專利名稱：用于基因治療的含雜交啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體的制作方法
本申請(qǐng)涉及可以用于基因操作，特別是用于疾病預(yù)防或治療(下文稱為基因治療)的核酸構(gòu)建體。在基因治療中，有待在有機(jī)體中表達(dá)的基因被引入到有機(jī)體中。這些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)對(duì)基因治療的預(yù)防和治療效果有重要意義。
專利申請(qǐng)PCT/GB95/02000、PCT/EP95/03370、PCT/EP95/03371、PCT/EP95/03368和PCT/EP95/03339描述了基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物。這些調(diào)節(jié)物包括激活物序列，其功能是，例如，細(xì)胞特異性或病毒特異性地激活基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄。此激活物序列的DNA序列通過其3′末端和啟動(dòng)子組件的5′末端連接。接著結(jié)構(gòu)基因通過其5′末端和此啟動(dòng)子組件的3′末端連接。
啟動(dòng)子組件由結(jié)合CDF和CHF家族或E2F和CHF家族之轉(zhuǎn)錄因子的核酸序列組成。在細(xì)胞周期的G0和G1期，這種結(jié)合導(dǎo)致上游激活物序列的抑制，結(jié)果使位于下游(即在轉(zhuǎn)錄方向上)的結(jié)構(gòu)基因抑制或者轉(zhuǎn)錄。
在細(xì)胞分裂的G0和G1期，細(xì)胞含有的DNA以二倍體狀態(tài)存在。在G0期，細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，而在G1期，其細(xì)胞周期進(jìn)程受到抑制。G1期之后是S期，此期發(fā)生DNA合成并且基因組復(fù)制。然后是G2期，此期細(xì)胞處于四倍體狀態(tài)。G2期之后是細(xì)胞分裂期(有絲分裂＝M期)。然后子代細(xì)胞進(jìn)入G0狀態(tài)和G1狀態(tài)。
在G0和G1期，細(xì)胞特異性或者病毒特異性的激活物序列和抑制激活物序列的啟動(dòng)子組件組合使以細(xì)胞特異性或者病毒特異性以及細(xì)胞周期特異性(即局限于S和G2期)的方式調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)成為可能。
激活物序列和啟動(dòng)子組件的組合體被稱為嵌合啟動(dòng)子。嵌合啟動(dòng)子在基因治療上有很多可能的應(yīng)用，但由子其缺點(diǎn)也有很多限制這些限制的例子是—引起結(jié)構(gòu)基因極低水平轉(zhuǎn)錄的弱激活物序列，
—在完全依靠細(xì)胞周期的方式中，不能被選擇的啟動(dòng)子組件抑制的激活物序列的使用，—對(duì)兩種結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物(例如細(xì)胞特異性或病毒特異性和細(xì)胞周期特異性)的限制，—已經(jīng)導(dǎo)入細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)基因之轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不充分胞內(nèi)運(yùn)輸。
本發(fā)明通過提供本發(fā)明的核酸構(gòu)建體，克服了利用已知嵌合啟動(dòng)子表達(dá)外源基因的這些弱點(diǎn)，這些核酸構(gòu)建體使得可以在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)。
本發(fā)明的目的是使得可以獲得能夠在宿主細(xì)胞中以精確的方式調(diào)節(jié)外源基因(轉(zhuǎn)基因)表達(dá)的核酸構(gòu)建體。因此，本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體，其中通過至少一種顯示出第一突變(這種突變抑制轉(zhuǎn)基因的正常表達(dá))的核酸序列來完成轉(zhuǎn)基因的精確調(diào)節(jié)，另外，其中至少另一種核酸序列顯示出第二突變，這種突變消除(abolish)第一核酸序列(S)中由于突變而產(chǎn)生的抑制作用。
具體地說，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體通過利用可變(alternative)構(gòu)建體調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。當(dāng)含有第一突變的核酸序列是轉(zhuǎn)基因(b)(這種轉(zhuǎn)基因包含抑制所說的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯或者抑制藥理活性化合物功能的突變)時(shí)，這種核酸構(gòu)建體還包含定位于轉(zhuǎn)基因5′末端的第一啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a)；或者，當(dāng)含有第一突變的核酸序列是第一啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a′)(其包含抑制第一啟動(dòng)子功能的突變)時(shí)，核酸構(gòu)建體還包含編碼藥理活性化合物的轉(zhuǎn)基因(b′)。另外，至少一種包含第二突變的核酸序列消除由于第一突變而引起的抑制作用。
這些核苷酸序列在相同或不同啟動(dòng)子序列控制之下，因此轉(zhuǎn)基因只有在所有啟動(dòng)子序列都被激活的情況下才能表達(dá)。
優(yōu)選的是，新核酸構(gòu)建體在5′末端至3′末端方向的閱讀框架中，包含至少下列組件第一(I)啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列(a)，其是非特異性的、細(xì)胞特異性或病毒特異性的，或者其可以被四環(huán)素或代謝性地和/或細(xì)胞周期特異性地激活，其激活轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄并且包含抑制此啟動(dòng)子功能的突變(a′)，
作為結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)基因(b′)，這種轉(zhuǎn)基因編碼活性化合物并且可能包含終止結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯或者抑制結(jié)構(gòu)基因產(chǎn)物功能的突變，第二(II)啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列(C)或(C′)，這種序列是非特異性的、細(xì)胞特異性或者病毒特異性的，或者其可以被代謝性地和/或細(xì)胞周期特異性地激活，其激活組件(d)或(d′)的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄并且包含抑制此啟動(dòng)子功能的突變，用于消除(relieve)一種或多種啟動(dòng)子或者轉(zhuǎn)基因中的突變的tRNA(抑制基因tRNA)或者調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(d)或者(d′)的基因。
第一(I)啟動(dòng)子序列或者增強(qiáng)子序列(a)和第二(II)啟動(dòng)子序列或者增強(qiáng)子序列(c)可以相同或不同，并且組件a)和c)至少一種可以是可非特異性地、細(xì)胞特異性地或者病毒特異性地激活的，可由四環(huán)素或者代謝性地(特別是由氧不足)或細(xì)胞周期特異性地激活的。
本發(fā)明也涉及核酸構(gòu)建體，其中所說的組件b)顯示出核保留信號(hào)，這種核保留信號(hào)的cDNA在其5′末端直接或間接地和結(jié)構(gòu)基因的3′末端連接，并且其中所說的核保留信號(hào)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯示出結(jié)合核輸出因子的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明也涉及核酸構(gòu)建體，除組件a)和d)之外，其還含有下列組件—另一種激活核輸出因子基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(i)，和—編碼核輸出因子(k)的核酸，所說的核輸出因子和核保留信號(hào)(h)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
在本發(fā)明的上下文中，啟動(dòng)子序列或增強(qiáng)子序列a)和c)至少一種可以是嵌合啟動(dòng)子，其中啟動(dòng)子組件CDE-CHR或E2FBS-CHR和上游激活物序列(此激活物序列是可細(xì)胞特異性、病毒特異性或代謝性地激活的)相互作用，進(jìn)而影響，特別是抑制下游基因的表達(dá)。
組件a)和c)也可以是激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位。這種構(gòu)建體也具有下列組件—至少一種啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(e)，這種序列可以被非特異性地、病毒特異性地、代謝性地、由四環(huán)素或者細(xì)胞特異性地和/或細(xì)胞周期特異性地激活，—至少一種激活物亞單位(f)，其位于啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列(e)的下游，并且其轉(zhuǎn)錄由所述啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(e)激活，
—激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)，其由(f)中描述的激活物亞單位或者幾種相同或不同激活物亞單位(f′)的表達(dá)產(chǎn)物激活。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體是這種一種核酸構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子序列或者增強(qiáng)子序列(a)和/或(c)和/或(i)和/或激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)是嵌合啟動(dòng)子，并且激活物亞單位(f)是至少一種激活激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)之嵌合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子。
本發(fā)明也涉及包含由兩種激活物亞單位(f，f′)激活的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)的核酸構(gòu)建體，例如和SV40啟動(dòng)子結(jié)合的LexA操縱子(單體或多體)。激活物亞單位f)包括LexA DNA結(jié)合蛋白的cDNA，這種cDNA編碼氨基酸1-81或1-202，其3′末端和Ga180蛋白質(zhì)(氨基酸1-435)之cDNA的5′末端連接。第二激活物亞單位(f′)包含Ga14蛋白質(zhì)的Ga180結(jié)合域之cDNA，這種cDNA編碼氨基酸851-881，其3′末端和SV40大T抗原之cDNA(編碼氨基酸126-132，其3′末端和HSV-1 VP16的反式激活域之cDNA(編碼氨基酸406-488)的5′末端連接)的5′末端連接。
在另一個(gè)由兩種激活物亞單位(f，f′)激活的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)的例子中，上述的Lex A操縱基因由Ga14結(jié)合域(單個(gè)或多個(gè)連續(xù)排列)替代，而LexA DNA結(jié)合蛋白質(zhì)之基因由Ga14蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合域(AA1至147)替代。
本發(fā)明也涉及核酸構(gòu)建體，這種核酸構(gòu)建體作為激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)，包含Ga14結(jié)合蛋白質(zhì)之結(jié)合序列的單體和多體；激活物亞單位(f)包含SV40的核定位信號(hào)(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；PKKKRKV，SEQ ID NO.1)、HSV-1 VP16(氨基酸406-488)的酸反式激活域(TAD)和CDA糖蛋白(氨基酸397-435)之細(xì)胞質(zhì)部分的cDNA；激活物亞單位(f)包含SV40的核定位信號(hào)(NLS)(SV40大T；氨基酸126-132；PKKKRKV)、Ga14蛋白質(zhì)(氨基酸1-147)之DNA結(jié)合域的cDNA、p56 Ick蛋白質(zhì)(氨基酸1-71)之CD-4結(jié)合序列的cDNA。
在另一個(gè)激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位的例子中，其中激活物的響應(yīng)啟動(dòng)子(g)的例子是Ga14結(jié)合序列，激活物亞單位(f)的Ga180蛋白質(zhì)(氨基酸1-435)之cDNA由CD4糖蛋白(氨基酸397-437；Simpson等，癌基因41141(1989)；Maddon等，細(xì)胞4293(1985))之細(xì)胞質(zhì)部分的cDNA替代，激活物亞單位(f)之Ga14蛋白質(zhì)的Ga180結(jié)合域的cDNA(編碼氨基酸851-881)由p56 Ick蛋白質(zhì)的CD4結(jié)合序列之cDNA替代(氨基酸1-71；Shaw等，細(xì)胞59627(1989)；Turner等，細(xì)胞60755(1990)；Perfmutter等，細(xì)胞生物化學(xué)雜志38117(1988))。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，新核酸構(gòu)建體可以顯示出核保留信號(hào)(NRS)，此NRS在閱讀方向的下游(即通過其DNA的5′末端)和轉(zhuǎn)基因(b)(即在轉(zhuǎn)基因的3′末端)連接。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，核保留信號(hào)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有結(jié)合核輸出因子(NEF)的結(jié)構(gòu)。核輸出因子的cDNA優(yōu)選通過其5′末端和另一個(gè)啟動(dòng)子序列或增強(qiáng)子序列(其與啟動(dòng)子序列a)和/或c)可以相同也可以不同)的3′末端連接。
核輸出因子(k)優(yōu)選的是選自由反轉(zhuǎn)錄病毒(如HIV-1或HIV-2病毒、Visna-maedi病毒、羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒、馬傳染性盆血病毒和貓免疫缺陷病毒或HTLV)的rev基因、或者h(yuǎn)nRNP-A1蛋白質(zhì)的基因、或者轉(zhuǎn)錄因子TFIII-A的基因組成的組。
通常，所述核酸是DNA，此新的核酸構(gòu)建體慣例上用作載體，特別是質(zhì)粒載體(非病毒)或病毒載體。
通常，所述的轉(zhuǎn)基因是編碼藥理活性化合物的結(jié)構(gòu)基因，這些化合物選自由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、抗體或抗體片段、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子的受體、具有抗增殖或細(xì)胞抑制作用的蛋白質(zhì)、酶、血管生成抑制劑、血栓形成誘導(dǎo)物質(zhì)、凝結(jié)抑制劑、具有纖維蛋白溶解作用的蛋白質(zhì)、血漿蛋白、補(bǔ)體激活蛋白、病毒包被蛋白、細(xì)菌抗原和寄生蟲抗原、對(duì)血液循環(huán)具有作用的蛋白質(zhì)、肽激素、核糖核酸(如核酶和反義RNA)組成的組。
在特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因可以是編碼一種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，該蛋白質(zhì)觸發(fā)控制性細(xì)胞死亡。這些蛋白質(zhì)的一個(gè)例子鞘磷脂酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因(b)可以是編碼一種酶的結(jié)構(gòu)基因，此酶切割藥物前體形成藥物。在特定的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因可以是編碼融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因，此蛋白由配位體和一種前述的蛋白或肽活性化合物組成。配位體可以是，例如抗原、抗原片段、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、肽激素或者受體。在特定的實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)基因可以編碼配位體—酶融合蛋白，酶切割藥物前體，進(jìn)而形成藥物，并且配位體結(jié)合在細(xì)胞表面，優(yōu)選的是內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的表面。
啟動(dòng)子序列、增強(qiáng)子序列或者激活物序列可以是選自由基因調(diào)節(jié)核苷酸序列組成的組，這些序列在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑機(jī)細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、白細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中激活，或者選自由HBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV或HIV病毒啟動(dòng)子序列組成的組。
并且，激活物序列還可以是和相應(yīng)抑制基因結(jié)合的四環(huán)素操縱基因。
本發(fā)明涉及包含新核酸構(gòu)建體的病毒或非病毒載體，其局部或經(jīng)口施用或注射到患者體內(nèi)。另外，可以通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)施用新核酸構(gòu)建體到體腔、器官或皮下。
本發(fā)明也涉及分離的細(xì)胞或細(xì)胞系，其含有新核酸構(gòu)建體，并且局部施用或注射給患者。
這些細(xì)胞的例子是腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)或者內(nèi)皮細(xì)胞。具有這種特性的細(xì)胞可以用于制備治療疾病的藥物，藥物的制備包含將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入到靶細(xì)胞中。
新核酸構(gòu)建體使得可以利用任何啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或者激活物序列。
轉(zhuǎn)基因(b)中或其上的新突變可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸的核酸序列的替代，這種替代的結(jié)果是表達(dá)的蛋白質(zhì)不再具有功能。在這種情況下，組件d)是編碼tRNA的核酸序列，這種tRNA，一方面通過其反密碼子和轉(zhuǎn)基因(b)中突變的核苷酸序列之mRNA結(jié)合，另一方面，攜帶給出(take up)正確氨基酸以消除轉(zhuǎn)基因(b)的突變的末端基團(tuán)。
然而，轉(zhuǎn)基因(b)中或其上的新突變也可以是結(jié)構(gòu)基因中的翻譯終止密碼子(這種密碼子或者沒有發(fā)現(xiàn)，或者只在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中很少地發(fā)現(xiàn))，以便轉(zhuǎn)基因不能被有效地翻譯。在這種情況下，組件d)是一種核酸序列，一方面其編碼具有反密碼子的tRNA，這種反密碼子和終止密碼子互補(bǔ)，進(jìn)而消除由于結(jié)構(gòu)基因(b)中的翻譯終止密碼子引起的翻譯抑制作用，另一方面，這種tRNA攜帶給出正確氨基酸的以消除轉(zhuǎn)基因(b)的突變的末端基團(tuán)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因(b)中或其上的突變可以是啟動(dòng)子序列的TATA盒的突變，這種序列定位于結(jié)構(gòu)基因5′末端的上游。此突變阻斷結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用。在這種情況下，組件d)是編碼和突變的TATA盒結(jié)合之蛋白質(zhì)進(jìn)而使轉(zhuǎn)錄能夠發(fā)生的核酸序列。
本發(fā)明還涉及通過使細(xì)胞和細(xì)胞增殖抑制量的核酸構(gòu)建體接觸來抑制細(xì)胞增殖的方法，所述構(gòu)建體包含至少一種含有第一突變(此突變抑制轉(zhuǎn)基因的正常表達(dá))的核酸序列和至少一種含有第二突變(此突變消除由第一突變產(chǎn)生的抑制作用)的核酸序列。
本發(fā)明也涉及治療患有和過量細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病的患者的方法，其中所說的方法包括對(duì)患者施用細(xì)胞增殖抑制量的本發(fā)明的核酸構(gòu)建體。核酸構(gòu)建體特別有效的疾病是腫瘤及和血管中細(xì)胞增殖相關(guān)的心血管疾病。
另外，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，該組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的細(xì)胞增殖抑制量的核酸構(gòu)建體。
附圖中公開的核酸構(gòu)建體只是優(yōu)選實(shí)施方案的例子，無意于將本發(fā)明限制在本文公開的特定組件中。


圖1A和1B描述了在可替換的方案中核酸構(gòu)建體的單個(gè)組件的排列。
圖2描述了激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位單個(gè)組件的排列。
圖3描述了核酸構(gòu)建體中優(yōu)選的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位。
圖4描述了利用嵌合啟動(dòng)子構(gòu)建體的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子。
圖5A和5B描述了在可替換的方案中另一個(gè)核酸構(gòu)建體的單個(gè)組件的排列。
圖6描述了另一個(gè)核酸構(gòu)建體中單個(gè)組件的排列。
圖7描述了另一個(gè)核酸構(gòu)建體中幾種相同的抗腫瘤或抗炎癥物質(zhì)(A，A)或不同的抗腫瘤物質(zhì)(A，B)之單個(gè)組件的排列。
圖8描述了病毒物質(zhì)A和抗病毒物質(zhì)B之單個(gè)組件的排列。
圖9描述了含有連接在一起的元件I和元件II的本發(fā)明雜交啟動(dòng)子。
圖10描述了含有連接在一起的元件IIa、III及IV的本發(fā)明的雜交啟動(dòng)子。
圖11描述了本發(fā)明優(yōu)選的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位之一的核苷酸序列。
圖12描述了激活物亞單位A的融合蛋白質(zhì)。
圖13描述了激活物亞單位B的融合蛋白質(zhì)。
本發(fā)明涉及用于宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸構(gòu)建體，這種構(gòu)建體包含至少一種含有第一突變(此突變抑制轉(zhuǎn)基因的正常表達(dá))的核酸序列，以及至少另一種含有第二突變(此突變消除第一核酸序列(S)中由突變產(chǎn)生的抑制作用)的核酸序列。
這些核苷酸序列在相同或不同啟動(dòng)子序列控制之下，因此只有在所有這些啟動(dòng)子序列全部被激活時(shí)，轉(zhuǎn)基因才能表達(dá)。
優(yōu)選的是，新的核酸構(gòu)建體在5′至3′末端方向的閱讀框架中包含至少下列組件—第一啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a)，這種序列激活轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄，并且可以包含也可以不包含抑制第一啟動(dòng)子(a′)功能的突變，—編碼藥理活性化合的的轉(zhuǎn)基因(b′)，其可以包含也可以不包含突變(b)，這種突變終止轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和/或者翻譯，或者抑制藥理活性化合物的功能，—第二啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列(c)，此序列激活組件d)的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄，并且可以包含也可以不包含抑制第二啟動(dòng)子功能的突變，—用于消除轉(zhuǎn)基因(b)或啟動(dòng)子(a)或(c)至少一種中的突變的tRNA(抑制基因tRNA)或者調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)(d)的基因。
圖1A和1B(方案A和B)以舉例的方式描述了單個(gè)組件的排列。這些附圖顯示核酸構(gòu)建體的可替換的實(shí)施方案。
在本發(fā)明的新核酸構(gòu)建體中，組件a)或c)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列可以相同或不同，并且，組件c)和d)可以定位在組件a)和b)的上游或下游。
至少一種強(qiáng)啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列(如來源于CMV(EP-A-0173177)或者SV40的)，或者和相應(yīng)的阻遏物組合的四環(huán)素操縱基因，或者任何其它的啟動(dòng)子序列或者增強(qiáng)子序列(這些對(duì)技術(shù)人員來說都是熟悉的)優(yōu)選地用作啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以細(xì)胞特異性地、代謝性地(例如，由氧不足)、病毒特異性地或細(xì)胞周期特異性地激活新核酸構(gòu)建體中至少一種啟動(dòng)子序列或增強(qiáng)子序列。
下列啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列是特別優(yōu)選的
能夠細(xì)胞特異性地激活內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、造血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的那些啟動(dòng)子序列或者增強(qiáng)子序列；和/或HBV、HCV、HSV、HPV、CMV、EBV、HTLV或者HIV病毒的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列；和/或可以被代謝性地激活的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列，例如氧不足可誘導(dǎo)的增強(qiáng)子(Semenza等，PNAS 88，5680(1991))或啟動(dòng)子(Mc Burney等，核酸研究19，5755，(1991)；WO95/21927)；和/或可以被細(xì)胞周期特異地激活的啟動(dòng)子，如cdc25C基因、細(xì)胞周期蛋白A基因、cdc2基因的啟動(dòng)子(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995)，Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)，Zwicker等，核酸研究23，2833(1995)；B-myb基因啟動(dòng)子(Lam等，EMBO J.12，2705(1995)；DHFR基因啟動(dòng)子(Means等，分子細(xì)胞生物學(xué)12，1054(1992)和EI-1基因啟動(dòng)子(Johnson等，基因進(jìn)展8，1514(1994)，Hsiao等，基因進(jìn)展8，15256(1994))或者其它結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的序列(這種序列在細(xì)胞增殖期間出現(xiàn)或激活)。這些結(jié)合序列的例子是被稱為Myc E盒的核苷酸序列的單體或多體(Blackwood和Eisenmam，科學(xué)251，1211(1991))。
還有可以由四環(huán)素激活的啟動(dòng)子(如和相應(yīng)的阻遏物組合的四環(huán)素操縱基因(Gos sen等，TIBS 18，471(1993)，Dingermann等，EMBO J.11，1487(1992)，Gossen等，科學(xué)268，1766(1995)也是本發(fā)明范圍內(nèi)可以利用的。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，新核酸構(gòu)建體中至少一種啟動(dòng)子序列或者增強(qiáng)子序列是嵌合啟動(dòng)子。在本發(fā)明中，嵌合啟動(dòng)子是上游激活序列(其可以被細(xì)胞特異性地、代謝性地或者病毒特異性地激活)和下游啟動(dòng)子組件的組合體。優(yōu)選的是，該啟動(dòng)子組件包含含有CDEE-CHR元件或者E2FBS-(Bmyb)-CHR元件的核苷酸序列，因此能夠在細(xì)胞周期的G0和G1期抑制上游激活物序列的激活(Lucibello等，EMBO J.14，132(1994)，PCT/GB95/02000；Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)；Zwicker等，科學(xué)271，1595(1996))。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，新核酸構(gòu)建體中至少一種啟動(dòng)子序列或者增強(qiáng)子序列(組件a)或c))是激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位。
對(duì)此部分來說，激活物響應(yīng)啟動(dòng)子由下列組件組成—一種或多種相同或不同啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列(s)(e)，這種序列可以被，例如，細(xì)胞周期特異性地、代謝性地、細(xì)胞特異性地或病毒特異性地激活，或者可以被細(xì)胞周期特異性地與和代謝性地、細(xì)胞特異性地或病毒特異性地激活(所謂的嵌合啟動(dòng)子)，—一種或幾種相同或者不同的激活物亞單位(s)(f)，其在任何情況下都定位在啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列的下游并且這些序列激活其基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄；—由一種或幾種激活物亞單位(s)的表達(dá)產(chǎn)物激活的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)。
附圖2的方案C以舉例的方式描述了激活物響應(yīng)啟動(dòng)子之單個(gè)組件的排列。
附圖3的方案D)以舉例的方式描述了新核酸構(gòu)建體中優(yōu)選的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子的插入。
在激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位最簡(jiǎn)單的形式中，其可以是，例如，如附圖4的方案E所描述的嵌合啟動(dòng)子構(gòu)建體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子可以是結(jié)合嵌合轉(zhuǎn)錄因子的序列，這些序列由DNA結(jié)合域、蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用域和反式激活域組成。作為藥理活性化合物優(yōu)選的結(jié)構(gòu)基因是蛋白質(zhì)和糖蛋白，這些蛋白質(zhì)選自由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子受體、抗體或抗體片段、配位體(如抗體或抗體片段)和細(xì)胞因子或者生長(zhǎng)因子組成的融合蛋白質(zhì)、具有抗增殖或細(xì)胞抑制作用的蛋白質(zhì)、血管形成抑制因子、血栓形成誘導(dǎo)蛋白質(zhì)、凝結(jié)抑制因子、血漿蛋白質(zhì)、補(bǔ)體激活蛋白質(zhì)、病毒包被物質(zhì)和細(xì)菌包被物質(zhì)。
按照本發(fā)明，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中提供了具有突變(此突變阻止功能蛋白質(zhì)(或肽)的表達(dá))的結(jié)構(gòu)基因(轉(zhuǎn)基因-組件b))。
此突變可以由一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的核苷酸序列替代，替代的結(jié)果是表達(dá)的蛋白質(zhì)不再具有功能(錯(cuò)義突變)，即不再產(chǎn)生任何活性化合物或任何功能酶。在結(jié)構(gòu)基因(轉(zhuǎn)基因-組件b))發(fā)生這種特性的突變時(shí)，組件d)是編碼tRNA的核苷酸序列，這種tRNA一方面通過其反密碼子和結(jié)構(gòu)基因(組件b))之mRNA的突變位點(diǎn)結(jié)合，另一方面攜帶給出正確氨基酸以消除轉(zhuǎn)基因(抑制基因tRNA)中的突變的末端基團(tuán)。
在上下文中，正常情況下，只很少地用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的那些tRNA將，具體地說，突變成抑制基因tRNA，以使細(xì)胞總翻譯效率的負(fù)結(jié)果最小化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)基因的突變是引入了一個(gè)或多個(gè)翻譯終止密碼子(無義突變)。已知mRNA中的核苷酸序列UAA、UGA和UAG是翻譯終止密碼子。這些終止密碼子相應(yīng)的DNA序列是DNA的TAA、TGA和TAG編碼鏈。這些終止密碼子之一作為突變優(yōu)選地插入到結(jié)構(gòu)基因(組件b))的DNA序列中。
基因結(jié)構(gòu)基因(組件b))發(fā)生這種特異的突變時(shí)，組件d)是編碼tRNA(抑制基因tRNA)的核酸序列，這種tRNA，一方面通過其反密碼子和突變，即和結(jié)構(gòu)基因(組件b))之mRNA的導(dǎo)入的終止密碼子結(jié)合，另一方面，攜帶給出正確氨基酸(這些氨基酸在突變的位點(diǎn)上由原來的DNA序列編碼)的末端基團(tuán)，已經(jīng)描述了大腸肝菌、酵母和植物細(xì)胞中這種特性的核酸序列(b)(Dingermann等，分子細(xì)胞生物學(xué)12，4038(1992)，EMBO J.11，1487(1992)；Gossen等TIBS 18，471(1993)；Gatz等，植物雜志2，397(1992))。按照本發(fā)明，正常情況下在哺乳動(dòng)物中只很少使用的tRNAs，在這種情況下，也突變成抑制基因tRNAs。
這樣，例如，可以選擇下列組合體(Lewin編輯，基因IV，牛津大學(xué)出版1990，151頁(yè))
表1氨基酸 密碼子終止突變 抑制基因tRNA 和抑制基因tRNA 基因座(密碼子) (反密碼子)聯(lián)系的氨基酸Tyr UAU UAG CUA Tyr sup F(su+3)Tyr UAC UAA UUA Tyr sup C(su+4)Ser UCG UAG CUA Ser sup D(su+1)Gln CAG UAG CUA Gln sup E(su+2)Lys AAA UAA UUA Lys sup G(su+5)Lys AAG UAG UUA Lys sup G(su+5)TrP UGG UGA UCA Trp sup U(su+7)TrpUGG UCA Trp sup U(su+7)在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)基因(組件b)中或其上的突變可以是位于結(jié)構(gòu)基因5′末端上游之啟動(dòng)子序列(組件a))的TATA盒的突變。TATA盒(TATAAA)被認(rèn)為是RNA聚合酶II和III的中央起始位點(diǎn)，這些聚合酶出現(xiàn)在細(xì)胞核中。通過和TATA盒結(jié)合蛋白質(zhì)(TBP)的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄在TATA盒起始，在實(shí)質(zhì)性的方式中，TBP和出現(xiàn)在細(xì)胞核中的所有RNA聚合酶(I、II、III)的轉(zhuǎn)錄相關(guān)。嚴(yán)格依賴TATA盒的啟動(dòng)子的例子是U6基因的啟動(dòng)子，此基因通過RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄，并且該基因產(chǎn)物以實(shí)質(zhì)性的方式和mRNA的剪接相關(guān)。
按照本發(fā)明，依賴于突變的TATA盒的啟動(dòng)子(組件a))定位于結(jié)構(gòu)基因(組件b))的5′末端上游。這種變突的例子可以是TGTAA。突變的結(jié)果是不再能識(shí)別正常TBP的DNA結(jié)合位點(diǎn)，并且結(jié)構(gòu)基因(b)不再有效地轉(zhuǎn)錄。在發(fā)生這種特性的突變時(shí)，組件d)是編碼共突變的TBP的核酸序列。共突變的結(jié)果是，TBP和組件a)中突變的TATA盒(例如和TGTAAA)結(jié)合，結(jié)果引起結(jié)構(gòu)基因(組件b))的有效轉(zhuǎn)錄。TBP基因的這種共突變已由，例如，Strubin和Struhl(細(xì)胞68，721(1992))和Heard等(EMBO J.12，3519(1993)描述。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在合適的位點(diǎn)將核保留信號(hào)(NRS)(h)和核輸出信號(hào)加入到新核酸構(gòu)建體中，附圖5的方案F)和G)描述了新核酸構(gòu)建體中單個(gè)組件的排列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，方案F)和G)描述的核酸構(gòu)建體彼此組合。這種方式的組合能夠包括另一個(gè)啟動(dòng)子(啟動(dòng)子IV，組件e))。附圖6的方案H)通過舉例的方式描述了這種組合中單個(gè)組件的排列。
核保留信號(hào)是阻止前信使RNA轉(zhuǎn)運(yùn)的核苷酸序列，前信使RNA通過核膜和其連接，但另一方面，前信使RNA組成結(jié)合輸出蛋白質(zhì)(被稱為核輸出因子)的結(jié)構(gòu)。核輸出因子(NEF)介導(dǎo)含有NRS的前信使或者信使RNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。含有NRS的前信使或信使RNA通過和NEF結(jié)合，結(jié)果由細(xì)胞核分泌出(Fischer等，細(xì)胞82，475(1995))。
NRS(組件h))優(yōu)選的是反轉(zhuǎn)錄病毒rev響應(yīng)元件(RRE)序列。在HIV-1中RRE是env基因(malim等，自然338，254(1989)；kjems等，PNAS 88，683(1991))中的包含243個(gè)核苷酸(核基酸7362-7595；Muesing等，自然313，450(1985)的序列。然而，在本發(fā)明中，核保留信號(hào)(NRS)也可以是同源和/或功能相似(類似)的核苷酸序列，例如HBV病毒的RRE等同元件(Huang等，分子細(xì)胞生物學(xué)13，7476(1993))。
在新核酸構(gòu)建體中，核輸出因子(NEF，組件K)是編碼結(jié)合NRS之mRNA蛋白質(zhì)的核苷酸序列，并且介導(dǎo)包含NRS的前信使RNA或信使RNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)(或者從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核)。在本發(fā)明的上下文中，具體使用來源于反轉(zhuǎn)錄病毒的rev基因，特別是來源于HIV-1病毒或HIV-2病毒的基因(Daly等，自然342，816(1989)；Emerman等，細(xì)胞57，1155(1989)；Felber等，PNAS 86，1495(1989)；Fischer等，EMBO J.13，4105(1994))。
反轉(zhuǎn)錄病毒的rev基因之rev蛋白通過其N末端域(Zapp等，自然342，714(1989)；malim等，細(xì)胞65，241(1991))和前信使mRNA的RRE結(jié)合(Iwai等，核酸研究20，6465(1992))。RRE和rev蛋白質(zhì)的結(jié)合使非剪接的前信使RNA以及任何其它含有RRE的RNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中(Fischer等，EMBO J.13，4105(1994)；Fischer等。細(xì)胞82，475(1995))，結(jié)果實(shí)質(zhì)上是增加了翻譯。
在本發(fā)明的上下文中，編碼和HIV-1 rev蛋白質(zhì)同源且功能相似之蛋白質(zhì)(Bogerd等細(xì)胞82，485(1995)的核苷酸序列(如visna maedi病毒(VMV；Tiley等，病毒學(xué)雜志65，3877(19917)rev基因，或風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV；Tiley等，病毒學(xué)雜志65，3877(19917)rev基因)也可以用作NEF。
然而，在本發(fā)明的上下文中，也可以利用那些編碼和HIV-1 rev蛋白質(zhì)功能相似之蛋白質(zhì)(在該蛋白質(zhì)和rev蛋白質(zhì)只具有很少的同源性或沒有同源性時(shí))的基因。
這些基因的例子是HTLV-1 rex基因(Cullen，微生物學(xué)綜述56，375(1992)、馬傳染性盆血病毒(EIAV)rev基因和貓免疫缺陷病毒(FIV)rev基因(manusco等，病毒學(xué)雜志68，1988(1994))。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，NEF也可以是一種蛋白質(zhì)的核苷酸序列，這種蛋白質(zhì)引起RNA從細(xì)胞核中分泌，甚至細(xì)胞核中沒有由NRS保留的這種RNA。這種蛋白質(zhì)的例子是轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA(Gaddat等，細(xì)胞60，619(1990)；Drew等，基因159，215(1995)或核內(nèi)不均一核糖核蛋白復(fù)合體A1(hnRNPA1-蛋白質(zhì)；Pinol-Roma等，自然355，730(1992))。
廣義來講，核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)也包括熱激蛋白70(hsc 70；mandell等，細(xì)胞生物學(xué)雜志111，1775(1990))和蛋白激酶抑制劑CPKI(Fantozzi等，生物化學(xué)雜志269，2676(1994)，Wen等，生物化學(xué)雜志269，32214(1994))。
NEF和其同源及相似蛋白質(zhì)共有的特性是位于氨基末端用于單體蛋白質(zhì)和NRS之RNA結(jié)合的域，以及大多數(shù)富含亮氨酸(hnRNPA1是一個(gè)例子)且對(duì)NEF運(yùn)輸功能是必需的域(Wen等，細(xì)胞82，463(1995)；Fischer等，細(xì)胞82，475(1995)；malim等，病毒學(xué)雜志65，4248(1991)；Venkatesh等，病毒學(xué)178，327(1990))。
NEF基因(組件k))的表達(dá)可能在啟動(dòng)子序列(組件i)＝啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列III)的控制之下，這種啟動(dòng)子序列位于NEF基因5’末端的上游。
可以選擇如已經(jīng)描述的用于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列I和II(組件a)和c))的核酸序列之一可以選擇來用作按照本發(fā)明的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列III或IV(參見附圖6的方案H)。
核酸構(gòu)建體優(yōu)選由DNA組成。術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”被理解為指可以在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的人工核酸結(jié)構(gòu)。其最好是插入到載體中，特別優(yōu)選的是非病毒載體、質(zhì)粒載體或病毒載體。這些載體和藥學(xué)上可接受的載體混合，以產(chǎn)生用于基因治療的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是公知的，并且含有核酸構(gòu)建體的優(yōu)選劑量可以通過方便的技術(shù)很容易確定。然后將藥物組合物局部施用給患者，用于疾病的預(yù)防和治療，或者注射或者通過靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)施用到體腔、器官或皮下。在治療腫瘤時(shí)，將藥物組合物直接注射到腫瘤中。然而，可以利用其它已知的通過合適載體的給藥方法(例如以導(dǎo)管為基礎(chǔ)的基因治療)。
由于術(shù)語(yǔ)“治療”涉及對(duì)患者施用包含本發(fā)明的核酸構(gòu)建體之載體，其應(yīng)當(dāng)理解為包括對(duì)患者給藥，以用于疾病的預(yù)防和改善。這些載體對(duì)過量細(xì)胞增殖的疾病特別有用。
新核酸構(gòu)建體可以用于與結(jié)構(gòu)基因一起細(xì)胞特異性地、或病毒特異性地、或在限定的代謝條件下或在暴露于四環(huán)素下后和細(xì)胞周期特異性地表達(dá)轉(zhuǎn)基因(組件b))，所述結(jié)構(gòu)基因優(yōu)選的是編碼藥理活性化合物或其它切割非活性藥物前體形成活性藥物的酶的基因?？梢赃x擇結(jié)構(gòu)基因，以便藥理活性化合物或酶和配體一起作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)，這種配體和細(xì)胞(如增殖內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)表面結(jié)合。
本發(fā)明也涉及含有新核酸構(gòu)建體的酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入到轉(zhuǎn)染后可用作轉(zhuǎn)基因表達(dá)的細(xì)胞系中。結(jié)果這些細(xì)胞可用作制備用于患者的藥物，并且也局部施用給或注謝到患者體內(nèi)，以便用于疾病的預(yù)防或治療。
新核酸構(gòu)建體實(shí)際上不能以這種形式出現(xiàn)，即活性化合物或酶或配體/酶融合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因或結(jié)構(gòu)基因不能天然地突變和不能天然地與消除這種突變的核酸序列組合；并且，其也不能天然地與核保留信號(hào)(NRS)組合，同時(shí)這兩種序列都不能與啟動(dòng)子I(a)及啟動(dòng)子II(c)天然組合，這種組合體依次不能與由啟動(dòng)子III和核輸出因子(NEF)組成的核苷酸序列天然組合。
作為應(yīng)用的函數(shù)選擇新核酸構(gòu)建體的啟動(dòng)子I、II、III和IV以及活性化合物(或者酶)的結(jié)構(gòu)基因。
根據(jù)核酸構(gòu)建體計(jì)劃的用途，可以選擇下列實(shí)施方案
1.通過抑制增殖的內(nèi)皮、治療腫瘤和慢性炎癥1.1a)在內(nèi)皮細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列的選擇在本發(fā)明的上下文中，由啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子組成的優(yōu)選的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子序列包括那些基因調(diào)節(jié)序列和/或編碼蛋白質(zhì)的基因元件，所述蛋白質(zhì)具體地說可以在內(nèi)皮細(xì)胞中(或者在其它和增殖內(nèi)皮細(xì)胞極接近的細(xì)胞中)檢測(cè)到。
Borrow等(藥物理論64，155(1994))和Plate等(腦病理學(xué)，4，207(1994))描述了這些蛋白的一部分。這些內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)的特定例子是-人腦特異性，內(nèi)皮葡萄糖-I-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Murakami等(生物化學(xué)雜志267，9300(1992))描述了啟動(dòng)子序列。
-EndoglinBellon等(歐洲免疫學(xué)雜志23，2340(1993)))和Ge等(基因138，201(1994))描述了啟動(dòng)子序列的一部分。
-VEGF受體識(shí)別了兩種不同的受體(Plate等，國(guó)際癌雜志(Int.J.Cancer)59，520(1994))·VEGF受體-1(flt-1)(de Vries等，科學(xué)255，989(1992)；Wakiya等血管研究雜志33，105(1996))和·VEGF受體-2(flk-1，KDR)(Terman等BBRC 187，1579(1992))。
這兩種受體都只在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)(Senger等，癌遷徒研究12，303(1993))。
-其它內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶·til-1和til-2(Partanen等，分子細(xì)胞生物學(xué)12，1698(1992)，Schniirch和Risau，發(fā)育19，957；Dumont等，癌基因7，1471(1992))·B61受體(Eck受體)(Bartley等，自然368，558(1994)，Pandey等，科學(xué)268，
567(1995)；van der Geer等，細(xì)胞生物學(xué)年度綜述10，251(1994))-B61B61分子是B61受體的配位體(Holzman等，美國(guó)腎學(xué)會(huì)雜志4，466(1993)；Bartley等，自然368，558(1994))-特別是內(nèi)皮·內(nèi)皮BBenatti等(臨床研究雜志91，1149(1993))描述了啟動(dòng)子序列。
·內(nèi)皮-1Wilson等(分子細(xì)胞生物學(xué)10，4654(1990))描述了啟動(dòng)子序列。
-內(nèi)皮受體，特別是內(nèi)皮B受體(Webb等，分子病理學(xué)47，730(1995)；Haendler等，心血管病理學(xué)雜志20，1(1992))。
-甘露糖-6-磷酸鹽受體Ludwig等(基因142，311(19949)；Oshima等，生物化學(xué)雜志263，2553(1988))和Pohlmann等(PNAS US 84，5575(1987))描述了啟動(dòng)子序列。
-von Willebrand因子Jahroudi和Lynch(分子細(xì)胞生物學(xué)14，999(1994))、Ferreira等(生物化學(xué)雜志293，641(1993))和Aird等(PNAS US 92，4567(1995)))描述了啟動(dòng)子序列。
-IL-1α，IL-1βHangen等(分子致癌物質(zhì)2，68(1986))、Terner等(免疫學(xué)雜志143，3556(1989))、Fenton等(免疫學(xué)雜志138，3972(1987))、Bensi等(細(xì)胞生長(zhǎng)分化1，491(1990))、Hiscott等(分子細(xì)胞生物學(xué)13，6231(1993))和Mori等(血液84，1688(1994))描述了啟動(dòng)子序列。
-IL-1受體Ye等(PNAS US 90，2295(1993))描述了啟動(dòng)子序列。
-血管細(xì)胞附著分子(VCAM-1)Neish等(分子細(xì)胞生物學(xué)15，2558(1995))、Ahmad等(生物化學(xué)雜志270，8976(1995))、Neish等(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志176，1583(1992))、Jademarco等(生物化學(xué)雜志267，16323(1992))和Cybulsky等(PNAS US88，7859(1991))描述了VCAM-1啟動(dòng)子序列。
-合成的激活物序列作為天然的內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子的一種替換，也可以利用合成的激活物序列，這種序列包含在內(nèi)皮細(xì)胞中是優(yōu)先或選擇性活性的轉(zhuǎn)錄因子之寡聚結(jié)合位點(diǎn)。這種轉(zhuǎn)錄因子的例子是轉(zhuǎn)錄因子GTTA-2，其在內(nèi)皮細(xì)胞um-基因中的結(jié)合位點(diǎn)是5-TTATCT-3′(Lee等，生物化學(xué)雜志266，16188(1991)；Dorfmann等，生物化學(xué)雜志267，1279(1992)和Wilson等，分子細(xì)胞生物學(xué)10，4854(1990))。
1.1.b)在激活的內(nèi)皮細(xì)胞附近之細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子或者激活物序列的選擇當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行增殖時(shí)，通過打開緊密接頭，相鄰的細(xì)胞變得能夠使來源于血液的大分子進(jìn)入。這種功能和結(jié)構(gòu)相互作用的結(jié)果是，和激活的內(nèi)皮細(xì)胞鄰近之細(xì)胞成為本發(fā)明意義之內(nèi)的靶細(xì)胞。
-VEGFVEGF基因的基因調(diào)節(jié)序列是·VEGF基因的啟動(dòng)子序列(5′側(cè)翼區(qū))(Michenko等，細(xì)胞分子生物學(xué)研究40，35(1994)；Tischer等，生物化學(xué)雜志266，11947(1991))或者·VEGF基因的增強(qiáng)子序列(3′側(cè)翼區(qū))(Michenko等，細(xì)胞分子生物學(xué)研究40，35(1994))或者·C-Src基因(Mukhopadhyay等，自然375，577(1995)；Bonham等，癌基因8，1973(1993)；Parker等，分子細(xì)胞生物學(xué)5，831(1985)，Anderson等，分子細(xì)胞生物學(xué)5，112(1985))或者·V-Src基因(Mukhodpadhyay等，自然375，577(1995)；Anderson等，分子細(xì)胞生物學(xué)5，112(1985)；Gibbs等，病毒學(xué)雜志53，19(1985))-類固醇激素受體和他們的啟動(dòng)子組件(Truss和Beato，內(nèi)分泌學(xué)研究14，459(1993))，特別是
·小鼠乳房腫瘤病毒啟動(dòng)子Chalepakis等(細(xì)胞53，371(1988))及Truss和Beato(內(nèi)分泌學(xué)研究14，459(1993))描述了MMTV長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)的啟動(dòng)子區(qū)之cDNA序列。
1.2.抗腫瘤(或者抗炎癥)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因1.2.a)增殖抑制劑在本發(fā)明中，抗腫瘤或者抗炎癥物質(zhì)應(yīng)理解為抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖之蛋白質(zhì)的DNA序列。這種DNA序列的例子是以下蛋白質(zhì)的DNA序列-成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)(pRb/p110)或者其類似物p107和120-p53蛋白質(zhì)-p21(WAF-1)蛋白質(zhì)-p16蛋白質(zhì)-其它CdK抑制蛋白-GADD45蛋白質(zhì)-bak蛋白質(zhì)。
為了阻止這些細(xì)胞周期抑制劑在胞內(nèi)迅速失活，優(yōu)選使用在表達(dá)蛋白質(zhì)的失活位點(diǎn)顯示出突變，因而這些蛋白質(zhì)的功能沒有受到破壞的那些基因。
成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)(pRb)和相關(guān)的p107和p130蛋白質(zhì)通過磷酸化滅活。優(yōu)選使用發(fā)生點(diǎn)突變的pRb/p110、p107或者p130 cDNA序列，這樣編碼蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)由不能磷酸化的氨基酸替代。
1.2.b)凝結(jié)誘導(dǎo)因子和血管形成抑制劑抗腫瘤或者抗炎癥物質(zhì)也將理解為誘導(dǎo)凝結(jié)和/或者抑制血管形成之蛋白質(zhì)的DNA序列。這些蛋白質(zhì)的例子是-組織因子(TF)和其凝結(jié)活性片段(Morrissey等，細(xì)胞50，129(1987)；Scarpati等，生物化學(xué)26，5234(1987)；Spicer等，PNAS US 84，5148(1987)；Rehemtulla等，Thromb.Heamost.65，521(1991))-血纖維蛋白溶酶原激活抑制劑-1(PAI-1)-PAI-2-PAI-3
Angiostatin和類似的抗血管生成肽(O′Reilly等，自然醫(yī)學(xué)2，689(1996)；Folkman等，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志26，1757(1995))-干擾素·IFNα·IFNβ·IFNγ-Thrombospondin-TNFα-血小板因子4-IL-2-TIMP-1-TIMP-2-TIMP-3-白血病抑制因子(LIF)1.2.c)細(xì)胞抑制和細(xì)胞毒素蛋白質(zhì)然而，抗腫瘤或者抗炎癥物質(zhì)也應(yīng)理解為對(duì)腫瘤細(xì)胞直接或者間接顯示出細(xì)胞抑制作用的蛋白質(zhì)之DNA序列。具體地說，所述蛋白質(zhì)包括-抗體或抗體切割產(chǎn)物-穿孔素-粒酶-IL-2-IL-4-IL-12-干擾素，例如·IFNα·IFNβ·IFNγ-TNF·TNFa·TNFB
-制瘤素M-神經(jīng)磷脂酶(Jarvis等PNAS-美國(guó)91，73(1994))-瓜蟾抗菌肽和瓜蟾抗菌肽衍生物(Cruciani等，PNAS 88，3792(1991)；Jacob等，Ciba Found.Symp.186，197(1994)；Peck-Miller等，癌化學(xué)療法藥理學(xué)32，109(1993))1.2.d)感染誘導(dǎo)物抗腫瘤物質(zhì)也應(yīng)理解為這樣一種蛋白質(zhì)的DNA序列，這種蛋白質(zhì)除了其抗腫瘤作用外，也能刺激感染，進(jìn)而有助于腫瘤細(xì)胞的消除。這些蛋白質(zhì)特定的例子是-RANTES(MCP-2)-單核細(xì)胞趨化性和激活因子(MCAF)-IL-8-巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1(MIP-1α和-β)-嗜中性白細(xì)胞活化因子-2(NAP-2)-IL-3-IL-4-IL-5-人類白血病抑制因子(LIF)-IL-7-IL-11-IL-13-GM-CSF-G-CSF-M-CSF-眼鏡蛇毒因子(CVF)或它的部分序列，其功能相當(dāng)于人類補(bǔ)體因子C3b，即其能夠和補(bǔ)體因子B結(jié)合，在用因子D切割之后，形成C3轉(zhuǎn)化酶。Frikinger等(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)91，12775(1994))公開了CVF的DNA序列和其部分序列。
-人類補(bǔ)體因子C3和它的部分序列C3b。De Bruijn等(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)82，708(1985))公開了C3的DNA序列及其部分序列。
-和CVF功能及結(jié)構(gòu)類似的人類補(bǔ)體因子C3的切割產(chǎn)物。OKeefc等(生物化學(xué)雜志263，12690(1988))描述了這種特性的切割產(chǎn)物。
-激活補(bǔ)體或者觸發(fā)炎癥的細(xì)菌蛋白質(zhì)，如Salminella typhimurium膜孔蛋白(Galdiero等，感染和免疫性46，55(1994))、金黃色釀膿葡萄球菌叢生因子(Espersen ACTA Path.Microb.Et Imm.Scandin.Sect C93，59(1985))、modulins，特別是那些革蘭氏陰性細(xì)菌(Henderson等，炎癥研究44，187(1995))、軍團(tuán)菌屬的主要外部膜蛋白(Bellinger-Kawahara等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志172，1201(1990))、或者嗜血菌屬的流感B型(BHetherington等，感染和免疫60，852(1992))、或者來源于克雷伯氏菌屬(Alberti等，感染和免疫61，852(1992))、或者來源于鏈球菌屬G族的M分子(Campo等，傳染病雜志171，601(1995))。
融合蛋白的DNA序列，一方面其在所列出的細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子和細(xì)胞膜上的受體配位體(例如，內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞特異性的抗體，或者人類免疫球蛋白的Fc部分)之間形成，另一方面，其可作為本發(fā)明的活性物質(zhì)。已經(jīng)描述了例如在EPA 0464 633 A1中具有這種性質(zhì)的DNA序列。
1.2.e)用以激活細(xì)胞抑制劑前體的酶然而，抗腫瘤或者抗炎癥物質(zhì)也應(yīng)理解為一種酶的DNA序列，這種酶能夠把抗腫瘤活性化合物的前體轉(zhuǎn)化成為抗腫瘤活性化合物。
Deonarain等(英國(guó)癌癥雜志70，786(1994))、Mullen(藥物治療63，199(1994))和Harris等(基因治療1，170(1994))已經(jīng)描述了具有這種特性的酶(其切割非活性前體物質(zhì)(前藥物(prodrugs)，進(jìn)而形成在每種情況下相關(guān)的活性細(xì)胞抑制劑(藥物)、前體藥物和藥物)。
例如，下列酶之一的DNA序列可被使用-單純皰疹病毒胸苷激酶(Garapin等，PNAS US 76，3755(1979)；Vile等，癌研究，53，3860(1993)；Wagner等，PNAS US 78，1441(1981)；Moelten等，癌研究46，5276(1986)；國(guó)家癌癥協(xié)會(huì)雜志82，297(1990))-水痘-帶狀皰疹病毒胸苷激酶
(Huber等，PNAS US 88，8039(1991)，Snoeck，完美抗菌劑雜志(Int.J.Antimicrob.)4，211(1994))-細(xì)菌硝酸還原酶(Michael等，F(xiàn)EMS微生物學(xué)通訊125，195(1994)；Bryant等，生物化學(xué)雜志266，4126(1991)；Watanabe等，核酸研究。18，1059(1990))-細(xì)菌β-葡萄糖醛酸酶(Jefferson等，PNAS US 83，8447(1986))-Secale cereale的植物β-葡萄糖醛酸酶(Schulz等，植物化學(xué)26，933(1987))-人類β-葡萄糖醛酸酶(Bosslet等，英國(guó)癌癥雜志65，234(1992)；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))·例如，人類羧肽酶(CB)，·肥大細(xì)胞CB-A(Reynolds等，臨床研究雜志89，273(1992))·胰CB-B(Yamamoto等，生物化學(xué)雜志267，2575(1992)；Catasus等，生物化學(xué)雜志270，6651(1995))·細(xì)菌羧肽酶(Hamilton等，細(xì)菌學(xué)雜志174，1626(1992)；Osterman等，蛋白質(zhì)化學(xué)雜志11，561(1992))-細(xì)菌β-內(nèi)酰胺酶(Rodrigues等，癌研究55，63(1995)；Hussain等，細(xì)菌學(xué)雜志164，223(1985)；Coque等，EMBO J.12，631(1993))-細(xì)菌胞嘧啶脫氨酶(Mullen等，PNAS US 89，33(1992)；Austin等，分子藥理學(xué)43，380(1993)；Danielson等，分子微生物學(xué)6，1335(1992))-人類過氧化氫酶或者過氧物酶(Ezurum等，核酸研究21，1607(1993))-磷酸酶，特別是
·人類堿性磷酸酶(Gum等，癌研究50，1085(1990))·人類酸性前列腺磷酸酶(Sharieff等，美國(guó)人類基因雜志49，412(1991)；Song等，基因129，291(1993)；Tailor等，核酸研究18，4928(1990))·5型酸性磷酸酶(基因130，201(1993))-氧化酶，特別是·人類賴氨酰氧化酶(Kimi等，生物化學(xué)雜志270，7176(1995))·人類酸性D-氨基氧化酶(Fukui等，生物化學(xué)雜志267，18631(1992))-過氧化物酶，特別是·人類谷胱甘肽過氧化物酶(Chada等，基因組學(xué)6，268(1990)；Ishida等，核酸研究15，10051(1987))·人類嗜酸性細(xì)胞過氧化物酶(Ten等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志169，1757(1989)；Sahamaki等，生物化學(xué)雜志264，16828(1989))·人類甲狀腺過氧化物酶(Kimura，PNAS US 84，5555(1987))。
-半乳糖苷酶為了有利于所列出酶的分泌，在每種情況下都包含在DNA序列中的同源信號(hào)序列可以由促進(jìn)胞外分泌的異源信號(hào)序列代替。
這樣，β-葡萄糖醛酸酶的信號(hào)序列(DNA位點(diǎn)≤27-93；Oshima等，PNAS84，685(1987))可以由，例如，免疫球蛋白的信號(hào)序列(DNA位點(diǎn)≤63-≥107；Riechmann等，自然332，323(1988))或者由CEA的信號(hào)序列(DNA位點(diǎn)≤33-≥134；Schrewe等，分子細(xì)胞生物學(xué)10，2738(1990)，Berling等，癌研究50，6534(1990))或者由人類呼吸合胞體病毒糖蛋白的信號(hào)序列(氨基酸的cDNA≤38-≥50或48-65；Lichtenstein等，普通病毒學(xué)雜志77，109(1996))替代。
此外，優(yōu)選的是選擇這些酶的基因，作為點(diǎn)突變的結(jié)果，這些酶只很少地儲(chǔ)存在溶酶體中，并以增加的程度分泌。已經(jīng)描述了這種性質(zhì)的點(diǎn)突變，例如，β-葡萄糖醛酸酶的(Shiplex等，生物化學(xué)雜志268，12193(1993))。
另外(或者此外)，可以將跨膜域的序列導(dǎo)入到信號(hào)序列中，目的是將酶錨定在酶形成細(xì)胞的細(xì)胞膜上。
這樣，可以將人類巨噬細(xì)胞菌落激活因子的跨膜序列(DNA位點(diǎn)≤1485-≥1554；Cosman等，Behring.Inst.Mitt.83，15(1988))、或者人類呼吸合胞體病毒(RSV)糖蛋白G的信號(hào)及跨膜域之DNA序列(氨基酸1-63或者它們的部分序列，氨基酸38-63； Vijaya等，分子細(xì)胞生物學(xué)8，1709(1988)；Lichtenstein等，普通病毒學(xué)雜志77，109(1996))、或者流感病毒神經(jīng)氨酸酶之信號(hào)及跨膜域的DNA序列(氨基酸7-35或者其部分序列(氨基酸7-27)；Brown等，病毒學(xué)雜志62，3824(1988))插入到啟動(dòng)子DNA序列和酶(例如D-葡萄糖醛酸酶)的DNA序列之間。
為了擴(kuò)大翻譯，可以將核苷酸序列GCCACC或者GCCGCC插入到信號(hào)及跨膜序列啟動(dòng)子的3′末端，并恰好在起始信號(hào)(ATG)的5′末端之前(Kozak，細(xì)胞生物學(xué)雜志108，299(1989))。
然而，為了將酶錨定在酶形成細(xì)胞的細(xì)胞膜上，也可以插入糖磷化物錨的核苷酸序列。
將糖磷化物錨的核苷酸序列插入到該酶核苷酸序列的3′末端；這種插入可以是除信號(hào)序列之外的插入。
已經(jīng)描述了糖磷化物錨，例如，CEA(DNA位點(diǎn)≤893-≥1079；Berling等，癌研究50，6534(1990))、N-CAM(Cunningham等，科學(xué)236，799(1987))和其它跨膜蛋白(如Thy-1)(Clissold，生物化學(xué)雜志281，129(1992))或者CD16(Selvaray等，自然333，565(1988))。
Ferguson等(生物化學(xué)年度綜述57，285(1988))已經(jīng)出版了錨定糖磷化物膜蛋白的綜述。
按照本發(fā)明，另一個(gè)細(xì)胞膜錨定酶的選擇是利用配位體-酶融合蛋白的DNA序列。這種融合蛋白的配位體的特異性直接針對(duì)存在于增殖的內(nèi)皮細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞之細(xì)胞膜上的膜結(jié)構(gòu)。
和增殖的內(nèi)皮細(xì)胞表面結(jié)合的配位體包括，例如，直接針對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的抗體和抗體片段，這一點(diǎn)已經(jīng)描述過，例如，Burrows等(藥物治療64，155(1994))、Hughes等(癌研究49，6214(1989))和Maruyama等(PNAS US 87，5744(1990))。特別是，它們包括VEGF受體的抗體。
優(yōu)選的是利用人源化形式的鼠單克隆抗體。以Winter等(自然349，293(1991))和Hoogenbooms等(V.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993))描述的方法實(shí)現(xiàn)人源化。按照本領(lǐng)域的方法制備抗體片段，例如，以Winter等(自然349，293(1991))、Hoogenbooms 等(V.Tr.Transfus.Hemobiol.36，19(1993))、Girol.Mol.Immunol.28，1379(1991)或者Huston等(國(guó)際免疫學(xué)綜述10，195(1993))描述的方法制備。
并且，配位體包括所有和內(nèi)皮細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)或者膜受體結(jié)合的活性化合物。這些活性化合物包括，例如，含有末端甘露糖的物質(zhì)、還有IL-1或生長(zhǎng)因子或它們的片段、或部分序列(它們都和內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的受體(如PDGF，bFGF，VEGF，TGGO(Pusztain等，病理學(xué)雜志169，191(1993)))結(jié)合)、或者細(xì)胞分裂素和細(xì)胞分裂素的衍生物或類似物。它們還包括和激活的和/或增殖的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的附著分子。已經(jīng)描述了具有這種特性的附著分子，例如，Slex、LFA-1、MAC-1、LeCAM-1、CLA-4或者玻連蛋白和其衍生物或類似物(Augustin-Voss等的綜述，細(xì)胞生物學(xué)雜志119，483(1992)；Pauli等，癌轉(zhuǎn)移綜述9，175(1990)；Honn等，癌轉(zhuǎn)移綜述11，353(1992)；Varner等，細(xì)胞附著和共有3，367(1995))。)然而，配位體也包括抗體或者他們的片段，這些物質(zhì)直接針對(duì)于腫瘤細(xì)胞膜上的腫瘤特異性或腫瘤結(jié)合性抗原。
Sedlacek等(輔助腫瘤學(xué)(Contrin.Oncol.)32(1988)和輔助腫瘤學(xué)43(1992))給出了具有這種性質(zhì)的抗原和相關(guān)抗體。已經(jīng)描述了抗體-酶融合蛋白，例如，Bosslet等，英國(guó)癌研究65，234(1992)。為了有利于所引用的配位體/酶融合蛋白質(zhì)的分泌，在每種情況下都包含在酶DNA序列中的同源信號(hào)序列(如已經(jīng)描述過的)可以由促進(jìn)胞外分泌的異源信號(hào)序列代替。
1.3.幾種抗腫瘤或者抗炎癥物質(zhì)的組合本發(fā)明也涉及包含幾種相同的抗腫瘤或抗炎癥物質(zhì)(A，A)或者不同的抗腫瘤物質(zhì)(A，B)之組合的核酸構(gòu)建體。為了表達(dá)這兩種DNA序列，優(yōu)選將內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)的cDNA作為調(diào)節(jié)組件插入其中。(參見圖7)。
例如，Mountford和Smith(TIG 11，179(1995))、Kaufman等(核酸研究19，4485(1991))、Morgan等(核酸20，1293(1992))、Dirks等(基因128，247(1993))、Pelletier和Sonenberg(自然334，320(1988))和Sugitomo等(生物技術(shù)12，694(1994))已經(jīng)描述了具有這種特性的IRES。
這樣，脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES序列的cDNA(位點(diǎn)≤5′UTR的140-≥630；Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988))可以用于和抗炎物質(zhì)A的DNA(3′末端)和抗炎物質(zhì)B的DNA(5′末端)連接。
取決于組合，具有這種特性的活性化合物在本發(fā)明的范圍內(nèi)具有加和(A+A，A+B)或協(xié)同效應(yīng)。
2.消除血液細(xì)胞缺失形成的活性化合物2.1.選擇造血細(xì)胞的啟動(dòng)子或者激活物序列在本發(fā)明中，基因調(diào)節(jié)序列，或者在造血細(xì)胞中編碼特別強(qiáng)烈或選擇表達(dá)之蛋白質(zhì)的基因元件，最好用作由啟動(dòng)子或增強(qiáng)子組成的啟動(dòng)子或者激活物序列。基因調(diào)節(jié)序列包括細(xì)胞因子或者其受體基因的啟動(dòng)子序列，這種基因調(diào)節(jié)序列在未成熟造血細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)生在隨后的細(xì)胞因子之前，需要這種細(xì)胞因子作為活性物質(zhì)是所需的，并對(duì)造血細(xì)胞發(fā)揮作用。對(duì)未成熟的造血細(xì)胞發(fā)揮作用的這種特性之細(xì)胞因子的例子是-干細(xì)胞因子-IL-1-IL-3-IL-6-GM-CSF2.2.造血細(xì)胞活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的選擇在本發(fā)明中，活性物質(zhì)應(yīng)理解為這樣一種DNA序列，其表達(dá)的蛋白質(zhì)引起血液細(xì)胞的增殖和/或分化。
3.治療自身免疫疾病、變應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)和炎癥以及預(yù)防器官排斥的活性化合物
3.1.特別的用于自身免疫疾病之啟動(dòng)子或者激活物序列的選擇在免疫反應(yīng)期間，在巨噬細(xì)胞和/或者淋巴細(xì)胞中形成增加的蛋白質(zhì)的基因調(diào)節(jié)序列將用作包含啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子的啟動(dòng)子或者激活物序列。具有這種特性的蛋白質(zhì)的例子是-IL-1-IL-1β-IL-1受體-IL-2-IL-2受體-IL-3-IL-3受體-IFNγ-IL-4-IL-4受體-IL-5-IL-6-LIF-IL-7-IL-10-IL-11-IL-12-IL-13-GM-CSF-GM-CSF受體-整聯(lián)蛋白β-2蛋白質(zhì)3.2.特別的用于自身免疫疾病之活性化合物的基因選擇在本發(fā)明中，活性物質(zhì)是編碼抗體、抗體片段，細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子或者其一種抑制劑、血漿蛋白質(zhì)、核酶(催化這些DNA序列之一的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者催化編碼細(xì)胞周期控制蛋白質(zhì)之基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)的DNA序列或者是抗體或酶的DNA序列?；钚晕镔|(zhì)的選擇取決于所治療的基本疾病和所選擇的啟動(dòng)子序列。
4.治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性化合物4.1.風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎激活物序列之啟動(dòng)子的選擇在本發(fā)明中，由啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子或者基因調(diào)節(jié)序列組成的激活物序列應(yīng)理解為，優(yōu)選的是和與轉(zhuǎn)錄因子(轉(zhuǎn)錄因子在滑液細(xì)胞和炎癥性細(xì)胞中形成或具有活性)相互作用的那些基因聯(lián)合。在本發(fā)明中，優(yōu)選的啟動(dòng)子序列包括編碼(特別是在滑液細(xì)胞和炎癥性細(xì)胞中)所表達(dá)的蛋白質(zhì)之基因的基因調(diào)節(jié)序列或元件。
4.2.風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎之活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的選擇在本發(fā)明中，活性物質(zhì)應(yīng)理解為這樣一種DNA序列，其表達(dá)的蛋白質(zhì)直接或間接抑制關(guān)節(jié)炎癥，例如，和/或促進(jìn)關(guān)節(jié)胞外基質(zhì)(軟骨、結(jié)締組織)的重建。
5.針對(duì)感染物的活性化合物的制備可以通過兩種根本不同的形式制備活性化合物-用于治療病毒感染和寄生物侵入，或者-用于預(yù)防病毒、細(xì)菌或寄生蟲引起的傳染病為了預(yù)防傳染病，利用了疫苗。然而，通過常規(guī)的方法制備有效疫苗的可能性受到限制(Brown，Tnt.J.Technol.Assessm.10，161(1994))；Ellis，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)進(jìn)展327，263(1992)；Arnon等，F(xiàn)ASEB J.6，3265(1992))。
因此，發(fā)展了DNA疫苗技術(shù)。然而，這些DNA疫苗引起有關(guān)功效程度、安全性和副作用的問題(Fynan等，國(guó)際免疫藥物學(xué)雜志17，79(1995)；Donnelly等，免疫學(xué)2，20(1994))。
在本發(fā)明中，用于預(yù)防傳染病的活性化合物，由于它們的細(xì)胞特異性和受細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，因此以高度的安全性引人注目。
5.1.啟動(dòng)子或者激活物序列的選擇5.1.a)用于傳染病的治療選擇細(xì)胞基因(特別是其活性通過細(xì)菌或者寄生物感染而變化的那些基因)的啟動(dòng)子序列作為激活物序列，或者選擇來源于這些病毒的啟動(dòng)子序列，這些病毒轉(zhuǎn)化它們感染的細(xì)胞并刺激這些細(xì)胞增殖。
這些病毒的例子是HBV、HCV、HSV、HPV、HIV、EBV和HTLV。
5.2.活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的選擇5.2.a)用于治療傳染病顯示出細(xì)胞抑制、細(xì)胞毒性、抗細(xì)菌或者抗病毒作用之蛋白質(zhì)的DNA選為活性物質(zhì)。上文已經(jīng)闡述了細(xì)胞毒素和細(xì)胞抑制蛋白質(zhì)的例子?？贵w或抗體片段可以作為抗細(xì)菌或抗病毒之蛋白質(zhì)的例子提到。當(dāng)選擇酶時(shí)，隨后必須施用抗病毒的細(xì)胞毒素和抗寄生蟲物質(zhì)的前體(此前體可以由酶切割)。
并且，在本發(fā)明中，用于抗病毒蛋白質(zhì)的活性物質(zhì)是細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，這兩種物質(zhì)具有抗病毒活性。例如，它們包括下列活性物質(zhì)的DNA序列-IFNα-IFNβ-IFNγ-TNFβ-TNFα-IL-1-TGFβ然而，在所列出的細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子或受體的胞外部分之間形成的融合蛋白之DNA序列，以及配位體，都可以用作本發(fā)明的活性物質(zhì)；例如，EPA 0464 633 A1中已經(jīng)描述了含有人類免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白。
消化細(xì)胞周期控制蛋白質(zhì)之基因的mRNA或者病毒的mRNA之核酶的基因，也可以作為活性物質(zhì)。例如，Christoffersen等(醫(yī)用化學(xué)雜志38，2033(1995))已經(jīng)綜述了催化HIV的核酶。
并且，在本發(fā)明中的化學(xué)物質(zhì)是具有特異性的抗體的DNA序列，這種特異性能滅活相關(guān)的病毒、或其含有VH-和VL-片段、或者通過接頭連接在一起的VH和VL片段，例如，這些片段按照Marasco等描述的方法制備(美國(guó)科學(xué)院學(xué)報(bào)90，7889(1993))。具有這種特異性抗病毒特性之抗體的例子在5.2.b)部分給出。
5.2.b)用于預(yù)防傳染病待選擇的活性物質(zhì)是對(duì)感染物特異性的抗體或抗體片段的DNA，或者是通過感染物形成的且通過觸發(fā)或免疫反應(yīng)(即由于抗體結(jié)合和/或由于細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞)導(dǎo)致該感染物的中和和/或破壞之蛋白質(zhì)的DNA。所說的具有這種特性的中和抗原已作為疫苗抗原(參見Ellis的實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)進(jìn)展327，263(1992))。編碼中和抗原之DNA序列的例子可從下列出版物中找到-流感A病毒抗原(Ulmer等，科學(xué)259，1745(1993)；Robinson等，疫苗11，957(1993)；Fynan等，國(guó)際免疫藥學(xué)雜志17，79(1995))-HIV抗原(Wang等，PNAS US 90，4156(1993))-狂犬病病毒抗原(Donnelly等，免疫學(xué)2/1，20(1994))-HSV(單純皰疹病毒)抗原(Fleckenstein等，自然274，57(1978))-RSV(呼吸合胞體病毒)抗原(Du等，生物技術(shù)12，813(1994)；Hall，科學(xué)265，1393(1993))-副流感病毒抗原(Du等，生物技術(shù)12，813(1994))-輪狀病毒屬抗原(Albert等，臨床微生物學(xué)雜志25，183(1987)；Anderson等，傳染病雜志153，823(1986)；Battaglia等，傳染病雜志155，140(1987)；Chanock等，傳染病雜志148，49(1983)；Dyall-Smith等，病毒學(xué)雜志38，1099(1981)；Glass等，科學(xué)265，1389(1994))-VZV(水痘-帶狀皰疹病毒)抗原(Straus等，內(nèi)科醫(yī)學(xué)年鑒109，438(1988)；Gershon，兒科傳染病2，171(1991)；Kinchington等，病毒學(xué)雜志64，4540(1990))-CMV(細(xì)胞肥大病毒)抗原(Plotkin，科學(xué)265，1383(1994))-麻疹病毒抗原
(Katz和Kellin，科學(xué)265，1391(1994))-HPV(人類乳頭狀瘤病毒)抗原(Tindl和Frazer，當(dāng)今微生物免疫學(xué)主題186，217(1994))-HBV(肝炎B病毒)抗原(Valenzuela等，自然280，815(1979)；Heerman等，病毒學(xué)雜志52，396(1984))-HCV(肝炎C病毒)抗原(Cerny等，當(dāng)今微生物免疫學(xué)主題189，169(1994)；Esteban等，肝疾病進(jìn)展10，253(1992)；Jung等，歐洲臨床研究雜志24，641(1994種))-HDV(肝炎D病毒)抗原(Iwarson，Scand.J.Infect.24，129(1992)；Consolo等，腎瘤(Nephron)61，251(1992))-HEV(肝炎E病毒)抗原(Iwarson，Scand.J.Infect.24，129(1992)；Consolo等，腎瘤(Nephron)61，251(1992))-HAV(肝炎病毒)抗原(d′Hondt，疫苗10，48(1992)；Andre，傳染病雜志171，33(1995)；Lemon等，疫苗10，40(1992)；Melnick等，疫苗10，24(1992)；Flehmig，Baillieres臨床胃腸病學(xué)4，707(1990))-霍亂弧菌抗原(Levine和Kaper，疫苗11，207(1993))-布氏疏螺旋體抗原(Schaible等，免疫學(xué)通訊36，219(1993)；Wallich等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)17，669(1993))-幽門螺桿菌抗原(Crabtree等，Lancet 338，332(1991)；Blascr，傳染病雜志161，626(1990)；Cover和Blaser，生物化學(xué)雜志267，10570(1993)；Cover等，傳染免疫學(xué)58，603(1990)；Dunn等，生物化學(xué)雜志265，9464(1990)；Dunn等，傳染免疫學(xué)60，1946(1992)；Lagc等，比利時(shí)胃腸病學(xué)學(xué)報(bào)56(增刊)，61(1993)；Mobley等，Scand.J.Gastroint 26(增刊.187)，39(1991)-瘧疾抗原(Nussenzweig和Long，科學(xué)265，1381(1994)；Maurice，科學(xué)267，320(1995)；Enders等，疫苗10，920(1992)；Knapp等，傳染病免疫學(xué)60，2397(1992))然而，在本發(fā)明中，具有這種特性的活性物質(zhì)也包括抗獨(dú)特型抗體或者其抗原結(jié)合片段，它的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)(即互補(bǔ)決定區(qū))構(gòu)成了感染物中和抗原的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或者碳水化合物結(jié)構(gòu)的拷貝。
具體地說，具有這種特性的抗獨(dú)特型抗體在細(xì)菌感染物存在的情況下，能夠代替碳水化合物抗原。
Hawkins等(免疫療法雜志14，273(1993))和Westerink和Apicella(免疫病理學(xué)Springer討論會(huì)。15，227(1993))已經(jīng)綜述了抗獨(dú)特型抗體和它們的切割產(chǎn)物。
5.3用于治療和預(yù)防傳染病之相同或不同活性物質(zhì)的組合本發(fā)明還涉及包含相同活性物質(zhì)(A，A)或不同活性物質(zhì)(A，B)之DNA序列組合的活性物質(zhì)。為了表達(dá)兩種序列，優(yōu)選內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的cDNA作為調(diào)節(jié)元件插入。
例如，Montford和Smith(TIG11，179(1995))、Kaufman等(核酸研究19，4485(1991))、Morgan等(核酸研究20，1293(1992))、Cirk等(基因128，247(199 3))、Pelletier和Sonenberg(自然334，320(1988))和Sugitomo等(生物技術(shù)12，694(1994))已經(jīng)描述了具有這種特性的IRES。
這樣，脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES序列的cDNA(位點(diǎn)≤5′UTR的140-≥630；Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988))可以用于連接病毒物質(zhì)A的DNA(3′末端)和病毒物質(zhì)B的DNA(5′末端)(參見圖8)。
依據(jù)組合，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的具有這種特性的活性化合物，具有加和(A+A，A+B1)或協(xié)同效應(yīng)。
這樣，對(duì)于例如治療病毒疾病，兩種相同或兩種不同的抗活性物質(zhì)可以彼此組合。
這樣，在預(yù)防傳染病的過程中，編碼一種感染物之不同抗原或不同感染物之不同抗原的幾種活性物質(zhì)可以彼此組合。并且，編碼感染物抗原的活性物質(zhì)可以和編碼細(xì)胞因子或者細(xì)胞因子受體之活性物質(zhì)組合。
同時(shí)，這樣形成(即在注射活性化合物之后形成的)的細(xì)胞因子或者細(xì)胞因子受體作為感染物受體可以影響正在進(jìn)行的免疫反應(yīng)的特性和強(qiáng)度。
5.2.d)已經(jīng)描述了擴(kuò)增體液免疫反應(yīng)之細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的DNA序列，5.2.a)和5.2.c)描述了擴(kuò)增細(xì)胞免疫反應(yīng)的序列。
下列是整體上擴(kuò)增免疫反應(yīng)之細(xì)胞因子的DNA序列的例子-I1-1α(Fenton，國(guó)際免疫藥學(xué)雜志14，401(1992)；Furntani等，核酸研究14，3167(1986)；Lafage等，血液73，104(1989)；Aarch等，自然315，641(1985))-I1-1β(Bensi等，基因52，9(1987)；Auron等，PNAS 81，7907(1984)；Clark等，核酸研究14，7897(1986))-I1-2(Fletscher等，淋巴循環(huán)研究6，45(1987)；Matsui等，淋巴因子12，1(1985)；Tanaguchi等，自然302，305(1983))-GM-CSF(Gough等，自然309，763(1979)；Nicola等，生物化學(xué)雜志254，5290(1979)；Wong等，科學(xué)228，810(1985))6.治療腫瘤的活性化合物6.1.腫瘤細(xì)胞啟動(dòng)子或激活物序列的選擇和在腫瘤細(xì)胞中形成或激活的轉(zhuǎn)錄因子相互作用的基因調(diào)節(jié)序列被稱為啟動(dòng)子或激活物序列。
新核酸構(gòu)建體能夠達(dá)到的腫瘤是優(yōu)選的。例如，這些腫瘤是白血病細(xì)胞(除在不同類型固體腫瘤鄰區(qū)中的增殖的內(nèi)皮細(xì)胞外)(靜脈施用核酸構(gòu)建體之后)、卵巢癌和胰癌(例如在腹膜內(nèi)注射核酸構(gòu)建體之后)、肺癌(例如在支氣管內(nèi)施用構(gòu)建體)。
在本發(fā)明中，優(yōu)選的啟動(dòng)子或者激活物序列包括編碼特別是在白血病細(xì)胞、癌細(xì)胞或者肉瘤細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)之基因的基因調(diào)節(jié)序列或元件。這樣，N-CAM蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子在小細(xì)胞支氣管癌的情況下優(yōu)選使用；而肝炎生長(zhǎng)因子受體或L-網(wǎng)質(zhì)的啟動(dòng)子在卵巢癌的情況下優(yōu)選使用；L-網(wǎng)質(zhì)或多形上皮粘蛋白(PEM)之啟動(dòng)子在胰癌的情況下優(yōu)選使用；前列腺特異性抗原(PSA)的啟動(dòng)子在前列腺腫瘤的情況下優(yōu)選使用。
6.2.腫瘤細(xì)胞活性物質(zhì)之結(jié)構(gòu)基因的選擇在本發(fā)明中，活性物質(zhì)被理解為這樣一種DNA序列，其表達(dá)的蛋白質(zhì)抑制細(xì)胞(特別是白血病細(xì)胞)的增殖。例如，這些細(xì)胞周期抑制劑包括如已經(jīng)描述過的抑制性細(xì)胞抑制和細(xì)胞毒素蛋白質(zhì)的DNA序列、抗體或抗體切割產(chǎn)物的DNA序列、酶的DNA序列。
并且，細(xì)胞周期抑制劑應(yīng)理解為表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞或者白血病細(xì)胞直接或間接顯示出細(xì)胞抑制或者細(xì)胞毒素效應(yīng)之蛋白質(zhì)的DNA序列。
細(xì)胞周期抑制劑也應(yīng)理解為一種核酶的DNA序列，這種核酶催化細(xì)胞周期控制蛋白之基因的mRNA。腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)也應(yīng)理解為一種DNA序列，這種DNA序列表達(dá)的蛋白質(zhì)或肽組成了觸發(fā)免疫反應(yīng)的腫瘤抗原。
7.抑制與血管閉塞相關(guān)的平滑肌細(xì)胞增殖之活性化合物7.1.平滑肌細(xì)胞啟動(dòng)子或者激活物序列的選擇在本發(fā)明中將使用的由啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子組成的啟動(dòng)子或者激活物序列優(yōu)選的是編碼特別在平滑肌細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)之基因的基因調(diào)節(jié)序列或元件。
7.2.平滑肌細(xì)胞活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)基因的選擇在本發(fā)明中，活性物質(zhì)應(yīng)理解為這樣一種DNA序列，其表達(dá)的蛋白質(zhì)抑制平滑肌細(xì)胞的增殖。這些增殖抑制劑包括1.2.a)和1.2.c)已經(jīng)提及的蛋白質(zhì)。
然而，活性物質(zhì)也應(yīng)理解為把細(xì)胞抑制劑的非活性前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞抑制劑酶的DNA序列(參見1.2.f)8.對(duì)凝結(jié)有作用的活性化合物8.1.對(duì)凝結(jié)有作用的啟動(dòng)子或者激活物序列的選擇在本發(fā)明中，使用的啟動(dòng)子或者激活物序列優(yōu)選的是編碼可以在平滑肌細(xì)胞、激活的內(nèi)皮細(xì)胞、激活的巨噬細(xì)胞或者激活的淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的基因的基因調(diào)節(jié)序列或元件。
8.1.a)平滑肌細(xì)胞已經(jīng)給出了平滑肌細(xì)胞中基因啟動(dòng)子序列的例子。
8.1.b)激活的內(nèi)皮細(xì)胞具體地說，Burrows等(藥物治療64，155(1994))已經(jīng)描述了在激活的內(nèi)皮細(xì)胞中形成的蛋白質(zhì)的例子。具體地說，這些蛋白質(zhì)的例子是在內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出增加的程度的蛋白質(zhì)(例如，上文已經(jīng)描述的那些蛋白質(zhì)和它們基因的啟動(dòng)子序列)。
8.1.c)激活的巨噬細(xì)胞和/或者激活的淋巴細(xì)胞在本發(fā)明中，激活物序列也應(yīng)理解為在免疫應(yīng)答期間在巨噬細(xì)胞和/或者淋巴細(xì)胞中形成增加的程度的蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子序列。這種特性的蛋白質(zhì)已經(jīng)描述過。
8.2.對(duì)凝結(jié)有作用之活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的選擇本發(fā)明中所使用的活性物質(zhì)是編碼直接或間接抑制血小板聚合或者血液凝固因子或者刺激纖維蛋白溶解之蛋白質(zhì)的DNA序列。
具有這種特性的活性物質(zhì)定義為凝結(jié)抑制劑。血纖蛋白溶酶或者血纖蛋白溶酶原激活物(PAs)(如組織PA(tPA)或者類尿激酶PA(uPA)、或者蛋白C、抗凝血酶III、C-1S抑制劑、α1-抗胰蛋白酶、組織因子途徑抑制劑(TFPI)或者水蛭素)都可以用作凝結(jié)抑制劑。
然而，編碼促進(jìn)血液凝結(jié)之蛋白質(zhì)的DNA序列也作為本發(fā)明的活性物質(zhì)。具有這種特性的蛋白質(zhì)的例子是血漿蛋白質(zhì)(如FVIII或者FIX或者組織因子)。
9.防止CNS破壞的活性化合物9.1.由防止CNS破壞之活性化合物的啟動(dòng)子或者增強(qiáng)子形成的啟動(dòng)子或者激活物序列9.1.a)在內(nèi)皮細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子或者激活物序列具體地說，這些序列包括內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)基因的啟動(dòng)子序列。
9.1.b)在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中激活的啟動(dòng)子或者激活物序列優(yōu)選的激活物序列也應(yīng)理解為和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中以特殊的程度形成或具有活性的轉(zhuǎn)錄因子相互作用的核苷酸序列(啟動(dòng)子序列或者增強(qiáng)子序列)。
9.2神經(jīng)特異性因子結(jié)構(gòu)基因的選擇在本發(fā)明中，神經(jīng)特異性因子應(yīng)理解為編碼神經(jīng)生長(zhǎng)因子的DNA序列。
利用下列實(shí)施例幫助更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，而不是把本發(fā)明限制在這些實(shí)施例中。實(shí)施例1制備雜交啟動(dòng)子新雜交啟動(dòng)子由下列不同的核苷酸序列組成，這些序列在下游方向上相繼排列。元件I-VEGF受體I基因啟動(dòng)子(核苷酸-1195至100；Morishita等，生物化學(xué)雜志270，27948(1995)。TATA盒(核苷酸TATAAA在位點(diǎn)-31至-26)突變成TGTAAA)-序列GCCACC(Kodak，細(xì)胞生物學(xué)雜志108，229(1989))-免疫球蛋白信號(hào)肽的cDNA(核苷酸序列63至107；Riechmann等，自然332，323(1988))-β-葡萄糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93至1982；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))元件II-cdc25C基因的啟動(dòng)子(核苷酸-487至+121，優(yōu)選的核苷酸是-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子細(xì)胞生物學(xué)。14，999(1994)，特別是核苷酸-290至+121)-TATA盒結(jié)合蛋白質(zhì)的基因(核苷酸序列+1至+1001，此序列在下列位點(diǎn)發(fā)生突變核苷酸862(T替換A)889和890(AC替換GT)及895(G替換C)(Strubin和Struhl，細(xì)胞68，721(1992)；Heard等，EMBO J.12，3519(1993))元件I和元件II的核苷酸序列如附圖9的方案所示連接。
把以這種方式制備的核苷酸構(gòu)建體克隆到pUC18/19或Bluescript衍生的質(zhì)粒載體中，然后將這種載體直接或以膠態(tài)分散體系統(tǒng)用于體內(nèi)給藥。
此構(gòu)建體的單個(gè)組件通過合適的限制位點(diǎn)連接，在PCR擴(kuò)增期間在不同組件的終點(diǎn)引入這些限制位點(diǎn)。利用對(duì)這些限制位點(diǎn)特異性的，并且技術(shù)人員熟悉的酶及DNA連接酶進(jìn)行連接。
將在培養(yǎng)物中一直保留的人類臍帶內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(Wi-38)用所描述的質(zhì)粒之一，利用技術(shù)人員熟知的方法轉(zhuǎn)染(Lucibello等，EMBOJ.14，132(1995))，利用4-methylumbelliferyl-β-葡糖苷酸作為底物檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶的數(shù)量。
為了檢測(cè)細(xì)胞周期特異性，通過除去甲硫氨酸48小時(shí)，使內(nèi)皮細(xì)胞G0/G1同步化(Nettelbeck等，有關(guān)制備的出版物)。用Hoechst 33258染色之后，在熒光激活細(xì)胞分選儀中測(cè)定細(xì)胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。
得到了下列結(jié)果和未轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞中沒有檢測(cè)到β-葡萄糖醛酸酶的增加。
轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)質(zhì)上表達(dá)了更多的β-葡萄糖醛酸酶。
增殖的內(nèi)皮細(xì)胞(DNA＞2S；S＝單染色體組)較G0/G1同步化的內(nèi)皮細(xì)胞(DNA＝2S)實(shí)質(zhì)上分泌更多的β-葡萄糖醛酸酶。
已經(jīng)描述的多啟動(dòng)子引起β-葡萄糖醛酸酶結(jié)構(gòu)基因的細(xì)胞特異性、細(xì)胞周期依賴性表達(dá)。實(shí)施例2和核保留信號(hào)(NRS)及核輸出因子(NEF)組合的雜交啟動(dòng)子的制備。
新雜交啟動(dòng)子由下列不同的核苷酸序列組成，這些核苷酸序列在下游的方向上相繼排列元件III-VEGF受體I基因的啟動(dòng)子(核苷酸-1195至100；Morishita等，生物化學(xué)雜志270，27948(1995)。TATA盒(核苷酸TATAAA在位點(diǎn)-31至-26)突變成TGTAAA)-序列GCCACC
(Kodak，細(xì)胞生物學(xué)雜志108，229(1989))-免疫球蛋白信號(hào)肽的cDNA(核苷酸序列63至107；Riechmann等，自然332，323(1988))-β-葡萄糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93至1982；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))-作為核保留信號(hào)(NRS)的HIV-1病毒RER之cDNA(核苷酸序列7357至7602；Ratner等，自然313，277(1985)；Malim等，自然338，254(1989))。元件IIa-cdc25C基因的啟動(dòng)子(核苷酸-290至+121；Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)；Zwicker等，核酸研究23，3822(1995))-包含共突變的TATA盒結(jié)合蛋白的基因(核苷酸序列1至1001，此序列在下列位點(diǎn)發(fā)生突變核苷酸862(T替換A)889和890(AC替換GT)及895(G替換C)(Strubin和Struhl，細(xì)胞68，721(1992)；Heard等，EMBO J.12，3519(1993))元件IV-von Willebrand因子(vWF)基因的啟動(dòng)子(核苷酸-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子細(xì)胞生物學(xué)14，999(1994))-作為核輸出因子(NEF)的HIV-1病毒REV的cDNA氨基酸序列1-117；Ratner等，自然313，277(1985)。
元件II、III和IV的核苷酸序列如附圖10的方案所示連接。
把以這種方式制備的核苷酸構(gòu)建體克隆到pUC 18/19或Bluescript衍生的質(zhì)粒載體中，然后將這種載體直接或以膠態(tài)分散體系統(tǒng)用于體內(nèi)給藥。
此構(gòu)建體的單個(gè)組件通過合適的限制位點(diǎn)連接，在PCR擴(kuò)增期間在不同組件的終點(diǎn)引入這些限制位點(diǎn)。利用對(duì)這些限制位點(diǎn)特異性的，并且技術(shù)人員熟悉的酶及DNA連接酶完成連接。
將在培養(yǎng)物中一直保留的人類臍帶內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(Wi-38)用所描述的質(zhì)粒，利用技術(shù)人員熟知的方法轉(zhuǎn)染(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))，利用4-methylumbellifcryl-β-葡糖苷酸作為底物檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶的數(shù)量。
為了檢測(cè)細(xì)胞周期特異性，通過除去甲硫氨酸48小時(shí)，使內(nèi)皮細(xì)胞G0/G1同步化(Nettelbeck等，有關(guān)制備的出版物)。用Hoechst 33258染色之后，在熒光激活細(xì)胞分選儀中測(cè)定細(xì)胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。
得到了下列結(jié)果和未轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞中沒有檢測(cè)到β-葡萄糖醛酸酶增加的可能性。
轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)質(zhì)上表達(dá)了更多的β-葡萄糖醛酸酶。
增殖的內(nèi)皮細(xì)胞(DNA＞2S)較G0/G1同步化的內(nèi)皮細(xì)胞(DNA＝2S)實(shí)質(zhì)上分泌更多的β-葡萄糖醛酸酶。
已經(jīng)描述的多啟動(dòng)子引起β-葡萄糖醛酸酶結(jié)構(gòu)基因的細(xì)胞特異性、細(xì)胞周期依賴性表達(dá)。實(shí)施例3和激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位組合的雜交啟動(dòng)子的制備。
新激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位由下列不同的核苷酸序列組成，這些核苷酸序列在下游的方向上相繼排列元件V激活物亞單位-cdc25C基因的啟動(dòng)子(核苷酸-290至+121；Zwicker等，EMBO J.14，4514(1995)；Zwicker等，核酸酸研究23，3822(1995))-Ga14蛋白質(zhì)DNA結(jié)合域的cDNA(氨基酸1至147；Chasman和Kornberg，分子細(xì)胞生物學(xué)10，2916(1990))-Ga180的cDNA(氨基酸1至435；Leuther等，科學(xué)256，1333(1992))激活物亞單位B-VEGF受體I基因啟動(dòng)子(核苷酸-1195至+100；Morishita等，生物化學(xué)雜志270，27948(1995)；在核苷酸-31至-26發(fā)生TGTAAA突變)-Ga14的Ga180結(jié)合域的cDNA(氨基酸851至881；Leuther等，科學(xué)256，1333(1992))-SV40的核定位信號(hào)(NLS)(SV40大T；氨基酸126至132PKKKRKV；Dingwall等，TIBS16，478(1991))-HSV-1VP16的酸反式激活域(TAD)(406至488氨基酸；Triezenberg等，基因發(fā)展2，718(1988)；Triezenberg，基因發(fā)展的現(xiàn)代觀點(diǎn)5，190(1995))激活物響應(yīng)啟動(dòng)子具有和SV40基礎(chǔ)啟動(dòng)子(核苷酸48至5191；Toozeb編輯，DNA腫瘤病毒(紐約冷泉港，紐約；冷泉港實(shí)驗(yàn)室)偶聯(lián)之核苷酸序列5-CGGACAACTGTTGAC CG-3′(SEQ ID NO2，Chasman和Kornberg，分子細(xì)胞生物學(xué))的Ga14結(jié)合序列。
激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位核苷酸序列的排列順序如圖11的方案所示。
描述的激活物序列功能如下-cdc25C啟動(dòng)子以細(xì)胞周期特異性方式調(diào)節(jié)Ga14結(jié)合蛋白和Ga180的組合cDNA的轉(zhuǎn)錄。
-VEGF受體I啟動(dòng)子限制Ga14的Ga180結(jié)合域、SV40 NSL和內(nèi)皮細(xì)胞TPA之偶聯(lián)的cDNA的轉(zhuǎn)錄。然而，這種激活作用由突變抑制。
-激活物亞單位A和B的表達(dá)產(chǎn)物通過Ga14的Ga180結(jié)合域和Ga180結(jié)合二聚化。
圖2通過圖解的方式表示了二聚化。
二聚化的蛋白質(zhì)是Ga14結(jié)合域/SV40啟動(dòng)子的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子DNA序列的嵌合轉(zhuǎn)錄因子。
按照本發(fā)明圖13的方案，所述啟動(dòng)子在其3′末端和序列GCCACC連接(Kocak，細(xì)胞生物學(xué)雜志108，229(1989))，后者和免疫球蛋白信號(hào)肽的cDNA連接(核苷酸序列63至107；Riechmann等，自然332，323(1989))。之后是β-葡萄糖醛酸酶的cDNA(核苷酸序列93至1982；Oshima等，PNAS US 84，685(1987))。
接下來，此單位在其3′末端和元件VI連接，然而，這種元件IV也可以加入到核苷酸構(gòu)建體的5′末端。元件VI元件VI包括-von Willebrand因子基因的啟動(dòng)子(核苷酸-487至+247；Jahroudi和Lynch，分子細(xì)胞生物學(xué)14，999(1994))-TATA盒結(jié)合蛋白基因(核苷酸序列1至1001，此序列在下列位點(diǎn)發(fā)生突變核苷酸862(T替換A)889和890(AC替換GT)及895(G替換C)。
TATA盒結(jié)合蛋白的共突變消除了VEGF受體啟動(dòng)子激活(激活物亞單位B)的抑制作用。
把以這種方式制備的核苷酸構(gòu)建體克隆到pUC 18/19或Bluescript衍生的質(zhì)粒載體中，然后將這種載體直接或以膠態(tài)分散體系統(tǒng)用于體內(nèi)給藥。
此構(gòu)建體的單個(gè)組件通過合適的限制位點(diǎn)連接，在PCR擴(kuò)增期間在不同組件的終點(diǎn)引入這些限制位點(diǎn)。利用對(duì)這些限制位點(diǎn)特異性的，并且技術(shù)人員熟悉的酶及DNA連接酶完成連接。
將在培養(yǎng)物中一直保留的人類臍帶內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(Wi-38)用所描述的質(zhì)粒，利用技術(shù)人員熟知的方法轉(zhuǎn)染(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))，利用4-methylumbelliferyl-β-葡糖苷酸作為底物檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸酶的數(shù)量。
為了檢測(cè)細(xì)胞周期特異性，通過除去甲硫氨酸48小時(shí)，使內(nèi)皮細(xì)胞G0/G1同步化(Nettelbeck等，有關(guān)制備的出版物)。用Hoechst 33258染色之后，在熒光激活細(xì)胞分選儀中測(cè)定細(xì)胞中DNA的含量(Lucibello等，EMBO J.14，132(1995))。
得到了下列結(jié)果
和未轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞相比，在轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞中沒有檢測(cè)到β-葡萄糖醛酸酶增加的可能性。
轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)質(zhì)上表達(dá)了更多的β-葡萄糖醛酸酶。
增殖的內(nèi)皮細(xì)胞(DNA＞2S)較G0/G1同步化的內(nèi)皮細(xì)胞(DNA＝2S)實(shí)質(zhì)上分泌更多的3-葡萄糖醛酸酶。
已經(jīng)描述的多啟動(dòng)子引起β-葡萄糖醛酸酶結(jié)構(gòu)基因的細(xì)胞特異性、細(xì)胞周期依賴性表達(dá)。
如實(shí)施例I-III描述的按照本發(fā)明的活性化合物，在局部給藥(例如在腫瘤位點(diǎn))、或者在顱內(nèi)或蛛網(wǎng)膜下給藥、或者全身(優(yōu)選的是靜脈或動(dòng)脈)給藥后，作為激活物響應(yīng)啟動(dòng)子亞單位的細(xì)胞周期特異性或者內(nèi)皮細(xì)胞特異性的結(jié)果，具有確保主要(如果不是唯一的)增殖分泌β-葡萄糖醛酸酶的內(nèi)皮細(xì)胞的作用。此β-葡萄糖醛酸酶切割強(qiáng)耐受阿霉素-β-葡萄糖醛酸化物(Jacquesy等，EPO 0 511 917 A1)，現(xiàn)在這種物質(zhì)被注射到具有細(xì)胞抑制作用的阿霉素中。阿霉素抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并且對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和鄰近的腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞抑制作用。這導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名Hoechst Aktiengesellschaft(B)街道-(C)城市Franlfurt(D)州-(E)國(guó)家德國(guó)(F)郵政編碼(ZIP)65926(G)電話069-305-3005(H)傳真069-35-7175(I)電報(bào)-(ii)發(fā)明名稱用于基因治療的含雜交啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn #1.0，#1.25版本(EPO)(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度7個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞肽(B)位點(diǎn)1..7(xi)序列描述SEQ ID NO1Pro Lys Lys Lys Arg LysVal1 5(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度17個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(ix)特性(A)名稱/關(guān)鍵詞外顯子(B)位點(diǎn)1..17(xi)序列描述SEQ ID NO2CGGACAACTG TTGACCG1權(quán)利要求
1.一種用于在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸構(gòu)建體，這種核酸構(gòu)建體包含至少一種含有第一突變的核酸序列，這種突變抑制所說的轉(zhuǎn)基因正常表達(dá)，和至少一種含有第二種突變的核酸序列，這種突變消除由第一突變產(chǎn)生的抑制作用。
2.權(quán)利要求1的用于在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸構(gòu)建體，其中(i)當(dāng)所說的含有所說的第一突變的核酸序列是包含抑制所說的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，或者抑制藥理活性化合物的功能的突變的轉(zhuǎn)基因(b)時(shí)，所說的核酸構(gòu)建體還包含第一啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a)，此序列定位在所說轉(zhuǎn)基因5′末端的上游，或者(i′)當(dāng)所說的含有所說的第一突變的核酸序列是包含抑制第一啟動(dòng)子的功能的突變的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a′)時(shí)，所說的核酸構(gòu)建體還包含編碼藥理活性化合物的轉(zhuǎn)基因(b′)。
3.按照權(quán)利要求1或2的用于在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的核酸構(gòu)建體，這種核酸構(gòu)建體在5′至3′末端方向的閱讀框架中包含下列組件(i)激活所說的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的第一啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a)，或包含抑制第一啟動(dòng)子功能的突變的第一啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a)；(ii)編碼藥理活性化合物的轉(zhuǎn)基因(b′)或者包含一種突變的轉(zhuǎn)基因(b)，這種突變抑制所說的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，或者抑制由所說的轉(zhuǎn)基因編碼的藥理活性化合物的功能；(iii)第二啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(c)，這種序列激活組件(d)的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄或包含抑制第二啟動(dòng)子功能的突變；和(iv)編碼消除啟動(dòng)子(a)和(c)至少之一或轉(zhuǎn)基因(b)中突變之tRNA或調(diào)節(jié)蛋白的基因。
4.權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建體，其中所說的啟動(dòng)子(a)和(c)是非特異性的、細(xì)胞特異性或病毒特異性的，并且其中啟動(dòng)子(a)和(c)可以被包括下列幾種激活機(jī)制在內(nèi)的至少一種機(jī)制激活非特異性地、病毒特異性地、代謝性地、由四環(huán)素、由氧不足、細(xì)胞特異性地和細(xì)胞周期特異性地。
5.如權(quán)利要求1-4之任一所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的轉(zhuǎn)基因(b)包含核保留信號(hào)(NRS)，這種核保留信號(hào)在其5′末端直接或間接和轉(zhuǎn)基因的3′末端連接，并且，其中所說的NRS的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物提供結(jié)合核輸出因子(NEF)的結(jié)構(gòu)。
6.權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建體，這種核酸構(gòu)建體還包含下列組件(v)激活NEF基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的第三啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(i)；和(vi)編碼和NRS轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合進(jìn)而介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的NEF(k)的核酸序列。
7.權(quán)利要求3或4的核酸構(gòu)建體，其中所說的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a)和(c)是相同的。
8.如權(quán)利要求3-7之任一所要求的核酸構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a)和(c)至少之一是含有啟動(dòng)子組件CDE-CHR或E2FBS-CHR的嵌合啟動(dòng)子，其中所說的啟動(dòng)子組件對(duì)下游基因的表達(dá)起作用，并且和鄰區(qū)、上游、激活物序列相互作用。
9.如權(quán)利要求1-8之任一所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的下游基因的表達(dá)是受細(xì)胞周期特異性抑制的。
10.權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a)、(c)和(i)至少之一是包含下列組件的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位(vii)至少一種啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(e)，這種啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列由包括下列幾種激活方法在內(nèi)的至少一種方法激活非特異性地、病毒特異性地、代謝性地、由四環(huán)素、細(xì)胞特異性地和細(xì)胞周期特異性地；(viii)至少一種位于啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(e)下游的激活物亞單位(f)，并且其中所說的激活物亞單位的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄由啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(e)激活；和(ix)一種激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)，這種啟動(dòng)子由該激活物亞單位(f)或幾種相同亞單位(f)或不同激活物亞單位(f′)的表達(dá)產(chǎn)物激活。
11.權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列(a)、(c)或(i)和激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)至少之一是嵌合啟動(dòng)子，并且激活物亞單位(f)是編碼至少一種激活嵌合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子之基因。
12.權(quán)利要求10或11的核酸構(gòu)建體，其中所說的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)是和SV40啟動(dòng)子結(jié)合的單體或多體LexA操縱基因，并且由兩種激活物亞單位(f)和(f′)激活；其中激活物亞單位(f)包含編碼LexA DNA結(jié)合蛋白的cDNA，其3′末端和編碼Ga180蛋白之cDNA的5′末端連接；和激活物亞單位(f′)在5′至3′末端的閱讀框架上包含編碼Ga14蛋白的Ga180結(jié)合域的cDNA、編碼SV40大T抗原的cDNA和編碼HSV-1 VP16反式激活域的cDNA。
13.權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體，其中所說的編碼LexA DNA結(jié)合蛋白的cDNA編碼LexA DNA結(jié)合蛋白的1-81或1-202位氨基酸；編碼Ga180蛋白的cDNA編碼Ga180蛋白的1-435氨基酸；編碼Ga14蛋白之Ga180結(jié)合域的cDNA編碼Ga14蛋白的851-881位氨基酸；編碼SV40大T抗原的cDNA編碼SV40大T抗原的126-132位氨基酸；編碼反式激活域的cDNA編碼HSV-1VP16的406-488位氨基酸。
14.權(quán)利要求12或13的核酸構(gòu)建體，其中所說的LexA操縱基因的單體或多體由Ga14結(jié)合域的單體或多體替代；并且編碼LexA DNA結(jié)合蛋白的cDNA由編碼Ga14蛋白的DNA結(jié)合域的cDNA替代。
15.權(quán)利要求10-13之任一所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)是編碼Ga14結(jié)合蛋白之結(jié)合序列的單體或多體；激活物亞單位(f)包含來源于SV40大T抗原的核定位信號(hào)(NLS)和來源于HSV-1 VP16的酸反式激活域(TAD)；或者激活物亞單位(f′)含有來源于SV40大T的核定位信號(hào)(NLS)、編碼Ga14蛋白質(zhì)DNA結(jié)合域的cDNA和編碼p56 Ick蛋白質(zhì)CD4結(jié)合序列的cDNA。
16.權(quán)利要求15的核酸構(gòu)建體，其中NLS編碼SEQ ID NO.1，TAD編碼HSV-1 VP16的406-488位氨基酸，Ga14蛋白質(zhì)DNA結(jié)合域的cDNA編碼Ga14蛋白質(zhì)的1-147位氨基酸，CD4結(jié)合序列的cDNA編碼p56 Ick蛋白質(zhì)的1-71位氨基酸。
17.權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建體，其中所說的編碼NRS的核酸序列選自由來源于HIV-1或HIV-2的Rev響應(yīng)元件(RRE)、不同于HIV-1和HIV-2的反轉(zhuǎn)錄病毒之RRE相等保留信號(hào)及HBV的RRE相等保留信號(hào)組成的組。
18.權(quán)利要求6的核酸構(gòu)建體，其中所說的NEF(k)選自由反轉(zhuǎn)錄病毒的rev基因、編碼hnRNP-A1蛋白質(zhì)的基因或編碼轉(zhuǎn)錄因子TFIII-A的基因組成的組。
19.權(quán)利要求6核酸構(gòu)建體，其中所說的反轉(zhuǎn)錄病毒選自由HIV-1、HIV-2、Visna-maedi病毒、羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒、馬傳染性盆血病毒和貓免疫缺陷病毒和HTLV組成的組。
20.權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體，其中啟動(dòng)子(a)、(c)、(g)和(i)至少之一的至少一種TATA序列是突變的；并且組件(d)是編碼TATA結(jié)合蛋白質(zhì)(TBP)的基因，這種基因是突變的且和突變的TATA盒結(jié)合，使得能夠轉(zhuǎn)錄。
21.權(quán)利要求20的核酸構(gòu)建體，其中所說的TATA盒突變成TGTAAA，編碼TBP的基因在N862突變成T，在N889突變成A，在N890突變成C，在N895突變成G。
22.權(quán)利要求2-21之任一所要求的包含雜交啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體，所說的雜交啟動(dòng)子在5′至3′末端方向的閱讀框架中包含下列元件元件I，其包含-VIGF受體I基因的啟動(dòng)子包含核苷酸-1195至+100，其中所說的TATAA的TATA盒在-31至-26位上的核苷酸突變成TGTAAA；-序列GCCACC-編碼免疫球蛋白信號(hào)肽之cDNA的63至107位核苷酸序列；和-編碼β-葡糖醛酸酶之cDNA的93-1982位的核苷酸序列；和元件II，其包含cdc25C基因啟動(dòng)子的-487至+121位核苷酸；TATA盒結(jié)合蛋白質(zhì)的+1至+1001位核苷酸序列，這種核苷酸序列在下列位點(diǎn)上發(fā)生突變核苷酸862(T替代A)、889和890(AC替代GT)和895(G替代C〕。
23.如權(quán)利要求2至21之任一所要求的核酸構(gòu)建體，其包含在5′至3′方向的閱讀框架中含有下列元件的雜交啟動(dòng)子元件III-包含核苷酸-1195至100的VIGF受體I基因之啟動(dòng)子，并且其中所說的TATAAA的TATA盒之核苷酸在-31至-26位上突變成TGTAAA；-序列GCCACC-編碼免疫球蛋白信號(hào)肽之cDNA的63至107位核苷酸序列；和-編碼β-葡糖醛酸酶之cDNA的93-1982位核苷酸序列；和-編碼作為核保留信號(hào)(NRS)的HIV-1病毒RER之cDNA的7357至7602位核苷酸序列；和元件IIa-cdc25C基因啟動(dòng)子的-290至+121位核苷酸；-TATA盒結(jié)合蛋白質(zhì)的+1至+1001位核苷酸序列，這種核苷酸序列在下列位點(diǎn)上發(fā)生突變核苷酸862(T替代A)、889和890(AC替代GT)和895(G替代C〕。元件IV-von Willebrand因子(vWF)基因啟動(dòng)子的-487至+247位核苷酸；和-編碼作為核輸出因子(NEF)的1-117位氨基酸序列的HIV-1病毒REV之cDNA。
24.如權(quán)利要求2至21之任一所要求的核酸構(gòu)建體，其包含雜交啟動(dòng)子和激活物響應(yīng)啟動(dòng)子單位(包含在5′至3′末端方向閱讀框架中)的這種核酸構(gòu)建體包含下列元件元件V，其包含1)激活物亞單位A，其包含-cdc25C基因啟動(dòng)子的-290至+121位核苷酸；-Ga14蛋白質(zhì)1-147位氨基酸的DNA結(jié)合域之cDNA；和-編碼Ga1801-435位氨基酸的cDNA；2)激活物亞單位B，其包含-VIGF受體I基因的啟動(dòng)子，其包含-1195至+100位核苷酸，并且在其-31至-26核苷酸位上是TGTAAA；-Ga14 851-881位氨基酸的Ga180結(jié)合域的cDNA；-編碼SEQ ID NO.1的核定位信號(hào)(NLS)；和-編碼HSV-1 VP16 406-488位氨基酸的酸反式激活域；和3)激活物響應(yīng)啟動(dòng)子，其包含-具有SEQ ID NO.2核苷酸序列的Ga14之結(jié)合序列，這種結(jié)合序列可操作地和SV40基礎(chǔ)啟動(dòng)子的48-5191位核苷酸連接；-序列GCCACC；-編碼免疫球蛋白信號(hào)肽之cDNA的63至107位核苷酸序列；和-β-葡糖醛酸酶之cDNA的93-1982位核苷酸序列；和元件VI包含von Willebrand因子(vWF)基因啟動(dòng)子的-487至+247位核苷酸；和TATA盒結(jié)合蛋白質(zhì)的+1至+1001位核苷酸序列，這種核苷酸序列在下列位點(diǎn)上發(fā)生突變核苷酸862(T替代A)，889和890(AC替代GT)和895(G替代C〕。
25.權(quán)利要求20的核酸構(gòu)建體，其中包括轉(zhuǎn)基因(b)、核輸出因子(k)、TBP(d)和激活物響應(yīng)啟動(dòng)子(g)的結(jié)合蛋白(f)和/或(f′)在內(nèi)的組件中至少之一的至少一種基因發(fā)生突變，結(jié)果使表達(dá)的蛋白質(zhì)沒有功能，并且其中所說的組件d)是具有反密碼子的tRNA的基因，這種反密碼子和該突變互補(bǔ)或者攜帶給出正確的氨基酸以消除所說的組件中的突變的末端基團(tuán)。
26.權(quán)利要求25的核酸構(gòu)建體，其中至少一種下列密碼子UAU，UUF，UAC，CAG，AAA，AAG或UGG突變成UAG，UAA，UAG，UGA或UGG，并且抑制基因tRNA(組件d))是sup F(su+3)；sup C(su+4)；sup D(su+1)；supE(su+2)；sup G(su+5)或sup U(su+7)基因。
27.權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中所說的核酸是DNA。
28.權(quán)利要求27的核酸構(gòu)建體，其中所說的核酸構(gòu)建體是載體，如質(zhì)粒載體或病毒載體。
29.如權(quán)利要求1-28之任一所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的轉(zhuǎn)基因是編碼藥理活性化合物的結(jié)構(gòu)基因，這些藥理活性化合物選自由下列物質(zhì)組成的組細(xì)胞因子；干擾素；生長(zhǎng)因子；抗體；來源于細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子受體的抗體片段；具有抗增殖、apoptotic、細(xì)胞抑制或溶細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)；血管生成抑制劑和/或血栓形成誘導(dǎo)蛋白；凝結(jié)抑制劑；具有纖維蛋白溶解作用的蛋白質(zhì)；血漿蛋白；補(bǔ)體激活蛋白(如眼鏡蛇毒因子)；人類C3b；修飾的C3b；細(xì)菌蛋白；病毒外被蛋白；細(xì)菌抗原和寄生蟲抗原；腫瘤抗原；對(duì)血液循環(huán)具有作用的蛋白質(zhì)；肽激素；酶；由配位體和活性化合物組成的融合蛋白；反義RNA和核酶。
30.如權(quán)利要求1-29之任一所要求的核酸構(gòu)建體，其中所說的轉(zhuǎn)基因是編碼酶和/或編碼配位體/酶融合蛋白的結(jié)構(gòu)基因，所述酶切割藥物前體形成藥物。
31.權(quán)利要求30的核酸構(gòu)建體，其中所說的配位體和增殖的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，并且選自由下列物質(zhì)組成的組抗體和它們的片段；含有末端甘露糖的蛋白質(zhì)；細(xì)胞因子；生長(zhǎng)因子和附著分子。
32.權(quán)利要求29的核酸構(gòu)建體，其中所說的細(xì)胞因子是IL-1或TNF；生長(zhǎng)因子是PDGF、G-FGF、VEGF或TGFβ；附著因子是SLex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1或VLA-1。
33.一種分離的細(xì)胞，這種細(xì)胞含有如權(quán)利要求1-32之任一所要求的核酸構(gòu)建體。
34.權(quán)利要求33的分離細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。
35.一種通過制備含有細(xì)胞增殖抑制量核酸構(gòu)建體的藥物抑制細(xì)胞增殖的方法，這種藥物用于治療患有下列疾病的患者和過量細(xì)胞增殖有關(guān)的疾病、腫瘤、心血管疾病、自身免疫疾病、變應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、炎癥、器官排斥、關(guān)節(jié)炎、傳染病或神經(jīng)元疾病。
36.一種藥物組合物，其含有在藥學(xué)上可接受的載體中的細(xì)胞增殖抑制量的如權(quán)利要求1-32之任一所要求的核酸構(gòu)建體。
全文摘要
用于基因治療和基因操作的含雜交啟動(dòng)子的核酸構(gòu)建體。本發(fā)明涉及用于在宿主細(xì)胞中精確調(diào)節(jié)基因表達(dá)之核酸構(gòu)建體,這種構(gòu)建體顯示出至少一種抑制所表達(dá)的基因正常表達(dá)的突變,并且顯示出至少另一種消除由第一突變產(chǎn)生的抑制作用的第二突變;本發(fā)明還涉及一種分離的細(xì)胞,這種細(xì)胞含有所述的核酸構(gòu)建體;本發(fā)明也涉及這種核酸構(gòu)建體在制備藥物和治療具有過量細(xì)胞增殖疾病上的用途。
文檔編號(hào)C07H21/00GK1179470SQ97119658
公開日1998年4月22日 申請(qǐng)日期1997年9月23日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月23日
發(fā)明者K－H·塞法特, R·穆勒, H－H·斯德拉斯克 申請(qǐng)人:赫徹斯特股份公司