融合蛋白酶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白表達(dá)和蛋白化學(xué)的技術(shù)領(lǐng)域，其中由融合蛋白釋放成熟蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 重組蛋白技術(shù)使得能夠生產(chǎn)大量的可用于其生物活性的所需蛋白。這種蛋白通常 表達(dá)為微生物宿主細(xì)胞中的重組融合蛋白。成熟蛋白（目標(biāo)蛋白）通常與融合伙伴蛋白或 較小的氨基酸延伸連接，以便提高表達(dá)水平、提高溶解性、促進(jìn)蛋白折疊或促進(jìn)純化和下游 加工。
[0003] 對于維持蛋白的完整生物活性以及藥物調(diào)節(jié)目的，由融合蛋白除去融合伙伴蛋白 以釋放具有天然N-和C-末端的成熟蛋白可能是關(guān)鍵的。
[0004] 目前，少數(shù)可用于由融合蛋白除去融合伙伴蛋白的蛋白酶可用作用于工業(yè)用途的 經(jīng)濟(jì)上可持續(xù)的酶，該蛋白酶在釋放的成熟靶蛋白中留下天然N-末端。
[0005] -種這樣的酶是腸激酶，然而，其缺少特異性而難以廣泛應(yīng)用。其它的這樣的酶有 因子Xa、胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、凝血酶、TEV或鼻病毒3C蛋白酶，它們均要么缺少特異性， 因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白包含內(nèi)部二次切割位點(diǎn)，要么在成熟蛋白的C-或N-末端留下氨基酸延伸。
[0006] Waugh,ProteinExpr.Purif. 80:283-293 (2011)公開了用于除去親和標(biāo)簽的 酶試劑的綜述。
[0007] W092/10576公開了在藥物制劑中使用具有DPPIV可切割的延伸肽部分的融合蛋 白。
[0008] Xin,ProteinExpr.Purif. 2002，24，pp530_538 公開了用于由重組蛋白除去 N-末端Pro-Pro的來自乳酸乳球菌（Zaciococci/6·Jaciis)的X-脯氨?；幕彪拿冈?大腸桿菌（fecAericAiacoJi)中的克隆、表達(dá)以及應(yīng)用。
[0009] Billow,TIBTECH9:226-231(1991)公開了一種通過基因融合來制備雙功能酶的 方法。
[0010] Seo,Appl.Environ.Microbiol. 2000，66，pp2484_2490 公開了 一種海藻 糖-6-磷酸合酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酶的雙功能融合酶。
[0011] 在制藥工業(yè)，蛋白藥物目前構(gòu)成競爭市場的相當(dāng)部分，因此，需要大規(guī)模制造這些 蛋白藥物的高效方法。融合蛋白的工業(yè)用途的關(guān)鍵問題仍然是由融合蛋白除去融合蛋白伙 伴以釋放完整的成熟蛋白。
[0012] 因此，需要一種工業(yè)方法，其特異性地除去融合伙伴蛋白，而不成熟蛋白中具有內(nèi) 部切割位點(diǎn)，且不在成熟蛋白上留下任何氨基酸延伸。優(yōu)選地，該融合伙伴蛋白的除去是使 用在工業(yè)方法中容易制備的僅單一酶進(jìn)行。同樣需要這樣的方法，其可在溫和的加工條件 下對眾多不同的蛋白起到該作用，以防止非計(jì)劃的成熟蛋白的化學(xué)和物理變化。
[0013] 概述 本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種用于由融合蛋白提供成熟蛋白的簡單的一步方法。
[0014] 小RNA病毒3C蛋白酶和Xaa-Pro-二肽基氨肽酶（XaaProDAP)均是非常特異的酶， 其表現(xiàn)出被發(fā)現(xiàn)可用于制造蛋白藥物的互補(bǔ)活性。然而，作為蛋白水解酶，它們還引起在融 合成為一種雙功能融合蛋白酶時(shí)自我切割方面的問題。
[0015] 由于兩種酶物理上靠近并因此副反應(yīng)更少，在融合蛋白酶中組合兩種酶可具有有 利的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的優(yōu)點(diǎn)。在融合蛋白酶中組合兩種酶還具有的優(yōu)點(diǎn)是，僅需要提供和使用 一種試劑。由于尺寸更大，融合蛋白酶也可容易地通過簡單的凝膠過濾方法由成熟蛋白中 除去。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種雙功能融合蛋白酶，其包含小RNA病毒3C蛋白 酶和XaaProDAP的催化結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙功能融合蛋白酶包含小RNA病毒3C 蛋白酶和XaaProDAP。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種雙功能融合蛋白酶，其包含下式的蛋白： X-Y-Z(I)或Z-Y-X(II) 其中 X是小RNA病毒3C蛋白酶或其功能變體； Y是任選的接頭； Z是Xaa-Pro-二肽基氨肽酶（XaaProDAP)或其功能變體； 其中所述融合蛋白酶實(shí)質(zhì)上不具有能夠損害兩種蛋白水解活性中的至少一種的自我 切割活性。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙功能融合蛋白酶具有式（I)，即所述小RNA病毒3C 蛋白酶或其功能變體位于所述雙功能融合蛋白酶的N-末端部分。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，X是人鼻病毒14型3C蛋白酶（HRV14 3C)或其功能變體。
[0020] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，Z是E.C. 3. 4. 14. 11酶或其功能變體。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種制備本發(fā)明的雙功能融合蛋白酶的方法，其包 括在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)包含雙功能融合蛋白酶的蛋白和隨后分尚雙功能融合蛋白酶。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方案中，制備雙功能融合蛋白酶的方法包括大腸桿菌作為所述宿主細(xì) 胞。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供本發(fā)明的雙功能融合蛋白酶用于由較大的肽或蛋白 除去N-末端肽或蛋白的用途。
[0024] 附圖簡述 圖1顯示純化的雙功能HRV14-XaaProDAP融合蛋白酶（蛋白酶20986)的還原SDS-PAGE。泳道1:蛋白標(biāo)志物。數(shù)字表示以kDa計(jì)的大小。泳道2:純化的蛋白酶20986。
[0025] 圖2顯示在使用1:20摩爾的酶與底物比與蛋白酶20986于37°C孵育3小時(shí)（反 應(yīng)1)后RL27_EVLFQGP_PYY(3-36)的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。Y-軸：相對 強(qiáng)度。
[0026] 圖3顯示在使用1:40摩爾的酶與底物比與蛋白酶20986于37°C孵育3小時(shí)（反 應(yīng)2)后RL27_EVLFQGP_PYY(3-36)的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。Y-軸：相對 強(qiáng)度。
[0027] 圖4顯示在使用1:20摩爾的酶與底物比與RL9-HRV14 3C蛋白酶于37°C孵育3 小時(shí)（反應(yīng)3)后RL27_EVLFQGP_PYY(3-36)的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。 Y-軸：相對強(qiáng)度。
[0028] 圖5顯示在使用1:40摩爾的酶與底物比與RL9-HRV14 3C蛋白酶于37°C孵育3 小時(shí)（反應(yīng)4)后RL27_EVLFQGP_PYY(3-36)的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。 Y-軸：相對強(qiáng)度。
[0029] 圖6顯示在使用1:500摩爾的酶與底物比與蛋白酶20986于4°C孵育過夜（反應(yīng) 12) 后RL27_EVLFQGP_胰高血糖素的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。Y-軸：相對 強(qiáng)度。
[0030] 圖7顯示在使用1:100摩爾的酶與底物比與蛋白酶28994于4°C孵育過夜（反應(yīng) 13) 后RL27_EVLFQGP_胰高血糖素的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。Y-軸：相對 強(qiáng)度。
[0031] 圖8顯示在使用1:500摩爾的酶與底物比與蛋白酶28996于4°C孵育過夜（反應(yīng) 16) 后RL27_EVLFQGP_胰高血糖素的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。Y-軸：相對 強(qiáng)度。
[0032] 圖9顯示在使用1:500摩爾的酶與底物比與蛋白酶28997于4°C孵育過夜（反應(yīng) 17) 后RL27_EVLFQGP_胰高血糖素的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。Y-軸：相對 強(qiáng)度。
[0033] 圖10顯示在使用1:20摩爾的酶與底物比與RL9-HRV14 3C蛋白酶于4°C孵育過 夜（反應(yīng)18,對照）后RL27_EVLFQGP_胰高血糖素的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷 比。Y-軸：相對強(qiáng)度。
[0034] 圖11顯示在使用1:500摩爾的酶與底物比與蛋白酶20986于4°C孵育過夜（反 應(yīng)20)后RL27_EVLFQGP_GLP-1 (7-37，K34R)的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。 Y-軸：相對強(qiáng)度。
[0035] 圖12顯示在使用1:100摩爾的酶與底物比與蛋白酶28994于4°C孵育過夜（反 應(yīng)21)后RL27_EVLFQGP_GLP-1 (7-37，K34R)的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。 Y-軸：相對強(qiáng)度。
[0036] 圖13顯示在使用1:100摩爾的酶與底物比與蛋白酶28996于4°C孵育過夜（反 應(yīng)23)后RL27_EVLFQGP_GLP-1 (7-37，K34R)的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。 Y-軸：相對強(qiáng)度。
[0037] 圖14顯示在使用1:100摩爾的酶與底物比與蛋白酶28997于4°C孵育過夜（反 應(yīng)25)后RL27_EVLFQGP_GLP-1 (7-37，K34R)的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷比。 Y-軸：相對強(qiáng)度。
[0038] 圖15顯示在使用1:20摩爾的酶與底物比與RL9-HRV14 3C蛋白酶于4°C孵育過夜 (反應(yīng)27)后RL27_EVLFQGP_GLP-1 (7-37，K34R)的去卷積質(zhì)譜。X-軸：以Da計(jì)的質(zhì)/荷 比。Y-軸：相對強(qiáng)度。
[0039] 描述 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種雙功能融合酶，其包含小RNA病毒3C蛋白酶和XaaProDAP的催化結(jié)構(gòu)域。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種雙功能融合蛋白酶，其包含下式的蛋白： X-Y-Z(I)或Z-Y-X(II) 其中 X是小RNA病毒3C蛋白酶或其功能變體； Y是任選的接頭； Z是Xaa-Pro-二肽基氨肽酶（XaaProDAP)或其功能變體； 其中所述融合蛋白酶實(shí)質(zhì)上不具有能夠損害兩種蛋白水解活性中的至少一種的自我 切割活性。
[0041] 本發(fā)明的方法提供優(yōu)于以前描述的用于由融合蛋白釋放成熟蛋白的方法的許多 優(yōu)點(diǎn)。例如，已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，可獲得非常特異性的融合蛋白水解，從而在沒有或具有最 低水平的相關(guān)雜質(zhì)的情況下以高產(chǎn)率釋放具有正確的天然N-末端氨基酸的成熟蛋白。存 在任何相關(guān)雜質(zhì)（即以具有化學(xué)結(jié)構(gòu)的有限差異的方式與成熟蛋白類似的蛋白）顯然是不 合乎需要的，因?yàn)樵谥圃爝^程中難以將它們除去，因此是昂貴的。另外的實(shí)施方案具有下述 優(yōu)點(diǎn)：使得能夠在具有低溫的反應(yīng)條件下由融合蛋白釋放成熟蛋白。
[0042] 還已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的雙功能融合蛋白酶可通過在大腸桿菌中重組表達(dá) 來制備。通常，難以在不引起問題的情況下在大腸桿菌中表達(dá)大的蛋白。然而，本發(fā)明的雙 功能融合蛋白酶可通過在大腸桿菌中重組表達(dá)來制備，如在公開的本發(fā)明實(shí)施例中所示。
[0043] 本發(fā)明人旨在提供一種融合蛋白酶，其包含功能性XaaProDAP和功能性小RNA病 毒3C蛋白酶。這樣的雙功能融合蛋白酶應(yīng)當(dāng)能夠在微生物中表達(dá)，且應(yīng)當(dāng)在表達(dá)、純化以 及用于由融合蛋白釋放成熟蛋白期間穩(wěn)定。在制備該雙功能融合蛋白酶期間，遇到了許多 技術(shù)挑戰(zhàn)。首先，發(fā)現(xiàn)HRV14 3C由HRV14 3C-XaaProDAP融合蛋白酶切割自身，從而融 合蛋白酶不穩(wěn)定。其次，HRV14 3C還在來自乳酸乳球菌的XaaProDAP中在不被識(shí)別為典型 的HRV14 3C切割位點(diǎn)內(nèi)部切割HRV14 3C-XaaProDAP融合蛋白酶。這也使融合蛋白酶 不穩(wěn)定。再次，當(dāng)XaaProDAP位于融合蛋白酶的C-末端時(shí)，來自乳酸乳球菌的XaaProDAP 可由HRV14 3C-XaaProDAP融合蛋白酶的N-末端除去二肽。因此，第一融合蛋白酶表現(xiàn) 出在三個(gè)不同位點(diǎn)的自我切割，如果雙功能融合蛋白酶的表達(dá)、純化、催化功能、穩(wěn)定性或 它們的組合是原因，那么導(dǎo)致沒有活性和待解決的挑戰(zhàn)性任務(wù)。
[0044] 在設(shè)計(jì)本發(fā)明的雙功能融合蛋白酶時(shí)，可進(jìn)行下述步驟： a)提供不具有蛋白表面上可用的QG子序列的XaaProDAP或功能變體，b)提供小RNA病毒3C蛋白酶或其功能變體，其若是位于雙功能融合蛋白酶的N-末端 則不在其N-末端具有XaaProDAP切割位點(diǎn)，且不具有使其能夠通過在其C-末端的切割而 切除自身的切割位點(diǎn)，和 c)將XaaProDAP和小RNA病毒3C蛋白酶經(jīng)由任選的氨基酸接頭序列連接，從而構(gòu)成 可由單一核酸序列表達(dá)的雙功能融合蛋白酶。
[0045] 應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語多肽、肽和蛋白在當(dāng)前語境中可互換使用。同樣，根據(jù)IUPAC命名 法將氨基酸縮寫為單字母或三字母名稱。
[0046] 本發(fā)明的雙功能融合蛋白酶優(yōu)選表現(xiàn)出在低溫（例如2-10°C或2_15°C)的充分 的活性，因?yàn)閺墓I(yè)制造觀點(diǎn)來看這是所需的，例如由于在非無菌工藝條件下控制微生物 活性。
[0047] 本文所用的"Xaa-Pro二肽基氨肽酶"（"XaaProDAP"）旨在意指具有Xaa-Pro 二肽特異性的二肽酶活性的酶，即易切斷的鍵連接Xaa-Pro二肽的C-末端與目標(biāo)肽或 蛋白的N-末端。根據(jù)國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)學(xué)會(huì)（IUBMB)酶命名法，將XaaProDAP 分類為來自肽酶家族S15的酶EC3.4. 14. 11和來自肽酶家族S9B的酶EC3.4. 14. 5。XaaProDAP的非限制性實(shí)例有來自哺乳動(dòng)物的二肽基-肽酶IV(DPP-IV)。XaaProDAP的 其他非限制性實(shí)例有來自細(xì)胞的Xaa-脯氨?；幕彪拿?，例如來自乳酸乳球菌、嗜熱 鏈球菌德氏乳桿菌（ZacioAaciUiA?ofe及和豬 鏈球菌si/is)。來自乳酸乳球菌乳脂亞種（Zaciococci/61 crevmris) 的Xaa-脯氨酰基二肽基氨肽酶具有下述序列： MRFNHFSIVDKNFDEQLAELDQLGFRffSVFWDEKKILKDFLIQSPTDMTVLQANTELDVIEFLKSSIELDW EIFWNITLQLLDFVPNFDFEIGKATEFAKKLNLPQRDVEMTTETIISAFYYLLCSRRKSGMILVEHWVSEGLLPLD NHYHFFNDKSLATFDSSLLEREVVWVESPVDTEQKGKNDLIKIQIIRPKSTEKLPVVITASPYHLGINEKANDLALH EMNVDLEKKDSHKIHVQGKLPQKRPSETKELPIVDKAPYRFTHGWTYSLNDYFLTRGFASIYVAGVGTRGSNGFQTS ⑶YQQIYSMTAVIDWLNGRTRAYTSRKKTHEIKATWANGKVAMTGKSYLGTMAYGAATTGVDGLEVILAEAGISSWY NYYRENGLVRSPGGFPGEDLDVLAALTYSRNLDGADYLKGNDEYEKRLAEMTTALDRKSGDYNQFWHDRNYLINSDQ VRADVLIVHGLQDWNVTPEQAYNFWQALPEGHAKHAFLHRGAHIYMNSWQSIDFSETINAYFSAKLLDRDLNLNLPP VILQENSKEQVWSAVSKFGGDDQLKLPLGKTAVSFAQFDNHYDDESFKKYSKDFNVFKKDLFENKANEAVIDLELPS ELTINGPIELEIRLKLNDSKGLLSAQILDFGPKKRLEDKARVKDFKVLDRGRNFMLDDLVELPLVESPYQLVTKGFT NLQNKDLLTVSDLKADEWFTLKFELQPTIYHLEKADKLRVILYSTDFEHTVRDNRKVTYEIDLSQSKLIIPIESVKK (SEQIDNO: 1)〇
[0048] XaaProDAP可以是在例如細(xì)菌或哺乳動(dòng)物中天然存在的酶，但是其也可以是這樣 的酶的功能變體。功能變體的非限制性實(shí)例有天然存在的XaaProDAP的類似物、延伸或截 短形式，該功能變體保留Xaa-Pro二肽特異性的二肽酶活性。
[0049] 小RNA病毒3C蛋白酶（或蛋白3C、Picornian3C或小RNA病毒3C)是一組具有 絲氨酸蛋白酶樣折疊的半胱氨酸蛋白酶，其負(fù)責(zé)在小RNA病毒科病毒中由前體多蛋白產(chǎn)生 成熟的病毒蛋白。
[0050] 本文所用的"小RNA病毒