fā)明可以涉及一種含有本發(fā)明多核苷酸的載體，特別是表達載體；一種用該載體遺傳工程化的宿主細胞，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染的宿主細胞；一種包括培養(yǎng)所述宿主細胞和回收表達產(chǎn)物的制備本發(fā)明多肽的方法。
本說明書和權(quán)利要求書中使用的下列術(shù)語除非特別說明具有如下的含義“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因組或合成的DNA或RNA，它們可以是單鏈或雙鏈的，代表有義鏈或反義鏈。類似地，術(shù)語“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列及其片段或部分。當本發(fā)明中的“氨基酸序列”涉及一種天然存在的蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列時，這種“多肽”或“蛋白質(zhì)”不意味著將氨基酸序列限制為與所述蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整的天然氨基酸。
蛋白質(zhì)或多核苷酸“變體”是指一種具有一個或多個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的多核苷酸序列。所述改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替換。變體可具有“保守性”改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸。變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。
“生物活性”是指具有天然分子的結(jié)構(gòu)、調(diào)控或生物化學功能的蛋白質(zhì)。類似地，術(shù)語“免疫學活性”是指天然的、重組的或合成蛋白質(zhì)及其片段在合適的動物或細胞中誘導特定免疫反應以及與特異性抗體結(jié)合的能力。
“抑制物”是指當與華支睪吸蟲乳酸脫氫酶結(jié)合時，一種可封閉或調(diào)節(jié)華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的生物學活性的分子。抑制物可以包括蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或任何其它可結(jié)合華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的分子。
“調(diào)節(jié)”是指華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的功能發(fā)生改變，包括蛋白質(zhì)活性的升高或降低、結(jié)合特性的改變及華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的任何其它生物學性質(zhì)、功能或免疫性質(zhì)的改變。
″基本上純″是指基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化華支睪吸蟲乳酸脫氫酶?；旧霞兊娜A支睪吸蟲乳酸脫氫酶在非還原性聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。華支睪吸蟲乳酸脫氫酶多肽的純度可用氨基酸序列分析。
“互補的”或“互補”是指在允許的鹽濃度和溫度條件下通過堿基配對的多核苷酸天然結(jié)合。例如，序列“C-T-G-A”可與互補的序列“G-A-C-T”結(jié)合。兩個單鏈分子之間的互補可以是部分的或全部的。核酸鏈之間的互補程度對于核酸鏈之間雜交的效率及強度有明顯影響。
“同源性”是指互補的程度，可以是部分同源或完全同源?！安糠滞础笔侵敢环N部分互補的序列，其至少可部分抑制完全互補的序列與靶核酸的雜交。這種雜交的抑制可通過在嚴格性程度降低的條件下進行雜交(Southern印跡或Northern印跡等)來檢測?；旧贤吹男蛄谢螂s交探針可競爭和抑制完全同源的序列與靶序列在的嚴格性程度降低的條件下的結(jié)合。這并不意味嚴格性程度降低的條件允許非特異性結(jié)合，因為嚴格性程度降低的條件要求兩條序列相互的結(jié)合為特異性或選擇性相互作用。
“反義”是指與特定的DNA或RNA序列互補的核苷酸序列?！胺戳x鏈”是指與“有義鏈”互補的核酸鏈。
“衍生物”是指HFP或編碼其的核酸的化學修飾物。這種化學修飾物可以是用烷基、?；虬被鎿Q氫原子。核酸衍生物可編碼保留天然分子的主要生物學特性的多肽。
“抗體”是指完整的抗體分子及其片段，如Fa、F(ab’)2及Fv，其能特異性結(jié)合華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抗原決定簇。
“分離的”一詞指將物質(zhì)從它原來的環(huán)境(例如，若是自然產(chǎn)生的就指其天然環(huán)境)之中移出。比如說，一個自然產(chǎn)生的多核苷酸或多肽存在于活動物中就是沒有被分離出來，但同樣的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系統(tǒng)中與之共存的物質(zhì)分開就是分離的。這樣的多核苷酸可能是某一載體的一部分，也可能這樣的多核苷酸或多肽是某一組合物的一部分。既然載體或組合物不是它天然環(huán)境的成分，它們?nèi)匀皇欠蛛x的。
如本發(fā)明所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶”是指華支睪吸蟲乳酸脫氫酶基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標準的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化華支睪吸蟲乳酸脫氫酶?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。華支睪吸蟲乳酸脫氫酶多肽的純度能用氨基酸序列分析。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種新的多肽——華支睪吸蟲乳酸脫氫酶，其基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的片段、衍生物和類似物。如本發(fā)明所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明多肽的片段、衍生物或類似物可以是(I)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選的是保守氨基酸殘基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遺傳密碼子編碼的；或者(II)這樣一種，其中一個或多個氨基酸殘基上的某個基團被其它基團取代包含取代基；或者(III)這樣一種，其中成熟多肽與另一種化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)這樣一種，其中附加的氨基酸序列融合進成熟多肽而形成的多肽序列(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列)通過本文的闡述，這樣的片段、衍生物和類似物被認為在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了分離的多核苷酸，基本由編碼具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸是從華支睪系成蟲的全長cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。它包含的多核苷酸序列全長為1358個堿基，其開放讀框(211-1194)編碼了328個氨基酸。根據(jù)氨基酸序列同源比較發(fā)現(xiàn)，此多肽與Anguilla rostrata乳酸脫氫酶有76％的同源性，可推斷出該蛋白就是華支睪吸蟲乳酸脫氫酶。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本發(fā)明所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)或多肽，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”是指包括編碼此多肽的多核苷酸和包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加用變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在95％以上，更好是97％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ IDNO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與以上所描述的序列雜交的核酸片段。如本發(fā)明所用，”核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少20-30個核苷酸，更好是至少50-60個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的擴增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的多核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫雜交以檢出同源的多核苷酸序列，2)表達文庫的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段，3)表達序列標簽(EST)技術(shù)分離的多核苷酸片段。
本發(fā)明的DNA片段序列也能用下列方法獲得1)從基因組DNA分離雙鏈DNA序列；2)化學合成DNA序列以獲得所述多肽的雙鏈DNA。
上述提到的方法中，分離基因組DNA最不常用。DNA序列的直接化學合成是經(jīng)常選用的方法。更經(jīng)常選用的方法是cDNA序列的分離。分離感興趣的cDNA的標準方法是從高表達該基因的供體細胞分離mRNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，形成質(zhì)?；蚴删w全長cDNA文庫。提取mRNA的方法已有多種成熟的技術(shù)，試劑盒也可從商業(yè)途徑獲得(Qiagene)。而構(gòu)建cDNA文庫也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。當結(jié)合使用聚合酶反應技術(shù)時，即使極少的表達產(chǎn)物也能克隆。
可用常規(guī)方法從這些cDNA文庫中篩選本發(fā)明的基因。這些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(2)標志基因功能的出現(xiàn)或喪失；(3)測定華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄本的水平；(4)通過免疫學技術(shù)或測定生物學活性，來檢測基因表達的蛋白產(chǎn)物。上述方法可單用，也可多種方法聯(lián)合應用。
在第(1)種方法中，雜交所用的探針是與本發(fā)明的多核苷酸的任何一部分同源，其長度至少10個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸。此外，探針的長度通常在2000個核苷酸之內(nèi)，較佳的為1000個核苷酸之內(nèi)。此處所用的探針通常是在本發(fā)明的基因序列信息的基礎上化學合成的DNA序列。本發(fā)明的基因本身或者片段當然可以用作探針。DNA探針的標記可用放射性同位素，熒光素或酶(如堿性磷酸酶)等。
在第(4)種方法中，檢測華支睪吸蟲乳酸脫氫酶基因表達的蛋白產(chǎn)物可用免疫學技術(shù)如Western印跡法，放射免疫沉淀法，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。
應用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的多核苷酸序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段等的多核苷酸序列可用常規(guī)方法如雙脫氧鏈終止法測定。這類多核苷酸序列測定也可用商業(yè)測序試劑盒等。為了獲得全長的cDNA序列，測序需反復進行。有時需要測定多個克隆的cDNA序列，才能拼接成全長的cDNA序列。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或直接用華支睪吸蟲乳酸脫氫酶編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
本發(fā)明中，編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的多核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7啟動子的表達載體；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體?？傊灰茉谒拗黧w內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用于構(gòu)建重組表達載體。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起始點、啟動子、標記基因和翻譯調(diào)控元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體的PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細胞或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強子序列將會使其在高等真核細胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強。增強子是DNA表達的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉(zhuǎn)錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側(cè)的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側(cè)的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性等。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體/轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動子、增強子等)和選擇性標記基因。
本發(fā)明中，編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導入宿主細胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”指原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細菌細胞如鼠傷寒沙門氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果蠅S2或Sf9；動物細胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細胞等。
用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知?？晒┻x擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達或生產(chǎn)重組的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼 華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了用多肽，及其片段、衍生物作為抗原以生產(chǎn)抗體的方法。這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還提供了針對華支睪吸蟲乳酸脫氫酶抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫產(chǎn)生的片段。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用華支睪吸蟲乳酸脫氫酶直接注射免疫動物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。制備華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的單克隆抗體的技術(shù)包括但不限于雜交瘤技術(shù)，三瘤技術(shù)，人B-細胞雜交瘤技術(shù)，EBV-雜交瘤技術(shù)等。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)也可用于生產(chǎn)抗華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的單鏈抗體。
抗華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抗體可用于免疫組織化學技術(shù)中，檢測活檢標本中的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶在蟲體中的分布和分泌排泄。
與華支睪吸蟲乳酸脫氫酶結(jié)合的單克隆抗體也可用放射性同位素標記，注入體內(nèi)可跟蹤其位置和分布。本發(fā)明中的抗體可用于預防或阻斷華支睪吸蟲乳酸脫氫酶引起的病理改變。
在本發(fā)明的第四方面，抑制華支睪吸蟲乳酸脫氫酶mRNA的寡核苷酸(包括反義RNA、反義DNA、干擾RNA)以及核酶也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內(nèi)切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術(shù)獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術(shù)已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩(wěn)定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側(cè)的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。干擾RNA(iRNA)是一類能在體內(nèi)特異降解靶基因mRNA從而使該基因沉默的一小段雙鏈RNA分子，其序列一般是mRNA5’下游70bp以后的一段互補序列。通過將該段序列及其反向序列同時克隆到同一個真核表達載體中，轉(zhuǎn)染華支睪蟲體或組織細胞，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄出來的RNA形成dsRNA，能特異降解靶基因的iRNA。mRNA沉默技術(shù)可用于治療由于華支睪吸蟲谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶的無表達或異常/無活性表達所致的細胞增殖、發(fā)育或代謝異常，從而確認基因(蛋白質(zhì)的生理功能)。
在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明的多肽以及該多肽的抑制劑可直接用于華支睪吸蟲病的診斷和治療。
具體就本發(fā)明的新的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶而言，該蛋白是華支睪吸蟲糖類代謝，尤其是厭氧代謝中的關(guān)鍵酶，對主要依賴厭氧代謝產(chǎn)能的華支睪吸蟲來說，其意義猶為重要。而且華支睪吸蟲能分泌乳酸脫氫酶到體外，進入宿主機體，誘發(fā)免疫應答，可以作為一個潛在的靶抗原，用于華支睪吸蟲病的免疫診斷。
本發(fā)明也提供了篩選化合物以鑒定阻遏華支睪吸蟲乳酸脫氫酶活性的藥劑的方法，乳酸脫氫酶在華支睪吸蟲中無處不在，在蛋白質(zhì)代謝的早期和晚期都發(fā)揮作用，其抑制劑能有效干擾華支睪吸蟲蛋白質(zhì)代謝，導致其代謝紊亂而死亡，因此，它可以作為一個重要的藥物靶標。華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的拮抗劑包括篩選出的抗體、化合物、受體缺失物和類似物等。華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的拮抗劑可以與華支睪吸蟲乳酸脫氫酶結(jié)合并消除其功能，或是抑制乳酸脫氫酶產(chǎn)生，或是與乳酸脫氫酶的活性位點結(jié)合使該多肽不能發(fā)揮生物學功能。
在篩選作為抑制劑的化合物時，可以將華支睪吸蟲乳酸脫氫酶加入生物分析測定中，通過測定化合物對華支睪吸蟲乳酸脫氫酶和其底物之間相互作用的影響來確定化合物是否是抑制劑。能與華支睪吸蟲乳酸脫氫酶結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，一般應對華支睪吸蟲乳酸脫氫酶分子進行標記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測華支睪吸蟲乳酸脫氫酶水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，包括酶比活性的測定和免疫學測定。試驗中所檢測的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶水平，可以用作華支睪吸蟲病感染程度(蟲負)的一個指標。
本發(fā)明的多肽還可用作肽譜分析，例如，多肽可用物理的、化學或酶進行特異性切割，并進行一維或二維或三維的凝膠電泳分析，更好的是進行質(zhì)譜分析。
編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的多核苷酸也可用于多種治療目的。重組的基因治療載體可設計用于表達變異的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶，以抑制內(nèi)源性的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶活性。例如，一種變異的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶可以是縮短的、缺失了催化中心的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶，雖可與下游的底物結(jié)合，但缺乏乳酸脫氫酶活性?；蛘吒鶕?jù)該基因的多核苷酸序列設計一段小的反義核酸，干擾該基因的轉(zhuǎn)錄過程和轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程，同樣可起到華支睪吸蟲蛋白質(zhì)代謝和其它生理功能的作用。這種抑制內(nèi)源性重組乳酸脫氫酶活性的質(zhì)粒，可以以適當?shù)膭┬秃头绞竭M入肝膽道中，被華支睪吸蟲所吞食，進入其合胞體中而起作用。
編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的多核苷酸可用于華支睪吸蟲病的診斷。編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的多核苷酸可用于檢測華支睪吸蟲的存在和乳酸脫氫酶的表達水平。如根據(jù)該多核苷酸序列設計引物，用多聚酶鏈式反應(PCR)從糞便標本的蟲卵中提取核酸模板進行基因擴增，根據(jù)擴增的多核苷酸片段的大小是否符合預定值來確定華支睪吸蟲的感染。該技術(shù)高度敏感特異，能夠克服常規(guī)形態(tài)學檢測方法容易發(fā)生的漏檢和誤檢?；驒z測的方法不僅可以檢測是否存在華支睪吸蟲的感染，而且還能對華支睪吸蟲進行分型，確定其亞種或株。編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的DNA序列還可用于對活檢標本進行雜交以判斷華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的表達狀況。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(Microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用華支睪吸蟲乳酸脫氫酶特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
本發(fā)明的序列對染色體鑒定也是有價值的。該序列會特異性地針對某條華支睪染色體具體位置且并可以與其雜交。目前，需要鑒定染色體上的各基因的具體位點。現(xiàn)在，只有很少的基于實際序列數(shù)據(jù)(重復多態(tài)性)的染色體標記物可用于標記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明，為了將這些序列與疾病相關(guān)基因相關(guān)聯(lián)，其重要的第一步就是將這些DNA序列定位于染色體上。
簡而言之，根據(jù)cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條華支睪染色體的體細胞雜合細胞。只有那些含有相應于引物的人基因的雜合細胞會產(chǎn)生擴增的片段。
體細胞雜合細胞的PCR定位法，是將DNA定位到具體染色體的快捷方法。使用本發(fā)明的寡核苷酸引物，通過類似方法，可利用一組來自特定染色體的片段或大量基因組克隆而實現(xiàn)亞定位?？捎糜谌旧w定位的其它類似策略包括原位雜交、用標記的流式分選的染色體預篩選和雜交預選，從而構(gòu)建染色體特異的cDNA庫。
將cDNA克隆與中期染色體進行熒光原位雜交(FISH)，可以在一個步驟中精確地進行染色體定位。一旦序列被定位到準確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。
在本發(fā)明的第六方面，華支睪吸蟲病的診斷除了除了常規(guī)的病原生物學檢查，主要的方式是使用免疫學診斷試劑盒。主要有兩類酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA)和快速免疫膠體金試劑盒(ICT)。華支睪吸蟲病的診斷即可通過檢測血清或尿液中的循環(huán)抗原判斷現(xiàn)癥感染，也可通過檢測血清或唾液中的特異性抗體來快速篩查。由于華支睪吸蟲主要是寄生在組織外，所產(chǎn)生的抗原成分絕大部分隨著膽汁排入腸道，只有感染度高，蟲體對膽管阻塞嚴重，引起膽管上皮嚴重破損時，其分泌排泄物才能進入肝臟和外周血中。進入外周血中的循環(huán)抗原大部分被抗體所中和，只有少量游離的循環(huán)抗原可被檢測到。因此，檢測循環(huán)抗原的方法雖然能反映現(xiàn)癥感染，但是敏感性較低。目前，臨床用于輔助診斷的主要是抗體檢測試劑盒。檢測抗體的方法分為兩種，一是用標記二抗作為檢測試劑與被包被在反應板或反應膜上的抗原所捕獲得抗體相結(jié)合，一種是用標記的抗原作為檢測試劑。二抗作為檢測試劑，一般只能檢測一種抗體，而且非特異性結(jié)合比較高；標記抗原作為檢測試劑，能檢測多種抗體，特異性更高。
本發(fā)明可以利用純化的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶制備ELISA檢測試劑盒，也可以利用純化的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶制備膠體金免疫層析檢測試劑盒。
在本發(fā)明的第七方面，華支睪吸蟲是組織外寄生蟲，免疫系統(tǒng)難以直接與其作用。它產(chǎn)生的抗原刺激機體粘膜系統(tǒng)產(chǎn)生粘膜免疫反應是其主要的保護性反應。粘膜免疫產(chǎn)生的分泌型IgA，可以阻止分泌排泄抗原通過膽管上皮進入肝細胞，從而降低這些抗原成分對機體的毒害作用，而不是直接對蟲體起到攻擊殺傷的作用。因此，華支睪吸蟲的疫苗以口服型疫苗為主，將重組乳酸脫氫酶蛋白與卵磷脂1∶10混合，加入10倍的生理鹽水溶液，超聲震蕩，制成脂質(zhì)體，裝入緩釋膠囊，制成口服型重組蛋白疫苗。
在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明還提供一種治療華支睪吸蟲病的藥物組合物，其含有用本發(fā)明多肽篩選出的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抑制劑，所篩選出的抑制劑以安全有效劑量與藥物上可接受的賦型劑組成治療華支睪吸蟲病的藥物組合物。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。
抑制劑藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。施用于患者的的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。


圖1為分離的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)，41kDa為蛋白質(zhì)的分子量，箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
圖2為膠體金免疫層析模式圖標號1測試線2質(zhì)控線3玻璃纖維片具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的克隆用異硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取華支睪吸蟲成蟲總RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司產(chǎn)品)從總RNA中分離poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。用Smart cDNA克隆試劑盒(購自Clontech)將cDNA片段定向插入到pBSK(+)載體(Clontech公司產(chǎn)品)的多克隆位點上，轉(zhuǎn)化DH5α，細菌形成cDNA文庫。用Dye terminate cycle reactionsequencing kit(Perkin-Elmer公司產(chǎn)品)和ABI 377自動測序儀(Perkin-Elmer公司)測定所有克隆的5’和3’末端的序列。將測定的cDNA序列與已有的公共DNA序列數(shù)據(jù)庫(Genebank)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中一個克隆c007b07的cDNA序列為新的DNA。通過合成一系列引物對該克隆所含的插入cDNA片段進行雙向測定。結(jié)果表明，c007b07克隆所含的全長cDNA為1358bp(如Seq ID NO1所示)，從第211bp至1194bp有一個984bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個新的蛋白質(zhì)(如Seq ID NO2所示)。我們將此克隆命名為c007b07，編碼的蛋白質(zhì)命名為華支睪吸蟲乳酸脫氫酶。
實施例2cDNA克隆的同源檢索將本發(fā)明的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的序列及其編碼的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等數(shù)據(jù)庫進行同源檢索。與本發(fā)明的多肽同源性最高的基因是一種已知的乳酸脫氫酶，在Genbank的準入號為P33571。結(jié)果顯示兩者高度同源，其相同性為57％；相似性為76％。
實施例3用RT-PCR方法克隆編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的基因用華支睪成蟲總RNA為模板，以oligo-dT為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，用Qiagene的試劑盒純化后，用下列引物進行PCR擴增Primer15’-CCGCTGTATACACTGGCATAG-3’(SEQ ID NO3)Primer25’-TTTTTGATGACATAGACATTT-3’(SEQ ID NO4)Primer1為位于SEQ ID NO1的5’端的第1bp開始的正向序列；Primer2為SEQ ID NO1的中的3’端反向序列。
擴增反應的條件在50μl的反應體積中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司產(chǎn)品)。在PE9600型DNA熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer公司)上按下列條件反應25個周期94℃ 30sec；45℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR時同時設β-actin為陽性對照和模板空白為陰性對照。擴增產(chǎn)物用QIAGEN公司的試劑盒純化，用TA克隆試劑盒連接到pCR載體上(Invitrogen公司產(chǎn)品)。DNA序列分析結(jié)果表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與SEQ ID NO1所示的1-1358bp完全相同。
實施例4Northern印跡法分析華支睪吸蟲乳酸脫氫酶基因的表達用一步法提取總RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。該法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M異硫氰酸胍-25mM檸檬酸鈉，0.2M乙酸鈉(pH4.0)對組織進行勻漿，加入1倍體積的苯酚和1/5體積的氯仿-異戊醇(49∶1)，混合后離心。吸出水相層，加入異丙醇(0.8體積)并將混合物離心得到RNA沉淀。將得到的RNA沉淀用70％乙醇洗滌，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-嗎啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸鈉-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％瓊脂糖凝膠上進行電泳。然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用α-32P dATP通過隨機引物法制備32P-標記的DNA探針。所用的DNA探針為圖1所示的PCR擴增的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶編碼區(qū)序列(211bp至1194bp)。將32P-標記的探針(約2×106cpm/ml)與轉(zhuǎn)移了RNA的硝酸纖維素膜在一溶液中于42℃雜交過夜，該溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鮭精DNA。雜交之后，將濾膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager進行分析和定量。
實施例5重組華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的體外表達、分離和純化根據(jù)SEQ ID NO1和圖1所示的編碼區(qū)序列，設計出一對特異性擴增引物，序列如下Primer35’-GCCCTCGAGATGTCATCAATATTGAAACCC-3’(Seq ID No5)Primer45’-AATGGATCCTTACCATTTGATGCCCTGGAT-3’(Seq ID No6)此兩段引物的5’端分別含EcoRI和BamHI酶切位點，其后分別為目的基因5’端和3’端的編碼序列，NdeI和BamHI酶切位點相應于表達載體質(zhì)粒pET-28a(+)(Novagen公司產(chǎn)品，Cat.No.69865.3)上的選擇性內(nèi)切酶位點。以含有全長目的基因的pBS-CS7B07質(zhì)粒為模板，進行PCR反應。PCR反應條件為總體積50μl中含pBS-CS7B07質(zhì)粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分別為10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司產(chǎn)品)1μl。循環(huán)參數(shù)94℃ 20s，59℃ 30s，68℃ 2min，共25個循環(huán)。用EcoRI和BamHI分別對擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a(+)進行雙酶切，分別回收大片段，并用T4連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用氯化鈣法大腸桿細菌DH5α，在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB平板培養(yǎng)過夜后，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，并進行測序。挑選序列正確的陽性克隆(pET-CS7B07)用氯化鈣法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司產(chǎn)品)。在含卡那霉素(終濃度30μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，宿主菌BL21(pET-CS7B07)在37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。離心收集菌體，經(jīng)超聲波破菌，離心收集上清，用能與6個組氨酸(6His-Tag)結(jié)合的親和層析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司產(chǎn)品)進行層析，得到了純化的目的蛋白華支睪吸蟲乳酸脫氫酶。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在41kDa處得到一單一的條帶(圖1)。將該條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上用Edams水解法進行N-端氨基酸序列分析，結(jié)果N-端15個氨基酸與SEQ ID NO2所示的N-端15個氨基酸殘基完全相同。
實施例6 華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的物理化學性質(zhì)將親和層析純化的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶，用enterokinase酶切除載體序列后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，和標準分子量曲線，測得其分子量約為41kDa；該蛋白含酸性氨基酸殘基28個，堿性氨基酸殘基30個，利用Amerham等電聚焦電泳儀，經(jīng)pH3-10和pH7-10梯度固定膠的等電聚焦電泳，測得其等電點為8.13。蛋白分子在水溶液環(huán)境中，呈球狀，易溶于水，其半衰期在哺乳動物線粒體中為30小時，在酵母細胞大于20小時，在大腸桿菌中超過10小時，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
實施例7 抗華支睪吸蟲乳酸脫氫酶抗體的產(chǎn)生用經(jīng)親和層析純化的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶加上完全弗氏佐劑免疫家兔，15天后再用該蛋白加不完全弗氏佐劑加強免疫一次。采用經(jīng)15μg/ml重組華支睪吸蟲乳酸脫氫酶包被的滴定板做ELISA測定兔血清中抗體的滴度。用蛋白A-Sepharose從抗體陽性的家兔血清中分離總IgG。將多肽結(jié)合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用親和層析法從總IgG中分離抗多肽抗體。免疫沉淀法證明純化的抗體可特異性地與華支睪吸蟲乳酸脫氫酶結(jié)合。該抗體是多克隆抗體，在瓊脂免疫雙擴試驗中與重組抗原效價在1∶32以上，與蟲體粗抗原的反應效價在1∶16以上。該抗體能夠檢測到重度感染的華支睪吸蟲病人的乳酸脫氫酶循環(huán)抗原。
實施例8本發(fā)明的多核苷酸片段用作雜交探針的應用從本發(fā)明的多核苷酸中挑選出合適的寡核苷酸片段用作雜交探針有多方面的用途，如用該探針可與不同來源的正常組織或病理組織的基因組或cDNA文庫雜交以鑒定其是否含有本發(fā)明的多核苷酸序列和檢出同源的多核苷酸序列，進一步還可用該探針檢測本發(fā)明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常組織或病理組織細胞中的表達是否異常。從本發(fā)明的多核苷酸SEQ ID NO1中選擇寡核苷酸片段用作雜交探針，應遵循以下原則和需要考慮的幾個方面探針大小優(yōu)選范圍為18-50個核苷酸；GC含量為30％-70％，超過則非特異性雜交增加；探針內(nèi)部應無互補區(qū)域；符合以上條件的可作為初選探針，然后進一步作計算機序列分析，包括將該初選探針分別與其來源序列區(qū)域(即SEQ ID NO1)和其它已知的基因組序列及其互補區(qū)進行同源性比較，若與非靶分子區(qū)域的同源性大于85％或者有超過15個連續(xù)堿基完全相同，則該初選探針一般就不應該使用；此外，再根據(jù)已設計好的探針片段或其互補片段的替換突變序列作為第二探針。
探針1(probe1)，屬于第一類探針，與SEQ ID NO1的基因片段完全同源或互補(40Nt)5’-TCAACGTGGCTGGTGTCCGGTTGTCCTCAATCAATCCGCA-3’(Seq ID No7)探針2(probe2)，屬于第二類探針，相當于SEQ ID NO1的基因片段或其互補片段的替換突變序列(40Nt)
5’-TCAACGTGGCTGGTGTCCAGTTGTCCTCAATCAATCCGCA-3’(Seq ID No8)核酸探針通常采用濾膜雜交方法，包括斑點印跡法、Southern印跡法、Northern印跡法和復印方法等，它們都是將待測的多核苷酸樣品固定在濾膜上后使用基本相同的步驟雜交。
與以下具體實驗步驟有關(guān)的其它未列出的常用試劑及其配制方法請參考文獻DNAPROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆實驗手冊書籍如《分子克隆實驗指南》(1998年第二版)[美]薩姆布魯克等著，科學出版社。
步驟1)將新鮮或新鮮解凍的華支睪吸蟲用冷勻漿緩沖液(0.25mol/L蔗糖；25mmol/L Tris-HCl，pH7.5；25mmol/LnaCl；25mmol/L MgCl2)懸浮沉淀(大約10ml/g)，4℃用電動勻漿器以全速勻漿組織懸液，直至組織被完全破碎。用苯酚抽提法組織中的DNA，然后用乙醇沉淀。必須除去RNA污染時，可將RNA酶A加到DNA溶液中，終濃度為100ug/ml，37℃保溫30分鐘消化RNA，然后再重新抽提DNA。樣膜的制備2)取4×2張適當大小的硝酸纖維素膜(NC膜)，用鉛筆在其上輕輕標出點樣位置及樣號，每一探針需兩張NC膜，以便在后面的實驗步驟中分別用高強度條件和強度條件洗膜。吸取及對照各15微升，點于樣膜上，在室溫中晾干。置于浸潤有0.1mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl的濾紙上5分鐘(兩次)，晾干置于浸潤有0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，3mol/LNaCl的濾紙上5分鐘(兩次)，晾干。夾于干凈濾紙中，以鋁箔包好，60-80℃真空干燥2小時。
3)探針用磷酸激酶標記32P后過Sephadex G-50柱，用液體閃爍儀監(jiān)測同位素量，合并第一峰的收集液后即為所需制備的32P-Probe(第二峰為游離γ-32P-dATP)。
4)預雜交將樣膜置于塑料袋中，加入3-10mg預雜交液(10×Denhardt’s；6×SSC，0.1mg/ml CT DNA(小牛胸腺DNA)。)，封好袋口后，68℃水浴搖2小時。
5)雜交將塑料袋剪去一角，加入制備好的探針，封好袋口后，42℃水浴搖過夜。
6)洗膜高強度洗膜取出已雜交好的樣膜；2×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，55℃洗30分鐘(2次)，室溫晾干。
低強度洗膜取出已雜交好的樣膜；2×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15分鐘(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15分鐘(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分鐘(2次)，室溫晾干。
7)X-光自顯影-70℃，X-光自顯影(壓片時間根據(jù)雜交斑放射性強弱而定)。
實驗結(jié)果采用低強度洗膜條件所進行的雜交實驗，以上四個探針雜交斑放射性強弱沒有明顯區(qū)別；而采用低強度洗膜條件所進行的雜交實驗，探針1的雜交斑放射性強度明顯強于其它三個探針雜交斑的放射性強度。因而可用探針1定性和定量地分析本發(fā)明的多核苷酸在不同組織中的存在和差異表達。
實施例9制備診斷試劑盒ELISA檢測試劑盒的制備將純化的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶用碳酸鹽包被緩沖液((pH9.6)配成0.1mg/ml，96孔酶標般的每孔加50ul，4℃過夜，倒掉包被液后，用含10％脫脂奶粉的PBS-Tween20溶液100u1封閉孔壁多余的蛋白結(jié)合位點，4℃封閉過夜后倒掉封閉液。在酶標板反應孔中加入待測血清50ul，輕搖5分鐘后，靜置37℃濕盒中30～60分鐘，用PBS-Tween20洗滌液反復震蕩洗滌3次，每次3分鐘；再加辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記的羊抗人IgG(1∶1000稀釋液50ul)，重復上述結(jié)合和洗滌過程，然后加底物和顯色劑顯色，當出現(xiàn)顯色明顯時，加入2％硫酸溶液終止反應。肉眼觀察或用酶標儀測定反應結(jié)果。
膠體金免疫層析檢測試劑盒的制備常見的免疫層析系統(tǒng)有浸條式(dipstick)、卡片式和盒式三種。盒式免疫層析系統(tǒng)具有圖2所示的相同的基本原理和構(gòu)造由層析系統(tǒng)(層析膜和一個或兩個吸收層相連)固相免疫反應系統(tǒng)(抗原或抗體呈線狀包被在層析膜特定的位置上作為測試線或質(zhì)控線)，樣品和膠體金標記試劑從一端加入，在膜的毛細管作用下，沿膜表面向另一端移動，并被吸收層吸收。樣品中的待測成分與膠體金檢測試劑在層析過程中與結(jié)合在膜上的捕獲試劑發(fā)生免疫結(jié)合反應，而停留在包被線(包括測試線1和質(zhì)控線2)上，顯示出一條紅色的反應線。當樣品中不含待測成分，則在測試線1處不顯色，而作為陽性對照的質(zhì)控線2則顯紅色。浸條式檢測試劑盒將測試條下端先后加入待測樣品液和標記的膠體金溶液中；卡片式和盒式檢測試劑盒中，標記的膠體金以干燥的固體形式保存在一端的玻璃纖維片3上，卡片式只需將待測溶液和緩沖液直接滴加到玻璃纖維片上，合上卡片，幾分鐘后即可蓋面的觀察窗判斷結(jié)果；盒式將檢測條裝入小塑料盒中，放膠體金的一端對應圓形的加樣孔，樣品和緩沖液從加樣孔加入，幾分鐘后從長方形的觀察窗中判斷結(jié)果。
本檢測試劑盒中，層析膜為孔徑8μm的混合纖維素膜，純化的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶包被在吸收層的遠端作為檢測線，華支睪病人的陽性血清包被在吸收層的近端作為質(zhì)控線，標記華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的膠體金溶液滴加到玻璃纖維片后干燥，放置在層析膜的另一端。
膠體金的制備及標記將氯金酸鹽用去離子的超純水配成0.01％的濃度，煮沸后，迅速加入1％的檸檬酸三鈉溶液，(每100ml加2ml)，不離火迅速振搖混勻，一直煮到溶液顏色變?yōu)槠咸丫萍t色后撤火，用超純水補足原有體積。制備的膠體金的平均粒徑約20nm。將制備好的膠體金溶液用0.25mol/L的碳酸鉀溶液調(diào)pH8.0，在攪拌情況下按15μg/mL的量加入純化的乳酸脫氫酶，反應10分鐘，15000g的離心力離心30分鐘，沉淀用原體積1/10的PBS(pH8.0)重新懸浮。
實施例10制備疫苗華支睪吸蟲是組織外寄生蟲，免疫系統(tǒng)難以直接與其作用。它產(chǎn)生的抗原刺激機體粘膜系統(tǒng)產(chǎn)生粘膜免疫反應是其主要的保護性反應。粘膜免疫產(chǎn)生的分泌型IgA，可以阻止分泌排泄抗原通過膽管上皮進入肝細胞，從而降低這些抗原成分對機體的毒害作用，而不是直接對蟲體起到攻擊殺傷的作用。因此，華支睪吸蟲的疫苗以口服型疫苗為主，將重組乳酸脫氫酶蛋白與卵磷脂1∶10混合，加入10倍的生理鹽水溶液，超聲震蕩，制成脂質(zhì)體，裝入緩釋膠囊，制成口服型重組蛋白疫苗。
實施例11制備藥物組合物華支睪吸蟲乳酸脫氫酶同人乳酸脫氫酶的5個同工酶在結(jié)構(gòu)上存在明顯的差別。利用此差別篩選出了對華支睪吸蟲乳酸脫氫酶選擇性抑制劑，8-脫氧半棉籽酚酸(2，3-二羥基-6-甲基-4-(1-甲基乙基)-1-萘酸)，該抑制劑與華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的解離常數(shù)低達50nM，選擇性高達400倍。該抑制劑能溶于水，以淀粉、甘油等作為賦型劑，制成口服型片劑或?qū)⒁种苿┭b入膠囊，可用于華支睪吸蟲病的治療。
序列表<110>中山大學<120>華支睪吸蟲乳酸脫氫酶，其編碼核酸及其應用<130>cs007b07<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1358<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>1ccgctgtata cactggcata gtgtaaattg ggtacgggcc ccccctcgag gtcgatggta 60tcgataagct tgatatcgaa ttcgtatcgg cctagcagtg gtatcaacgc agagtggcca 120ttacggtcgg ggacatttac gcggggatat aaacaactta tcagtttcat cacgactcac 180ctacgactgt gaaatcagac gcagagcaaa atgtcatcaa tattgaaacc cgtagcgcca 240gctgatgcta gatctcgccc gaggacgaag atcactgtga ttggtgtggg atctgtgggc 300atggcctcag ctttcgcatt gatggaaata accggagagc tttgtctaat tgatattgcc 360gtagacaaag tgaaaggcga ggttcttgac ctgcaacatg gacaacaatt tctgaggaga 420tgtcacgtgc acggaagctc tgactacaaa gacagtgcaa attcggatat tgttgtaata 480acagctggtg ctcgtcagaa tgaaggagaa tccaggctaa atctagtcca gaggaatgtt 540gacatcttca aacatatgat tccgaacatc gtgaagtaca gtccaaattg cattattgtc 600gtcgtgtcga atcccgtgga cgtgttgacc tatgttgctg ctaaactcag tggttttcca 660actcatcgag ttattggcac aggtacaatg ctggactctg cccgtttccg ttatctatta 720ggagaaaagt tgggggtgtc agcgaattct gtacatggtt acgtcattgg tgaacatgga 780gattcgagtg tgccgatatg gagtaatgtc aacgtggctg gtgtccggtt gtcctcaatc 840aatccgcaga taggaacagc agctgacccg gaaaagtttg gagaaataca caaagaggtg 900gttgagagtg cgtatgaaat aattagattg aaaggatata cctcctgggc aatcgggctt 960acttgccgtt cattgtgcaa cgcaattctt cataatttac atgcggttta cccacttaca1020acttgtgcca aaggctttca cggtattcaa aatgatgtat acctgagctt accttgtttg1080
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Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Leu Gly Glu Lys Leu Gly Val165 170 175Ser Ala Asn Ser Val His Gly Tyr Val Ile Gly Glu His Gly Asp Ser180 185 190Ser Val Pro Ile Trp Ser Asn Val Asn Val Ala Gly Val Arg Leu Ser195 200 205Ser Ile Asn Pro Gln Ile Gly Thr Ala Ala Asp Pro Glu Lys Phe Gly210 215 220Glu Ile His Lys Glu Val Val Glu Ser Ala Tyr Glu Ile Ile Arg Leu225 230 235 240Lys Gly Tyr Thr Ser Trp Ala Ile Gly Leu Thr Cys Arg Ser Leu Cys245 250 255Asn Ala Ile Leu His Asn Leu His Ala Val Tyr Pro Leu Thr Thr Cys260 265 270Ala Lys Gly Phe His Gly Ile Gln Asn Asp Val Tyr Leu Ser Leu Pro275 280 285Cys Leu Leu Thr Ser Val Gly Val Ser His Ile Val Pro Gln Gln Leu290 295 300Asn Glu Gln Glu Gln Gln Lys Ile Thr Ala Ser Ala Asp Thr Leu Trp305 310 315 320Lys Val Ile Gln Gly Ile Lys Trp325<210>3<211>21<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>3ccgctgtata cactggcata g 21<210>4
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權(quán)利要求
1.一種分離的多肽-華支睪吸蟲乳酸脫氫酶，其特征在于它包含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、類似物或衍生物。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含選自下組中的一種(a)編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有SEQ ID NO1中211-1194位的序列或SEQ ID NO1中1-1358位的序列。
4.一種能與多肽結(jié)合的抗體，其特征在于所述抗體是能與所述華支睪吸蟲乳酸脫氫酶特異性結(jié)合的抗體。
5.一類調(diào)節(jié)多肽表達的多核苷酸，其特征在于它們是抑制所述華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的表達的多核苷酸，且具有SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或其片段的反義序列或者與其序列一致的寡聚雙鏈RNA。
6.如權(quán)利要求1所述多肽的應用，其特征在于它應用于篩選華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抑制劑；或者用于肽指紋圖譜鑒定。
7.如權(quán)利要求2-3中的任一權(quán)利要求所述的多核苷酸的應用，其特征在于它作為引物用于核酸擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
8.一種檢測華支睪吸蟲的試劑盒，其特征在于它含有特異性檢測華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的引物、權(quán)利要求4所述的抗體、權(quán)利要求1所述的多肽任一或其組合。
9.一種用于預防華支睪吸蟲病的疫苗，其特征在于其含有權(quán)利要求1所述的多肽或含有權(quán)利要求2或3所述的多核苷酸的真核表達載體。
10.一種用于治療華支睪吸蟲病的藥物組合物，其特征在于含有用權(quán)利要求1所述多肽篩選出的華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的基因，基因編碼的多肽，多肽的抗體。本發(fā)明還公開了此多肽用于篩選華支睪吸蟲乳酸脫氫酶的抑制劑，多核苷酸作為引物或者作為探針的應用，尤其公開了此多肽與多核苷酸作為診斷試劑盒、疫苗與藥物組合物的用途。
文檔編號A61K38/43GK1670200SQ20051002400
公開日2005年9月21日 申請日期2005年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月22日
發(fā)明者余新炳, 吳忠道, 徐勁, 陳守義, 張紅梅 申請人:中山大學