專利名稱：一種定量檢測(cè)肌鈣蛋白i/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白的熒光免疫層析方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以量子點(diǎn)可實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記的特性為基礎(chǔ)，利用量子點(diǎn)標(biāo)記抗體定量檢測(cè)生化標(biāo)志物的方法，特別公開了一種肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白定量檢測(cè)試劑盒，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白的定量檢測(cè)，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
心血管疾病對(duì)人類健康和生命的威脅很大，已成為醫(yī)學(xué)上的兩大難關(guān)之一，心血管疾病是全世界導(dǎo)致人類死亡的“頭號(hào)殺手”，我國(guó)有心血管疾病患者近2億人，每年死于心血管疾病者近300萬(wàn)人。因此建立一套可以準(zhǔn)確、快速、方便地預(yù)測(cè)和診斷癌癥、心血管疾病的檢測(cè)系統(tǒng)已迫在眉睫。心血管標(biāo)志物主要包括肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶 (CK-MB)、肌紅蛋白、D- 二聚體、C反應(yīng)蛋白等。目前對(duì)心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)主要是對(duì)單個(gè)標(biāo)志物指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。 本實(shí)用新型通過(guò)對(duì)多個(gè)指標(biāo)的快速檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)行全面的預(yù)測(cè)、 診斷和預(yù)后，對(duì)心血管疾病的預(yù)防和治療有著重要的指導(dǎo)意義。免疫層析(immunochromatography)是近十年來(lái)興起的一種快速診斷技術(shù)，具有精確、快速和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。膠體金免疫層析技術(shù)已經(jīng)在臨床檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用， 其基本原理是通過(guò)膠體金標(biāo)記物與分析物及包被抗體或抗原反應(yīng)形成膠體金本身的顏色 (紅色)，可通過(guò)肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果。但是對(duì)于某些抗原或抗體含量極低的樣本，膠體金的顏色很淺且很難用肉眼來(lái)判斷結(jié)果，靈敏度低。并且膠體金試紙條大多對(duì)單個(gè)標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)多個(gè)標(biāo)志物檢測(cè)時(shí)，易發(fā)生交叉干擾，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。量子點(diǎn)又叫半導(dǎo)體納米晶(quantum dots，QDs)，通常是由II-VI族或III-V族元素組成的穩(wěn)定的、尺寸介于1 20nm之間的納米微晶體。其具有許多優(yōu)良的光學(xué)特性(1) 量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜窄而對(duì)稱，熒光發(fā)射波長(zhǎng)可調(diào)，且覆蓋范圍可從紫外到近紅外區(qū)。 (2)量子點(diǎn)的吸收光譜寬且連續(xù)，可實(shí)現(xiàn)一元激發(fā)，多元發(fā)射，適合于多色標(biāo)記。(3)量子點(diǎn)具有較強(qiáng)的光學(xué)穩(wěn)定性。Cdk/ZnS量子點(diǎn)的光穩(wěn)定性是羅丹明6G的100倍以上。(4)量子點(diǎn)摩爾吸光系數(shù)可以高達(dá)106L/(mol ^m)，且熒光量子產(chǎn)率高(50 80% )，因而可產(chǎn)生較強(qiáng)熒光信號(hào)。( 量子點(diǎn)斯托克斯位移較大，熒光壽命長(zhǎng)(20 50ns)，使得信號(hào)可以顯著區(qū)分于背景和其它熒光基團(tuán)。量子點(diǎn)是一種理想的應(yīng)用于超靈敏和多組分生物化學(xué)分析的熒光探針。將量子點(diǎn)與抗體結(jié)合可應(yīng)用于熒光免疫分析和檢測(cè)。量子點(diǎn)高熒光特性結(jié)合層析試紙條簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)生化標(biāo)志物的快速、 靈敏檢測(cè)。并且利用量子點(diǎn)多色標(biāo)記的特性，可實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)物的同時(shí)檢測(cè)。肌紅蛋白是存在于肌肉組織中的一種亞鐵血紅素蛋白，當(dāng)肌肉細(xì)胞損傷后，由于分子量小，肌紅蛋白迅速釋放到血液中，2小時(shí)可異常增高。肌紅蛋白雖不夠特異但靈敏度很高，是目前心肌受損后最早發(fā)生異常的心血管標(biāo)志物，并具有很高的陰性排除價(jià)值。CK是由兩種不同亞基(M和B)組成的二聚體，這樣正常人體組織主要含3種同工酶，即CK-MM、CK-BB, CK-MB。CK-MM主要存在于肌肉細(xì)胞中，CK-BB主要存在于腦細(xì)胞中， CK-MB主要存在于心肌細(xì)胞中。CK-MB是目前常用的心肌損傷標(biāo)志物，曾一度被視為診斷 AMI的“金標(biāo)準(zhǔn)”。CK-MB在急性心肌梗死發(fā)病后4 他內(nèi)增高，24h達(dá)峰值，兩三天恢復(fù)正常。心肌肌鈣蛋白是由cTnl、cTnC以及cTnT組成的復(fù)合物，在肌肉收縮和舒張過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。其中，cTnC沒有心肌特異性，較少用于心肌損傷的檢查。在正常狀態(tài)下，cTnl和cTnT均不能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入血液循環(huán)，故健康人血內(nèi)不含或含極低量的cTnl、 cTnT ；當(dāng)心肌細(xì)胞受損后，cTnl及cTnT彌散進(jìn)人細(xì)胞間質(zhì)，較早的出現(xiàn)在外周血中。通常， 心肌肌鈣蛋白在發(fā)病后3 證即可升高，15 24h達(dá)高峰，持續(xù)時(shí)間久，5 10天后降至正常。cTnl在心肌中無(wú)其它亞型，特異性高于cTnT，此外其分子量亦小于cTnT，在AMI發(fā)病時(shí)，更早被釋放于血液中，因此cTnl更優(yōu)于cTnT，可謂目前診斷心肌梗死最好的心肌損傷標(biāo)志物。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朇N200510025494. X和CN200520041211. 6公布了一種心血管疾病的診斷和預(yù)測(cè)多指標(biāo)蛋白芯片檢測(cè)試劑盒，該試劑盒利用化學(xué)發(fā)光在蛋白芯片上進(jìn)行心肌肌鈣蛋白I、肌紅蛋白等八項(xiàng)指標(biāo)同時(shí)定性檢測(cè)。此法雖較敏感、準(zhǔn)確，但存在著操作繁瑣， 檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朇N200720140932. 1公布了一種人肌紅蛋白/肌酸激酶同工酶/ 心肌鈣蛋白I診斷試紙，該試紙利用顏色顆粒(如膠體金顆粒、染料顆粒)在常規(guī)試紙條進(jìn)行三項(xiàng)指標(biāo)的定性檢測(cè)。膠體金免疫層析法雖然具有簡(jiǎn)便快速便宜的優(yōu)勢(shì)，然而當(dāng)樣本中抗原或抗體含量極低時(shí)，膠體金的顏色將很淺，很難用肉眼來(lái)判斷結(jié)果，容易出現(xiàn)誤判，靈敏度較低，且三項(xiàng)指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)時(shí)，有一定的交叉干擾，易產(chǎn)生假陽(yáng)性。故現(xiàn)有多項(xiàng)標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)主要存在如下缺點(diǎn)1)膠體金免疫層析試紙條靈敏度低，線性范圍窄，有一定的交叉干擾。2)酶聯(lián)免疫和蛋白芯片存在操作繁瑣，檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題為針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)多項(xiàng)生化標(biāo)志物靈敏度低和標(biāo)志物間相互干擾的缺點(diǎn)，提供了一種檢測(cè)的熒光免疫層析方法。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種量子點(diǎn)多色標(biāo)記定量檢測(cè)肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白的熒光免疫層析方法，包括以下步驟步驟1)量子點(diǎn)多色標(biāo)記合成不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)，并用化學(xué)交聯(lián)分別將肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白的特異性抗體連接到不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)表面， 得到抗體修飾的量子點(diǎn)，所述不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)波長(zhǎng)范圍為550 1300nm ；步驟2、抗體包被混合三種步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)，并固定在標(biāo)記墊上，且標(biāo)記墊上同時(shí)固定有質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)，所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)與步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)不同，且波長(zhǎng)范圍為550 1300nm，在層析膜上分別設(shè)有質(zhì)控帶和至少三條定量帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶分別固定有對(duì)應(yīng)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶或肌紅蛋白的與對(duì)應(yīng)步驟1)所述抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻試紙條組裝以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊和底板構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板具低熒光特性；步驟4)熒光定量檢測(cè)試紙條免疫層析后，檢測(cè)定量帶和質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度， 并以質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度校正定量帶熒光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白的同時(shí)定量檢測(cè)。本發(fā)明提供的一種量子點(diǎn)多色標(biāo)記定量檢測(cè)肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白的熒光免疫層析方法是一種以不同激發(fā)波長(zhǎng)的量子點(diǎn)為熒光信號(hào)的，采用多色標(biāo)記技術(shù)，在免疫層析試紙條上同時(shí)實(shí)現(xiàn)肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白定量檢測(cè)的方法。本發(fā)明量子點(diǎn)多色標(biāo)記定量檢測(cè)肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白的熒光免疫層析方法能夠解決現(xiàn)有熒光免疫層析技術(shù)中背景與信號(hào)難區(qū)分、靈敏度低、生化標(biāo)志物檢測(cè)時(shí)相互干擾的不足和缺陷，可實(shí)現(xiàn)對(duì)微量樣本中多項(xiàng)標(biāo)志物的同時(shí)檢測(cè)。由于量子點(diǎn)熒光受激發(fā)光干擾很小，靈敏度大大提高，其靈敏度是用傳統(tǒng)染料和有色標(biāo)記物檢測(cè)方法的10 1000倍。為了提高與背景的區(qū)分度，本發(fā)明選用發(fā)射光波長(zhǎng)為550 1300 nm的量子點(diǎn)。因?yàn)樵谧贤庹丈湎?，層析膜、底板和扣卡的熒光?qiáng)度在^Onm以下遠(yuǎn)強(qiáng)于550nm以上，從而對(duì)低濃度CK-MB檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生一定的影響，故可優(yōu)選發(fā)射波長(zhǎng)大于550nm的量子點(diǎn)。另外層析膜、底板和扣卡在近紅外區(qū)域(750 1300nm)熒光強(qiáng)度極弱，并結(jié)合量子點(diǎn)合成技術(shù)，優(yōu)選近紅外波長(zhǎng)的量子點(diǎn)(750 1300nm)可進(jìn)一步提高靈敏度。本發(fā)明所用量子點(diǎn)包含單一化合物形成的量子點(diǎn)或是幾種化合物組裝成的復(fù)合物量子點(diǎn)，且量子點(diǎn)具有較強(qiáng)的光穩(wěn)定性。形成量子點(diǎn)的化合物是從aiS、CdS、HgS、MgS、 CdSe, MgSe, ZnSe、PbSe、PbSe, CdTe, MgTe, ZnTe, HgTe, InAs, InP 組成的組中選擇的，且可摻雜Cu、Mn和Hg。本發(fā)明采用四種不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)分別修飾肌鈣蛋白I抗體、肌酸激酶同工酶抗體、肌紅蛋白抗體和質(zhì)控分子，以減少量子點(diǎn)非特異性吸附和標(biāo)志物間的交叉干擾，對(duì)定量檢測(cè)的影響，其中不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)具有相同的電性，且不同量子點(diǎn)發(fā)射峰之間
重疊很少。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的實(shí)施例中，使用有機(jī)相方法合成570nm和630nm的CdSe/ SiS，和690nm和750nm的CdTe/CdSe，并把量子點(diǎn)由脂溶性轉(zhuǎn)為水溶性，此過(guò)程中量子點(diǎn)熒
光無(wú)明顯變化。作為優(yōu)選，在本發(fā)明實(shí)施例中，標(biāo)記墊中肌鈣蛋白I抗體、肌酸激酶同工酶抗體和肌紅蛋白抗體修飾的量子點(diǎn)發(fā)射波長(zhǎng)分別為750nm、690nm和630nm，質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)為570nm。本發(fā)明中采用化學(xué)交聯(lián)將抗體修飾到量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)。其中抗體分別為肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶或肌紅蛋白的一個(gè)或多個(gè)抗原表位的抗體。本發(fā)明中的化學(xué)交聯(lián)為當(dāng)量子點(diǎn)表面有活性基團(tuán)，可與抗體或質(zhì)控分子直接反
6應(yīng)時(shí)，不需用化學(xué)交聯(lián)劑，反之用化學(xué)交聯(lián)劑把抗體修飾到量子點(diǎn)表面。在本發(fā)明的實(shí)施例中采用化學(xué)交聯(lián)法對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)分子修飾的方法為 利用1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、戊二醛等交聯(lián)劑將量子點(diǎn)表面的官能團(tuán)(如羧基、氨基)與蛋白質(zhì)分子(如抗原、抗體等)表面的官能團(tuán)(如氨基、羧基、醛基等)連接。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用EDC/NHS交聯(lián)法對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行修飾。其中 EDC/NHS交聯(lián)法對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行抗體修飾的一般步驟為將量子點(diǎn)溶液與EDC和NHS混合，然后加入一定量的抗體，以緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)，培育4h，加入L-甘氨酸封閉，以色譜、層析柱或超濾離心等方式純化，從而得到抗體修飾的量子點(diǎn)。分別將肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白的特異性抗體修飾到750nm、690nm和630nm的量子點(diǎn)表面，將質(zhì)控分子修飾到 570nm的量子點(diǎn)表面。為了降低對(duì)量子點(diǎn)熒光信號(hào)的影響，本發(fā)明采用弱熒光層析膜、低熒光底板和低熒光扣卡，從而保證獲得高熒光信背比，能良好區(qū)分信號(hào)與背景，進(jìn)而提高檢測(cè)靈敏度。作為優(yōu)選，在本發(fā)明實(shí)施例中，底板(8)為黑色，表面附有不干膠，且層析膜G)、 扣卡(11)、底板(8)和不干膠均不含有熒光劑。如扣卡含有潤(rùn)濕孔(1 時(shí)，則潤(rùn)濕孔可在層析膜的近樣品墊一端或在近吸水墊一端。為區(qū)別于膠體金免疫層析試紙條的檢測(cè)帶，本發(fā)明中層析膜上固定分析物配體的區(qū)域稱為定量帶，用于準(zhǔn)確定量檢測(cè)分析物的濃度，并以質(zhì)控帶作內(nèi)質(zhì)控校正定量帶，以減弱樣本、環(huán)境因素等的影響。本發(fā)明的免疫層析試紙條可采取常規(guī)的層析方式，作為優(yōu)選，本發(fā)明采用預(yù)潤(rùn)免疫層析進(jìn)行分析物檢測(cè)。其中預(yù)潤(rùn)免疫層析試紙條有直接和間接預(yù)潤(rùn)兩種，直接預(yù)潤(rùn)免疫層析試紙條由樣品墊⑴、過(guò)濾膜⑵、標(biāo)記墊⑶、層析膜⑷、吸水墊(7)和底板⑶組成， 如圖1所示。本發(fā)明的實(shí)施例中為間接預(yù)潤(rùn)免疫層析試紙條，由樣品墊(1)、過(guò)濾膜( 、標(biāo)記墊(3)、層析膜、潤(rùn)濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(7)和底板(8)組成，如圖2所示。在標(biāo)記墊上固定有鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白的特異性抗體分別修飾的量子點(diǎn)， 以及質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)。在試紙條層析膜上分別設(shè)有三條定量帶和兩條質(zhì)控帶，其中質(zhì)控帶固定有能與質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，三條定量帶分別固定有肌鈣蛋白I抗體、肌酸激酶同工酶抗體和肌紅蛋白抗體，其中定量帶上對(duì)應(yīng)抗體與標(biāo)記墊上抗體的抗原決定簇不同，但肌鈣蛋白I能與量子點(diǎn)表面的肌鈣蛋白I抗體和定量帶上的肌鈣蛋白I抗體形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，肌酸激酶同工酶能與量子點(diǎn)表面的肌酸激酶同工酶抗體和定量帶上的肌酸激酶同工酶抗體形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)，肌紅蛋白能與量子點(diǎn)表面的肌紅蛋白抗體和定量帶上的肌紅蛋白抗體形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，發(fā)明人所選用的待測(cè)樣本為血清，且樣本進(jìn)一步包含全血和血漿。當(dāng)樣本為全血時(shí)，熒光免疫層析試紙條還包括在標(biāo)記墊與層析膜之間設(shè)置的過(guò)濾膜，用于凝固、過(guò)濾紅細(xì)胞，該過(guò)濾膜可分別與樣品墊和標(biāo)記墊直接毛細(xì)作用接觸，如圖1 所示，也可與標(biāo)記墊和層析膜直接毛細(xì)作用接觸。本發(fā)明實(shí)施例采用預(yù)潤(rùn)免疫層析方法對(duì)樣本中的肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。其中預(yù)潤(rùn)免疫層析為加入一定體積的緩沖液到層析膜上，目的是預(yù)潤(rùn)濕層析膜，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，以使量子點(diǎn)標(biāo)記物均勻通過(guò)層析膜，且減少在層析膜上的非特異性吸附，并減緩樣本流動(dòng)速度，從而增加特異性結(jié)合。其中緩沖液體積一般為 20 80 μ 1，潤(rùn)濕時(shí)間一般為30秒 2分鐘，而樣本層析時(shí)間一般為8 25分鐘。本發(fā)明的預(yù)潤(rùn)免疫層析可為將緩沖液直接或間接滴加于層析膜。而將緩沖液間接滴加于層析膜時(shí)，熒光免疫層析試紙條還包括潤(rùn)濕墊和連接墊，其中潤(rùn)濕墊分別與層析膜和連接墊以毛細(xì)作用接觸，連接墊分別與潤(rùn)濕墊和吸水墊以毛細(xì)作用接觸。緩沖液通過(guò)潤(rùn)濕墊到達(dá)層析膜。本發(fā)明采用的緩沖液為ρΗ 7. 2 11的堿性緩沖液，且該緩沖液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性劑。其中表面活性劑可包括吐溫20、吐溫80、曲拉通Χ-100、聚乙二醇和聚乙烯基吡咯烷酮等。作為優(yōu)選，本發(fā)明實(shí)施例中，使用緩沖液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH 9. 0 的磷酸緩沖液。本發(fā)明的檢測(cè)用熒光定量?jī)x包含激發(fā)光源模塊、濾光模塊、光電轉(zhuǎn)換模塊、控制分析模塊和軟件系統(tǒng)。其中激發(fā)光源模塊包含光源和聚光裝置，該光源為發(fā)光二極管或激光二極管，波長(zhǎng)選擇300 400nm之間或500 600nm之間。濾光模塊包含濾光片輪，該濾光片輪包含不同種濾光片，以獲取相應(yīng)量子點(diǎn)的熒光信號(hào)。光電轉(zhuǎn)換模塊包含圖像傳感器或光電倍增管。層析結(jié)束后，在光源激發(fā)下，試紙條產(chǎn)生的熒光信號(hào)，經(jīng)過(guò)濾光模塊濾除雜散光及背景熒光，到達(dá)光電轉(zhuǎn)換模塊，轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。其中所獲質(zhì)控帶與定量帶的熒光強(qiáng)度有一定相關(guān)性，主要影響因素有溫度、濕度、基質(zhì)等。本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果的判定方法為如果質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度值超過(guò)熒光定量?jī)x內(nèi)部設(shè)定的可接受值，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果無(wú)效；在檢測(cè)結(jié)果有效的前提下，定量帶熒光強(qiáng)度與質(zhì)控帶比值越高，表示相應(yīng)標(biāo)志物濃度越高，反之越低。本發(fā)明采用熒光定量?jī)x檢測(cè)一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度與所對(duì)應(yīng)的校正熒光信號(hào)強(qiáng)度關(guān)系曲線，關(guān)系式為F = f (C)。校正熒光信號(hào)強(qiáng)度為F= aFg—A^j^，其中α為校正系數(shù)，受溫度、濕度和基質(zhì)等影響。然后檢測(cè)樣本，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白的濃度。本發(fā)明還提供了一種量子點(diǎn)多色標(biāo)記定量檢測(cè)肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白的熒光免疫層析試劑盒，包括緩沖液、扣卡(U)和熒光免疫層析試紙條，如圖3所示。該試劑盒采用間接預(yù)潤(rùn)免疫層析方法?？劭?11)為熒光免疫層析試紙條的外部殼結(jié)構(gòu)，包括上樣孔(12)、視窗(14)和潤(rùn)濕孔(13)，且具低熒光特性，或?yàn)椴缓瑹晒鈩?。熒光免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)如圖2所示，其包含樣品墊(1)、標(biāo)記墊(3)、層析膜0)、 潤(rùn)濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(7)和底板(8)。層析膜(4)包含質(zhì)控帶( 和定量帶 (6)。其中樣品墊(1)、標(biāo)記墊(3)、層析膜(4)、潤(rùn)濕墊(9)、連接墊(10)和吸水墊(7)搭載于底板(8)之上，樣品墊(1)連接于標(biāo)記墊(3)，且位于上樣孔(12)的下方，標(biāo)記墊(3)連接于層析膜G)，層析膜(4)上固定有兩條質(zhì)控帶( 和三條定量帶(6)，且質(zhì)控帶(5)位于定量帶(6)的兩側(cè)，三條定量帶分別對(duì)應(yīng)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白的檢測(cè)區(qū)域，層析膜(4)位于視窗(14)的下方，層析膜(4)連接于潤(rùn)濕墊(9)，且潤(rùn)濕墊(9)位于潤(rùn)濕孔(13)的下方，潤(rùn)濕墊(9)連接于連接墊(10)，連接墊(10)連接于吸水墊(7)
8
進(jìn)行全血樣本層析時(shí)，試紙條還包括過(guò)濾膜O)，具體結(jié)構(gòu)如圖2所示，其中試紙條包含樣品墊(1)、標(biāo)記墊(3)、層析膜(4)、潤(rùn)濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(7)、底板(8) 和過(guò)濾膜O)。過(guò)濾膜連接于樣品墊(1)與標(biāo)記墊C3)之間。本發(fā)明構(gòu)建的預(yù)潤(rùn)免疫層析試紙條，其特征是，增加潤(rùn)濕墊(9)和連接墊(10)，其中潤(rùn)濕墊分別與層析膜(4)和連接墊(10)毛細(xì)作用接觸，用于減小滴加緩沖液時(shí)，緩沖液對(duì)層析膜的沖擊，以潤(rùn)濕層析膜(4)，并減少非特異性吸附。而連接墊(10)分別與潤(rùn)濕墊(9)和吸水墊(7)毛細(xì)作用接觸，具有緩慢的吸水速度，以減少潤(rùn)濕時(shí)的吸水量，促使緩沖液充分潤(rùn)濕層析膜G)，當(dāng)加樣本層析時(shí)，吸水墊(7) 可通過(guò)連接墊(10)吸水，促使樣本層析。試紙條的層析膜(4)具有弱熒光特性，優(yōu)選不含熒光劑，其熒光噪聲且在大于 550nm時(shí)很弱，以減少對(duì)低濃度目標(biāo)物檢測(cè)的影響。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下1)本發(fā)明方法采用量子點(diǎn)作為特異性抗體的標(biāo)記物，與有機(jī)熒光染料相比，具有發(fā)光強(qiáng)度高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命長(zhǎng)、表面修飾多功能化及穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。 并優(yōu)選了 550 1300nm的量子點(diǎn)，以提高與背景的區(qū)分度。2)本發(fā)明試劑盒的組成部件中的扣卡、底板以及層析膜在大于550nm時(shí)均具有低的熒光特性，以減少對(duì)量子點(diǎn)熒光信號(hào)獲取的影響，從而保證獲得高的熒光信背比，進(jìn)而達(dá)到提高靈敏度的目的。3)本發(fā)明采用熒光定量?jī)x檢測(cè)定量帶和質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度，并以質(zhì)控帶校正定量帶熒光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而依據(jù)熒光定量?jī)x獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)分析物的定量檢測(cè)。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度(c)與所對(duì)應(yīng)的校正熒光信號(hào)強(qiáng)度(F)的關(guān)系曲線，關(guān)系式為F = f(C)。校正熒光信號(hào)強(qiáng)度為F= aFg^/Fgi，其中α為校正系數(shù)，受溫度、濕度和基質(zhì)等影響。然后檢測(cè)樣本，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中分析物濃度。4)本發(fā)明改變量子點(diǎn)的粒徑或種類，就可得到不同波長(zhǎng)的熒光，用不同類型的量子點(diǎn)標(biāo)記不同的抗體，可產(chǎn)生多色熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)多組分的同時(shí)檢測(cè)；利用量子點(diǎn)多色標(biāo)記技術(shù)，減少質(zhì)控分子對(duì)分析物檢測(cè)的影響，也可減少分析物間的交叉干擾和假陽(yáng)性，方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，有利于同時(shí)高靈敏定量檢測(cè)多種分析物。5)本發(fā)明可利用預(yù)潤(rùn)免疫層析技術(shù)，增強(qiáng)特異性結(jié)合，減少非特異性吸附，增強(qiáng)試劑盒的檢測(cè)靈敏度，有利于樣品中肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白含量極低時(shí)的準(zhǔn)
確定量。6)本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、成本低，且靈敏很高。與傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法檢測(cè)肌酸激酶同工酶相比，具有操作簡(jiǎn)便、快速、不需昂貴的檢測(cè)設(shè)備，適合單人份或小批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)；與常規(guī)膠體金免疫層析方法相比，本發(fā)明具有標(biāo)記穩(wěn)定性好、非特異性低、靈敏度高、線性范圍寬以及定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。


圖1為直接預(yù)潤(rùn)免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，2為過(guò)濾膜，3為標(biāo)記墊，4為層析膜，5為質(zhì)控帶，6為定量帶，7為吸水墊，8為底板；圖2為間接預(yù)潤(rùn)免疫層析試紙條的組裝示意圖，其中1為樣品墊，3為標(biāo)記墊，4
9為層析膜，5為質(zhì)控帶，6為定量帶，7為吸水墊，8為底板，9為潤(rùn)濕墊，10為連接墊；圖3為熒光免疫層析試劑盒示意圖，其中11為扣卡，12為上樣孔，13為潤(rùn)濕孔，14 為視窗，5為質(zhì)控帶，6為定量帶。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種量子點(diǎn)多色標(biāo)記定量檢測(cè)肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白的熒光免疫層析方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及其試劑盒已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明的技術(shù)方案為步驟1)量子點(diǎn)多色標(biāo)記合成不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)，并用化學(xué)交聯(lián)分別將肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白的特異性抗體連接到不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)表面， 得到抗體修飾的量子點(diǎn)，所述不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)波長(zhǎng)范圍為550 1300nm ；步驟2、抗體包被混合三種步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)，并固定在標(biāo)記墊上，且標(biāo)記墊上同時(shí)固定有質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)，所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)與步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)不同，且波長(zhǎng)范圍為550 1300nm，在層析膜上分別設(shè)有質(zhì)控帶和至少三條定量帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶分別固定有對(duì)應(yīng)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶或肌紅蛋白的與對(duì)應(yīng)步驟1)所述抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟幻試紙條組裝以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊和底板構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板具低熒光特性；步驟4)熒光定量檢測(cè)試紙條免疫層析后，檢測(cè)定量帶和質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度， 并以質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度校正定量帶熒光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白的同時(shí)定量檢測(cè)。采用雙抗體夾心法原理定量檢測(cè)人樣本(全血、血清或血漿)中生化標(biāo)志物(如肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白)含量。檢測(cè)時(shí)，首先向潤(rùn)濕孔中滴加緩沖液，然后將樣本滴加到上樣孔中樣本先與標(biāo)記墊中的量子點(diǎn)標(biāo)記物相混合，并沿著層析膜向吸水墊方向毛細(xì)運(yùn)動(dòng)，分別流經(jīng)層析膜上的定量帶和質(zhì)控帶。若樣本中含有生化標(biāo)志物，則生化標(biāo)志物與對(duì)應(yīng)的量子點(diǎn)表面的生化標(biāo)志物抗體相結(jié)合，當(dāng)層析至定量帶時(shí)，會(huì)被預(yù)先包被于相應(yīng)條帶的能與對(duì)應(yīng)生化標(biāo)志物結(jié)合的抗體相結(jié)合，從而構(gòu)成雙抗體夾心復(fù)合物。光源激發(fā)下，采用熒光定量?jī)x獲取定量帶和質(zhì)控帶的熒光信號(hào)強(qiáng)度，依據(jù)熒光定量?jī)x獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而分析樣本中生化標(biāo)志物(肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白)的濃度。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1 量子點(diǎn)熒光多色標(biāo)記后采用間接預(yù)潤(rùn)免疫層析對(duì)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白的定量檢測(cè)(一 )量子點(diǎn)合成及修飾
取0. 2375g硒粉、2. 60mL十八烯和1. 57mL三正辛基膦，依次加入25ml小試劑瓶中，加熱瓶中混合液體并反復(fù)振蕩直至硒粉全部溶解，即得硒前體。另取0. 0368g氧化鎘、 0. 342g硬脂酸和3. 8ml十八烯，依次加入三頸燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至氧化鎘全部溶解。 降溫使溶液冷卻至凝固。取2. 25g十八胺和0. 95g三辛基氧化膦，加入三頸燒瓶，并加熱使固體融解，繼續(xù)加熱至280°C，注入4. 2mL硒前體，升溫至240°C，于不同反應(yīng)時(shí)間取樣獲得不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的Cdk量子點(diǎn)，并以甲醇純化量子點(diǎn)。取IOmL十八烯、0. IlOg硫粉，依次加入三頸燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至硫粉溶解，即得硫前體。另取0. 8375g氧化鋅、9mL油酸和2mL十八烯，依次加入三頸燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至鋅粉溶解，即得鋅前體。加入anl Cdk量子點(diǎn)溶液，加入三頸燒瓶中，抽真空去除氯仿，取以上合成的硫前體和鋅前體，以及5mL十八烯和1. 4g十八胺，依次加入三頸燒瓶中，加熱使固體融解，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱使量子點(diǎn)生長(zhǎng)至所需波長(zhǎng)，并以甲醇純化。同理，加入其他熒光發(fā)射波長(zhǎng)的Cdk量子點(diǎn)獲得所需波長(zhǎng)的Cdk/ZnS量子點(diǎn)。表征量子點(diǎn)熒光特征，合成CcKe/ZnS量子點(diǎn)熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別為570nm、630nm，量子產(chǎn)率大于50%。同理獲得690nm和750nm CdTe/CdSe量子點(diǎn)。取0. 5 1. Og四甲基氫氧化銨五水合物，加入0. 1 Iml巰基丙酸和IOml氯仿， 搖均，靜置30分鐘后，去除上層液體，然后加入100 μ 1量子點(diǎn)溶液。溶液中有紅色沉淀析出，48小時(shí)后取出紅色懸浮物，以氯仿純化后，溶于水溶液中，得到表面官能團(tuán)為羧基的量子點(diǎn)。量子點(diǎn)相轉(zhuǎn)移前后熒光特性無(wú)明顯變化。向ρΗ7· 4磷酸緩沖液中加入60pmol量子點(diǎn)(發(fā)射波長(zhǎng)為750nm)、10 μ g EDC和 15 μ g NHS溶液和10 30 μ g的肌鈣蛋白I的單抗，混合均勻于室溫下反應(yīng)4h，然后加入 Img甘氨酸封閉。用色譜柱或?qū)游鲋蛛x純化，得到肌鈣蛋白I單抗修飾的量子點(diǎn)。同理得到肌酸激酶同工酶單抗修飾的量子點(diǎn)(690nm)、肌紅蛋白單抗修飾的量子點(diǎn)(630nm)和羊抗兔抗體修飾的量子點(diǎn)(570nm)。( 二)試劑盒構(gòu)建以摩爾比1 :2:5: 1的比例混合均勻以上四種量子點(diǎn)標(biāo)記物(依次為肌鈣蛋白I肌單抗、酸激酶同工酶單抗、肌紅蛋白單抗和羊抗兔抗體修飾的量子點(diǎn))，其中混合液中含有1 15%蔗糖、0.05 0.5%牛血清白蛋白(B SA)和吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100 等表面活性劑，其中表面活性劑含量在0.01 之間，然后均勻噴涂在標(biāo)記墊上，37°C干燥后密封，4°C下保存。以劃膜儀在弱熒光層析膜上劃四條平行條帶，條帶間隔3 4mm，條帶寬都約為 1mm。其中兩側(cè)的兩條為質(zhì)控帶，中間三條為定量帶，以樣本層析方向，第一、二、三條為定量帶分別包被肌鈣蛋白I肌多抗、肌酸激酶同工酶多抗、肌紅蛋白多抗。質(zhì)控帶上噴涂兔免疫球蛋白(兔IgG)，濃度分別為0. 2 lmg/ml和1 3mg/ml ；第一定量帶噴涂的肌鈣蛋白I多抗?jié)舛葹?. 5 2mg/ml ；第二定量帶噴涂肌酸激酶同工酶BB (CK-MM)多抗，濃度為 0. 5 2mg/ml ；第三定量帶噴涂肌紅蛋白多抗，濃度為0. 5 2mg/ml。37°C干燥后密封，4°C 下保存。在黑色底板上，依次粘貼上層析膜(長(zhǎng)30cm，寬2. 5cm)、標(biāo)記墊(長(zhǎng)30cm，寬8mm)、 過(guò)濾膜(長(zhǎng)3Ocm,寬l6mm)、樣品墊(長(zhǎng)3Ocm,寬l6mm)、連接墊(長(zhǎng)3Ocm,寬IOmm)、潤(rùn)濕墊 (長(zhǎng)30cm，寬IOmm)和吸水墊(長(zhǎng)30cm，寬16mm)。膜與膜之間都要緊密相連，制成熒光免疫層析試紙大板，示意圖如圖2所示。用切條機(jī)將粘貼好的試紙大板縱向切成4mm寬的試紙條，放入低熒光扣卡中組裝成不含緩沖液的免疫層析試劑盒，如圖3所示，干燥后密封， 與緩沖液共同構(gòu)建為熒光免疫層析試劑盒，4°C避光保存。
(三)樣本檢測(cè)
用正常人血清作稀釋液，將肌鈣蛋白I標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液如下 0. 05ng/mL、0. lng/mL、0. 2ng/mL、0. 4ng/mL、0. 8ng/mL、l. 6ng/mL、3. 2ng/mL、6. 4ng/mL、 12. 8ng/mL、25. 6ng/mL、51. 2ng/mL和 102. 4ng/mL。
用正常人血清作稀釋液，將肌酸激酶同工酶標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液如下0. 25ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、16ng/mL、32ng/mL、64ng/mL、 128ng/mL 禾口 256ng/mL。
用正常人血清作稀釋液，將肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液如下 2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL、640ng/mL、 1280ng/mL 和 2560ng/mL。
緩沖液為含有0· 05 0· 2% BSA和0. 05 1 % Tween-20的pH9. 0磷酸緩沖液。 層析時(shí)先將50 μ 1緩沖液滴加到潤(rùn)濕孔中，1分鐘后，將100 μ 1陰性血清或標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別滴加到上樣孔中，Hmin后，以熒光定量?jī)x檢測(cè)(每個(gè)樣本分別用3個(gè)試紙條測(cè)定3次，取平均值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別滴加不同標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品，可獲得不同標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
將50 μ 1緩沖液滴加到潤(rùn)濕孔中，1分鐘后，將100 μ 1血清樣本滴加到上樣孔中， 13分鐘后以熒光定量?jī)x檢測(cè)，根據(jù)不同定量帶的熒光強(qiáng)度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣本中肌鈣蛋白I肌、酸激酶同工酶和肌紅蛋白的濃度。
結(jié)果表明，肌鈣蛋白I最低檢測(cè)限為0. Ing/mL，最低定量限為0. 2ng/mL,CK-MB最低檢測(cè)限為0. 5ng/mL，最低定量限為Ing/mL，肌紅蛋白最低檢測(cè)限為5ng/mL，最低定量限為lOng/mL，在定量檢測(cè)范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均R2 > 0. 99，未出現(xiàn)HOOK效應(yīng)，且批內(nèi)與批間重復(fù)性均較好，可為心血管疾病診斷提供參考。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求
1.一種量子點(diǎn)多色標(biāo)記定量檢測(cè)肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白的熒光免疫層析方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1)量子點(diǎn)多色標(biāo)記合成不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)，并用化學(xué)交聯(lián)分別將肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白的特異性抗體連接到不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)表面，得到抗體修飾的量子點(diǎn)，所述不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)波長(zhǎng)范圍為550 1300nm ；步驟2、抗體包被混合三種步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)，并固定在標(biāo)記墊上，且標(biāo)記墊上同時(shí)固定有質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)，所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)與步驟1)得到的抗體修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)不同，且波長(zhǎng)范圍為550 1300nm，在層析膜上分別設(shè)有質(zhì)控帶和至少三條定量帶，其中質(zhì)控帶固定有能與所述質(zhì)控分子特異性結(jié)合的生物分子，定量帶分別固定有對(duì)應(yīng)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶或肌紅蛋白的與對(duì)應(yīng)步驟1) 所述抗體不同抗原決定簇的特異性抗體；步驟3)試紙條組裝以樣品墊、標(biāo)記墊、層析膜、吸水墊和底板構(gòu)建成熒光免疫層析試紙條，其中所述層析膜為弱熒光層析膜，底板具低熒光特性；步驟4)熒光定量檢測(cè)試紙條免疫層析后，檢測(cè)定量帶和質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度，并以質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度校正定量帶熒光信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白的同時(shí)定量檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)波長(zhǎng)為750nm、690nm或630nm，步驟2、所述質(zhì)控分子修飾的量子點(diǎn)的發(fā)射波長(zhǎng)為 570nmo
3.如權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述量子點(diǎn)為單一化合物形成的量子點(diǎn)或幾種化合物組成的復(fù)合量子點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求2所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述化合物為選自aiS、CdS、 HgS、MgS、CdSe、MgSe、ZnSe、PbSe、PbSe、CdTe、MgTe、ZnTe、HgTe,InAs, InP ψ 的任意一種或幾種，且可摻雜Cu、Mn和Hg。
5.如權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟1)所述不同發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)具有相同的電性，且不同量子點(diǎn)發(fā)射峰之間重疊很少，或不重疊。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述層析膜在大于 550nm處熒光很弱或不含熒光劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述底板為黑色，表面附有不干膠，且兩者均不含熒光劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟幻所述熒光免疫層析試紙條還包括能使樣本中液體與細(xì)胞分離的過(guò)濾膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟4)所述免疫層析為預(yù)潤(rùn)免疫層析，其中預(yù)潤(rùn)免疫層析為先以緩沖液預(yù)潤(rùn)層析膜，再加入樣本到樣品墊中，樣本流經(jīng)定量帶和質(zhì)控帶后，進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述預(yù)潤(rùn)層析膜為將緩沖液直接滴加于層析膜。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，當(dāng)所述預(yù)潤(rùn)層析膜為將緩沖液間接滴加于層析膜時(shí)，步驟幻所述熒光免疫層析試紙條還包括潤(rùn)濕墊和連接墊，其中潤(rùn)濕墊分別與層析膜和連接墊以毛細(xì)作用接觸，連接墊分別與潤(rùn)濕墊和吸水墊以毛細(xì)作用接觸。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述緩沖液為pH7. 2 11的堿性緩沖液。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述堿性緩沖液為包含牛血清白蛋白、酪蛋白和表面活性劑的堿性緩沖液。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述堿性緩沖液為包含牛血清白蛋白和吐溫20的pH9. 0的磷酸緩沖液。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，步驟4)所述熒光定量檢測(cè)為通過(guò)檢測(cè)層析膜上定量帶和質(zhì)控帶熒光信號(hào)強(qiáng)度，并依據(jù)熒光定量?jī)x獲取的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比分析實(shí)現(xiàn)的。
16.一種定量檢測(cè)心肌肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白的熒光免疫層析試劑盒，包括緩沖液、扣卡(11)和熒光免疫層析試紙條，其特征在于，所述扣卡(11)為熒光免疫層析試紙條的外部殼結(jié)構(gòu)，包括上樣孔(12)、視窗(14)和潤(rùn)濕孔(1 ；所述熒光免疫層析試紙條包括樣品墊(1)、標(biāo)記墊(3)、層析膜、潤(rùn)濕墊(9)、連接墊(10)、吸水墊(7)和底板(8)，其中樣品墊(1)、標(biāo)記墊(3)、層析膜(4)、潤(rùn)濕墊(9)、連接墊(10)和吸水墊(7)搭載于底板(8)之上，樣品墊(1)連接于標(biāo)記墊(3)，且位于上樣孔(12)的下方，標(biāo)記墊(3) 連接于層析膜G)，層析膜(4)上固定有兩條質(zhì)控帶( 和三條定量帶(6)，且質(zhì)控帶(5) 位于定量帶(6)的兩側(cè)，三條定量帶分別對(duì)應(yīng)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶和肌紅蛋白的檢測(cè)區(qū)域，層析膜(4)位于視窗(14)的下方，層析膜(4)連接于潤(rùn)濕墊(9)，且潤(rùn)濕墊(9)位于潤(rùn)濕孔(13)的下方，潤(rùn)濕墊(9)連接于連接墊(10)，連接墊(10)連接于吸水墊(7)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的熒光免疫層析試劑盒，其特征在于，所述熒光免疫層析試紙條還包括過(guò)濾膜O)，其中所述過(guò)濾膜( 分別與樣品墊(1)或?qū)游瞿?4)毛細(xì)作用接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的熒光免疫層析試劑盒，其特征在于，所述扣卡(11)具有低熒光特性，或不含熒光劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種量子點(diǎn)多色標(biāo)記定量檢測(cè)多項(xiàng)心血管疾病標(biāo)志物的方法，及心肌肌鈣蛋白I/肌酸激酶同工酶/肌紅蛋白的試劑盒。本發(fā)明的方法利用量子點(diǎn)優(yōu)良的熒光特性，結(jié)合熒光多色標(biāo)記技術(shù)和免疫層析技術(shù)，在優(yōu)化試紙條各組成部件的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)的熒光定量檢測(cè)。與常規(guī)膠體金免疫層析方法相比，本發(fā)明具有標(biāo)記穩(wěn)定性好、非特異性低、靈敏度高、線性范圍寬、交叉干擾小以及定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明試劑盒對(duì)肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)，適用于全血、血清和血漿樣本的檢測(cè)，可為心腦血管疾病診斷提供參考，可廣泛用于基層醫(yī)院和診所。
文檔編號(hào)G01N33/573GK102520192SQ20111045164
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者王東 申請(qǐng)人:深圳康美生物科技股份有限公司