一種抗癌活性蛋白及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物藥物領域，具體涉及一種抗癌活性蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002] 癌癥是人類健康的大敵，世界范圍內每年有數(shù)以千萬計的病人遭受癌癥的折磨。 癌細胞的重要特點就是喪失凋亡能力，增殖加速、失控。在發(fā)展中國家，宮頸癌發(fā)病率排在 婦科腫瘤的首位，估計世界上每年約有50萬婦女罹患宮頸癌。開發(fā)和利用高療效低副作用 的藥物治療這種疾病是腫瘤學和婦科學研究工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。近幾十年來，許多相 關研究工作者一直在竭力探究癌基因影響細胞生理生化過程的機制，尋找能夠誘導癌細胞 凋亡，抑制其異常增殖的試劑或方法。由于有毒動物(如蛇、蝎、蟾蜍和蜘蛛等)來源的天然 毒素中富含具有細胞毒性和抗癌活性的成分，從而成為受人關注的篩選抗癌藥物前體分子 的寶貴資源。
[0003] 目前普遍認為，抗癌藥物的抗腫瘤效應主要是基于其誘導細胞凋亡、阻斷細胞DNA 合成、導致細胞DNA損傷和阻斷細胞有絲分裂等的作用。有鑒于此，半個多世紀以來，許多研 究都集中在利用細胞毒性試劑用于治療癌癥的可能性。很多動物的毒液被證明對來自人宮 頸癌細胞系的HeLa細胞具有毒性，提示其中含有抗宮頸癌的活性成分，可以用來作為篩選 抗宮頸癌藥物的前體分子。
[0004] 文獻調研表明，蛇毒抗癌活性的研究最為廣泛。多種蛇的毒液或其蛋白質活性成 分被證明對包括HeLa細胞在內的癌細胞具有抑制作用。蝎毒對He La細胞的作用則因蝎毒的 來源不同而呈現(xiàn)一定的差異。蟾蜍毒液也被實驗證明含有較強細胞毒性和抗癌活性的成 分。相對而言，蜘蛛毒腺毒液抗癌活性成分研究的報道較少。但如發(fā)明專利申請 200510120779.1提供了一種蜘蛛毒注射液，它含有活性蜘蛛毒素和注射用溶液。制備時包 括以下步驟:1)取活性蜘蛛凍干粉加入適量注射用溶液，輕輕振搖溶解，然后加入注射用溶 液稀釋至〇. 5mg~5mg/100ml; 2)分裝于滅菌過的容器中，1~6°C的低溫保存?zhèn)溆?。該發(fā)明提 供的蜘蛛毒注射液主要用于治療風濕和類風濕、三叉神經(jīng)痛和坐骨神經(jīng)痛等神經(jīng)疼痛，還 可用于各種原因引起的機體免疫機能減退及多種癌癥。其中，蜘蛛毒取自成年蜘蛛的毒腺， 具體可以從虎紋捕鳥蛛、敬釗纓毛蛛、智利蜘蛛、黑寡婦蜘蛛、美國漏斗網(wǎng)蛛、漏斗網(wǎng)蛛、黑 腹櫛足蛛或狼蛛的毒腺中獲取。
[0005] 另外，黃新、王勤等人發(fā)表的《蜘蛛毒素的細胞毒作用研究進展》中也公開蜘蛛毒 腺毒素用于抑制癌細胞的研究，如有將雷氏大尤蛛毒素應用于人子宮頸HeLa細胞，蜘蛛毒 素在10~40mg/L的濃度里能有效地抑制細胞的增殖，并且有良好的量效和時效關系，形態(tài) 學上可見細胞凋亡和壞死，而細胞凋亡是caspase-3的上調引起的。
[0006] 但在抗癌尤其是抑制HeLa細胞的增殖方面，本領域還可以做出進一步的努力，以 使得抗癌藥的來源更為廣泛和多樣，或使得藥物的抗癌效果更優(yōu)。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明從黑寡婦蜘蛛幼蛛提取物中分離純化出一種具有抗癌活性的蛋白質。該活 性蛋白的分子量約為23kDa，已測定出其編碼基因的核苷酸序列和蛋白質的全部氨基酸序 列。該活性蛋白能誘發(fā)HeLa細胞凋亡，抑制HeLa細胞增殖，可用于抗癌藥物的開發(fā)。
[0008] 具體地，本發(fā)明提供一種抗癌活性蛋白，所述蛋白是從黑寡婦蜘蛛的幼蛛中提取 得到的分子大小為20~25KDa的蛋白質。
[0009 ]與文獻報道的抗癌活性成分都來自動物的毒腺不同，本發(fā)明分離純化的抗癌活性 成分來自黑寡婦蜘蛛的幼蛛，本領域技術人員可知蜘蛛幼蛛中并不存在能產(chǎn)生毒素的毒 腺，但發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在目前世界上已知毒性最強的蜘蛛之一黑寡婦蜘蛛的幼蛛中能提取出抗 癌活性蛋白。且提取得到的該抗癌活性蛋白與黑寡婦成蛛毒腺中分泌的毒素具有完全不同 的結構和性質。具體地，通過分析SDS-PAGE圖譜可知，該蛋白不存在于黑寡婦蜘蛛的成蛛體 內，包括不存在于成蛛的毒腺中，即幼蛛長大后該蛋白將消失。且該蛋白不存在于其它品種 的蜘蛛幼蛛中，而僅在黑寡婦蜘蛛的幼蛛中發(fā)現(xiàn)并分離純化得到。
[0010]在一種具體的實施方式中，所述蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1所示。
[0011]在另一種具體的實施方式中，所述蛋白為在SEQ ID NO: 1所不氣基酸序列的基礎 上進行修飾或改造而得到的蛋白質突變體。
[0012] 在另一種具體的實施方式中，所述蛋白為與SEQ ID NO: 1氨基酸序列相似度在 80%以上且與SEQ ID NO: 1表示的蛋白質具有相同功能的蛋白質。所述與SEQ ID NO: 1氨基 酸序列相似度在80%以上的蛋白例如為由數(shù)據(jù)庫中搜索或常規(guī)突變方法得到。所述數(shù)據(jù)庫 為基因數(shù)據(jù)庫或蛋白質數(shù)據(jù)庫。具體例如通過采用常規(guī)方法對非關鍵氨基酸進行等同替換 或去除，得到一種功能與SEQ ID N0:1所示蛋白具有同等功能(對HeLa癌細胞具有相同或相 近的抑制活性)的蛋白質突變體。
[0013] 在一種具體的實施方式中，所述抗癌活性蛋白為自天然材料中提取或以分子生物 學表達得到。
[0014]本發(fā)明還提供一種如上所述蛋白在制備抑制HeLa癌細胞的藥物中的應用。
[0015] 本發(fā)明還提供一種核苷酸序列，所述序列為如下序列a)~c)之一：
[0016] a)所述核苷酸序列為如SEQ ID N0:2所示的序列；
[0017] b)與SEQ ID NO: 2具有90%以上同源性且與其編碼相同功能蛋白質的核苷酸序 列；
[0018] c)能與序列a)或序列b)雜交的核苷酸序列。
[0019] 本發(fā)明提供的活性蛋白能通過阻滯細胞周期、激活細胞凋亡關鍵酶等機制抑制 HeLa細胞增殖，誘發(fā)HeLa細胞凋亡。由于本發(fā)明相應提供了它的編碼基因序列，為大規(guī)模的 基因異源表達和樣品制備提供了方便，為該蛋白用于抗癌藥物的開發(fā)提供了前提條件。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明提供的抗癌活性蛋白PP23對HeLa細胞增殖的影響，
[0021]圖2為本發(fā)明提供的抗癌活性蛋白PP23對細胞凋亡關鍵酶caspase 3活性的影響。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明采用分子篩層析、離子交換和反相HPLC相結合的技術從黑寡婦蜘蛛幼蛛的 提取物中分離純化出一種活性蛋白，將其命名為PP23。
[0023]該蛋白可以從天然材料提取和分子生物學表達兩種途徑獲取，但由于天然材料的 來源有限，我們已克隆該基因并異源表達成功。
[0024] 實施例1
[0025]實施例1描述本發(fā)明所述蛋白質PP23的制備方法。
[0026] -、該蛋白來自于天然材料的提取步驟：
[0027] 1)剝開黑寡婦蜘蛛卵囊獲取幼蛛，在50mmol/L PBS緩沖液中研磨后4°C下1000 Og 離心10min，取上清。重復三次，合并上清得到幼蛛提取液。
[0028] 2)用截留分子量10000的超濾管超濾，取分子量>10000的部分。
[0029] 3)利用分子篩層析將蛋白質混合物進行分級分離，得到幾個不同的級分。
[0030] 4)SDS-PAGE檢測目標蛋白質所在的級分。
[0031] 5)取