用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的載體的制作方法
【專利說明】用于轉(zhuǎn)基因表達(dá)的載體
[000。 通過引用納入
[0002] 本文引用或參考的所有文件（"本文引用的文件"），W及本文引用的文件中引用或 參考的所有文件，W及對(duì)于本文所述的或通過引用納入任何文件中的任何產(chǎn)品的任何生產(chǎn) 商的指南、說明、產(chǎn)品說明書和產(chǎn)品頁，均通過引用納入本文，并且可用于本發(fā)明實(shí)踐中。更 具體地，所有參考文獻(xiàn)都W相同程度通過引用納人本文，就如各文獻(xiàn)被具體地和單獨(dú)地說 明通過引用納入本文一樣。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及一種載體系統(tǒng)，其可包含替換轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件的間隔子(spacer)或填 充（Stuffer)核巧酸序列（SNS)。具體而言，本發(fā)明設(shè)及用不相關(guān)的短間隔子序列替換±撥 鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)序列，所述短間隔子序列促進(jìn)感興趣的核巧酸在逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體系統(tǒng)中的高效表達(dá)。本發(fā)明還設(shè)及遞送和表達(dá)感興趣的核巧酸至祀細(xì)胞的方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，例如慢病毒載體系統(tǒng)，已被建議用作遞送系統(tǒng)。W098/17815 設(shè)及移除多個(gè)附屬基因（accessoiT gene；LW099/45126設(shè)及gag-pol序列的密碼子優(yōu)化，作 為尋求克服Rev/RRE的輸出要求并增強(qiáng)RNA穩(wěn)定性的手段。
[0006] 乙型肝炎病毒化BV)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(PRE)和內(nèi)含子可能是功能性等同物陽uang， Z.M.和化n，T.S.( 1995)Mol. Cell. Biol. 15:3864-386] )?！罁苁蟾窝撞《?WHV)，一種與皿 V 緊密相關(guān)的病毒，也具有PRE(本文稱作WPRE;參見US 6，136,597和US 6,287,814)。在慢病 毒載體中插入WPRE導(dǎo)致顯著增強(qiáng)的報(bào)告基因的表達(dá)，例如，許多不同物種的多種細(xì)胞中的 巧光素酶和綠色巧光蛋白（GFP) [Zuffer巧，R.等，（1999) J. Virol 73: 2886-2892]。刺激與 轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的周期狀態(tài)無關(guān)。
[0007] WPRE包含對(duì)于其增強(qiáng)表達(dá)水平的功能而言重要的S種順式作用的序列。然而，此 夕h其包含約180個(gè)堿基對(duì)(bp)的片段，其可包含WHV X蛋白開放閱讀框的5'末端，及其相關(guān) 的啟動(dòng)子。已將全長X蛋白與腫瘤發(fā)生相關(guān)[Flajolet，M.等，（iggSU.Virol.TSienS-eiSO]。運(yùn)已通過如下方式被直接證明 [1]57,419,829]:通過將614￥載體給予胎內(nèi)的胎兒小 鼠：用包含野生型EIAV的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠發(fā)展肝腫瘤，而用缺失WPRE的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠沒 有發(fā)展肝腫瘤。已知，因病毒DNA插入宿主基因組所致的myc家族癌基因的順式活化的腫瘤 發(fā)生活性是WHV介導(dǎo)的癌發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制(811611山曰，1.4.(1994)刊于(：.化6〇11〇*(編），《原發(fā) 性肝癌：病因?qū)W和進(jìn)展因子KPrimary liver cance;r:etiological and progression factors)，第211-224頁；CRC出版社，佛羅里達(dá)州波卡拉頓；Fourel，G. (1994)刊于 F.Tronche和M.化niv(編），《肝基因表達(dá)KLiver gene e邱ression)，第297-:343頁；R.G.蘭 德斯公司（R.G丄andes Company),德克薩斯州奧斯?。?。此外，在人肝細(xì)胞癌中，在C末端截 短的乙型肝炎病毒X蛋白可能比全長X蛋白更具致瘤性(Tu H等.2001肝細(xì)胞癌組織中乙型 肝炎病毒X蛋白的天然COOH末端缺失的生物學(xué)影響（Biological impact of natural COOH-terminal delections of hepatitis B virus X protein in hepatocellular carcinoma tissues).Cancer Res 61:7803-7810)。
[000引 US 7,419,829設(shè)及用突變WPRE序列來替換野生型WPRE序列，所述突變WPRE序列經(jīng) 設(shè)計(jì)W維持增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但不表達(dá)X-蛋白。相信可對(duì)WPRE做出有限數(shù)量的變化而不 影響其增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力。然而，已知逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶具有低保真度(平均每10， 000個(gè)逆轉(zhuǎn)錄的核巧酸引入一個(gè)錯(cuò)誤）。因此，對(duì)于任何突變的WPRE而言，均有可能恢復(fù)成具 有腫瘤發(fā)生潛力的功能性野生型序列。
[0009] Real等(Appl Microbiol Biotechnol[2011]91:1581)顯示，移除慢病毒載體中的 WPRE能夠顯著減少轉(zhuǎn)基因表達(dá)，如同Ramezani等發(fā)現(xiàn)的那樣(MoIecular l'herapy[2000]2 (5): 458) Johnson等(Gene Hierapy [2013] 20:607)顯示，在轉(zhuǎn)基因已經(jīng)優(yōu)化為高表達(dá)的慢 病毒系統(tǒng)中，移除WPRE對(duì)于轉(zhuǎn)基因表達(dá)并無顯著作用:然而，其在用填充序列替換WPRE時(shí)是 沉默的。EP1757702描述了一種丫 -逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，其在不存在WPRE的情況下可支持 高轉(zhuǎn)基因表達(dá):同樣，其也在用填充序列替換WPRE時(shí)沉默。
[0010] 該申請(qǐng)文件中任何文獻(xiàn)的引用或鑒定并非承認(rèn)運(yùn)類文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)驚人地顯示，用不相關(guān)短核巧酸序列替換WPRE能促進(jìn)異源基因 或感興趣的核巧酸W增強(qiáng)的表達(dá)水平從逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒表達(dá)載體表達(dá)。因此，X-蛋白 的ORF的完全移除能夠除去該序列的腫瘤發(fā)生潛力，從而提高運(yùn)些載體在治療應(yīng)用上的安 全性能。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種工程改造的核巧酸分子，其缺失±撥鼠肝炎病 毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)，其中將間隔子核巧酸序列插入并替換WPRE。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 式中，所述分離的核巧酸分子可包含SEQ ID NO: 1[TCTAGA]的序列。所述WPRE可包含X區(qū)。
[0013] 在本發(fā)明的第二方面中，提供一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組，其可包含至少一種感 興趣的核巧酸序列(NOI)和本發(fā)明第一方面所述的分離的核酸分子。
[0014] 優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組可W是慢病毒載體基因組。具體而言，所述慢 病毒載體基因組可W是最小的慢病毒載體基因組。所述慢病毒載體基因組可衍生自選自下 組的病毒物種:人免疫缺陷病毒化IV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、綿羊脫髓銷性腦白質(zhì)炎/羊 慢性進(jìn)行性肺炎病毒(VMV)、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)、馬傳染性貧血病毒(EIAV)、貓免 疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
[0015] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可破壞編碼Rev的核酸序列或其功能等同物，從而該核 酸序列無法編碼功能性Rev,或從載體基因組移除。
[0016] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可破壞編碼化t的核酸序列，從而該核酸序列無法編碼 功能性化t，或從載體基因組移除。
[0017] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式提供一種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組，其可包含中屯、聚嚷 嶺區(qū)（CPPT)序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組可包含具有ATG基 序的gag-包裝信號(hào)，并且其中所述ATG基序可W是ATTG基序。
[0018] 在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組可W是多順反子，并且可 包含至少一種內(nèi)部調(diào)控元件。優(yōu)選地，所述內(nèi)部調(diào)控元件可W是啟動(dòng)子，或內(nèi)部核糖體進(jìn)入 位點(diǎn)（IRES)。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的第=方面，提供一種用于生成逆轉(zhuǎn)錄病毒源性的載體顆粒的逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體系統(tǒng)，其可包含(i)本發(fā)明第二方面所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組，（ii)編碼逆轉(zhuǎn) 錄病毒gag和POl蛋白的核巧酸序列；（iii)編碼其它必需的病毒包裝組分的核巧酸序列，所 述其它必需的病毒包裝組分不被(ii)的核巧酸序列編碼。優(yōu)選地，可W破壞，來自衍生所述 顆粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒的，編碼化r、Vif Jat、化f或類似的輔助基因中至少一種的，一種或多種 核酸序列，例如，該一種或多種核巧酸序列無法編碼功能性化r、Vif、化t、化f或類似的輔助 蛋白，或從所述系統(tǒng)移除。
[0020] 優(yōu)選地，所述載體系統(tǒng)可由異源env蛋白的至少部分而假型化(pseudotype)的。具 體而言，所述異源env蛋白可源自狂犬病-G或VSV-G。
[0021] 在本發(fā)明的第五方面中，提供由本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)產(chǎn)生的病毒顆粒。
[0022] 在本發(fā)明的第六方面中，提供一種已用本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì) 胞。
[0023] 在本發(fā)明的第屯方面，提供一種組合物，其可包含本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因 組，W及運(yùn)載體或稀釋劑。
[0024] 本發(fā)明的第八方面提供一種組合物，其可包含本發(fā)明的病毒顆粒，W及運(yùn)載體或 稀釋劑。
[0025] 本發(fā)明的第九方面提供，將至少一種NOI遞送至祀細(xì)胞的方法，所述方法可包括將 本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因組引入祀細(xì)胞，由此將NOI遞送至祀細(xì)胞。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供本文提供的間隔子或填充序列。
[0027] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是本發(fā)明不包括任何先前已知的產(chǎn)品、制備產(chǎn)品的過程 或使用產(chǎn)品的方法，使得申請(qǐng)人保留權(quán)利并由此公開放棄任何先前已知的產(chǎn)品、過程或方 法。還應(yīng)注意，本發(fā)明不旨在在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括任何產(chǎn)品、制備產(chǎn)品的過程或使用產(chǎn)品 的方法，其不符合USPT0(35U. S. C. §112，第一段)或EPCKEPC的第83條）的允許要求和書面說 明，使得申請(qǐng)人保留權(quán)利并由此公開放棄任何先前已知的產(chǎn)品、制備產(chǎn)品過程或使用產(chǎn)品 的方法。
[0028] 應(yīng)注意，在該公開文件W及特別在權(quán)利要求和/或段落中，諸如"包含"等的術(shù)語具 有美國專利法中對(duì)其賦予的含義，例如，其可表示"包括"等;且諸如"基本由……組成"的術(shù) 語具有美國專利法中對(duì)其賦予的含義，例如，其允許未明確列出的要素，但排除發(fā)現(xiàn)于現(xiàn)有 技術(shù)中或影響本發(fā)明基本或新穎性的要素。
[0029] 公開了運(yùn)些和其他實(shí)施方式，其在下述發(fā)明詳述中明顯并包括于其中。
[0030] 附圖的簡要說明
[0031] W下發(fā)明詳述W示例的形式給出但不旨在單獨(dú)將本發(fā)明限制為所述特定實(shí)施方 式，其最好可連同所附附圖進(jìn)行理解。
[0032] 圖1是稱為祀LNS-NY-ESO ADB152的原始轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的示意圖。
[0033] 圖2是稱為pELNS-NY-ESO NoX ADB693的質(zhì)粒的示意圖。已對(duì)pELNS-NY-ESO ADB152質(zhì)粒的WPRE區(qū)進(jìn)行修飾，W移除3'端的截短的X-蛋白和X-啟動(dòng)子。
[0034] 圖3是稱為pELNS-NY-ESO NoW ADB694的質(zhì)粒的示意圖。已對(duì)pELNS-NY-ESO ADB152質(zhì)粒的WPRE區(qū)進(jìn)行修飾，W用6個(gè)核巧酸(TCTAGA)(即，XbaI限制性酶切位點(diǎn)）替換 WWE 區(qū)。
[0035] 圖4是稱為祀LNS Tomato-Luc ADB73的質(zhì)粒的示意圖。
[0036] 圖5是稱為祀LNS Luc ADB678的質(zhì)粒的示意圖。
[0037] 圖6是稱為祀LNS LucNoX ADB679的質(zhì)粒的示意圖。
[0038] 圖7是稱為祀LNS LucNoW ADB680的質(zhì)粒的示意圖。
[0039] 圖8顯示，Luc、LucNoX和LucNoW慢病毒載體制備物中存在的慢病毒載體相關(guān)的 p24gag衣殼蛋白的水平。
[0040] 圖9顯示，用Luc、LucNoX和LucNoW載體的連續(xù)稀釋物轉(zhuǎn)導(dǎo)的SupTl細(xì)胞中的巧光素 酶活性的表達(dá)。
[0041 ] 圖10顯示，來自稱為BufT504、BufT505、Buff506和Buf巧07的四種不同供體的 SupTl和原發(fā)性T細(xì)胞中的巧光素酶活性的表達(dá)。
[0042] 圖11顯示，由包含全長WPRE或WPRE替換性填充序列的表達(dá)巧光素酶的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒 衍生的LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的SupTl細(xì)胞表達(dá)的巧光素酶活性。
[0043] 圖 12顯示，NYESO-I TCR在用NY-ESOl、NY-ES01 WPRE NoX或NY-ESOl NoW 6聚體的 連續(xù)稀釋物轉(zhuǎn)導(dǎo)的SupTl細(xì)胞表面上的表達(dá)。
[0044] 發(fā)明詳述
[0045] 現(xiàn)將通過非限制性示例的方式描述本發(fā)明的多種優(yōu)選特征和實(shí)施方式。盡管，一 般而言，本文中提及的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，具體可參見Sambrook,等，《分子克隆，實(shí)驗(yàn)室 手冊(cè)KMolecular Cloning，A LaboratoiT Manual)(1989)，和Ausubel等，《分子生物學(xué)簡 要方案》（化ort Protocols in Molecular Biology) (1999)第4版，約翰威利父子出版社公 司（John Wiley&Sons，Inc. KW及《現(xiàn)代分子生物學(xué)方案》（Current Protocols in Molecular Biology)的完整版）。
[0046] 本文所用術(shù)語"操作性地連接"表示所述組分處于某種關(guān)系中，該關(guān)系允許其W所 需方式發(fā)揮功能。
[0047] ±撥鼠肝炎病毒(WHV)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控元件(WPRE)可增強(qiáng)從多種不同載體類型（包括 慢病毒載體）的表達(dá)[US 6,136,597;6,287,814;Zufferey，R.等.（1999)J.Virol.73:2886-92]。不意在受理論限制，認(rèn)為該增強(qiáng)歸因于轉(zhuǎn)錄后水平上的改善的RNA處理，導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄本 的水平增加。mRNA穩(wěn)定性的兩倍增加也促進(jìn)了運(yùn)一增強(qiáng)[Zufferey，R.，等.同上]。經(jīng)報(bào)道， 包含WPRE的轉(zhuǎn)錄本的增強(qiáng)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平是不包含WPRE的那些的大致2至5倍，并且與轉(zhuǎn) 錄本水平的增加呈良好相關(guān)。運(yùn)已采用多種不同的轉(zhuǎn)基因證明（2證'6丘67，1?.，等.同上）。
[0048] WPRE包含對(duì)于其增強(qiáng)表達(dá)水平的功能而言重要的S種順式作用的序列。此外，其 包含約18化P的片段，其可可包含WHV X蛋白ORF的5 '端(全長ORF是42化P)，及其相關(guān)的啟動(dòng) 子。始于X啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄本的翻譯會(huì)導(dǎo)致形成代表X蛋白的N出末端的60個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。 該截短的X蛋白可促進(jìn)腫瘤發(fā)生，具體而言，在將該截短的X蛋白序列整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基 因組的特定基因座時(shí)，可促進(jìn)腫瘤發(fā)生[Bal sano，C.等，（1991)Biochem.Biophys Res.Commun.176:985-92;Flajolet，M.等，（1998)J.Virol.72:6175-80;Zheng，Y.W.等， (1994)J.Biol.Chem. 269