納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)液體樣品中的待測(cè)物的納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，所述方法依次包括以下步驟：1)提供檢測(cè)探針，所述檢測(cè)探針通過(guò)將磁性納米顆粒與能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)制備；2)提供捕獲探針，所述捕獲探針是固定化的能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第二分子；3)使所述液體樣品與所述檢測(cè)探針接觸；4)使與所述檢測(cè)探針接觸過(guò)的所述液體樣品與所述捕獲探針接觸；以及5)向經(jīng)過(guò)步驟4)的所述捕獲探針加入供氫底物和過(guò)氧化物進(jìn)行顯色反應(yīng)。本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)液體樣品中的待測(cè)物的納米模擬酶免疫層析檢測(cè)裝置。
【專利說(shuō)明】納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料及生物醫(yī)學(xué)納米【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明涉及磁性納米顆粒模擬酶，并提供了其應(yīng)用于免疫層析生物分子檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠體金免疫層析法是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來(lái)的以膠體金為標(biāo)記物的檢測(cè)方法，它把免疫親和技術(shù)、印潰技術(shù)和斑點(diǎn)薄層層析技術(shù)組合在一起。由于用該層析條檢測(cè)的時(shí)候，所有樣品均經(jīng)過(guò)較窄的纖維素膜的持續(xù)性反應(yīng)，實(shí)際上對(duì)被測(cè)物質(zhì)起到了濃縮、聚集作用，提高了反應(yīng)的靈敏度，加快了反應(yīng)速度，整個(gè)操作時(shí)間僅需3?15分鐘。其原理是將特異的抗體(或抗原)先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)(層析)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體、抗原的區(qū)域時(shí)，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金作標(biāo)記物可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷。傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速等特點(diǎn)，但由于靈敏度相對(duì)較低，嚴(yán)重制約了其在生物分子檢測(cè)方面的廣泛應(yīng)用，信號(hào)放大是解決免疫層析技術(shù)靈敏度低的關(guān)鍵所在。
[0003]磁性納米顆粒具有良好的生物相容性，其既具有納米材料所特有的性質(zhì)，如粒徑小、比表面積大、偶聯(lián)容量高，又具有磁響應(yīng)性及超順磁性，可以在恒定磁場(chǎng)下聚集和定位、在交變磁場(chǎng)下吸收電磁波產(chǎn)熱，利用這些特性，磁性納米顆粒被廣泛應(yīng)用于磁共振對(duì)比劑、磁靶向藥物載體、細(xì)胞與生物分子分離、生物傳感與檢測(cè)以及磁感應(yīng)腫瘤熱療等生物學(xué)領(lǐng)域。
[0004]最近幾年，磁性免疫層析(MagneticImmunoChromatographic Test,MICT)作為一種新一代單人份快速定量檢測(cè)技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)，它是以超順磁性納米顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標(biāo)記物(膠體金，乳膠顆粒等)來(lái)進(jìn)行免疫層析，最后通過(guò)磁信號(hào)閱讀儀讀取結(jié)合在檢測(cè)線處磁顆粒的磁場(chǎng)強(qiáng)度，從而對(duì)所檢樣品進(jìn)行定性定量判斷。目前國(guó)內(nèi)成型的磁信號(hào)閱讀儀還沒(méi)有上市，國(guó)際上也只有少數(shù)外國(guó)公司(如美國(guó)MagnaBioSciences公司)具有該項(xiàng)技術(shù)，但其價(jià)格昂貴，因而限制了磁性免疫層析的發(fā)展和推廣。
[0005]近年來(lái)，我們課題組研究發(fā)現(xiàn)磁納米顆粒具有內(nèi)在的模擬酶活性，可替代過(guò)氧化物酶進(jìn)行免疫檢測(cè)(閻錫蘊(yùn)等，Nature Nanotechnology.2007) 0最近，我們課題組又研制了三功能(識(shí)別、催化、磁性)于一體的新型免疫組化檢測(cè)試劑，發(fā)現(xiàn)磁顆粒表面包裹蛋白分子后仍然具有酶活性(閻錫蘊(yùn)等，Nature Nanotechnology.2012)。這種催化活性與辣根過(guò)氧化物酶相似，在過(guò)氧化氫存在下，磁性納米顆粒可以催化辣根過(guò)氧化物酶的底物，如可以催化3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)生成藍(lán)色的產(chǎn)物，催化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)生成棕色沉淀，催化鄰苯二胺(OPD)生成橘紅色產(chǎn)物，催化活性依賴于pH值、溫度和過(guò)氧化氫濃度，其催化機(jī)理符合乒乓機(jī)制。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)磁性納米顆粒的催化活性隨著顆粒粒徑的減小而增強(qiáng)，顆粒的粒徑越小，其催化活性越高。磁性顆粒的粒徑達(dá)微米量級(jí)后，催化活性降低至接近零值。磁性納米顆粒的模擬酶活性，相比蛋白制劑的辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase, HRP),具有更多的優(yōu)勢(shì):(I)蛋白酶在極端pH和溫度下容易變性，同時(shí)也容易被蛋白酶降解，而磁性納米顆粒在極端條件下很穩(wěn)定；(2)蛋白酶的生產(chǎn)成本很高，而磁性納米顆粒制備簡(jiǎn)單、廉價(jià)；(3)由于磁性納米顆粒具有超順磁性，用磁鐵可以回收反復(fù)利用；同時(shí)基于磁性納米顆粒的磁可控性，拓展了其作為模擬酶的應(yīng)用領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有免疫層析技術(shù)存在的不足，提供一種納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，其基本原理同膠體金試紙條，首先將某一特定抗原特異的抗體A與磁性納米顆粒偶聯(lián)，制備磁顆粒墊，然后將另一種針對(duì)此抗原的抗體B固定于硝酸纖維素膜的特定區(qū)帶形成檢測(cè)線(T線)，將抗抗體A的抗體(二抗)也固定于硝酸纖維素膜的特定區(qū)帶形成質(zhì)控線(C線)，與T線平行，組裝和制備磁性免疫層析試紙。當(dāng)干燥的硝酸纖維素膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至磁顆粒墊時(shí)，磁顆粒上的抗體A就會(huì)與抗原反應(yīng)，生成抗原-抗體A-磁顆粒的復(fù)合物，繼續(xù)經(jīng)毛細(xì)管作用移動(dòng)到固定有另一抗體B的T線區(qū)域時(shí)，樣品中的抗原就會(huì)與這一抗體B發(fā)生反應(yīng)，最后生成抗體B-抗原-抗體A-磁顆粒復(fù)合物；而沒(méi)有結(jié)合抗原的磁顆?？贵w探針繼續(xù)向前移動(dòng)，在C線處與二抗結(jié)合形成二抗-抗體A-磁顆粒復(fù)合物，磁顆粒就會(huì)在T線和C線處聚集。如果樣品中的抗原濃度較高，那么在T線處聚集的磁顆粒也多，會(huì)顯示出磁顆粒的顏色；如果樣品中的抗原濃度很低時(shí)，則T線處聚集的磁顆粒很少，不足以顯示出磁顆粒的顏色，這時(shí)加入過(guò)氧化物和供氫底物如TMB、DAB等，利用磁顆粒的過(guò)氧化物酶催化作用產(chǎn)生大量沉淀而增強(qiáng)強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，以檢測(cè)出低濃度的抗原物質(zhì)。該技術(shù)集磁性納米顆粒過(guò)氧化物酶催化活性及磁分離特性于一體，層析后通過(guò)加入過(guò)氧化物和供氫底物如鄰苯二胺(DAB)等，利用磁顆粒的酶催化作用產(chǎn)生棕色沉淀，從而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，提高靈敏度，使得檢測(cè)結(jié)果通過(guò)肉眼觀察即可以判定，免除了對(duì)儀器的依賴性，基于此新技術(shù)的生物樣本檢測(cè)，簡(jiǎn)便快速、非常適合現(xiàn)場(chǎng)使用。
[0007]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0008]納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，所述方法包括:1)采用合適尺寸的磁性納米顆粒，將特異性結(jié)合待測(cè)抗原的生物分子偶聯(lián)于其表面制備特異性納米顆粒探針，制備出磁顆粒墊；2)組裝和制備磁性免疫層析試紙；3)層析反應(yīng)，待檢抗原與磁納米探針、檢測(cè)線抗體、質(zhì)控線抗體反應(yīng)形成夾心復(fù)合物，陽(yáng)性樣品會(huì)在T線處形成磁顆粒聚集；4)顯色反應(yīng)，加入過(guò)氧化物和供氫底物如TMB、DAB等，利用磁顆粒的酶催化作用產(chǎn)生大量沉淀而增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)；5)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的定性和半定量檢測(cè)。
[0009]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，其中所述組裝和制備磁性免疫層析試紙條是將包被膜、結(jié)合了待檢抗原所對(duì)應(yīng)抗體的磁顆粒墊、樣品墊、吸水墊以相互交錯(cuò)的形式依次粘貼在底板上，然后在上層覆蓋透明塑料密封膜組裝而成，其中所述的包被膜上預(yù)包被有待檢抗原的檢測(cè)線和質(zhì)控線。
[0010]更進(jìn)一步地，上述的納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:所述磁性納米顆粒可以是球形、棒形、立方形、三角形、多角形等形狀的任意一種；其粒徑在10納米至500納米范圍內(nèi)；其可以是裸露的磁顆粒、也可以是蛋白外殼如病毒外殼、轉(zhuǎn)鐵蛋白外殼、鐵蛋白外殼包被的磁顆粒；其可以是Fe3O4磁顆粒，也可以是外層修飾有二價(jià)鐵離子試劑的Fe2O3磁顆粒。
[0011]更進(jìn)一步地，上述的納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:所述供氫底物包括四甲基聯(lián)苯胺TMB、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽TMBS、鄰苯二胺0PD、二氨基聯(lián)苯胺DAB、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸DAB-4HC1、5-氨基水楊酸5-AS、鄰聯(lián)甲苯胺OT或連氮二銨鹽ABTS ;所述過(guò)氧化物包括過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲等。
[0012]更進(jìn)一步地，上述的納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:所述特異性生物分子包括蛋白、核酸、多肽；所述的靶標(biāo)分子存在于溶液或體液中。
[0013]本發(fā)明技術(shù)方案突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步主要體現(xiàn)在:
[0014]本發(fā)明針對(duì)目前膠體金無(wú)信號(hào)放大功能、靈敏度相對(duì)較低的不足，結(jié)合最新的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，提供一種納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，該技術(shù)集磁性納米顆粒過(guò)氧化物酶催化活性及磁分離特性于一體，層析后通過(guò)加入過(guò)氧化物和供氫底物如鄰苯二胺(DAB)等，利用磁顆粒的酶活性產(chǎn)生大量棕色沉淀，放大檢測(cè)信號(hào)10-100倍，使得檢測(cè)結(jié)果通過(guò)肉眼觀察即可以判定，免除了對(duì)儀器的依賴性，基于此新技術(shù)的生物樣本檢測(cè)，簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、非常適合現(xiàn)場(chǎng)使用，是一項(xiàng)具有新穎性、創(chuàng)造性、實(shí)用性的新技術(shù)。
[0015]更具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng):
[0016]1.一種用于檢測(cè)液體樣品中的待測(cè)物的納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，所述方法依次包括以下步驟:
[0017]I)提供檢測(cè)探針，所述檢測(cè)探針通過(guò)將磁性納米顆粒與能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)制備；
[0018]2)提供捕獲探針，所述捕獲探針是固定化的能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第二分子;
[0019]3)使所述液體樣品與所述檢測(cè)探針接觸；
[0020]4)使與所述檢測(cè)探針接觸過(guò)的所述液體樣品與所述捕獲探針接觸；以及
[0021]5)向經(jīng)過(guò)步驟4)的所述捕獲探針中加入供氫底物和過(guò)氧化物進(jìn)行顯色反應(yīng)。
[0022]2.根據(jù)I所述的方法，其中所述磁性納米顆粒的粒徑在10納米至500納米范圍內(nèi)。
[0023]3.根據(jù)I所述的方法，其中所述磁性納米顆粒是Fe3O4磁性納米顆粒。
[0024]4.根據(jù)I所述的方法，其中所述待測(cè)物是蛋白質(zhì)、多肽或核酸。
[0025]5.根據(jù)I所述的方法，其中所述待測(cè)物是蛋白質(zhì)，并且所述第一分子和所述第二分子是針對(duì)所述蛋白質(zhì)的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。
[0026]6.根據(jù)5所述的方法，其中所述第一分子與所述磁性納米顆粒通過(guò)EDC-NHS法偶聯(lián)。
[0027]7.根據(jù)I所述的方法，其中所述供氫底物包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMBS)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB-4HC1)、5-氨基水楊酸(5-AS)、鄰聯(lián)甲苯胺(OT)或連氮二銨鹽(ABTS)。
[0028]8.根據(jù)I所述的方法，其中所述過(guò)氧化物包括過(guò)氧化氫和過(guò)氧化脲。
[0029]9.一種用于檢測(cè)液體樣品中的待測(cè)物的納米模擬酶免疫層析檢測(cè)裝置，所述裝置包括依次設(shè)置在底板上的以下各項(xiàng):
[0030]樣品墊，所述樣品墊用于承接所述液體樣品并濾過(guò)所述樣品中的雜質(zhì)；[0031]磁性納米顆粒墊，所述磁性納米顆粒墊包含與能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)的磁性納米顆粒；
[0032]檢測(cè)線，所述檢測(cè)線包含能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第二分子；
[0033]吸收墊，所述吸收墊一般由較厚的濾紙或類似的吸水材料制成，用于提供層析的動(dòng)力，
[0034]其中所述磁性納米顆粒的粒徑優(yōu)選在10納米至500納米范圍內(nèi)，
[0035]其中所述磁性納米顆粒優(yōu)選是Fe3O4磁性納米顆粒，
[0036]其中所述待測(cè)物優(yōu)選是蛋白質(zhì)、多肽或核酸，并且更優(yōu)選地，所述待測(cè)物是蛋白質(zhì)而所述第一分子和所述第二分子是針對(duì)所述蛋白質(zhì)的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體，
[0037]其中所述第一分子與所述磁性納米顆粒優(yōu)選通過(guò)EDC-NHS法偶聯(lián)，
[0038]其中所述供氫底物優(yōu)選包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMBS)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB-4HC1)、5-氨基水楊酸(5-AS)、鄰聯(lián)甲苯胺(OT)或連氮二銨鹽(ABTS)，并且
[0039]其中所述過(guò)氧化物優(yōu)選包括過(guò)氧化氫和過(guò)氧化脲。
[0040]10.根據(jù)9所述的檢測(cè)裝置，其中在所述檢測(cè)線之后還設(shè)置有質(zhì)控線，所述質(zhì)控線固定有能夠與所述第一分子特異性結(jié)合的第三分子。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0041]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明:
[0042]圖1:膠體金免疫層析法示意圖
[0043]圖2:根據(jù)本發(fā)明納米模擬酶免疫層析法的一個(gè)實(shí)施方案的示意圖；
[0044]圖3:酶聯(lián)免疫(ELISA)方法篩選高親和力的相思子毒素單克隆抗體；
[0045]圖4:相思子毒素單克隆抗體的亞型鑒定；
[0046]圖5:免疫印跡(Western blotting)方法鑒定抗體識(shí)別相思子毒素的抗原表位；
[0047]圖6:雙抗夾心酶聯(lián)免疫(ELISA)方法篩選相思子毒素的配對(duì)抗體；
[0048]圖7:磁性納米顆粒的制備；
[0049]圖8:磁顆?？贵w探針的制備及點(diǎn)印跡(Dot blot)檢驗(yàn)；
[0050]圖9:磁顆粒納米模擬酶免疫層析方法與膠體金免疫層析方法檢測(cè)相思子毒素靈敏度的比較。
【具體實(shí)施方式】
[0051]以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)描述本發(fā)明，要理解本發(fā)明的范圍不受限于具體實(shí)施例。
[0052]實(shí)施例:納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法檢測(cè)相思子毒素
[0053]I)雜交瘤細(xì)胞的制備
[0054]相思子毒素是豆科植物相思子種子中的成分，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最強(qiáng)的植物毒素之一，對(duì)人、動(dòng)物和昆蟲(chóng)都有很大的毒性，嚼服一粒相思子種子足以致人死亡，本發(fā)明以檢測(cè)相思子毒素(相思子毒素以及下文中提到的蓖麻毒素均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供)為例來(lái)說(shuō)明納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法的靈敏度和實(shí)用性。實(shí)驗(yàn)中使用的抗相思子毒素的單克隆抗體Abrin-1、Abrin-2、Abrin-3、Abrin_4,分別來(lái)自分泌單克隆抗體Abrin-1、Abrin-2> Abrin-3> Abrin-4的雜交瘤細(xì)胞(單克隆抗體的制備方法是本領(lǐng)域中已知的，并且可以參見(jiàn)例如 Kohler 和 Milstein, Nature 256:495,1975 ；Yeh 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1979 ；Yeh等，Int.J.Cancer, 1982)，具體為:采用硫酸銨沉淀法獲得相思子種子中的粗毒素，再通過(guò)分子篩柱層析、離子交換柱層析、冷凍干燥等步驟獲得高純度的毒素；經(jīng)甲醒滅活后的相思子毒素全毒素作為免疫原對(duì)BALB/C小鼠進(jìn)行免疫接種,每次皮下注射20yg蛋白/每只鼠，每?jī)尚瞧谝淮?，共三次。取脾?xì)胞之前加強(qiáng)免疫一次。加強(qiáng)免疫之后三天，取脾臟，并將脾細(xì)胞懸浮于RPMI培養(yǎng)基中。在聚乙二醇(PEG)存在下，將脾細(xì)胞和SP2/0-Agl4鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，并用HAT選擇性培養(yǎng)基(含次黃嘌呤hypoxantin、氨基蝶呤aminopterin和胸腺卩密唳脫氧核苷thymidin的培養(yǎng)基)對(duì)雜交瘤進(jìn)行篩選，獲得雜交瘤細(xì)胞。用ELISA的方法篩選與天然相思子毒素有強(qiáng)結(jié)合能力的抗體，獲得四株抗體，分別命名為Abrin-l、Abrin-2、Abrin-3、Abrin_4,同時(shí)獲得分泌這些抗體的雜交瘤細(xì)胞,依次是 Abrin-1、Abrin_2、Abrin_3、Abrin-4。
[0055]2) ELISA方法鑒定單克隆抗體Abrin-l、Abrin-2、Abrin-3、Abrin_4對(duì)相思子毒素的親和力
[0056]具體方法如下:首先在96孔ELISA板中過(guò)夜包被50 μ I的2 μ g/ml的相思子毒素蛋白；用PBST洗三遍，加入5%BSA-PBS封閉Ih ;分別加入單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37°C孵育Ih ;用PBST洗三遍，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體孵育Ih ;用PBST洗三遍，加入 TMB 顯色底物(200ng/ml 的 TMB, 0.03% 的 H2O2, ρΗ4.5)顯色，50 μ I/ 孔，37°C 反應(yīng)15min，加入50 μ I/孔2Μ的硫酸溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。從ELISA結(jié)果可以看出，Abrin-3、Abrin-4的親和力可以達(dá)到1:5000,而Abrin-l、Abrin-2的親和力高達(dá)1:50000(如圖 3)。
[0057]3)親和層析純化單克隆抗體
[0058]具體方法如下:大量培養(yǎng)擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞Abrin-l、Abrin-2> Abrin-3、Abrin-4,分別制成細(xì)胞懸液，取六周齡BALB/C小鼠腹腔注射降植烷(Sigma-Aldrich) 0.5ml/只，約十天后，收集腹水，離心取上清液。通過(guò)蛋白G親和層析(Roche)，從腹水中純化單克隆抗體。純化好的單克隆抗體無(wú)菌過(guò)濾，冷藏或冷凍保存。
[0059]4)單克隆抗體亞型鑒定
[0060]采用鼠抗體亞型鑒定試劑盒(BD Pharmingen),按照說(shuō)明書(shū)操作，鑒定出抗體Abrin-1 屬于 IgG2a, Abrin-2> Abrin-3> Abrin-4 屬于 IgGl 亞型(如圖 4)。
[0061]5)免疫印跡(Western blotting)方法對(duì)抗體識(shí)別相思子毒素抗原表位的鑒定
[0062]具體方法是:用0.1M的二硫蘇糖醇(DTT)將相思子毒素A、B鏈的二硫鍵還原打開(kāi)，利用Western blotting方法鑒定抗體識(shí)別相思子毒素的表位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Abrin-UAbrin-2、Abrin-3、Abrin-4均在26kD的位置出現(xiàn)條帶,而在34kD位置沒(méi)有條帶如圖5),這說(shuō)明這四種抗體均識(shí)別相思子毒素的A鏈(分子量大小約為30kD)。
[0063]6)雙抗夾心ELISA方法篩選配對(duì)抗體
[0064]具體方法是:首先將過(guò)氧化物酶HRP通過(guò)戊二醛二步法或過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記到抗體 Abrin-1 上，然后將 Abrin-2> Abrin-3> Abrin-4 抗體以 0.02M 的 PBS (pH7.2)稀釋至2μ g/ml，然后以50μ I/孔的量加入到到96孔板中，4°C包被過(guò)夜；用PBST洗三遍，加入5%BSA-PBS封閉Ih ;分別加入100、10、1、0.lng/ml的相思子毒素以及10ng/ml的蓖麻毒素作為陰性對(duì)照(Ctrl)，37°C孵育Ih ;用PBST洗三遍，加入I μ g/ml濃度的HRP標(biāo)記的Abrin-1抗體孵育Ih ;用PBST洗三遍，加入TMB顯色底物(200ng/ml的ΤΜΒ，0.03%的H2O2,PH4.5)顯色，50 μ I/孔，37°C反應(yīng)15min，加入50 μ I/孔2M的硫酸溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)。從ELISA結(jié)果可以看出(如圖6), Abrin-1與Abrin-2配對(duì)后效果最好。
[0065]7) Fe3O4磁性納米顆粒的制備
[0066]在王水浸泡過(guò)的燒杯中，分別加入0.3g的CoC12-6H20、0.675g的FeCl3_6H20和20mL的乙二醇,攪拌至完全溶解；加入1.5g無(wú)水NaAc, 0.15g PAA,繼續(xù)攪拌30min ;置于反應(yīng)釜中200°C反應(yīng)14h ;降溫，將其中溶液倒入離心管中，磁分離并去除上清，加入乙醇超聲洗4次，50-60°C干燥，制備的磁顆粒MNPs粒徑約350nm左右(如圖7)。
[0067]8)磁顆粒探針的制備
[0068]首先采用EDC-NHS (EDC:碳化二亞胺鹽酸鹽；NHS:羥基丁二酰亞胺)將磁顆粒表面的羧基活化，然后將相思子毒素單克隆抗體Abrin-1偶聯(lián)于350nm四氧化三鐵磁性顆粒上形成MNPsOAbrin-1。具體步驟如下:稱取適量四氧化三鐵磁性顆粒，加入50mg/ml的NHS,EDC各50 μ 1，室溫孵育30分鐘，用去離子水清洗，除去多余的NHS/EDC。加入1ml、pH6.0的乙酸鈉溶液，加入100 μ g的Abrin-1抗體，混勻，4°C孵育2小時(shí)，PBS洗滌，加入50mM pH7.4 Tris-Cl封閉活化的羧基，PBS重懸，4°C保存；偶聯(lián)效果采用點(diǎn)印跡(Dot blot)方法檢測(cè)，即在硝酸纖維素膜上分別點(diǎn)上lmg/ml的羊抗鼠抗體、相思子毒素Abrin、蓖麻毒素各
Iμ I,待干燥后加入MNPsOAbrin-1溶液，反應(yīng)后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這種磁顆粒探針只與羊抗鼠抗體、相思子毒素Abrin結(jié)合，而不與蓖麻毒素Ricin結(jié)合，這說(shuō)明偶聯(lián)的MNPsOAbrin-1抗體探針特異性很好(如圖8)。
[0069]9)納米模擬酶免疫層析法試紙條的組裝(如圖2)
[0070]a.包被膜的制備:用包被緩沖液(0.02M磷酸鹽緩沖液，pH 7.2)將相思子毒素的抗體Abrin-2、公司購(gòu)買的羊抗鼠抗體(二抗)分別稀釋為0.5mg/ml與lmg/ml,使用定量噴膜裝置以I μ 1/cm的量按前后順序?qū)⒍咭?.8cm的間隔均勻噴印于3.5cm寬度的硝酸纖維素膜上，分別形成檢測(cè)線(T線)抗體帶與質(zhì)控線(C線)抗體帶。室溫晾干30min后于封閉液(含有0.5%BSA的0.02M PBS, pH 7.2)中浸泡IOmin后于25_35°C烘干8小時(shí)，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0071]b.磁顆粒探針墊的制備:使用噴膜儀的專用噴頭將處理好的磁顆粒探針(如8)中所制備的)以50 μ Ι/cm的量均勻噴涂于0.8cm寬度的玻璃纖維墊上，過(guò)夜冷凍干燥，力口入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0072]c.樣品墊的處理:將1.8cm寬度的樣品墊(親水性的玻璃纖維)浸入樣品墊處理液(l_5%Casein(酪蛋白),0.1_1%PVA (聚乙烯醇),0.01-0.2%Tween 20，0.02M PBS, pH
7.2)處理I小時(shí)，取出后于25-35°C烘干8小時(shí)。
[0073]d.試紙條的組裝及切割:將3.5cm包被膜、0.8cm磁顆粒探針墊、1.8cm樣品墊、
2.5cm吸水墊以相互交錯(cuò)2mm的形式依次粘貼在背襯(底板)上(層疊順序如圖2所示)，覆蓋一層透明塑料密封膜，組裝成試紙板；使用切條機(jī)將組裝好的試紙板切成0.5cm寬的成品試紙條；將切割好的試紙條置于塑料低卡上的卡槽內(nèi)，蓋上上蓋，使用壓卡機(jī)將上下兩片塑料卡壓緊，加入干燥劑室溫封存?zhèn)溆?上述包被膜、磁顆粒探針墊、樣品墊、吸水墊的尺寸以及相互交錯(cuò)的寬度可以根據(jù)實(shí)際需要由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)調(diào)整)。[0074]10)加樣檢測(cè)
[0075]微量移液器取50 μ I含有梯度濃度的相思子毒素樣品溶液(濃度依次是IOOng/ml、10ng/ml、lng/ml、0ng/ml)加入檢測(cè)卡上的樣品墊上，再加入50 μ I層析緩沖液(l%Tween 20,0.5%Triton X-1OO, 1%ΝΡ-40,0.05%NaN3, 20mM PBS, pH 7.2)，等待反應(yīng)進(jìn)行15min。由于磁顆粒上偶聯(lián)有相思子毒素的單克隆抗體Abrin-1，它與樣品溶液中的相思子毒素結(jié)合后形成的復(fù)合物繼續(xù)先前移動(dòng)時(shí)，會(huì)與檢測(cè)線(T線)處相思子毒素的另一抗體Abrin-2結(jié)合形成磁顆粒的聚集，而沒(méi)有結(jié)合相思子毒素的磁顆粒Abrin-1抗體探針會(huì)繼續(xù)移動(dòng)到質(zhì)控線(C線)處通過(guò)與其二抗作用形成磁顆粒的聚集。
[0076]11)酶催化放大檢測(cè)信號(hào)
[0077]在檢測(cè)線T線(Abrin-2抗體帶)和質(zhì)控線C線(羊抗鼠抗體帶)處加入50 μ I的顯色溶液(過(guò)氧化氫H2O2濃度為530mM;過(guò)氧化物酶的生色底物二氨基聯(lián)苯胺(3, 3’ -diaminobenzidine, DAB)濃度為816mM),反應(yīng)5min ;由于磁顆粒的過(guò)氧化物模擬酶活性，會(huì)在磁顆粒聚集的T線和C線處生成大量棕褐色的不溶性沉淀物，從而將檢測(cè)信號(hào)放大，其檢測(cè)靈敏度是傳統(tǒng)膠體金試紙條檢測(cè)法的100倍(如圖9所示)。
[0078]綜上所述，本發(fā)明為一種納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，該技術(shù)集磁性納米顆粒過(guò)氧化物酶催化活性及磁分離特性于一體，免疫層析后通過(guò)加入過(guò)氧化物和供氫底物如鄰苯二胺(DAB)等，利用磁顆粒的酶活性產(chǎn)生大量棕色沉淀，放大檢測(cè)信號(hào)10-100倍，使得檢測(cè)結(jié)果通過(guò)肉眼觀察即可以判定，免除了對(duì)儀器的依賴性。該方法操作步驟簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、非常適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)使用，粒過(guò)氧化物酶的功能，具有十分廣闊的應(yīng)用前景，是一項(xiàng)具有新穎性、創(chuàng)造性、實(shí)用性的新技術(shù)。
[0079]以上僅是本發(fā)明的具體應(yīng)用范例。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本專利而不用于限制本發(fā)明的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測(cè)液體樣品中的待測(cè)物的納米模擬酶免疫層析檢測(cè)方法，所述方法依次包括以下步驟: 1)提供檢測(cè)探針，所述檢測(cè)探針通過(guò)將磁性納米顆粒與能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)制備； 2)提供捕獲探針，所述捕獲探針是固定化的能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第二分子; 3)使所述液體樣品與所述檢測(cè)探針接觸； 4)使與所述檢測(cè)探針接觸過(guò)的所述液體樣品與所述捕獲探針接觸；以及 5)向經(jīng)過(guò)步驟4)的所述捕獲探針中加入供氫底物和過(guò)氧化物進(jìn)行顯色反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述磁性納米顆粒的粒徑在10納米至500納米范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述磁性納米顆粒是Fe3O4磁性納米顆粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述待測(cè)物是蛋白質(zhì)、多肽或核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述待測(cè)物是蛋白質(zhì)，并且所述第一分子和所述第二分子是針對(duì)所述蛋白質(zhì)的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第一分子與所述磁性納米顆粒通過(guò)EDC-NHS法偶聯(lián)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述供氫底物包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMBS)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB-4HC1)、5-氨基水楊酸(5-AS)、鄰聯(lián)甲苯胺(OT)或連氮二銨鹽(ABTS)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述過(guò)氧化物包括過(guò)氧化氫和過(guò)氧化脲。
9.一種用于檢測(cè)液體樣品中的待測(cè)物的納米模擬酶免疫層析檢測(cè)裝置，所述裝置包括依次設(shè)置在底板上的以下各項(xiàng): 樣品墊，所述樣品墊用于承接所述液體樣品并濾過(guò)所述樣品中的雜質(zhì)； 磁性納米顆粒墊，所述磁性納米顆粒墊包含與能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第一分子偶聯(lián)的磁性納米顆粒； 檢測(cè)線，所述檢測(cè)線包含能夠與所述待測(cè)物特異性結(jié)合的第二分子； 吸收墊，所述吸收墊由吸水材料制成，用于提供層析的動(dòng)力， 其中所述磁性納米顆粒的粒徑優(yōu)選在10納米至500納米范圍內(nèi)， 其中所述磁性納米顆粒優(yōu)選是Fe3O4磁性納米顆粒， 其中所述待測(cè)物優(yōu)選是蛋白質(zhì)、多肽或核酸，并且更優(yōu)選地，所述待測(cè)物是蛋白質(zhì)而所述第一分子和所述第二分子是針對(duì)所述蛋白質(zhì)的特異性抗體，優(yōu)選是單克隆抗體， 其中所述第一分子與所述磁性納米顆粒優(yōu)選通過(guò)EDC-NHS法偶聯(lián)， 其中所述供氫底物優(yōu)選包括四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMBS)、鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸(DAB-4HC1)、5-氨基水楊酸(5-AS)、鄰聯(lián)甲苯胺(OT)或連氮二銨鹽(ABTS)，并且 其中所述過(guò)氧化物優(yōu)選包括過(guò)氧化氫和過(guò)氧化脲。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測(cè)裝置，其中在所述檢測(cè)線之后還設(shè)置有質(zhì)控線，所述質(zhì)控線固定有能夠與所述第一分子特異性結(jié)合的第三分子。
【文檔編號(hào)】G01N33/558GK103808926SQ201410015610
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月14日
【發(fā)明者】閻錫蘊(yùn), 段德民, 張德璽, 楊東玲, 馮靜, 宋麗娜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所