與溶酶體貯積癥的測試相關的化合物和方法
【專利說明】
[0001] 相關申請的奪叉引用
[0002] 本申請取決于2013年3月15如提交的美國臨時申請第61/789, 985號且要求所 述申請的優(yōu)先權，所述申請的內容以全文引用的方式并入本文中。
技術領域
[0003] 本說明書涉及檢測酶活性以檢測溶酶體酶活性的分析型試劑。
【背景技術】
[0004] 溶酶體貯積癥為一組遺傳性病癥，其特征為身體中缺乏特定酶，導致身體不能分 解代謝物質。舉例來說，法布立病（Fabrydisease)為每40, 000人中見于一人的溶酶體貝士 積癥。其由酶α-半乳糖苷酶的缺乏造成，所述缺乏導致身體不能分解稱作神經酰胺三己 糖苷（globotriaosylceramide)的特定脂肪物質。第二實例為戈謝?。℅aucherdisease)， 由不能分解稱作葡糖神經酰胺（也被稱為葡糖腦苷脂）的脂肪物質或脂質造成的溶酶體貯 積癥?；加懈曛x病的個體不制造葡糖腦苷脂酶，分解這些脂肪物質所需的酶。這些脂肪物 質隨后積聚在肝、脾和骨髓細胞中。第三實例為蓬佩病（Pompedisease)，由缺乏分解某些 稱作肝糖的糖所需的酶酸性α-葡糖苷酶造成的溶酶體貯積癥。當酶酸性α-葡糖苷酶缺 失時，肝糖積聚在身體中的各種組織和器官中。
[0005] 溶酶體貯積癥主要為兒童病癥，盡管一些顯現(xiàn)在成人期。在大部分所述病癥中，患 者在出生時正常且在一些時間以后開始具有進展性神經惡化。臨床表現(xiàn)型取決于生化缺陷 的類型和嚴重程度。這些溶酶體病癥中的一些，如蓬佩病和克拉培病主要顯現(xiàn)于嬰兒期。已 持續(xù)努力開發(fā)在臨床癥狀發(fā)作之前檢測此類病癥以使得可以起始治療性干預的方法。
[0006] 在過去的十年里，測試代謝病癥的實驗室已將串聯(lián)質譜引入到其新生兒篩選程序 中。串聯(lián)質譜持續(xù)在診所中受到歡迎，因為此技術允許在單一樣品中檢定多種代謝物。舉例 來說，此技術已實施為使用干燥血點樣品檢測新生兒中的遺傳代謝病癥的常規(guī)臨床實踐。 盡管溶酶體酶活性可以使用串聯(lián)質譜定量，但由于可溶性問題和并入外標的需要，公布的 檢定方法已略微難以適應臨床配置。
[0007] 因此，仍需要用于檢測溶酶體病癥的改進的方法和組合物。

【發(fā)明內容】

[0008] 提供以下發(fā)明概述以促進對本發(fā)明特有的創(chuàng)新性特征中的一些的理解且不打算 為完整描述。本發(fā)明的各種方面的完整理解可以通過將整個說明書、權利要求書、附圖和摘 要作為整體來獲得。
[0009] 提供使用如質譜的檢測系統(tǒng)檢測酶促反應的改進的組合物和方法。這些組合物 提供在水性溶劑系統(tǒng)中的提尚的可溶性和/或與目標酶的提尚的反應性，進而提尚檢定效 率、再現(xiàn)性和精確性。
[0010] 本發(fā)明提供適用于評估樣品中的溶酶體酶活性水平的化合物。測試溶酶體酶活性 例如在新生兒中篩選代謝病癥時以及在評估具有影響酶活性的醫(yī)學病況的個體或經歷如 替代療法、基因療法或骨髓移植的醫(yī)學治療的個體時適用。本文所述的化合物包括用于目 標酶的底物和適用作酶檢定中的對照物或標準物的相關分子。
[0011] 本發(fā)明的一個目標為提供適合于檢測酶，說明性地由于缺乏而導致溶酶體貯積癥 的酶的活性的底物。提供具有以下通式的底物：
[0012]
[0013] 其中A為單糖或二糖；B1為：C「C2。烷基；含雜原子的C「C2。烷基、C2-Cjf基；含 雜原子的C2-C2。烯基、經取代或未經取代C6-C2。芳基；B2為：C2-C7氨基甲酸酯；(：2-(：7酰胺 基、C2-C7酯、C2-C7脲基；C2-C7氨甲?；籆2-C7羰基；C「C7烷基；含雜原子的C「C7烷基；具 有N、0或S的取代基的烷基；C2-C7烯基；含雜原子的C2-C7烯基；具有N、0或S的取 代基的C2-C7烯基；且B3為：C「C2。烷基、含雜原子的C「C2。烷基；具有N、0或S的取代基的 C「C2。烷基；C4-C2。醚；C「C2。酯；C「C2。烯基；含雜原子的C「C2。烯基；具有N、0或S的取代 基的C2-C2。烯基；C「(：2。炔基；含雜原子的CiC2。炔基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。炔基 C6_C2。芳基；和含有N、0或S的雜原子的C6-C2。雜環(huán)。N、0或S的取代基獨立地、任選地為 羥基、氨基、硫醇、醚、硫醚或仲胺。在一些實施例中，A為醛己糖或酮己糖，任選地通過和α 或β糖苷鍵連接到分子的其余部分。任選地，Α為D-葡萄糖或D-半乳糖。Β1部分任選地 為亞甲基或C2烷基。B2部分任選地為C2-C7_胺基。B3部分任選地為具有N、0或S的取 代基的C2-C2。烯基。在一些實施例中，底物包括為D-葡萄糖或D-半乳糖的A、為亞甲基的 B1、SC2-C7_胺基的B1和為具有以羥基形式存在的0的取代基的C13-Cjf基的B3。
[0014] 還提供通式II的化合物
123 其類似地適用作檢測溶酶體貯積癥的底物。根據(jù)式II，A為醛己糖或酮己糖；R1為 C「C6烷基或C2-Cjt基；且R2為C「C2。烷基、具有N、0或S的取代基的C「C2。烷基、CiC2。 烯基或具有N、0或S的取代基的。烯基。應了解，R1或R2可以是任選地含有N、0或S 的取代，或N、0或S的取代基的。炔基。在一些實施例中，式II的底物包括D-葡萄糖 或D-半乳糖形式的A、C4-C6烷基形式的R1和為C13-C2。烷基的R2、具有N、0或S的取代基的 C13_C2。烷基、C13-C2。烯基或具有N、0或S的取代基的C13-C2。烯基。任選地，R2為C13烷基。 2 還提供適合于檢測溶酶體貯積癥存在或不存在或僅檢測包括式III結構的酶存 在或不存在的底物： 3
[0018] 其中A為單糖或二糖；B1為：CfC2。烷基；含雜原子的C「C2。烷基、C2_C2。烯基；含 雜原子的C2-C2。烯基；和經取代或未經取代C6-C2。芳基；R1'為經取代或未經取代C或N;R2'為經取代或未經取代C、經取代或未經取代N、0或S;R~為經取代或未經取代C、N或 0 ;R~不存在、為經取代或未經取代Q-CpO或S為：C 烷基；含雜原子的Ci-C7烷基； 具有N、0或S的取代基的烷基；C2-C7烯基；含雜原子的C2-C7烯基；具有N、0或S的 取代基的(：2-(：7烯基；R~不存在、為經取代或未經取代(^-(：2;0或S;且R~為。烷基、 含雜原子的。烷基；具有N、0或S的取代基的C「C2。烷基；C4-C2。醚；C「C2。酯；C「(：2。烯 基；含雜原子的。烯基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。烯基；C6-C2。芳基；和含有N、0 或S的雜原子的C6-C2。雜環(huán)。A任選地為醛己糖或酮己糖，任選地通過和α或β糖苷鍵連 接到分子的其余部分。任選地，Α為D-葡萄糖或D-半乳糖。在一些實施例中，根據(jù)式III 的底物為：
[0019] f其中為經取代或未經取代C或經取代或未經取代N; 、?
[0020]
[0021]
中R2"為Η或甲基且R2"'為Η或甲基；或
[0022；
其中R3'為經取代或未經取代C;且
[0023] W不存在、為經取代或未經取代(^-(：2、0或S。
[0024] 應了解，在以上或另外包括本發(fā)明的底物的各者中的任一個中，A任選地為醛己糖 或酮己糖，任選地通過和α或β糖苷鍵連接到分子的其余部分。任選地，A為D-葡萄糖 或D-半乳糖。
[0025] 在一些實施例中，根據(jù)式III的底物包括：
[0026]
?中^為經取代或未經取代C或經取代或未經取代N;且 為CfC2。烷基、含雜原子的C廠(：2。烷基；具有N、0或S的取代基的C廠(：2。烷基；C4-C2。醚； 。酯；Ci-C2。烯基；含雜原子的C「C2。烯基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。烯基；C6-C2。 芳基；和含有N、0或S的雜原子的C6-C2。雜環(huán)；
[0027]其中為經取代或未經取代C或經取代或未經取代
? N;R2為C13-C2。烷基、含雜原子的C13-C2。烷基、具有N、0或S的取代基的C13-C2。烷基；C13-C2。 烯基、含雜原子的C13-C2。烯基；或具有N、0或S的取代基的C13-C2。烯基；或
[0028]
中R2為c13-c2。烷基、含雜原子的C13-c2。烷基、具有 N、0或S的取代基的C13-C2。烷基；C13-C2。烯基、含雜原子的C13-C2。烯基；或具有N、0或S的 取代基的C13-C2。烯基。在以上或另外包括本發(fā)明的底物的各者中的任一個中，A任選地為 醛己糖或酮己糖，任選地通過和0或β糖苷鍵連接到分子的其余部分。任選地，A為D-葡 萄糖或D-半乳糖。
[0029] 還提供包括以下的底物：
[0030]
其中η為0、1、2、3、4或5。A任選地為醛己 糖或酮己糖，任選地通過和α或β糖苷鍵連接到分子的其余部分。任選地，A為D-葡萄 糖或D-半乳糖。
[0031] 本發(fā)明的底物中的任一個任選地包括元素或其它標簽的穩(wěn)定次普遍同位素。在一 些實施例中，穩(wěn)定次普遍同位素在每次出現(xiàn)時選自由以下組成的群組： 2h、13c、15n、17o、1so、 31P或 34S。
[0032] 本發(fā)明的另一目標為提供可以具有酶功能的抑制劑、用于檢測酶活性的方法的內 標或治療劑形式使用的分子。此類分子任選地包括式V結構：
[0033]
[0034] 其中B1選自由以下組成的群組。烷基；含雜原子的C「C2。烷基、C2_C2。烯基； 含雜原子的C2_C2。烯基、經取代或未經取代C6_C2。芳基；B2選自由以下組成的群組：(：2_(：7氨 基甲酸酯；c2-c7酰胺基、c2-c7酯、c2-c7脲基；c2-c7氨甲酰基；c2-c7羰基；CfC7烷基；含雜原 子的Ci-Q烷基；具有N、0或S的取代基的Ci-C7烷基；C2-C7烯基；含雜原子的C2-C7烯基； 具有N、0或S的取代基的c2-c7烯基；且B3選自由以下組成的群組：C「C2。烷基、含雜原子 的C「C2。烷基；具有N、0或S的取代基的C「C2。烷基；C4-C2。醚；C「C2。酯；C「C2。烯基；含雜 原子的。烯基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。烯基；C「C2。炔基；含雜原子的C「(：2。炔 基；具有N、0或S的取代基的C2-C2。炔基C6-C2。芳基；和含有N、0或S的雜原子的C6-(：2。雜 環(huán)。在一些實施例中，B1為亞甲基。任選地，B2*C2-C7_胺基。任選地，B3為具有N、0或 S的取代基的C2-Cjf基。在一些實施例中，B1為亞甲基，B2為C2-C7酰胺基，且B3為具有 以羥基形式存在的〇的取代基的C13-C2。烯基。
[0035] 本發(fā)明的分子中的任一個任選地包括元素或其它標簽的穩(wěn)定次普遍同位素。在一 些實施例中，穩(wěn)定次普遍同位素在每次出現(xiàn)時選自由以下組成的群組： 2H、13C、15N、170、1S0、 31P或 34S。
[0036] 還提供檢測酶的存在、不存在或含量以檢測受試者中存在或不存在酶缺乏的方 法。酶任選地為所述酶的缺乏導致溶酶體貯積癥的酶。在檢測酶的存在、不存在或含量的 方法中使用式I-VI的組合物允許來自水性溶劑系統(tǒng)中的酶的提高的可溶性的檢定結果的 提高的可信度。檢測酶活性的方法包括在其中目標酶能夠作用于底物以產生酶促產物的條 件下接觸含有目標酶的樣品與任一本文所述的底物或其等效物；和檢測酶促產物。任選地， 所述目標酶為酸性β-葡糖腦苷脂酶且所述底物具有式I，其中所述B2為C2-C7酰胺基，且 B3為具有N、0或S的取代基的C2-C2。烯基。任選地，目標酶為酸性半乳糖腦苷脂β-半乳 糖苷酶或酸性β-葡糖腦苷脂酶且所述其中Β2為C2-C7酰胺基，且Β3為具有以羥基形式存 在的〇的取代基的c13-c2。。
[0037] 任選地，用于檢測酶活性的方法中的底物為以下中的任何一個或多個的底物：化 合物1至80,任選地1或7,或其任何組合。任選地，方法包括在接觸步驟期間或之后添加 內標到反應溶液中。此類內標任選地為任何組合物81-86的標準物。
[0038] 檢測步驟任選地通過質譜，任選地通過多反應監(jiān)測，如在MS/MS中。檢測步