檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，其包括頂板(1)結(jié)構(gòu)和底板(2)結(jié)構(gòu)，用膠帶(19和20)密封，其中頂板(1)上的氣泵(3)、加樣口(4)、樣本填充區(qū)(12)、標(biāo)記抗體存儲池(5)和樣本混合區(qū)(13)依次連接；底板上的過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測區(qū)(8)、液體釋放通道(16)依次連接；底板的檢測區(qū)(8)分別與清洗液存儲池(9)和發(fā)光基底液存儲池(10)通過液體釋放通道(16)連接；所述頂板(1)還包括蓋子(11)；所述底板(2)還包括廢液池(15)。
【專利說明】
檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控芯片技術(shù)實現(xiàn)CK-MB高靈敏定量檢測的方法，特別公開了一種檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，可實現(xiàn)全血樣本中CK-MB的準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測，屬于微流控芯片化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前我國心血管疾病的防控形勢依然嚴(yán)峻，心血管疾病發(fā)病率呈不斷上升態(tài)勢。據(jù)統(tǒng)計，心血管病死亡率占人口死亡的40%，因此做好早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防、早救治，提高心血管病防治水平是關(guān)鍵。心血管疾病常用檢測指標(biāo)為心肌酶譜系列。心肌酶是指心肌細(xì)胞內(nèi)的酶類物質(zhì)，具有催化心肌細(xì)胞代謝和調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞電活動的作用。心肌酶譜包括乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)等。如心肌細(xì)胞受損，這些酶會釋放到血液。因此心肌酶譜升高程度可間接衡量心肌細(xì)胞的損害程度。其中CK和CK-MB是靈敏度較高的指標(biāo)，能在發(fā)病早期心肌尚未大面積壞死時，在患者血液中檢測出來，第一時間為臨床提供可靠資料。
[0003]CK是由兩種不同亞基(M和B)組成的二聚體，正常人體組織主要含3種同工酶，SPCK-MM、CK-BB、CK-MB<XK-MM主要存在于肌肉細(xì)胞中，CK-BB主要存在于腦細(xì)胞中，CK_MB主要存在于心肌細(xì)胞中。
[0004]CK-MB是目前常用的心肌損傷標(biāo)志物，曾一度被視為診斷心肌梗死的“金標(biāo)準(zhǔn)”。CK-MB在急性心肌梗死發(fā)病后4?8小時內(nèi)增高，24小時達(dá)峰值，兩三天恢復(fù)正常。CK-MB因其具有重要的生理功能和臨床應(yīng)用價值已引起人們廣泛的重視和深入的研究。
[0005]傳統(tǒng)上多用酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法及膠體金免疫層析法等測定血清中的CK-MB。但酶聯(lián)免疫吸附法操作復(fù)雜，檢測耗時長;化學(xué)發(fā)光法對技術(shù)要求高，不易在臨床實驗室中進(jìn)行常規(guī)開展。膠體金免疫層析法雖然具有標(biāo)本用量少，簡便快速，便宜的優(yōu)勢，然而當(dāng)遇到某些樣本中抗原或抗體含量極低時，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來判斷結(jié)果，容易出現(xiàn)誤判，靈敏度較低。
[0006]中國專利200610114997.9公布了一種血清中肌酸激酶同工酶的化學(xué)發(fā)光測定方法，其主要利用肌酸激酶催化磷酸肌酸與二磷酸腺苷反應(yīng)生成三磷酸腺苷和肌酸，再用甘油激酶催化三磷酸腺苷和甘油生成3-磷酸甘油，3-磷酸甘油被磷酸甘油氧化酶氧化并產(chǎn)生過氧化氫，再經(jīng)過氧化物酶作用，過氧化氫使魯米諾氧化而發(fā)光。中國專利200520041211.6披露了一種心血管疾病診斷和預(yù)測多指標(biāo)蛋白芯片檢測試劑盒，該試劑盒采用化學(xué)發(fā)光法(如辣根過氧化氫酶和魯米諾)檢測，并能同時檢測C反應(yīng)蛋白、肌紅蛋白、心肌肌鈣蛋白
1、肌酸激酶同工酶等八種抗體。雖然化學(xué)發(fā)光法靈敏度較高，但重復(fù)性和穩(wěn)定性均較差，且配套儀器昂貴，不能單人份快速即時檢測，限制了他們的廣泛應(yīng)用。
[0007]因此開發(fā)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的檢測方法，具有巨大發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。與熒光和吸收光相比，化學(xué)發(fā)光沒有外來激發(fā)光源背景信號干擾，交叉干擾小，靈敏度高、線性范圍寬。微流控芯片技術(shù)把樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，可完成全過程分析。
[0008]針對現(xiàn)有CK-MB檢測方法的不足和缺陷，微流控磁微粒化學(xué)發(fā)光方法利用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光和微流控技術(shù)，可實現(xiàn)對CK-MB準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為針對現(xiàn)有快速診斷方法靈敏度低、重復(fù)性差、受干擾明顯，以及現(xiàn)有化學(xué)發(fā)光配套儀器昂貴、檢測時間長的問題，提供一種檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，通過集成化芯片(把除測試樣本外所有組分均集成到芯片內(nèi))并配套小型便攜設(shè)備，從而實現(xiàn)現(xiàn)場樣本中CK-MB的快速、準(zhǔn)確、高靈敏定量檢測。
[0010]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0011]—種檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，所述微流控芯片包括頂板(I)結(jié)構(gòu)和底板(2)結(jié)構(gòu)，其中頂板(I)上的氣栗(3)、加樣口(4)、樣本填充區(qū)(12)、標(biāo)記抗體存儲池(5)和樣本混合區(qū)(13)依次連接;底板上的過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測區(qū)(8)、液體釋放通道(16)依次連接;底板的檢測區(qū)(8)分別與清洗液存儲池(9)和發(fā)光基底液存儲池(10)通過液體釋放通道(16)連接；
[0012]所述標(biāo)記抗體存儲池(5)存儲預(yù)封裝酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗CK-MB抗體，磁顆粒包被區(qū)
(7)包被預(yù)封裝磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體，清洗液存儲池(9)和發(fā)光基底液存儲池(I O)存儲預(yù)封裝清洗液和發(fā)光基底液;所述微流控芯片測試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動或聚集；所述標(biāo)記抗體存儲池、清洗液存儲池和發(fā)光基底液存儲池為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體;所述過濾區(qū)包含濾血膜，所述頂板(I)與底板(2)用膠帶(19和20)密封。
[0013]具體地，本發(fā)明所述的微流控芯片，其發(fā)光基底液保質(zhì)期少于I年時應(yīng)分開，用發(fā)光基底液存儲池A(23)和發(fā)光基底液存儲池B(24)替代發(fā)光基底液存儲池(10)，所述發(fā)光基底液存儲池A( 23)和發(fā)光基底液存儲池B (24)通過預(yù)混合通道(25)連接。
[0014]具體地，所述磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體使用的磁顆粒為包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物的超順磁性顆粒，磁顆粒尺寸為0.1??ομπι，與磁珠匹配的磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500-30000 高斯。
[0015]優(yōu)選地，所述磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體使用的磁顆粒包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物，磁顆粒尺寸為I?3μπι，與磁珠匹配的磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為1000-8000高斯。
[0016]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液、磁顆粒標(biāo)記抗體溶液和清洗液均包含緩沖液、蛋白質(zhì)、表面活性劑和防腐劑，且磁顆粒標(biāo)記抗體溶液還包含糖類。
[0017]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Proclin300的pH7.4Tris-HCl緩沖液;所述磁顆粒標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、葡萄糖、吐溫_20和Proclin300的pH7.4Tris-HCl緩沖液；所述清洗液包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin300 的 pH7.4Tris_HCl 緩沖液。
[0018]具體地，所述酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、吐溫-20和Proclin300的pH7.4磷酸鹽緩沖液;所述磁顆粒標(biāo)記抗體溶液包含牛血清白蛋白、酪蛋白、蔗糖、吐溫-20、曲拉通X-1OO和ProcI in300的pH7.4磷酸鹽緩沖液;所述清洗液包含牛血清白蛋白、吐溫20、曲拉通乂-100和?抓(:1111300的?!17.4磷酸鹽緩沖液。
[0019]具體地，本發(fā)明所述微流控芯片的配套儀器為小型便攜設(shè)備，包含擠壓氣栗和存儲池，磁鐵移動，發(fā)光檢測系統(tǒng)等功能。
[0020]本發(fā)明所述微流控芯片制備方法如下:
[0021 ]步驟I)酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗CK-MB抗體，磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體，這兩種抗體可相同或不同；
[0022]步驟2)將酶或發(fā)光劑標(biāo)抗體溶液放入頂板的標(biāo)記抗體存儲池中，密封，將磁顆粒標(biāo)記抗體溶液放入底板的磁顆粒包被區(qū)中，干燥，將清洗液和發(fā)光基底液分別注入清洗液存儲池和發(fā)光基底液存儲池中，密封，用膠帶(19和20)密封頂板和底板，并組裝成微流控芯片。
[0023]本發(fā)明提供的一種檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片是一種以化學(xué)發(fā)光為基礎(chǔ)、在微流控芯片上實現(xiàn)CK-MB快速、準(zhǔn)確、高靈敏檢測的微流控芯片。
[0024]這種芯片是將抗CK-MB抗體修飾酶，抗CK-MB抗體修飾在磁顆粒上，利用抗原抗體作用，如雙抗體夾心法原理結(jié)合磁顆粒富集、化學(xué)發(fā)光檢測全血樣本中是否含有CK-MB，并準(zhǔn)確分析其含量。
[0025]本發(fā)明中所述酶，包含但不限于過氧化氫酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)。發(fā)光基底液為酶對應(yīng)的發(fā)光底物(如魯米諾或金剛烷)和發(fā)光增強(qiáng)液(如苯衍生物等增強(qiáng)劑)，其中發(fā)光底物和發(fā)光增強(qiáng)液可合并，如圖1所示混合均勻后注入一個發(fā)光基底液存儲池(10);但當(dāng)混合液保質(zhì)期少于I年時應(yīng)分開，如圖3所示分別注入發(fā)光基底液存儲池A(23)和發(fā)光基底液存儲池B (24),通過預(yù)混合通道(25)連接，如圖3所示，儲存在存儲池A( 23)和發(fā)光基底液存儲池B(24)中的發(fā)光基底液在預(yù)混合通道(25)混合均勻。本發(fā)明一個實施例采用過氧化氫酶。
[0026]本發(fā)明所述發(fā)光劑，包含但不限于吖啶酯和吖啶磺酰胺。發(fā)光劑與發(fā)光基底液作用后，不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)。本發(fā)明的一個實施例采用吖啶酯。發(fā)光基底液包含H202溶液和堿性溶液，可合并成堿性H202溶液，注入發(fā)光基底液存儲池(10)；但當(dāng)穩(wěn)定性不好時，H202溶液和堿性溶液應(yīng)分別注入發(fā)光基底液存儲池A (23)和發(fā)光基底液存儲池B(24)，通過預(yù)混合通道(25)混合均勻，如圖3所示。
[0027]本發(fā)明采用的標(biāo)記方法包含化學(xué)交聯(lián)或生物分子間特異性作用將抗CK-MB抗體連接到酶或磁顆粒表面，得到抗體標(biāo)記的酶或抗體標(biāo)記的磁顆粒。
[0028]本發(fā)明的CK-MB抗體包含單克隆抗體和多克隆抗體。該抗體可與CK-MB結(jié)合(如雙抗體夾心法)。其中酶標(biāo)記的抗體與磁顆粒標(biāo)記的抗體可以相同，也可以不同。
[0029]本發(fā)明的酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗體溶液和磁顆粒標(biāo)記抗體溶液均包含緩沖液、蛋白質(zhì)、表面活性劑和防腐劑，且磁顆粒標(biāo)記抗體溶液還包含糖類。其中HRP標(biāo)記的配體，緩沖體系中不能含有NaN3; ALP標(biāo)記配體，緩沖體系不能是磷酸體系。
[0030]本發(fā)明的微流控芯片如圖1所示，包含頂板結(jié)構(gòu)(I)和底板結(jié)構(gòu)(2)，以膠帶(19和20)密封后，組裝形成微流控芯片。頂板和底板的成型材料為聚合物，包含但不限于聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、環(huán)氧樹脂等，膠帶可為雙面膠或單面膠，其中雙面膠可用兩片單面膠替代。如圖1所示，頂板結(jié)構(gòu)由氣栗(3)、加樣口(4)、標(biāo)記抗體存儲池(5)、蓋子(11)、樣本填充區(qū)(12)和樣本混合區(qū)(13)組成。底板結(jié)構(gòu)由過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、檢測區(qū)(8)、清洗液存儲池(9)、發(fā)光基底液存儲池(10)、清洗區(qū)(14)、廢液池(15)和液體釋放通道(16)。如圖2所示，在發(fā)光基底液和清洗液存儲池區(qū)域，以及磁鐵滑軌區(qū)域，在頂板上需留出存儲池和磁鐵滑軌的讓位孔(分別為17和18)，在雙膠帶上應(yīng)留出存儲池和樣本混合液流入過濾區(qū)時的讓位孔(分別為21和22)，讓位孔的作用是讓開一定的區(qū)域，不干擾液體流路，或配套儀器部件作用于微流控芯片的通路。
[0031 ]本發(fā)明的存儲池為液體密封池，所用密封材料包含玻璃、塑料、橡膠、鋁箔和高阻隔薄膜，其中密封材料可為同種材料組成，也可為多種材料組合而成。在物理擠壓下，存儲池可局部破裂，從而把密封的液體釋放出來。其中酶標(biāo)CK-MB抗體存儲池、清洗液存儲池、發(fā)光基底液存儲池可采用相同或不同材料和方法制作。在本發(fā)明的一個實施例中，酶標(biāo)CK-MB抗體存儲池、清洗液存儲池、發(fā)光基底液存儲池均采用塑料和彈性橡膠密封而成。本發(fā)明的另一個實施例中，酶標(biāo)CK-MB抗體存儲池采用塑料和彈性橡膠密封而成，而清洗液存儲池、發(fā)光基底液存儲池采用高阻隔薄膜密封而成。
[0032]本發(fā)明的過濾區(qū)包含濾血膜，其中濾血膜可通過物理孔徑或生物/化學(xué)試劑使液體與細(xì)胞分離，實現(xiàn)血漿與紅細(xì)胞分離，血漿流到磁顆粒包被區(qū)，而紅細(xì)胞停留在濾血膜上，從而減少紅細(xì)胞對試驗結(jié)果的干擾。其中所述生物/化學(xué)試劑包含凝血劑等，可使紅細(xì)胞間連接，形成凝塊，增大尺寸，更容易被濾血膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻擋。
[0033]本發(fā)明的微流控芯片，當(dāng)存在發(fā)光基底液存儲池A(23)和發(fā)光基底液存儲池B
(24)，應(yīng)在底板上增加發(fā)光基底液預(yù)混合通道(25)，該預(yù)混合通道可為蛇形通道或上下結(jié)構(gòu)混合通道，如圖3所示。
[0034]在一個實施例中，標(biāo)記抗體存儲池(5)封入HRP標(biāo)記抗CK-MB抗體，包被區(qū)包被磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體(與酶標(biāo)抗體不同)，以磁微粒酶促化學(xué)發(fā)光法檢測CK-MB。另一個實施例中，標(biāo)記抗體存儲池(5)封入吖啶酯標(biāo)記抗CK-MB抗體，包被區(qū)包被磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體(與吖啶酯標(biāo)記抗體不同)，以磁微粒酶促化學(xué)發(fā)光法檢測CK-MB。
[0035]本發(fā)明的清洗液，用于清洗磁顆粒，去除非特異性吸附的CK-MB、酶標(biāo)記物及其他影響檢測結(jié)果的物質(zhì)。清洗液主要包含緩沖體系、蛋白質(zhì)和表面活性劑，其中緩沖體系包含但不限于硼酸鹽、磷酸鹽、Tris-HCl和醋酸鹽等。清洗液pH 6.0?10.0，當(dāng)檢測樣本為強(qiáng)酸或強(qiáng)堿性時，PH范圍可放寬。其中蛋白質(zhì)包含但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白等。其中表面活性包含但不限于可包括吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。
[0036]作為優(yōu)選，本發(fā)明一個實施例中，清洗液為包含牛血清白蛋白、曲拉通X-100和Proclin30(^9pH7.0Tris-HCl緩沖液。另一個實施例中，清洗液為牛血清白蛋白、吐溫20、曲拉通 X-10(^PProclin30(^^pH7.4 磷酸鹽緩沖液。
[0037]本發(fā)明的樣本體積在10?500μ1，優(yōu)選20?ΙΟΟμΙ。作為優(yōu)選，在實施例中加樣體積為50μ1。
[0038]—種檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的測試流程包括:
[0039]步驟I)將全血樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子，微流控芯片放入配套儀器中，酶標(biāo)抗體釋放后，氣栗使樣本和酶標(biāo)抗體混合均勻，然后注入底板過濾區(qū)；
[0040]步驟2)樣本經(jīng)過濾區(qū)后，到達(dá)包被區(qū)，溶解磁標(biāo)抗體，充分反應(yīng)后磁鐵收集磁顆粒，清洗液存儲池釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，移至檢測區(qū)，釋放發(fā)光基底液，儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號強(qiáng)度，進(jìn)而實現(xiàn)全血樣本中CK-MB的定量檢測。
[0041 ]本發(fā)明的微流控芯片為快速檢測，檢測時間應(yīng)小于30分鐘，作為優(yōu)選，實施例中采用15分鐘。
[0042]本發(fā)明的抗體儀器包含擠壓氣栗和存儲池，磁鐵移動，發(fā)光檢測系統(tǒng)等功能，應(yīng)可包含擠壓裝置、磁鐵及移動裝置、檢測系統(tǒng)、控制分析模塊和軟件系統(tǒng)。
[0043]本發(fā)明的核心是采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)在微流控芯片實現(xiàn)目標(biāo)物的快速、高靈敏度、準(zhǔn)確定量檢測。
[0044]微流控芯片技術(shù)是把生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。
[0045]本發(fā)明的微流控芯片將檢測過程所需的所有試劑組分(酶標(biāo)CK-MB抗體、磁顆粒標(biāo)記CK-MB抗體、清洗液、發(fā)光基底液等)均集成、內(nèi)置到微流控芯片中，并通過巧妙溝道設(shè)計，在配套儀器的操作下，實現(xiàn)微流控芯片的一鍵式檢測(只需按開始鍵就能實現(xiàn)檢測，無需復(fù)雜操作)，實現(xiàn)全血分離、免疫反應(yīng)、清洗分離、化學(xué)發(fā)光檢測，從而避免了現(xiàn)有微流控芯片中結(jié)構(gòu)設(shè)計簡單、檢測時操作復(fù)雜等不足和缺陷。還克服了傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光儀只能進(jìn)行血清或血漿檢測，而不能對全血樣本進(jìn)行檢測的缺點。
[0046]由于磁顆粒易沉淀，傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光儀采用手工混合，并以持續(xù)振蕩維持磁顆粒的懸浮狀態(tài)，但微流控芯片內(nèi)磁顆粒混均操作難以在小型便攜儀器中實現(xiàn)。
[0047]本發(fā)明將磁顆粒包被、干燥于微流控芯片溝道中，并設(shè)計了磁鐵主動驅(qū)動磁顆粒(而傳統(tǒng)微流控芯片一般采用流體驅(qū)動或電驅(qū)動)，從而使磁顆粒復(fù)溶，并在微流控芯片不同區(qū)域?qū)崿F(xiàn)免疫反應(yīng)、清洗、發(fā)光。此設(shè)計不僅解決了磁顆粒應(yīng)用于微流控芯片時易沉淀、重復(fù)性差等問題，還實現(xiàn)了更可控的免疫反應(yīng)和物理清洗，提高了靈敏度和重復(fù)性。其中磁鐵磁性和磁顆粒尺寸對檢測效果了明顯影響，本發(fā)明選擇磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500-30000高斯，優(yōu)選1000-8000高斯;磁顆粒尺寸為0.1-10μπι，優(yōu)選0.5_3μπι。
[0048]本發(fā)明中微流控芯片配套儀器與微流控芯片無液體接觸，無需要清洗的部件，避免了傳統(tǒng)大型化學(xué)發(fā)光儀需要攪拌或加樣、清洗等操作而產(chǎn)生的交叉干擾及污染。
[0049]所以本發(fā)明并非簡單疊加磁微?；瘜W(xué)發(fā)光技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，而是通過液體密封設(shè)計、溝道設(shè)計，把檢測所需所有化學(xué)組分集成、內(nèi)置到微流控芯片中，并以磁鐵主動驅(qū)動，實現(xiàn)一鍵式的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測，從而在便攜配套儀器中實現(xiàn)全血中CK-MB的快速、高靈敏度、準(zhǔn)確定量檢測。
[0050]本發(fā)明可應(yīng)用于心血管疾病尤其是心力衰竭中CK-MB的定量檢測。
[0051 ]本發(fā)明的主要優(yōu)點如下:
[0052]I)本發(fā)明采用化學(xué)發(fā)光方法，具有背景低、靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點。
[0053]2)本發(fā)明采用磁顆粒技術(shù)，具有磁富集功能，增強(qiáng)并放大信號;并能利用磁鐵把磁顆粒轉(zhuǎn)移區(qū)域(如由包被區(qū)一清洗區(qū)一檢測區(qū))，減少樣本基質(zhì)的影響。
[0054]3)本發(fā)明采用微流控芯片技術(shù)，把樣本混合、反應(yīng)、分離和檢測集成在芯片上，并把反應(yīng)所需的所有試劑組分集成到芯片上。
[0055]4)本發(fā)明操作簡便，檢測時，只需加入樣本，蓋上蓋子，把芯片放入小型便攜配套儀器中即可。
[0056]5)本發(fā)明配套儀器是小型便攜儀器，儀器只與芯片發(fā)生物理接觸，芯片內(nèi)液體不與儀器接觸，不會污染儀器而產(chǎn)生交叉干擾。
【附圖說明】
[0057]圖1為CK-MB定量檢測的微流控芯片主體結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為頂板，2為底板，3為氣栗，4為加樣口，5為標(biāo)記抗體存儲池，6為過濾區(qū)，7為磁顆粒包被區(qū)，8為檢測區(qū)，9為清洗液存儲池，10為發(fā)光基底液存儲池，11為蓋子，12為樣本填充區(qū)，13為樣本混合區(qū)，14為清洗區(qū)，15為廢液池，16為液體釋放通道，17為發(fā)光基底液和清洗液存儲池讓位孔(于頂板)，18為磁鐵滑軌讓位孔。
[0058]圖2為CK-MB定量檢測的完整微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中I為頂板，2為底板，19為雙面膠帶，20為單面膠帶，21為發(fā)光基底液和清洗液存儲池讓位孔(于雙面膠帶)，22為混合液流入過濾區(qū)時的讓位孔。
[0059]圖3為雙發(fā)光基底液的微流控芯片底板結(jié)構(gòu)示意圖，其中23為發(fā)光基底液存儲池A，24為發(fā)光基底液存儲池B，25為預(yù)混合通道。
【具體實施方式】
[0060]本發(fā)明公開了一種檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光微流控芯片，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0061]為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0062]實施例1:酶促化學(xué)發(fā)光測定CK-MB
[0063](一)抗體標(biāo)記
[0064]取5yg HRP溶解于ImL蒸餾水中，再加入0.2mL0.1M新配Na14溶液，室溫避光反應(yīng)20min后，以ImM pH4.4醋酸鈉緩沖液透析純化溶液。再以0.2M pH9.5碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH至9.0，加入1yg抗CK-MM單抗，室溫避光反應(yīng)2h。加0.ImL新配的4mg/mL NaBH4液，混勻，于4°C反應(yīng)2h。將上述溶液裝入透析袋，以0.15M pH7.4PBS透析，4°C過夜，得到HRP標(biāo)記CK-MM抗體。
[0065]向磷酸緩沖液中加入Img磁顆粒(直接為2μπΟ、1yg EDC和15yg NHS溶液和10?30yg抗CK-BB單抗(與HRP標(biāo)記的抗體不同)溶液，混合均勾并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。以磁鐵吸附富集純化，去除未反應(yīng)的CK-BB抗體，得到磁顆粒標(biāo)記CK-BB抗體。
[0066](二)微流控芯片組裝
[0067]HRP標(biāo)記CK-匪抗體溶液中含0.2 %牛血清白蛋白、0.1 %吐溫2 O和0.0 2 %Procl in300的pH7.4Tri s_HCl緩沖液;磁顆粒標(biāo)記CK-BB抗體溶液為包含0.5 %牛血清白蛋白、I % 葡萄糖、0.2% 吐溫20和0.02%Proclin300的pH7.4Tris_HCl緩沖液。
[0068]將HRP標(biāo)抗體溶液放入頂板標(biāo)記抗體存儲池中，密封。將磁標(biāo)抗體溶液放入底板磁顆粒包被區(qū)中，室溫干燥。
[0069]清洗液為0.3%牛血清白蛋白、0.2%曲拉通父-100和0.02%卩^(:1111300的pH7.0Tri s-HCl緩沖液。將清洗液注入清洗液存儲池。發(fā)光基底液分為HRP底物(魯米諾的雙氧水溶液)和堿性增強(qiáng)液(苯衍生物的堿性溶液)，分別注入發(fā)光基底液存儲池A(23)和發(fā)光基底液存儲池B(24)中，密封。按圖1所示，將濾血膜粘入底板中，將存儲池內(nèi)置入底板。然后按圖2所示，以單面膠帶和雙面膠帶，將頂板和底板組裝成微流控芯片。裝入鋁箔袋中，密封4°保存。
[0070](三)樣本檢測
[0071]用正常人血漿作稀釋液，將CK-MB標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如下濃度:0pg/ml、500pg/ml、lng/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、lOOng/ml和500ng/ml。
[0072]將50μ1樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子。將微流控芯片放入配套儀器(磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為6000高斯)中，儀器擠出HRP標(biāo)記單抗，并使樣本和HRP標(biāo)記單抗混合均勻后注入底板過濾區(qū)。樣本過濾后，到達(dá)微通道，并溶解磁顆粒標(biāo)記單抗，磁鐵加速樣本反應(yīng)，形成HRP標(biāo)記單抗-CK-MB抗原-磁顆粒標(biāo)記單抗的三明治結(jié)構(gòu)，然后磁鐵收集磁顆粒。水泡釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，發(fā)光基底液釋放，儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號強(qiáng)度?？倷z測時間15min。每個樣本分別用3個微流控芯片測定3次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0073]將50μ1全血樣本滴入加樣口，15分鐘內(nèi)儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號強(qiáng)度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中CK-MB濃度。
[0074]檢測原理為:當(dāng)全血加入微流控芯片后，全血先與HRP標(biāo)記抗體混合，然后經(jīng)過濾區(qū)后，混合了HRP標(biāo)記抗體的血漿到達(dá)微通道，血漿溶解磁標(biāo)記抗體。當(dāng)血樣中含有CK-MB，則形成HRP標(biāo)記抗體-CK-MB-磁顆粒標(biāo)記抗體的三明治結(jié)構(gòu)(雙抗體夾心法)。經(jīng)清洗后，再發(fā)光基底液作用下發(fā)光，儀器檢測系統(tǒng)測試發(fā)光信號。依據(jù)配套儀器獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而分析血樣中CK-MB濃度。樣本中CK-MB含量越高，則發(fā)光信號越強(qiáng)。
[0075]結(jié)果表明，其最低檢測限為100pg/ml，最低定量限為500pg/ml，在定量檢測范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，可為心梗心衰疾病診斷提供參考。
[0076]實施例2:直接化學(xué)發(fā)光測定CK-MB
[0077](一)抗體標(biāo)記
[0078]向磷酸緩沖液中加入適量活化的吖啶酯和10yg抗CK-BB單抗溶液，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。透析后，得到吖啶酯標(biāo)記CK-BB抗體。
[0079]向Iml 1mM pH7.4磷酸緩沖液中加入Img磁顆粒(直徑為Ιμπι)、1yg EDC和15ygNHS溶液和20yg鏈霉親和素，混合均勻并于室溫下反應(yīng)4h，加入Img甘氨酸封閉。以磁鐵吸附富集，去除未反應(yīng)的鏈霉親和素，得到磁顆粒標(biāo)記鏈霉親和素。
[0080]將1yg抗CK-MM單抗加入5yL0.25mg/mL Sulfo-NHS-LC-b1tin溶液中，反應(yīng)lh。以超濾離心管純化，去除未反應(yīng)的生物素。得到生物素化抗CK-MM抗體。
[0081 ]通過親和素-生物素間的相互作用，把抗CK-MM抗體連接到磁顆粒表面，得到磁顆粒標(biāo)記CK-MM抗體。其中親和素標(biāo)記的磁顆粒和生物素化的抗體比例為5:104。
[0082](二)微流控芯片組裝
[0083]吖啶酯標(biāo)記CK-BB抗體溶液中含0.1 %牛血清白蛋白、0.05 %吐溫20和0.05%Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液;磁顆粒標(biāo)記CK-MM抗體溶液為包含0.2%牛血清白蛋白、
0.1%酪蛋白、2%蔗糖,0.2%吐溫20、0.I % 曲拉通X-100和0.02%Proclin300的pH7.4磷酸緩沖液。將口丫啶酯標(biāo)記抗體溶液放入頂板標(biāo)記抗體存儲池中，密封。將磁標(biāo)抗體溶液放入底板磁顆粒包被區(qū)中，室溫干燥。
[0084]清洗液為0.3%牛血清白蛋白、0.1 %吐溫20、0.2%曲拉通X-100和0.02%Proclin300的pH7.0磷酸鹽緩沖液。將清洗液注入清洗液存儲池。發(fā)光基底液分為包含H2O2溶液和堿性溶液，分別注入發(fā)光基底液存儲池A(23)和發(fā)光基底液存儲池B(24)，密封。按圖1所示，將濾血膜粘入底板中，將存儲池內(nèi)置入底板。然后按圖2所示，以單面膠帶和雙面膠帶，將頂板和底板組裝成微流控芯片。裝入鋁箔袋中，密封4°保存。
[0085](三)樣本檢測
[0086]用正常人血楽作稀釋液，將0(-冊標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成如下濃度:(^8/1111、50(^8/1111、11^/ml、5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、lOOng/ml和500ng/ml。
[0087]將50μ1樣本滴入加樣口后，蓋上蓋子。將微流控芯片放入配套儀器(磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為2000高斯)中，儀器擠出吖啶酯標(biāo)記單抗，并使樣本和吖啶酯標(biāo)記單抗混合均勻后注入底板過濾區(qū)。樣本過濾后，到達(dá)微通道，并溶解磁顆粒標(biāo)記單抗，磁鐵加速樣本反應(yīng)，形成吖啶酯標(biāo)記抗體-CK-MB抗原-磁顆粒標(biāo)記抗體的三明治夾心結(jié)構(gòu)，然后磁鐵收集磁顆粒。水泡釋放清洗液，將磁顆粒清洗后，發(fā)光激發(fā)液釋放，儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號強(qiáng)度。總檢測時間15min。每個樣本分別用3個微流控芯片測定3次，取平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0088]將50μ1血楽樣本滴入加樣口，15分鐘內(nèi)儀器檢測系統(tǒng)檢測發(fā)光信號強(qiáng)度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中CK-MB濃度。
[0089]檢測原理為:當(dāng)血漿加入微流控芯片后，血漿先與吖啶酯標(biāo)記抗體混合，然后經(jīng)過濾區(qū)后，混合了吖啶酯標(biāo)記抗體的血漿到達(dá)微通道，血漿溶解磁標(biāo)記抗體。當(dāng)血樣中含有CK-MB，則形成吖啶酯標(biāo)記抗體-CK-MB-磁顆粒標(biāo)記抗體的三明治結(jié)構(gòu)(雙抗體夾心法)。經(jīng)清洗后，發(fā)光激發(fā)液釋放，經(jīng)混合后與吖啶酯作用產(chǎn)生直接化學(xué)發(fā)光，儀器檢測系統(tǒng)測試發(fā)光信號。依據(jù)配套儀器獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而分析血漿中CK-MB濃度。血漿中CK-MB含量越高，則發(fā)光信號越強(qiáng)。
[0090]結(jié)果表明，其最低檢測限為200pg/ml，最低定量限為700pg/ml，在定量檢測范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，可為心梗心衰疾病診斷提供參考。
[0091 ]實施例3:磁微粒顆粒尺寸篩選
[0092]其他的實驗條件參見實施例2，磁顆粒尺寸和磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度按照以下方案進(jìn)行。
[0093]顆粒尺寸為0.1μπι、0.5μηι、1μηι、3μηι、ΙΟμπι。磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500高斯、1000高斯、4000高斯、8000高斯、12000高斯。分別以這三種磁鐵分別驅(qū)動五中尺寸的磁顆粒。
[0094]實驗結(jié)果顯示:0.1Mi磁顆粒和500高斯磁鐵組合時，化學(xué)發(fā)光信號較弱，靈敏度不高;而1(^111磁顆粒和10000高斯磁鐵組合時，陰性樣本信號較高，線性范圍不寬。
[0095]根據(jù)以上結(jié)果，磁顆粒尺寸優(yōu)選I?3μηι，磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度優(yōu)選1000-8000高斯。
[0096]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1.一種檢測全血中肌酸激酶同工酶的磁微粒化學(xué)發(fā)光微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括頂板(I)結(jié)構(gòu)和底板(2)結(jié)構(gòu)，用膠帶(19和20)密封，其中頂板(I)上的氣栗(3)、加樣口( 4)、樣本填充區(qū)(12)、標(biāo)記抗體存儲池(5)和樣本混合區(qū)(13)依次連接;底板上的過濾區(qū)(6)、磁顆粒包被區(qū)(7)、清洗區(qū)(14)、檢測區(qū)(8)、液體釋放通道(16)依次連接;底板的檢測區(qū)(8)分別與清洗液存儲池(9)和發(fā)光基底液存儲池(10)通過液體釋放通道(16)連接;所述頂板(I)還包括蓋子(11);所述底板(2)還包括廢液池(15); 所述標(biāo)記抗體存儲池(5)存儲預(yù)封裝酶或發(fā)光劑標(biāo)記抗CK-MB抗體，磁顆粒包被區(qū)(7)包被預(yù)封裝磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體，清洗液存儲池(9)和發(fā)光基底液存儲池(10)存儲預(yù)封裝清洗液和發(fā)光基底液;所述微流控芯片測試流程中，用磁鐵操控磁顆粒移動或聚集;所述標(biāo)記抗體存儲池、清洗液存儲池和發(fā)光基底液存儲池為液體密封池，可通過外力擠壓而局部破裂，釋放液體;所述過濾區(qū)包含濾血膜。2.如權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于發(fā)光基底液保質(zhì)期少于I年時應(yīng)分開，用發(fā)光基底液存儲池A(23)和發(fā)光基底液存儲池B(24)替代發(fā)光基底液存儲池(10)，所述發(fā)光基底液存儲池A( 23)和發(fā)光基底液存儲池B (24)通過預(yù)混合通道(25)連接。3.如權(quán)利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述膠帶為雙面膠或單面膠;所述雙面膠由兩片單面膠代替。4.如權(quán)利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述頂板(I)還包括發(fā)光基底液和清洗液存儲池區(qū)域和磁鐵滑軌區(qū)域的讓位孔(17和18)，所述膠帶(19)還包括存儲池和樣本混合液流入過濾區(qū)時的讓位孔(21和22)。5.如權(quán)利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述儲存池的制備材料為玻璃、塑料、橡膠、鋁箔或高阻隔薄膜中的一種或多種。6.如權(quán)利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述預(yù)混合通道(25)為蛇形通道或上下結(jié)構(gòu)混合通道。7.如權(quán)利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體使用的磁顆粒為超順磁性顆粒，由鐵、鈷或鎳的化合物構(gòu)成;磁顆粒尺寸為0.1?ΙΟμ??，與磁珠匹配的磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為500-30000高斯。8.如權(quán)利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述磁顆粒標(biāo)記抗CK-MB抗體使用的磁顆粒包含三氧化二鐵和四氧化三鐵化合物，磁顆粒尺寸為I?3μπ?，與磁珠匹配的磁鐵磁感應(yīng)強(qiáng)度為1000-8000高斯。
【文檔編號】G01N33/573GK205599183SQ201520828568
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年10月26日
【發(fā)明人】王東, 李泉
【申請人】深圳華邁興微醫(yī)療科技有限公司