ctatcagtgatagagacaccaggaaacct^S tcai^tagatcgaatggactctaaatccgttcag ccgggttagattcccggggtttccggacaagtgcggttttttt
[0560] SEQ ID No 38
[0561] HltRNA-A2B構(gòu)建體
[0562] aatatttgcatgtcgctatgtgttctgggaaatcaccataaacgtgaaatccctatcagtgatagagac ttataagttccctatcagtgatagagacaccaggaaacct^S tca?i^tagatcgaatggactctaaatccgttcag ccgggt空agattcccggggtttccggacaagtgcggttttttt
[0563] SEQ ID No 39
[0564] Hl-tRNA構(gòu)建體中使用的終止子序列：
[0565] gacaagtgcggttttttt
[0566] SEQ ID No 40
[0567] 小家鼠tRNAglu編碼序列
[0568] tccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcccgggttcgattctcggtcagg gaa
[0569] SEQ ID No 41
[0570] 具有5'和3'非編碼區(qū)的小家鼠tRNA Glu :
[0571] Gcctgtagtagtccgccggagcggaggttccaggcgggcaagcagtgtatctgccacggtggcggagag gctgtgtgtctgagtgtctccaggagtcggtagccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctaKtggttagga ttcggcgctctcaccgccgcggcccg^gttcgattctcggtcagggaagcctctcttcttcctctctgcaccctcac ttccccaaacctcgctcctcttccctcgctcacttttgcccaacaccaacgcacacc
[0572] SEQ ID No 42
[0573] 1 X tRNAglu-pyl DNA構(gòu)建體
[0574] gccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcc cgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaa tccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcttcttcctcttttct
[0575] SEQ ID No 43
[0576] 3 X tRNAglu-pyl :包括雙順反子構(gòu)建體tRNAglu-tRNApyl的3個重復(fù)序列的DNA 構(gòu)建體
[0577] gccgtgacctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcc cgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaa tccgttcagccgggttagattcccggggtttccgcttcttcctcttttctgcaccctcacttcagctgagccgtgac ctcgggccgacgctccctggtggtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcccgggttcgattctcgg tcagggaagcctctcccccaaacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggtt agattcccggggtttccgcttcttcctcttttctgcaccccaatattgccgtgacctcgggccgacgctccctggtg gtctagtggttaggattcggcgctctcaccgccgcggcccgggttcgattctcggtcagggaagcctctcccccaaa cctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgtagc gtcctttttggaaagacaagtgggtggcgaattcgatatc
[0578] SEQ ID No 44
[0579] 用于tRNAglu-pyl構(gòu)建體的5'前導(dǎo)序列
[0580] gccgtgacctcgggccgacgc
[0581] SEQ ID No 45
[0582] tRNAglu-pyl構(gòu)建體中使用的終止子序列
[0583] tagcgtcctttttg
[0584] SEQ ID No 46
[0585] tRNAglu-pyl構(gòu)建體中使用的終止子序列
[0586] Cttcttcctcttttct
[0587] SEQ ID No 47
[0588] tRNAglu-pyl構(gòu)建體中使用的基因間序列
[0589] gcctctcccccaaacctc
[0590] SEQ ID No 48
[0591]小家鼠tRNAasp編碼序列
[0592] TcctcRttaRtataRtRRtRaRtatccccRcctRtcacccRCRaRaccRRCRttccattccccRacRRR gag
[0593] SEQ ID No 49
[0594] 具有上游和下游區(qū)域的小家鼠tRNA Asp
[0595] tgggtgagacggaggttgtgggtcgtgtgtgtcgtcgtagacggtcgggcgacggtgcgtcgtagtcgg cgttgtcctcgttagtatagtggtgagtatccccgcctgtcacccgcgagaccggcgttccattccccgacggggag acgtagcgtcctttttggaaagacaagtgggtggcccgcggg
[0596] SEQ ID No 50
[0597] 1XtRNAasp-pyl DNA構(gòu)建體
[0598] ggtgcgtcgtagtcggcgttgtcctcgttagtatagtggtgagtatccccgcctgtcacccgcga gaccggcgttccattccccgacggggagacgtagccccacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggact ctaaatccgttcagccgggttagattcccgggg七ttccg
[0599] SEQ ID No 51
[0600] 2XtRNAasp-pyl :包括雙順反子構(gòu)建體tRNAasp-pyl的2個重復(fù)序列的DNA構(gòu)建 體
[0601] tcctcgttagtatagtggtgagtatccccgcctgtcacccgcgagaccggcgttccattccccgacggg gagacgtagccccacctcggaaacctgatcatgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattccc ggggtttccgtagcgtcctttttggaaagacaaggtgcgtcgtagtcggcgttgtcctcgttagtatagtggtgagt atccccgcctgtcacccgcgagaccggcgttccattccccgacggggagacgtagccccacctcggaaacctgatca tgtagatcgaatggactctaaatccgttcagccgggttagattcccggggtttccgtagcgtccttttt
[0602] SEQ ID No 52
[0603] 2XAsp_pyl構(gòu)建體中使用的前導(dǎo)序列
[0604] Ggtgcgtcgtagtcggcgttg
[0605] SEQ ID No 53
[0606] 2XAsp_pyl構(gòu)建體中使用的終止子序列
[0607] tagcgtccttttt
[0608] SEQ ID No 54
[0609] tRNAasp-pyl構(gòu)建體中使用的基因間序列
[0610] acgtagccccacctc
[0611] SEQ ID No 55
[0612] 人tRNAglu編碼序列
[0613] TCCCTGGTGGTCTAGTGGCTAGGATTCGGCGCTTTCACCGCCGCGGCCCGGGTTCGATTCCCGGTCAGG AAT
[0614] SEQ ID No 56
[0615] 人tRNAasp編碼序列
[0616] TCCTTGTTAGTATAGTGGTGAGTGTTTCTGCCTGTCATGTGGAGACTGGAGTTTGAGTCCCCAACAGG GA
[0617] SEQ ID No 57
[0618] 7SL啟動子變體：7SL_1
[0619] CGCTCCCCAATGACGTAACTGCCCTGC-AGCTTCTAGTAGCT-TTTCGCAGCGTCTCCGACCG
[0620] SEQ ID No 58
[0621] 7SL啟動子變體：7SL_2
[0622] TCTGGTTGCTACCATGTGTAGCC-TGCAAGCCTCTAGCAGCTCTTTTGCAGCGACGCCGACCG
[0623] SEQ ID No 59
[0624] 7SL啟動子變體：SL28
[0625] TAACATTGCTAATGAGTTTTGGGCACACATTGTCATTGATAACATCTTATCAGGAGACAGGG
[0626] SEQ ID No 60
[0627] 7SL啟動子變體：7L63
[0628] ACAGAGGAACTACCATAACAAGAACCAAAGAGAAATGGCAtACcTCAGG
[0629] SEQ ID No 61
[0630] 7SL啟動子變體：7L23
[0631] CTCCCTCTCAAAACTCAAGGAAATCTAGTGGGCATGGTGCACAT
[0632] SEQ ID No 62
[0633] 7SL啟動子變體：7L7
[0634] AGGTACTACCCAATGGTTTTCTAAAATACTTGCATC-TGCACATGCCATG
[0635] SEQ ID No 63
[0636] EBER啟動子變體：EBER1
[0637] GATCCAAACTTTTGTTTTAG GATTTATGCA TCCATTATCC CGCAGTTCCA CCTAAACGGG GCTTAACGTT GCATCCCAGA AGATGCACGC TTAACCCCGC CTACAACCGT GACGTAGCTG TTTACCAGCA TGTATAGAGT TACGGTTCGC TACATCAAAC
[0638] SEQ ID No 64
[0639]穹窿體啟動子變體：Hvg3
[0640] aggtcgctgagtcaagctaaagcaccgttgttttgactcactctttgtgacgtaggtctttctcaccag tcaagaaaatacaatccgaaagcaacctctg
[0641] SEQ ID No 65
[0642]穹窿體啟動子變體：Hvg2
[0643] Tggttgctgagtcatgctaaaacactgttgttttgactcactttgtgacgtaggtctttctcaccagtc aagaaaatataatccggagatagcctctg
[0644] SEQ ID No 66
[0645]馬氏甲焼八疊球菌pylRS aa序列
[0646] Mdkkplntlisatglwmsrtgtihkikhhevsrskiyiemacgdhlvvnnsrssrtaralrhhkyrktc krcrvsdedlnkfltkanedqtsvkvkvvsaptrtkkampksvarapkplenteaaqaqpsgskfspaipvstqesv svpasvstsissistgatasalvkgntnpitsmsapvqasapaltksqtdrlevllnpkdeislnsgkpfrelesel lsrrkkdlqqiyaeerenylgklereitrffvdrgfleikspilipleyiermgidndtelskqifrvdknfclrpm lapnlynylrkldralpdpikifeigpcyrkesdgkehleeftmlnfcqmgsgctrenlesiitdflnhlgidfkiv gdscmvygdtldvmhgdlelssavvgpipldrewgidkpwigagfglerllkvkhdfknikraarsesyyngistnl
[0647] SEQ ID No 67
[0648]馬氏甲烷八疊球菌pylRS核苷酸序列
[0649] atggataaaaaaccattgaatacgctcattagcgcaactgggctgtggatgagccgtacgggaacgatt cataaaatcaagcaccacgaagtatctcgtagcaaaatctatatcgagatggcttgcggcgaccatctcgtggtaaa caatagcaggtcctcacggaccgcccgtgccttgcgccaccacaaatatcgtaaaacttgtaagagatgtagagtga gcgacgaggatctgaacaagtttcttacaaaggccaacgaggaccaaaccagcgtcaaagtcaaggttgtgagcgcc ccaacacgcaccaagaaggccatgcccaagtctgttgcgcgggcaccgaaacctctggagaatactgaggccgctca ggcccagcccagcggttcaaaattctctcctgccattccagttagcactcaagagtcagtcagcgtgcccgcctctg tgtctacatccatcagctctatctccaccggcgcaacagcctctgccctggtgaagggtaatacgaaccctatcacg agtatgtccgcacccgtgcaagcaagtgctcccgcactcactaaatcccaaacggaccggctggaggtcctgcttaa ccctaaggatgaaatcagcctgaacagtggaaaaccgtttcgagaactggaatccgagctcttaagccggcgaaaga aagatttgcaacagatttacgccgaagaacgggaaaattatctgggcaagctggagagagaaatcactaggttcttt gtagataggggctttctggagattaagagtcccatattgatccctctcgaatacattgagcgtatgggcatcgacaa cgacacagaacttagcaagcagatctttcgggtggacaaaaacttctgcctcaggcctatgctggctccaaatctgt acaactatcttaggaaactcgaccgggccctgcccgatcccattaaaatcttcgaaattggaccttgctatagaaag gagagcgatggcaaggagcacctggaggagtttactatgctcaatttctgtcaaatgggctccggctgcacacgtga gaacctcgaatccattataaccgacttcctgaatcacctggggattgatttcaagatcgtgggcgactcctgcatgg tgtttggtgatacgttggatgtgatgcacggagatttggaattgtcaagcgctgtggtaggccccattcctctcgac agggagtggggtattgacaagccctggatcggcgcaggttttggact-ggagcgcctgttgaaggttaagcatgact tcaaaaacataaagagagccgcacgcagcgaatcctattataatggaatcaqcactaacttqtaa
[0650]在本說明書通篇和隨后的權(quán)利要求書中，除非上下文另外要求，詞語'包括 (comprise)'、以及變型如'包括（comprises)'和'包括（comprising)'將理解為意味著 包括所陳述的整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組，但是不排除任何其他整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟 組。
[0651]由本說明書和權(quán)利要求書部分構(gòu)成的申請可以用作任何后續(xù)申請的優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)。 這種后續(xù)申請的權(quán)利要求書可以涉及在此所述的任何特征或特征組合。它們可以是產(chǎn)品、 組合物、方法、或用途權(quán)利要求的形式，并且可以無限制地通過實例包括下列【主權(quán)項】
【主權(quán)項】
1. 一種DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含一個tRNApyl編碼序列和一個RNA聚合酶III 啟動子序列，該DNA構(gòu)建體能夠在真核表達(dá)系統(tǒng)中起作用以表達(dá)足以支持無義抑制的功能 性 tRNApyl〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA構(gòu)建體，其中該無義抑制是琥珀型抑制。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含在該tRNApyl編碼 序列下游的終止子序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的DNA構(gòu)建體，其中該構(gòu)建體包含tRNApyl基因， 該基因包含該tRNApyl編碼序列，以及功能性基因內(nèi)RNA聚合酶III啟動子。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA構(gòu)建體，其中該tRNApyl基因含有在該基因內(nèi)RNA聚合 酶III啟動子的推測性A盒和/或推測性B盒中的1或2個核苷酸位置上的突變。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的DNA構(gòu)建體，其中該tRNApyl基因含有在該推測性B盒中的 1或2個核苷酸位置（例如1個位置）上的突變。7. 根據(jù)權(quán)利要求4至6中任一項所述的DNA構(gòu)建體，其中該tRNApyl基因具有或包含 來源于馬氏甲烷八疊球菌的SEQ ID No 7、8、9、10、或11的序列或具有或包含來源于另一個 細(xì)菌物種的類似tRNApyl基因的序列，其中在SEQ ID No 7、8、9、10、或11中通過粗體指示 的突變發(fā)生在等效位置。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的DNA構(gòu)建體，其中該tRNApyl編碼序列可操作 地連接至RNA聚合酶III啟動子，其中所述啟動子置于該tRNApyl編碼序列的5'。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的DNA構(gòu)建體，其中該5'啟動子和該tRNApyl編碼序列通過含 有轉(zhuǎn)錄起始位點的間隔子序列分開。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含基因內(nèi)啟動子元件 和5'啟動子元件，該5'啟動子元件為置于該tRNApyl編碼序列5'的RNA聚合酶III啟動 子元件，這樣使得所述基因內(nèi)啟動子元件和所述5'啟動子元件的組合構(gòu)成雜合啟動子。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的DNA構(gòu)建體，其中所述5'啟動子元件為4型RNA聚合酶 III啟動子的5'元件。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的DNA構(gòu)建體，其中4型RNA聚合酶III啟動子的該5'啟 動子元件選自EBER RNA基因啟動子、7SL RNA基因啟動子以及穹窿體RNA基因啟動子的5 ' 啟動子元件。13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的DNA構(gòu)建體，其中該5'啟動子元件選自SEQ ID No 12、20、 26、57、58、59、60、61、62、63、64 以及 65。14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的DNA構(gòu)建體，其中4型RNA聚合酶III啟動子的該5'啟動 子元件是7SL RNA基因啟動子。15. 根據(jù)權(quán)利要求10至14中任一項所述的DNA構(gòu)建體，其中該5'啟動子元件和該 tRNApyl編碼序列通過含有轉(zhuǎn)錄起始位點的間隔子序列分開。16. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的DNA構(gòu)建體，其中該間隔子序列選自SEQ ID NO 13、21以 及27。17. -種多聚體DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含多個拷貝（例如2至60個拷貝）的根據(jù)權(quán) 利要求1至16中任一項所述的DNA構(gòu)建體。18. -種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含在tRNApyl基因5'的一個真核tRNAglu基因或一 個真核tRNAasp基因，所述tRNAglu基因或tRNAasp基因被去除終止序列，因此在轉(zhuǎn)錄時產(chǎn) 生雙順反子信息。19. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的DNA構(gòu)建體，其中該tRNApyl基因是野生型基因。20. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的DNA構(gòu)建體，其中該tRNApyl基因含有在該推測性A盒和 /或該推測性B盒中的1或2個核苷酸位置上的突變。21. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體還包含PylRS編碼序 列或基因。22. -種真核宿主細(xì)胞，該細(xì)胞用包含根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的DNA構(gòu)建 體的載體轉(zhuǎn)化。23. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的真核宿主細(xì)胞，該細(xì)胞用包含編碼靶蛋白的基因的載體轉(zhuǎn) 化，該靶蛋白含有由無義密碼子編碼的一個或多個非天然氨基酸。24.-種真核細(xì)胞系，該真核細(xì)胞系表達(dá)或能夠表達(dá)功能性PylRS和功能性tRNApyl， 其中功能性tRNApyl表達(dá)發(fā)生在一個基因內(nèi)啟動子元件和一個5'啟動子元件的控制下，該 5'啟動子元件為置于該tRNApyl編碼序列5'的RNA聚合酶III啟動子元件，這樣使得所述 基因內(nèi)啟動子元件和所述5 '啟動子元件的組合構(gòu)成一個足以支持無義抑制的雜合啟動子。25. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的真核細(xì)胞系，其中該無義抑制是琥珀型抑制。26. 根據(jù)權(quán)利要求17至20中任一項所述的真核宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞是哺乳動物 細(xì)胞。27. -種用于制備含有由無義密碼子編碼的一個或多個非天然氨基酸的靶蛋白的方 法，該方法包括在真核細(xì)胞系中表達(dá)所述靶蛋白，該真核細(xì)胞系用編碼含有由無義密碼子 編碼的一個或多個非天然氨基酸的靶蛋白的基因轉(zhuǎn)化并且該真核細(xì)胞系還用編碼PylRS 和tRNApyl的基因轉(zhuǎn)化，這樣使得PylRS和tRNApyl被表達(dá)并且充分起作用以支持無義抑 制。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中該細(xì)胞系用根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項所述 的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。29. -種用于制備化學(xué)修飾的靶蛋白的方法，該方法包括根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的 方法制備靶蛋白并且對所得靶蛋白化學(xué)修飾。30. 根據(jù)權(quán)利要求22至29中任一項所述的細(xì)胞、細(xì)胞系或方法，其中該無義密碼子是 琥珀密碼子。31. 根據(jù)權(quán)利要求22至30中任一項所述的細(xì)胞、細(xì)胞系或方法，其中這些非天然氨基 酸中的至少一個包含炔或疊氮部分。32. -種使用根據(jù)權(quán)利要求27至31中任一項所述的方法制備的如抗體綴合物的蛋白 質(zhì)綴合物，其中如抗體的該蛋白質(zhì)通過包含三唑部分的接頭綴合至選自蛋白質(zhì)、藥物以及 PEG部分的一個或多個其他部分。33. -種用于增加穩(wěn)定轉(zhuǎn)化以表達(dá)含有一個或多個非天然氨基酸的靶蛋白且表達(dá) PylRS和tRNApyl的真核細(xì)胞系的活力的方法，該方法包括用編碼PylRS和tRNApyl的基因 轉(zhuǎn)化該真核細(xì)胞系，這樣使得PylRS和tRNApyl被表達(dá)并且充分起作用以支持無義抑制。34. 根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中該無義抑制是琥珀型抑制。35. 根據(jù)權(quán)利要求1至34中任一項所述的DNA構(gòu)建體、細(xì)胞、細(xì)胞系、方法或蛋白質(zhì)綴 合物，其中該tRNApyl不是來源于巴氏甲燒八疊球菌的tRNApyl。
【專利摘要】在此尤其提供了一種DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含一個tRNApyl編碼序列和一個RNA聚合酶III啟動子序列，該構(gòu)建體能夠在真核表達(dá)系統(tǒng)中起作用，以表達(dá)足以支持無義抑制的功能性tRNApyl。
【IPC分類】C12N15/11, C12N15/09
【公開號】CN105247049
【申請?zhí)枴緾N201480019597
【發(fā)明人】G·迪西, M·馬瑞利, K·H·格拉布斯坦
【申請人】米迪繆尼有限公司
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2014年3月14日
【公告號】CA2906292A1, EP2970949A2, US20160024522, WO2014140347A2, WO2014140347A3