專利名稱：一種大豆籽粒維生素e的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。是一種大豆籽粒維生素E含量超聲萃取、定性定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
維生素E是大豆種子中的重要功能性成分之一，其含量與組成隨品種和生長環(huán)境的不同而存在差異。據(jù)報(bào)道，作物種子中維生素E不僅是人類獲得天然維生素E的重要來源，在對(duì)人體防衰老、抗疾病等方面也具有顯著作用，故而引起人們廣泛的關(guān)注。測(cè)定種子中的維生素E不僅關(guān)系到衡量營養(yǎng)指標(biāo)，而且關(guān)系到資源的開發(fā)利用。當(dāng)代農(nóng)作物的育種已進(jìn)人了生化工程時(shí)代，依靠正確的生化測(cè)定來篩選現(xiàn)有種質(zhì)資源中品質(zhì)狀況，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
由于維生素E結(jié)構(gòu)復(fù)雜，異構(gòu)體種類多，分析測(cè)定困難，多年來許多科學(xué)家致力于其分析測(cè)定的研究，取得了很大的進(jìn)展，主要分析方法包括雙波電壓法、示波法、薄層色譜法、氣相色譜法、紫外分光光度法、熒光分光光度法、高效液相色譜法等。從近年發(fā)展看，利用熒光分光光度法測(cè)定各類作物中維生素E較多見。它能直觀地測(cè)出各類作物種子中維生素E的含量，還在于免除了一般分光光度法干擾因素較多、準(zhǔn)確性稍差的缺點(diǎn)，又比色譜法步驟簡便?？墒?，目前應(yīng)用仍不夠廣泛，主要原因在于試樣分離提取時(shí)需要通入高純氨氣保護(hù)維生素E免受氧化破壞，因而裝置復(fù)雜，費(fèi)用較貴。并且，分離提取過程耗時(shí)長達(dá)16-18小時(shí)，使種子中的維生素E難免有所損失，因此在大批量樣品的分析測(cè)試時(shí)，困難較大、經(jīng)費(fèi)較多，影響了普遍運(yùn)用。
高效液相色譜法(HPLC)是近三十年迅速發(fā)展的一種分離分析技術(shù)，用來分析維生素E能極大地簡化樣品預(yù)處理步驟，與其它方法相比具有干擾小，靈敏度高、快速等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為理想的檢測(cè)技術(shù)。但是，該方法目前只能測(cè)定大豆油中的維生素E組分含量，而且不能實(shí)現(xiàn)單個(gè)籽粒維生素E組分含量的檢測(cè)，在大豆資源篩選和品種改良上仍存在一定的不足。
為此，我們針對(duì)上述缺陷，對(duì)大豆籽粒維生素E提取方法、色譜檢測(cè)流動(dòng)相等進(jìn)行改進(jìn)，同時(shí)結(jié)合大豆籽粒的微量取樣方法，研究出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從以上技術(shù)背景出發(fā)，對(duì)大豆籽粒中的維生素E總量進(jìn)行超聲萃取，把得到的四種不同結(jié)構(gòu)的維生素E混合物離心后，取上清液在液相色譜上進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。具體提取和檢測(cè)程序如下a.前期準(zhǔn)備藥品準(zhǔn)備80％乙醇；1μg/ml母育酚的80％乙醇溶液；樣品準(zhǔn)備單個(gè)籽粒編號(hào)后，用壁紙刀片在豆粒的遠(yuǎn)臍端多次切取薄薄的碎片(注意不要超過籽粒的1/3)，用天平稱取10-12毫克，放入編好號(hào)的帶蓋的塑料試管中；b.維生素E的提取每個(gè)樣品中加入1ml母育酚乙醇溶液→勻質(zhì)器混勻10秒→超聲波萃取15分鐘→室溫靜止15分鐘→勻質(zhì)器混勻10秒→超聲波萃取15分鐘→用離心機(jī)以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘→將上清液移入ep管→用離心機(jī)以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘→吸取500μl于2ml頂空瓶中，準(zhǔn)備分析；c.維生素E的檢測(cè)高效液相色譜(HPLC)的檢測(cè)條件用長2m，直徑3mm的填充柱，檢測(cè)波長295nm，柱溫40℃；流動(dòng)相為乙氰和甲醇，分流比為9∶1；流速為0.5ml/min；進(jìn)樣量為30μl；重復(fù)次數(shù)為3次，檢測(cè)時(shí)間為25-30分鐘；維生素E的定性方法根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的各組分保留時(shí)間與實(shí)驗(yàn)所得的保留時(shí)間判定。在本檢測(cè)中α、β、γ、δ-維生素E的保留時(shí)間分別在18-19、14-15、15-16和12-13分鐘之間；維生素E的定量方法本檢測(cè)采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)各種維生素E組分進(jìn)行定量，大豆籽粒中各種維生素E組分含量由對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值求得。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)籽粒樣品(10-12毫克左右)的檢測(cè)，不影響大豆籽粒的繼續(xù)生長和發(fā)育，可以在資源篩選及品種改良的任意階段進(jìn)行鑒定和評(píng)價(jià)，對(duì)高維生素E大豆育種和改良提供了有利的技術(shù)支撐。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明在中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所的“大豆功能營養(yǎng)資源拓寬與改良”課題中得到了應(yīng)用。在課題實(shí)施過程中采用本發(fā)明對(duì)200多份東北大豆資源進(jìn)行了分析和評(píng)價(jià)，得到了2份α-維生素E和3份總維生素E含量較高的大豆遺傳材料，對(duì)于本課題的完成和高維生素E大豆育種都起到了有效的技術(shù)支撐。下面列出了部分大豆資源籽粒中維生素E含量的檢測(cè)結(jié)果部分大豆資源籽粒中維生素E含量的檢測(cè)結(jié)果(mg/100g)

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果可以看出，東北大豆資源在維生素E組分含量及總量上都存在很大的遺傳變異。比較而言，γ-維生素E和δ-維生素E含量較多，而α-維生素E含量較少，β-維生素E含量更少。這些檢測(cè)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的基本上是一致的，可見本方法不僅是可行的，而且還在高維生素E大豆育種和改良上具有絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。
權(quán)利要求
1.一種大豆維生素E的檢測(cè)方法，其特征在于先對(duì)大豆籽粒中的維生素E總量進(jìn)行超聲萃取，再把得到的四種不同結(jié)構(gòu)的維生素E混合物離心后，取上清液在液相色譜以上進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，提取和檢測(cè)程序如下a.樣品準(zhǔn)備單個(gè)籽粒編號(hào)后，用壁紙刀片在豆粒的遠(yuǎn)臍端多次切取薄薄的碎片(注意不要超過籽粒的1/3)，用天平稱取10-12毫克，放入編好號(hào)的帶蓋塑料試管中；b.維生素E的提取每個(gè)樣品中加入1ml母育酚乙醇溶液→勻質(zhì)器混勻10秒→超聲波萃取15分鐘→室溫靜止15分鐘→勻質(zhì)器混勻10秒→超聲波萃取15分鐘→用離心機(jī)以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘→將上清液移入ep管→用離心機(jī)以13000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘→吸取500μl于2ml頂空瓶中，準(zhǔn)備分析；c.維生素E的檢測(cè)高效液相色譜(HPLC)的檢測(cè)條件用長2m，直徑3mm的填充柱，檢測(cè)波長295nm，柱溫40℃；流動(dòng)相為乙氰和甲醇，分流比為9∶1；流速為0.5ml/min；進(jìn)樣量為30μl；重復(fù)次數(shù)為3次，檢測(cè)時(shí)間為25-30分鐘；在檢測(cè)中α、β、γ、δ-維生素E的保留時(shí)間分別在18-19、14-15、15-16和12-13分鐘之間，實(shí)現(xiàn)了維生素E的定性檢測(cè)；本發(fā)明采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)各種維生素E組分進(jìn)行定量，大豆籽粒中各種維生素E組分含量由對(duì)應(yīng)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值求得。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。是一種大豆籽粒維生素E含量超聲萃取、定性定量檢測(cè)方法。本發(fā)明在傳統(tǒng)維生素E檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了維生素E的提取方法和液譜檢測(cè)的流動(dòng)相等，同時(shí)結(jié)合大豆籽粒的微量取樣方法，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)大豆籽粒維生素E含量的微量測(cè)定，在高維生素E大豆育種和品種改良上具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)G01N30/06GK1987450SQ20061016327
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月18日
發(fā)明者潘相文, 王國棟, 李艷華, 蘭志華, 梁桂榮, 邢海軍, 張士春 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所