專利名稱：一種酶法快速定量檢測heparosan的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶法快速定量檢測heparosan的方法。
背景技術(shù)：
Heparosan,又稱 N-acetylheparosan, (-GlcUA-l, 4-GlcNAc-l, 4-) n,是 E.coli010:Κ5:Η4 (簡稱Ε.coli Κ5)等菌株莢膜中多糖骨架的二糖重復(fù)單位，可作為肝素和硫酸乙酰肝素的生物合成前體。目前heparoan的檢測方法主要有硫酸-咔唑法、干重法，干重法需要將細(xì)菌發(fā)酵液進(jìn)行分離、醇沉、烘干、稱量等步驟，最后獲得的粗多糖中含有較多雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、其他多糖等)，測量精度差。而硫酸咔唑法是適用范圍比較廣的一種糖醛酸含量的測定方法，多糖含量的測定也是通過先測定多糖中糖醛酸的含量，再換算成多糖的含量，該方法目前廣泛應(yīng)用于軟骨素、透明質(zhì)酸、肝素、硫酸乙酰肝素、黃瓜多糖、果膠多糖等酸性多糖中糖醛酸含量的測定，該測定方法易受試劑或樣品中雜質(zhì)(葡萄糖、鹽、鐵離子等)的干擾，存在操作繁瑣、重現(xiàn)性差、干擾因素多、專一性差等缺點(diǎn)。而選定合適的酶，進(jìn)行酶法檢測具有快速、簡便、專一性強(qiáng)和高精密度等優(yōu)點(diǎn)，目前在實(shí)際應(yīng)用中越來越廣。Heparinase III酶(EC4.2.2.8)為黃桿菌(fIavobacteriumheparinum)中提取的細(xì)菌肝素酶，能特異性裂解N-硫酸化或N-乙?；咸烟前?GIcNSO3或GlcNAc)與葡萄糖醛酸之間的糖苷鍵。目前研究者已證明heparinase III酶能降解硫酸乙酰肝素，但還未有報(bào)道將heparinase III酶應(yīng)用于heparosan或硫酸乙酰肝素含量檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為 了提供一種的酶法快速定量檢測heparosan的方法，該方法與硫酸咔唑法、干重法相比具有專一性強(qiáng)，精度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種酶法快速定量檢測heparosan的方法，所述方法包括:(I)取待測樣品，溶于ρΗ7.(Γ7.5的緩沖液中配制成樣品溶液，混勻，25 35°C下平衡0.1 IOmin,加入足量Heparinase III酶，混勻，25 35°C水浴0.1 3h,加入HCl溶液，離心混勻，取上清液進(jìn)行紫外分光光光度計(jì)檢測，以未進(jìn)行酶反應(yīng)的樣品為空白對照，讀出樣品的吸光度值A(chǔ)235nm ;所述待測樣品可以是提取后的heparosan樣品，也可以是含有heparosan的粗品或E.coli K5發(fā)酵上清液等；(2)配制梯度濃度的h印arosan標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照步驟(I)方法進(jìn)行反應(yīng)和檢測，繪制吸光度值與底物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)對照標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品吸光度值A(chǔ)235nm,獲得樣品溶液中heparosan濃度值，換算得到樣品中heparosan含量。所述步驟(I)緩沖液組成如下:Tris!1(:110 501111，恥(:140 801111，03(:121 41111，牛血清蛋白0.005 0.02% (w/w)，溶劑為水，ρΗ7.0 7.5。對酶反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，所述方法如下:
(I)取待測樣品，溶于緩沖液A中配制成樣品濃度f500g/L的樣品溶液(樣品為提取后的heparosan樣品時,樣品濃度為l 10g/L為宜,樣品為含有heparosan的粗品時，樣品濃度可為10(T500g/L，優(yōu)選為30(T500g/L)，取0.6mL樣品溶液，混勻，25 35°C下平衡
0.riOmin,加入 Heparinase III 酶液 0.05mL,混勻，25 35 °C水浴 0.1 3h，加入 50mMHCl溶液2.35mL,離心混勻，取上清液進(jìn)行紫外分光光光度計(jì)檢測，以未進(jìn)行酶反應(yīng)的樣品為空白對照，讀出樣品的吸光度值A(chǔ)235nm;所述緩沖液A組成如下:Tris HC120mM, NaC150mM,CaCl24mM,牛血清蛋白 0.01%,溶劑為水，pH7.5 ;所述 Heparinase III 酶液由 HeparinaseIII酶溶于緩沖液A制得，酶液單位酶活大于165U/mL;(2)配制梯度濃度的h印arosan標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照步驟(I)方法進(jìn)行反應(yīng)和檢測，繪制吸光度值與底物濃度的標(biāo)·準(zhǔn)曲線；(3)對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品吸光度值A(chǔ)235nm,獲得樣品溶液中h印arosan濃度值，換算得到樣品中heparosan含量。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了一種酶法快速定量檢測heparosan的方法，該方法可適用于提取后的heparosan樣品的測定,也可以是含有heparosan的粗品或E.coli K5發(fā)酵上清液中heparosan含量的測定,與硫酸咔唑法、干重法相比具有專一'I"生強(qiáng)、精度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，而且操作簡單方便。


圖1為不同酶反應(yīng)時間下heparosan的解聚效果；泳道1飛分別為酶反應(yīng)O、15、30、60、90、120min 樣品；圖2為不同Heparinase III酶量對酶法測定heparosan的影響；圖3為反應(yīng)體系A(chǔ)中Heparinase III酶法檢測heparosan的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為反應(yīng)體系B中Heparinase III酶法檢測heparosan的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:實(shí)施例1:Heparinase III酶活的測定肝素裂解酶III特異性裂解葡萄糖醛酸與葡萄糖胺之間的價鍵，具體如下:
權(quán)利要求
1.一種酶法快速定量檢測heparosan的方法,所述方法包括: (1)取待測樣品，溶于PH7.(Γ7.5的緩沖液中配制成樣品溶液，混勻，25 35°C下平衡0.1 IOmin,加入足量Heparinase III酶，混勻，20 35°C水浴0.1 3h,加入HCl溶液，離心混勻，取上清液進(jìn)行紫外分光光光度計(jì)檢測，以未進(jìn)行酶反應(yīng)的樣品為空白對照，讀出樣品的吸光度值A(chǔ)235nm; (2)配制梯度濃度的heparosan標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照步驟(I)方法進(jìn)行反應(yīng)和檢測，繪制吸光度值與底物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)對照標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品吸光度值A(chǔ)235nm,獲得樣品溶液中heparosan濃度值,換算得到樣品中heparosan含量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(I)緩沖液組成如下=TrisHCll(T50mM，NaC14(T80mM，CaCl21 4mM，牛血清蛋白 0.005 0.02%，溶劑為水，ρΗ7.0 7.5。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下: (1)取待測樣品，溶于緩沖液A中配制成樣品濃度f500g/L的樣品溶液，取0.6mL樣品溶液，混勻，25 35°C下平衡 0.Γ Οπι η, ρΛ Heparinase III 酶液 0.05mL，混勻，25 35°C水浴0.5 3h，加入50mM HCl溶液2.35mL,離心混勻，取上清液進(jìn)行紫外分光光光度計(jì)檢測，以未進(jìn)行酶反應(yīng)的樣品為空白對照，讀出樣品的吸光度值A(chǔ)235nm ;所述緩沖液A組成如下:TrisHC120mM, NaC150mM, CaCl24mM，牛血清蛋白 0.01%，溶劑為水，ρΗ7.5 ;所述 Heparinase III酶液由!feparinaseIII酶溶于緩沖液A制得，酶液單位酶活大于165U/mL ； (2)配制梯度濃度在0.l"10g/L之間的heparosan標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按照步驟(I)方法進(jìn)行反應(yīng)和檢測，繪制吸光度值與底物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)對照標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)樣品吸光度值A(chǔ)235nm,獲得樣品溶液中heparosan濃度值,換算得到樣品中heparosan含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種酶法快速定量檢測heparosan的方法，所述方法包括(1)取待測樣品，溶于pH7.0~7.5的緩沖液中配制成樣品溶液，混勻，25~35℃下平衡0.1~10min，加入足量Heparinase III酶，混勻，25~35℃水浴0.1~3h，加入HCl溶液，離心混勻，取上清液進(jìn)行紫外分光光光度計(jì)檢測，以未進(jìn)行酶反應(yīng)的樣品為空白對照，讀出樣品的吸光度值A(chǔ)235nm；(2)配制梯度濃度的heparosan標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照步驟(1)方法進(jìn)行反應(yīng)和檢測，繪制吸光度值與底物濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品吸光度值A(chǔ)235nm，獲得樣品溶液中heparosan濃度值，換算得到樣品中heparosan含量。該方法與硫酸咔唑法、干重法相比具有專一性強(qiáng)，精度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N21/31GK103149198SQ20131005018
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月8日
發(fā)明者鐘衛(wèi)鴻, 黃海嬋, 趙穎穎, 呂沈聰 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)