一種檢測(cè)維生素c中脫氫維生素c的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)維生素C中脫氫維生素C的方法，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域；該方法采用液相色譜、HILIC親合色譜柱，乙腈??異丙醇?水為流動(dòng)相A相、乙腈?水為流動(dòng)相B相，梯度洗脫進(jìn)行分析，本技術(shù)方案可以迅速、準(zhǔn)確的分析出脫氫維生素C的含量，該方法的定量限可達(dá)0.38μg/ml，檢測(cè)限為0.11μg/ml，同時(shí)該方法的平均回收率為100.5％，在0.38μg/ml～77.75μg/ml范圍內(nèi)，脫氫VC濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系；本發(fā)明公開(kāi)的液相方法也可以應(yīng)用于維生素C藥品、注射用復(fù)方維生素(3)及復(fù)方維生素(13)注射液穩(wěn)定性、降解等維生素質(zhì)量研究。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種檢測(cè)維生素 C中脫氫維生素 C的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)維生素 C中脫氫維生素 C的方法，特別涉及一種利用HILIC親 合柱測(cè)定脫氫維生素 C的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素 C是細(xì)胞氧化-還原反應(yīng)中的催化劑，人體自身不能合成，必須從食物中攝 取;食品中加入維生素 C兼有營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化和防變質(zhì)、保鮮等多重作用;其結(jié)構(gòu)式為：
[0003]
[0004] 分子式為C6H8〇6,分子量為176.13
[0005] 維生素 C不穩(wěn)定，極易被氧化分解，從而失去維生素 C的功效。當(dāng)在有氧條件下，維 生素(：被氧化為脫氫抗壞血酸（脫氫維生素〇，然后生成2,3-二氧代-1^-古洛糖酸（2,3-Dike-to-L-gulonic acid)，進(jìn)一步降解生成糠醛和羥基糠醛;脫氫抗壞血酸的生成標(biāo)志著 維生素 C已失去了活性，所以測(cè)定脫氫抗壞血酸具有重要的意義，其結(jié)構(gòu)式為：
[0006]
[0007] 分子式為C6H6〇6,分子量為174.11
[0008] 目前沒(méi)有關(guān)于維生素 C中脫氫維生素 C檢測(cè)分析方法的專(zhuān)利文獻(xiàn)，而在非專(zhuān)利文獻(xiàn) 中，張會(huì)輕等人研究了一種維生素 C中降解產(chǎn)物脫氫VC的HPLC測(cè)定方法(醫(yī)藥化工，2011.6 第34卷第6期），該文獻(xiàn)中公開(kāi)了采用高效液相色譜法，用氨基柱（250X4.6mm)對(duì)VC及脫氫 VC進(jìn)行分離測(cè)定，流動(dòng)相乙腈和三氟乙酸的比例為85:15,采用蒸發(fā)光檢測(cè)器，柱溫為100 °C;最后檢測(cè)脫氫VC和VC的保留時(shí)間分別為3.93min和4.45min，此文獻(xiàn)中公開(kāi)的脫氫VC的 檢測(cè)范圍為0.5-1.5mg/ml，平均回收率為101.2%;文獻(xiàn)抗壞血酸降解產(chǎn)物的色譜分析(袁 軍、華西藥學(xué)雜志，2001.16(4) :305-306)中公開(kāi)了采用光二極管陣列檢測(cè)器、硅膠柱，以 0.02mo 1/L的KH2PO4-乙腈（1:3)為流動(dòng)相，流速0.5ml/min，測(cè)試VC和脫氫VC的混合液，VC和 脫氫VC的混合液中兩峰保留時(shí)間分別為7.35min和5.46min;同時(shí)本文獻(xiàn)中公開(kāi)了利用硅膠 G板薄層板的方法測(cè)出的去氫抗壞血酸的最低檢出限為0.8ug。
[0009] 由于維生素 C極易被氧化分解失去維生素 C的功效，而以上檢測(cè)方法中脫氫維生素 C的最低檢測(cè)限較高，靈敏度不高，并且方法的回收率數(shù)值超過(guò)了 101 %，另外氨基柱和硅膠 柱的耐用性不高，蒸發(fā)光檢測(cè)器普及性差、靈敏度低等問(wèn)題，急需要一種靈敏度高、檢測(cè)限 低、回收率準(zhǔn)確的分析方法來(lái)檢測(cè)維生素 C中脫氫維生素 C的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明為解決以上問(wèn)題提供一種簡(jiǎn)單、快速分離分析維生素 C中的脫氫維生素 C的 高效液相色譜法，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)維生素 C的質(zhì)量控制。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0012] -種檢測(cè)維生素 C中脫氫維生素 C的方法，該方法采用高效液相色譜儀測(cè)定，其色 譜條件為：
[0013] 色譜柱:HILIC親合色譜柱；
[0014] 流速:0.8-1.2ml/min;
[0015] 柱溫：30-40 °C;
[0016] 紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：220-230nm;
[0017] 進(jìn)樣量：1〇-3〇μ1;
[0018] 流動(dòng)相:Α相：乙腈一異丙醇-水；
[0019] B相：乙腈-水；
[0020] 流動(dòng)相A、B按梯度程序進(jìn)行。
[0021] 上述HILIC親合色譜柱規(guī)格為:250mm X 4 · 6mm，5μπι。
[0022] 其中，流動(dòng)相:Α相中乙腈一異丙醇-水的體積比為:85~89:8~12:3;Β相中乙腈- 水的體積比為65~75:25~35;
[0023] 流動(dòng)相:Α相乙腈一異丙醇-水的體積比優(yōu)選為:86~87:9~11:3; Β相乙腈-水的體 積比優(yōu)選為：68~73:28~32;
[0024]優(yōu)選的進(jìn)樣溫度為35°C;
[0025] 優(yōu)選的進(jìn)樣量為20μ1。
[0026] 進(jìn)樣梯度程序?yàn)椋?br>[0027]
[0028]
[0029] 該方法可用于檢測(cè)注射用復(fù)方維生素(3)及復(fù)方維生素（13)注射液中脫氫維生素 C的含量，以便用于研究注射劑的穩(wěn)定性、降解性等性能。
[0030] 本發(fā)明的有益效果：
[0031] 1)通過(guò)采用紫外檢測(cè)器及HILIC親合色譜柱的技術(shù)，解決了蒸發(fā)光檢測(cè)器靈敏度 低、普及性差，以及氨基柱、硅膠柱等耐用性差的問(wèn)題，得到了靈敏度高、重復(fù)性好、可以準(zhǔn) 確定量檢測(cè)維生素 C中脫氫維生素 C的分析方法；
[0032] 2)經(jīng)過(guò)檢測(cè)，本發(fā)明的定量限為0.38μg/ml，檢測(cè)限為O.lUig/ml;表明該法檢測(cè)靈 敏度較高，滿(mǎn)足VC中微量脫氫VC的定性和定量檢測(cè)；
[0033] 3)在已知濃度的樣品中加入脫氫VC標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算回收率，其平均回收率為 100.5 %，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.01 %，達(dá)到分析要求；
[0034] 4)本發(fā)明在0.38μg/ml~77.75μg/ml范圍內(nèi)，脫氫VC濃度與峰面積呈良好的線性 關(guān)系，其線性回歸方程為A = 4.3953C-2.9546，r = 0.9998，其中C單位為μg/ml，A為峰面積， 該技術(shù)方案能檢測(cè)出較小范圍內(nèi)脫氫維生素 C的含量。
【附圖說(shuō)明】：
[0035]圖1是實(shí)施例3中脫氫VC的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
【具體實(shí)施方式】：
[0036]實(shí)施例1檢測(cè)限和定量限的檢測(cè)
[0037] 步驟（1)、精密稱(chēng)取脫氫VC對(duì)照品（含量為95.0% ) 19.91mg，置25ml量瓶中，加流動(dòng) 相B溶解并稀釋至刻度，搖勻；
[0038] 步驟(2)、精密量取步驟(1)中的溶液lml，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相B稀釋至刻度， 搖勻；
[0039] 步驟(3 )、精密量取步驟(2)中的溶液5ml，置100ml量瓶中，加流動(dòng)相B稀釋至刻度， 搖勻，作為待測(cè)溶液；
[0040] 步驟(4)、精密量取20μ1，注入液相色譜儀，信噪比S/N=10:1，將該溶液作為定量 限溶液，定量限濃度為0.38μg/ml;
[0041] 步驟(5)、精密量取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相B稀釋至刻度，搖勻， 精密量取20μ1，注入液相色譜儀，信噪比S/N = 3:1，將該溶液作為檢測(cè)限溶液，檢測(cè)限濃度 為0·llμg/ml。
[0042] 實(shí)施例2標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定
[0043] 步驟（1)、精密稱(chēng)取脫氫VC對(duì)照品（含量為95.0% )40.90mg，置50ml量瓶中，加流動(dòng) 相B溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；
[0044] 步驟（2)、精密量取步驟（1)中的溶液2.5ml、4ml、5ml、6ml、7.5ml、10ml，分別置 100ml量瓶中，加流動(dòng)相B稀釋至刻度，搖勻，分別作為線性溶液1、線性溶液2、線性溶液3、線 性溶液4、線性溶液5、線性溶液6;
[0045] 步驟(3)精密量取步驟(2)中的線性溶液1-6各20μ1，注入液相色譜儀，包括定量限 在內(nèi)，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，線性方程為A = 4.3953C-2.9546，C 單位為ug/ml，Α為峰面積;相關(guān)系數(shù)為r = 0.9998。
[0046] 實(shí)施例3脫氫VC回收率測(cè)定
[0047] 步驟（1)、稱(chēng)取VC原料藥約0.4g，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相B溶解并稀釋至刻度，搖 勻，作為待測(cè)溶液;精密稱(chēng)取脫氫VC對(duì)照品（含量為95.0 % ) 11.63mg，置25ml量瓶中，加流動(dòng) 相B溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液，精密量取lml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相 B稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；
[0048] 步驟(2)、精密稱(chēng)取VC原料藥約0.4g三份，各置10ml量瓶中，分別加對(duì)照品貯備液 0.8ml、1.0ml、1.2ml，用流動(dòng)相B溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別作為80 %、100 %、120 %組供 試品溶液，各個(gè)濃度水平平行配制3份。
[0049]步驟(3)、精密量取上述各溶液20μ1，注入液相色譜儀，以測(cè)得量與原有量之差與 加入量的比值，計(jì)算回收率，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如下表：
[0050]
[0051]
[0052] 實(shí)施例4 VC原料藥(已變性含脫氫VC)的測(cè)定 [0053]步驟1、供試品溶液的配制
[0054] 取脫氫VC對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相B溶解并稀釋至刻度， 搖勻，作為對(duì)照品貯備液;精密量取lml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相B稀釋至刻度，搖勻，作為 對(duì)照品溶液;取VC原料藥(已變性含脫氫VC)約0.4g，精密稱(chēng)定，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相B溶 解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
[0055]步驟2、液相色譜條件為：
[0056] 色譜柱:HILIC親合色譜柱；
[0057] 流速：1 .Oml/min;
[0058] 柱溫：35 Γ;
[0059] 檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器
[0060] 檢測(cè)波長(zhǎng)：226nm;
[0061] 進(jìn)樣量:20μ1。
[0062]流動(dòng)相:Α相：乙臆一異丙醇-水(87:10:3) ;Β相：乙臆-水(70:30);
[0063]流動(dòng)相Α、Β按如下梯度程序進(jìn)行：
[0064]
[0065]精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，按上述條件進(jìn)行分析，結(jié)果為：維生 素 C原料藥中脫氫維生素 C和維生素 C完全分離，分離度為6.21，脫氫VC出峰時(shí)間在 7.947min，VC出峰時(shí)間為10.850min，脫氫VC 含量為2.15μg/ml。
[0066]實(shí)施例5 VC原料藥(已變性含脫氫VC)的測(cè)定 [0067]步驟1、供試品溶液的配制
[0068] 取脫氫VC對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相B溶解并稀釋至刻度， 搖勻，作為對(duì)照品貯備液;精密量取lml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相B稀釋至刻度，搖勻，作為 對(duì)照品溶液;取VC原料藥(已變性含脫氫VC)約0.4g，精密稱(chēng)定，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相B溶 解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
[0069] 步驟2、色譜條件為：
[0070] 色譜柱:HILIC親合色譜柱；
[0071] 流速：1 .Oml/min;
[0072] 柱溫：35Γ;
[0073] 檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器 [0074]檢測(cè)波長(zhǎng)：226nm;
[0075] 進(jìn)樣量:20μ1。
[0076] 流動(dòng)相:Α相：乙腈一異丙醇-水(85:12:3) ;Β相：乙腈-水(75:25);
[0077]流動(dòng)相Α、Β按如下梯度程序進(jìn)行：
[0078]
[0079] 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，按上述條件進(jìn)行分析，結(jié)果可知，在 該條件下維生素 C原料藥中脫氫維生素 C和維生素 C完全分離，分離度為5.32，脫氫VC出峰時(shí) 間在8.005min，VC出峰時(shí)間為10.605min，脫氫VC含量為2.09μg/ml。
[0080]實(shí)施例6注射用復(fù)方維生素(3)中脫氫VC的測(cè)定(已發(fā)生變性，含脫氫VC)
[0081]步驟1、供試品溶液的配制
[0082] 取脫氫VC對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相B溶解并稀釋至刻度， 搖勻，作為對(duì)照品貯備液;精密量取lml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相B稀釋至刻度，搖勻，作為 對(duì)照品溶液;取注射用復(fù)方維生素(3)(已發(fā)生變性)約150mg，精密稱(chēng)定，置10ml量瓶中，加 流動(dòng)相B溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
[0083]步驟2、其色譜條件為：
[0084] 色譜柱:HILIC親合色譜柱；
[0085] 流速：0.8-1.2ml/min;
[0086] 柱溫：30-40 Γ;
[0087]檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器
[0088] 檢測(cè)波長(zhǎng)：220-230nm;
[0089] 進(jìn)樣量：20μ1。
[0090]流動(dòng)相:A相：乙腈一異丙醇-水(89:8:3) ;B相：乙腈-水(65:35);
[0091]流動(dòng)相A、B按如下梯度程序進(jìn)行：
[0092]
[0093]精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，按上述條件進(jìn)行分析，結(jié)果為：在該 條件下注射用復(fù)方維生素(3)中脫氫VC)的測(cè)定和維生素 C完全分離，分離度為5.46,脫氫VC 出峰時(shí)間在7.869min，VC出峰時(shí)間為10.392min，脫氫VC含量為2.54μg/ml。
[0094]實(shí)施例7復(fù)方維生素（13)中脫氫VC的測(cè)定(已發(fā)生變性，含脫氫VC)
[0095]步驟1、供試品溶液的配制
[0096] 取脫氫VC對(duì)照品約10mg，精密稱(chēng)定，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相B溶解并稀釋至刻度， 搖勻，作為對(duì)照品貯備液;精密量取lml，置10ml量瓶中，加流動(dòng)相B稀釋至刻度，搖勻，作為 對(duì)照品溶液;取復(fù)方維生素（13)(已發(fā)生變性，含脫氫VC)注射液10ml，置10ml量瓶中，搖勻， 作為供試品溶液。
[0097]步驟2、液相色譜條件為：
[0098] 色譜柱:HILIC親合色譜柱；
[0099] 流速：l.〇ml/min;
[0100] 柱溫:35°C;
[0101] 檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器
[0102] 檢測(cè)波長(zhǎng)：226nm;
[0103] 進(jìn)樣量:20μ1。
[0104] 流動(dòng)相:Α相：乙腈一異丙醇-水(87:10:3) ;Β相：乙腈-水(75:25);
[0105]流動(dòng)相Α、Β按如下梯度程序進(jìn)行：
[0106]
[0107]
[0108] 精密量取供試品溶液20μ1，注入液相色譜儀，按上述條件進(jìn)行分析，結(jié)果為:在該 條件下復(fù)方維生素（13)中脫氫VC的測(cè)定和維生素 C完全分離，分離度為5.85,脫氫VC出峰時(shí) 間在7.845min，VC出峰時(shí)間為10.489min，脫氫VC含量為3.56μg/ml。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)維生素 c中脫氨維生素 c的方法，其特征在于，采用高效液相色譜儀測(cè)定，其 色譜條件為： 色譜柱:HILIC親合色譜柱； iflL3E：〇.8-l .2ml/min； 柱溫:30-40 °C; 紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng):220-230nm; 進(jìn)樣量：1〇-3〇μ1; 流動(dòng)相:A相：乙臘--異丙醇-水； B相：乙臘-水； 流動(dòng)相A、B按梯度程序進(jìn)行。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)維生素 C中脫氨維生素 C的方法，其特征在于，所述 HILIC親合色譜柱規(guī)格為:250mm X 4.6mm，5皿。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)維生素 C中脫氨維生素 C的方法，其特征在于，所述流 動(dòng)相:A相中乙臘--異丙醇-水的體積比為:85~89:8~12:3; B相中乙臘-水的體積比為65~ 75:25~35。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)維生素 C中脫氨維生素 C的方法，其特征在于，所述流 動(dòng)相:A相乙臘--異丙醇-水的體積比優(yōu)選為：86~87:9~11:3 ;B相乙臘-水的體積比優(yōu)選 為：68~73:28~32。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)維生素 C中脫氨維生素 C的方法，其特征在于，所述的 進(jìn)樣溫度為35 °C。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)維生素 C中脫氨維生素 C的方法，其特征在于，所述的 進(jìn)樣量為20μ1。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)維生素 C中脫氨維生素 C的方法，其特征在于，所述的 梯度程序?yàn)椋?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)維生素 C中脫氨維生素 C的方法，其特征在于，該方法 可用于檢測(cè)注射用復(fù)方維生素(3)及復(fù)方維生素(13)注射液中脫氨維生素 C的含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/74GK105974040SQ201610498365
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月29日
【發(fā)明人】張穎, 李永福, 姜明明, 翟雪梅, 朱召貞
【申請(qǐng)人】濟(jì)南康和醫(yī)藥科技有限公司