專利名稱：靶向性白細(xì)胞介素融合蛋白及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體涉及白細(xì)胞介素融合蛋白及其制備和其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)治療癌癥的方法有手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療和激素治療等。近年來，開發(fā)選擇性作用于特定靶點的高效、低毒、特異性強的抗腫瘤分子靶向藥物已成為重要研究開發(fā)方向。腫瘤免疫治療已成為最活躍的抗腫瘤靶向研究領(lǐng)域之一，單克隆抗體、細(xì)胞過繼免疫治療、腫瘤疫苗、細(xì)胞因子治療已顯示出與傳統(tǒng)療法的互補性。白細(xì)胞介素2(IL_2)是本領(lǐng)域熟知的一種白細(xì)胞介素，發(fā)現(xiàn)于1976年，Morgan等人用植物的血球凝集素刺激正常的人淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可以產(chǎn)生一種能選擇性促進(jìn)T淋巴細(xì)胞生長的細(xì)胞因子，它必須和IL-2受體結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。IL-2是多種生物功能細(xì)胞因子，可刺激細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞分化、激活細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞的非特異性殺傷功能，也能增強B淋巴細(xì)胞的抗體分泌和增殖。因此臨床上也主要用于免疫佐劑調(diào)動機(jī)體的系統(tǒng)免疫，達(dá)到輔助治療控制腫瘤的目的。作為第一個被分離純化的白細(xì)胞介素分子，80年代美國Cetus公司開發(fā)人源重組 IL-2用于治療癌癥，直至1993年，IL-2被FDA批準(zhǔn)用于治療腎癌和黑色素瘤；目前IL-2也被批準(zhǔn)大劑量用于治療HIV。臨床試驗表明IL-2單藥治療癌癥的有效率低，副作用大。高劑量治療黑色素瘤的客觀有效率為5-27%，其中只有0-4%的病人病情完全緩解。IL-2的副作用大，病人產(chǎn)生體液儲留、腹瀉、血壓過低等一系列反應(yīng)，小部分患者死亡，這些毒副作用多與IL-2引發(fā)非治療病灶的全身其他組織免疫過度反應(yīng)有關(guān)。 針對于IL-2臨床使用的局限，目前IL-2蛋白質(zhì)藥物研究主要方向是減小藥物副作用、提高藥效、延長藥物半衰期。策略主要包括IL-2的聚乙二醇(PEG)修飾、與人血清白蛋白(HSA)融合延長半衰期，糖基化修飾提高IL-2穩(wěn)定性，與單克隆抗體融合將藥物靶向到特定靶點(如腫瘤細(xì)胞)，與其他蛋白(如免疫調(diào)節(jié)因子)融合產(chǎn)生藥物聯(lián)用效果等。在臨床實驗中，PEG修飾的IL-2與IL-2相比，并沒有顯著改善半衰期和有效率，至今未被FDA批準(zhǔn)用于癌癥治療。Human GenomeSciences公司開發(fā)了 HSA-IL-2融合蛋白 Albuleukin，靜脈注射Albuleukin的血漿半衰期從IL-2的19分鐘提高到6小時，目前已進(jìn)入二期臨床實驗。天然IL-2的第三位Thr是被糖基修飾的，目前IL-2的糖基化地手段分為真核細(xì)胞表達(dá)、以及合成的糖基化短肽和IL-2蛋白連接兩種策略，Symansis公司用人293細(xì)胞表達(dá)hcxIL-2已經(jīng)在市面上出售，國內(nèi)有若干個實驗室都開發(fā)酵母表達(dá)糖基化的IL-2，目前還處于開發(fā)階段。目前默克公司將抗神經(jīng)節(jié)苷脂⑶2的C端融合IL-2的抗體藥物EMD273066(hul4. 18-IL-2)用于治療黑色素瘤已經(jīng)完成I期臨床，結(jié)果表明33例病人中，8例病情穩(wěn)定。無4級毒性反應(yīng)(死亡)發(fā)生，但仍發(fā)現(xiàn)有低血壓、組織缺氧等3級毒性反應(yīng)。此外也有將IL-2融于其他抗體(如anti-her2antibody，anti-her3，IgG3等) 的研究，以增強IL-2誘導(dǎo)的T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞殺傷特異性。其他IL-2融合蛋白藥物，如Aerolysin-IL-2, IL-6-IL-2，GCSF-IL-2、重組人α胸腺素原-白介素2等，產(chǎn)生藥物聯(lián)用的效果。對于與生物大分子耦聯(lián)/融合的白介素_2可能存在的問題是，雖然半衰期延長但藥物分子量的成倍增加使其更難于穿過生理屏障到達(dá)靶組織，尤其對大型實體瘤的浸潤性差，使其難于穿過生理屏障到達(dá)腫瘤部位。靶向藥物的特異性和親和性不高會造成靶向藥物在到達(dá)靶組織以前損傷正常細(xì)胞，消耗了藥效。針對上述問題，首先要選擇特異性高的腫瘤抗原為靶點，另外還要通過蛋白質(zhì)工程對靶向藥物進(jìn)行合理設(shè)計，減小分子質(zhì)量，提高親和力和特異性，增加藥物在腫瘤組織的濃度和減少在正常組織的分布，減少對正常細(xì)胞的毒副作用?？梢赃x擇主要靶向于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的靶向短肽及非抗體蛋白，其中有針對腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面分子氨基肽酶N的NGR和整聯(lián)蛋白(integrins α ν β 3)的R⑶。某些利用上述的相關(guān)靶向肽的開發(fā)藥物，已經(jīng)成功進(jìn)入臨床實驗。如Modmed公司開發(fā)ARENEGYR就為NGR融合腫瘤壞死因子(NGR-hTNFa )，用于治療直腸癌、肝癌、間皮瘤已經(jīng)進(jìn)入II期臨床。GE公司開發(fā)用于腫瘤診斷的藥物18F-AH111585(放射性標(biāo)記的RGD)也進(jìn)入一期臨床。生長抑素(Somatostatin，SST)及生長抑素類似物如伐普肽(Vapreotide)和蘭瑞肽(Lanreotide)等作為單藥已經(jīng)分別成功用于心血管疾病(腦血栓等)和類癌、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤等的臨床治療。生長抑素受體(SSTR)發(fā)現(xiàn)表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞，這些研究充分支持了靶向肽選擇的合理性和可行性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靶向性白介素融合蛋白，該融合蛋白能夠特異性結(jié)合某些細(xì)胞特別是腫瘤組織細(xì)胞或其新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，顯著的增加白細(xì)胞介素在靶向組織的濃度，降低其在其他組織的濃度，從而提高治療效果，降低毒副作用。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種融合蛋白，從N端至C端包括(1)特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向結(jié)合區(qū)；(2)白細(xì)胞介素。根據(jù)情況，本發(fā)明所述融合蛋白可有不多于10個氨基酸組成的連接區(qū)，用于連接所述靶向結(jié)合區(qū)和白細(xì)胞介素。在本發(fā)明的一個實施方案中，連接區(qū)有三個氨基酸甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-(GGS)，在另一個實施例中有6個氨基酸甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸_絲氨酸(GGSGGS)。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述融合蛋白中白細(xì)胞介素為人源白細(xì)胞介素2，具有如SEQ ID NO 1的氨基酸序列。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述融合蛋白中靶向結(jié)合區(qū)為人源氨基酸序列。更優(yōu)選地，所述靶向結(jié)合區(qū)與生長抑素同源，所述靶向結(jié)合區(qū)的氨基酸序列與生長抑素同源性不低于60%。在具體實施方式
中，本發(fā)明具體提供一種融合蛋白，其靶向結(jié)合區(qū)的氨基酸序列為FCYWKSCT，如SEQ ID NO 2所示，或為SEQ IDN0. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少有80%的一致性，且具有特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。 在一種實施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白中靶向結(jié)合區(qū)可以是包括不少于3個但不多于50個氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選的序列含有生長抑素同源的不多于15個氨基酸序列，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白的靶向結(jié)合區(qū)含有如SEQ ID N0:2所述的氨基酸序列，其N末端可帶有大腸桿菌表達(dá)的起始密碼子翻譯的甲硫氨酸，在翻譯過程中可能被不均一切除。作為優(yōu)選，將如SEQ ID NO :2所示的靶向結(jié)合區(qū)中酪氨酸由任一含苯環(huán)或雜環(huán)的氨基酸替換，優(yōu)選替換為苯丙氨酸或色氨酸，不影響其靶向性。作為優(yōu)選，將如SEQ ID NO :2所示的靶向結(jié)合區(qū)中絲氨酸由任一含有羥基的氨基酸替換或缺失，優(yōu)選替換為蘇氨酸，不影響其靶向性。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種具體的融合蛋白，含有如SEQ IDD NO 3 所述的氨基酸序列，記作SIL。為了使融合蛋白質(zhì)便于純化，可在氨基(N)末端或羧基(C) 末端連接上氨基酸標(biāo)簽，包括但不限于多聚組氨酸(Poly-His通常為6個組氨酸)、多聚精氨酸(Poly-Arg通常為5-6個精氨酸)等。本發(fā)明的另一方面也提供了編碼本發(fā)明所述融合蛋白的DNA分子。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼含有如SEQ IDD NO :3所述氨基酸序列的融合蛋白的DNA分子， 其核苷酸序列如SEQ IDD NO 4所示。為了生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白，編碼融合蛋白的DNA分子被整合至表達(dá)盒中，隨后表達(dá)盒被插入合適的表達(dá)載體。然后，這一表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或者動物用于重組蛋白表達(dá)。表達(dá)盒至少包括以下幾個內(nèi)容(1)轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，(2)可以編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子，該轉(zhuǎn)錄是在在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的調(diào)控下進(jìn)行的，以及(3)轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。根據(jù)用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞的不同，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄中止區(qū)可以是天然存在或者人工構(gòu)建的序列，該序列適合于真核或者原核細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄。此類序列在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知。適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄起始序列的DNA片與適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄中止區(qū)的DNA 片段與編碼融合蛋白的DNA片段相連接。這種連接方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知，比如，選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切以及連接。本發(fā)明進(jìn)一步提供重組了編碼本發(fā)明所述融合蛋白的DNA分子的表達(dá)載體以及表達(dá)所述融合蛋白的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動物。所述表達(dá)載體優(yōu)選質(zhì)?；虿《?。所述細(xì)胞可以是哺乳動物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，酵母或者細(xì)菌。轉(zhuǎn)基因動物可以是轉(zhuǎn)基因羊，牛，等等。在本發(fā)明的實施例中，具體提供一種重組了編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子的大腸桿菌，所述大腸桿菌于2010年5月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3867。另外，本發(fā)明也提供了所述融合蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟提供含有編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物，使該細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)所述融合蛋白以及分離所述融合蛋白。實驗表明，本發(fā)明所述融合蛋白可通過在腫瘤組織/部位激活NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞、 LAK細(xì)胞，提高免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，因此本發(fā)明還提供了所述融合蛋白的應(yīng)用，即用于治療細(xì)胞過度增生導(dǎo)致的疾病或制備治療細(xì)胞過度增生導(dǎo)致的疾病如癌癥的藥物中的用途。生物保藏說明分類命名大腸埃希氏菌，Escherichia coli.于2010年5月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 3867。


圖1示本發(fā)明所述融合蛋白結(jié)構(gòu)示意圖。A 靶向結(jié)合區(qū)；B :連接區(qū)；C 人源白細(xì)胞介素2。圖2示本發(fā)明所述融合蛋白SIL表達(dá)與純化后的SDS-PAGE鑒定結(jié)果。泳道1 分子量 Marker ；從上至下依次為 97. OkDa,66. OkDa,45. OkDa,30. OkDa, 20.lkDa、14. 4kDa。泳道2 表達(dá)融合蛋白的宿主菌裂解物；

泳道3 最終洗滌的包涵體；泳道4:經(jīng)Ni Sepharose High Performance親合純化的目的蛋白。圖3示本發(fā)明所述融合蛋白SIL復(fù)性的SDS-PAGE結(jié)果。A 15% SDS-PAGE 分析，0 非還原電泳；M 分子量 Marker，從上至下依次為 97. OkDa,66. OkDa,43. OkDa,30. OkDa, 20.lkDa、14. 4kDa ；R SIL還原電泳；圖4示本發(fā)明所述融合蛋白SIL碳18反相高效液相分析圖(C18RP-HPLC)，層析柱Z0RBA 300SB-C185um,4. 6*250mm ；檢測波長280nm ；純度96. 7%。圖5本發(fā)明所述融合蛋白SIL體外靶向結(jié)合實驗結(jié)果。圖6示本發(fā)明所述融合蛋白SIL結(jié)合不同靶細(xì)胞后對CTLL-2細(xì)胞增殖率影響。圖7示本發(fā)明所述融合蛋白SIL高劑量與低劑量與IL-2體內(nèi)抗腫瘤實驗對比結(jié)^ ο圖8示本發(fā)明所述融合蛋白SIL與IL-2對接種H22昆明小鼠生命延長率對比。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種白細(xì)胞介素融合蛋白及其制備和其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的產(chǎn)品、方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。依照本發(fā)明，一種靶向性的白細(xì)胞介素的融合蛋白，從N端至C端包括(1)特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向結(jié)合區(qū)；(2)根據(jù)情況可有一不多于10個氨基酸的連接區(qū)；(3)白細(xì)胞介素氨基酸序列在一種實施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白中靶向結(jié)合區(qū)可以是包括不少于3個但不多于50個氨基酸的氨基酸序列，優(yōu)選的序列含有生長抑素同源的不多于15個氨基酸序列，在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白的靶向結(jié)合區(qū)含有如SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列，其中N端可帶有大腸桿菌表達(dá)的起始密碼子翻譯的甲硫氨酸，在翻譯過程中可能被不均一切除；作為優(yōu)選，將如SEQ ID NO :2所示靶向結(jié)合區(qū)中酪氨酸由任一含有苯環(huán)或雜環(huán)的氨基酸替換，優(yōu)選苯丙氨酸或色氨酸，不影響其靶向性。作為優(yōu)選，將如SEQ ID NO :2所示靶向結(jié)合區(qū)中酪氨酸由任一含有羥基的氨基酸替換或缺失，優(yōu)選為蘇氨酸，不影響其靶向性。本發(fā)明所述融合蛋白的靶向結(jié)合區(qū)和白細(xì)胞介素可以直接由肽鍵或由連接區(qū)連接到一起。視需要而定，連接區(qū)可以有2至10個氨基酸連接靶向結(jié)合區(qū)與白細(xì)胞介素2在一個實施方案中，連接區(qū)有三個氨基酸甘氨酸_甘氨酸_絲氨酸_ (GGS)，在另一個實施例中有6個氨基酸甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸(GGSGGS)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白含有如SEQ IDDNO 4所述的氨基酸序列，記作SIL。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述融合蛋白含有如SEQ IDDNO 3所述的氨基酸序列。本發(fā)明的另一方面也提供了編碼本發(fā)明上述的融合蛋白的DNA分子。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特定蛋白的核苷酸序列。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼含有如SEQ IDD NO :3所述氨基酸序列的融合蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ IDD N0:4所示。為了生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白，編碼融合蛋白的DNA分子被整合至表達(dá)盒中，隨后表達(dá)盒被插入合適的表達(dá)載體。然后，這一表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或者動物用于重組蛋白表達(dá)。表達(dá)盒至少包括以下幾個內(nèi)容⑴轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，(2)可以編碼本發(fā)明所述的融合蛋白的DNA分子，該轉(zhuǎn)錄是在在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的調(diào)控下進(jìn)行的，以及(3)轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。根據(jù)用于蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞的不同，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和轉(zhuǎn)錄中止區(qū)可以是天然存在或者人工構(gòu)建的序列，該序列適合于真核或者原核細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄。此類序列在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知。適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄起始序列的DNA片與適當(dāng)?shù)暮修D(zhuǎn)錄中止區(qū)的DNA 片段與編碼融合蛋白的DNA片段相連接。這種連接方法在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知，比如，選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切以及連接。表達(dá)盒可以被整合插入表達(dá)載體，隨后這一表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞或者動物。 一般情況下，表達(dá)載體還要包括復(fù)制起始序列，以及篩選標(biāo)記，例如，對于細(xì)菌的蛋白表達(dá)， 質(zhì)粒是一種很有用途的載體。本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)有很多種為人所熟知的可以用于此目的的質(zhì)粒載體，包括，但是不僅限于，pET15b、pET22b、pET25b、pET28b等等。如果通過酵母細(xì)胞來重組表達(dá)融合蛋白，酵母表達(dá)載體，比如pPIC9，pA0815，pPICZ等等，可以作為表達(dá)載體。如果通過哺乳動物細(xì)胞來進(jìn)行蛋白表達(dá)，也有很多合適的重組蛋白表達(dá)載體。用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)蛋白的表達(dá)載體包含的DNA序列，需要適合以同源重組方式整合插入宿主細(xì)胞染色體。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，比如pcDNA3. 1，pSI等等。對于通過動物來表達(dá)融合蛋白，用于生產(chǎn)含有表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因動物(轉(zhuǎn)基因羊，牛，等等)的技術(shù)手段，在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)已為人所熟知。比如PBLG等等，可以作為轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)的載體。
獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動物后，可在適合表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的條件下表達(dá)出融合蛋白。通過其理化性質(zhì)和其它特性的差別運用各種分離方法分離純化融合蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，例如常規(guī)的變性復(fù)性處理、離心、超聲破碎、超濾膜過濾、金屬親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、透析、高效液相層析等常規(guī)純化方法及這些方法的結(jié)合。本 發(fā)明所述融合蛋白通過在腫瘤組織/部位激活NK細(xì)胞、CTL細(xì)胞、LAK細(xì)胞等提高局部組織和/或器官免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細(xì)胞的能力。本發(fā)明的另一個方面還提供所述融合蛋白的醫(yī)藥用途，或可以生產(chǎn)用于治療一種疾病的藥物。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實施例1.用于表達(dá)本發(fā)明所述生長抑素同源靶向肽的白介素2融合蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建基于融合蛋白的N末端和N末端氨基酸序列以及待加入之N末端附加的靶向結(jié)合區(qū)氨基酸，設(shè)計并合成一對引物，并以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)從人肝臟cDNA文庫中擴(kuò)增得到編碼人白細(xì)胞介素2 (IL-2)的DNA序列，也可以直接合成編碼人白細(xì)胞介素2 (C125S) 的DNA序列作為模板，設(shè)計的一對引物為5上游引物CATATGTTCTGTTTCTGGAAGACGTGCACCGGCGGTAGCGCACCTAC (如 SEQ ID NO 5 所示)其中依次含有NdeI位點CATATG，包括24個核苷酸的靶向結(jié)合區(qū)編碼序列 TTCTGTTTCTGGAAGACGTGCACC，鏈接區(qū)序列GGCGGT以及其后的白細(xì)胞介素2退火序列 AGCGCACCTAC ；3 (下游)引物CAACACTGACTCACCATCACCATCACCATTGAAGCTT (如 SEQID NO 6 所示)其中依次含有退火序列CAACACTGACT、組氨酸標(biāo)簽序列CACCATCACCATCACCAT、 終止密碼子TGA及其后的HindIII位點。以NdeI和HindIII酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及pET25b空質(zhì)粒((工具酶皆購自 Takara公司，質(zhì)粒購自Novage公司)，上述酶切片段均以瓊脂糖凝膠回收相應(yīng)大小的片段， 用T4DNA連接酶連接各片段，所得的重組質(zhì)粒即為白細(xì)胞介素融合蛋白的表達(dá)載體，命名為pET-S-IL。融合蛋白結(jié)構(gòu)如圖1所示。首先將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-lBlue，在含有青霉素的培養(yǎng)基中保溫過夜后，挑選陽性菌落并從中大量制備DNA，經(jīng)DNA序列分析，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所
7J\ ο進(jìn)一步證實序列正確性后，將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到攜帶T7啟動子基因的感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen)中，即為表達(dá)相應(yīng)蛋白的工程菌，命名為SIL-BL21，該工程菌分類命名大腸埃希氏菌，Escherichia coli.于2010年5月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 3867。實施例2 本發(fā)明所述融合蛋白的表達(dá)與純化將重組質(zhì)粒pET-S-IL轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21克隆加在LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)(37 °C )，待細(xì)菌密度達(dá)到0D600 ^ 4-6，按接種量5_10 %進(jìn)行5L發(fā)酵罐培養(yǎng)，待0D600 10-20，向培養(yǎng)基中加入0. 5-11111異丙基-0-0-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，至誘導(dǎo)后0D600不再增加下罐，以10，OOOgX (15分鐘)離心收獲菌體。將收獲的菌體重懸于3M尿素IOOmM磷酸20mM Tris pH8. 0緩沖液(buffer)中， 室溫放置1小時，并將細(xì)胞超聲處理3次，20，OOOg離心收集包涵體。然后將包涵體溶解于 8M尿素IOOmM磷酸鈉50mM巰基乙醇Tris (pH 8. 0)緩沖中放置4小時，以20000g離心20 分鐘收集上清。將上清液上樣于用上述緩沖液預(yù)平衡過的Ni Sepharose HighPerformance (GE公司)親合柱，用8M尿素IOOmM磷酸鈉20mM咪唑緩沖液以pH 8. 0-4. 0進(jìn)行pH遞減洗脫， pH4. 0時得到純度大于90%的重組蛋白，如圖2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示。
將按上述方法從Ni+親合柱洗脫下來的含目的融合蛋白的洗脫物，按1 10的體積比迅速稀釋于含有3M尿素、IOOmM NaCl、20mMTris_HCl (pH 8. 0)、5mM還原態(tài)谷胱甘肽和 0. 05mM氧化態(tài)谷胱甘肽的溶液中以使蛋白質(zhì)重折疊(復(fù)性)。經(jīng)4度放置48小時后透析于PBS中，并用截留分子量為5000道爾頓的超濾膜濃縮，進(jìn)行蛋白純度分析，如圖3和圖4 所示。實施例3 本發(fā)明所述融合蛋白體外靶向性研究將人胃癌細(xì)胞SGC-7901、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231、人胰腺癌細(xì)胞PANC-I、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、人胚胎成纖維細(xì)胞M-20體外常規(guī)培養(yǎng)，消化離心，將上述細(xì)胞分別接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長至培養(yǎng)板70 % -80 %左右，加入不同濃度的白細(xì)胞介素2及本發(fā)明所述融合蛋白S-白介素2(SIL)樣品(終濃度分別為 2000U/ml、1000U/ml、500U/ml)，設(shè)PBS陰性對照組，加藥后作用約4h后棄上清，用PBS連續(xù)清洗三遍，沖洗干凈后加入無IL-2、密度20XlOVml的小鼠T淋巴細(xì)胞(CTLL-2)細(xì)胞lml， 過夜培養(yǎng)，第二天顯微鏡下觀察，待陰性對照孔CTLL-2細(xì)胞基本凋亡時，每孔加入5mg/ml 的四甲基噻唑藍(lán)(MTT)約IOOul，作用約4h，加入SDS-HCl裂解液過夜，酶標(biāo)儀570nm下測 OD值，計算CTLL-2增殖率。計算公式CTLL_2增殖率=(0D加藥組/OD空白組-1) X 100%結(jié)果表明無靶向結(jié)合區(qū)的白細(xì)胞介素2(IL_2)與人胃癌細(xì)胞(SGC-7901)不結(jié)合，SIL能與之結(jié)合且呈劑量相關(guān)性，MTT顯色結(jié)果與顯微鏡下觀察結(jié)果一致(如圖5) ；SIL 與人胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等腫瘤細(xì)胞有特異性結(jié)合，與內(nèi)皮細(xì)胞略有結(jié)合，且呈劑量相關(guān)性，與胎兒成纖維細(xì)胞基本不能結(jié)合(如圖6)，說明多種腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)生長抑素受體，雖有差異但融合蛋白的靶向結(jié)合區(qū)可與之結(jié)合。實施例4 =SIL體內(nèi)抗腫瘤活性一一抑瘤率實驗昆明小鼠右前肢腋下接種小鼠肝癌(H22)，按1 X 106/ml，0. 2ml/只進(jìn)行接種，分為生理鹽水組、IL-2高劑量組(6000U/只/天)、IL低(3000U/只/天)、SIL高(6000U/只 /天)、SIL低(3000U/只/天)，每組10只，接瘤后靜脈給藥連續(xù)給藥12天。停藥后觀察 6天，處死小鼠，剝離腫瘤稱重，計算每組平均瘤種和抑瘤率。抑瘤率以下式計算。
^ ,,,、 對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重抑瘤率(％) = -X100%
對照組平均瘤重
結(jié)果表明，在高劑量組，SIL與IL-2的抑瘤率對比，無顯著差異(P > 0. 05)，在低劑量組，SIL與IL的抑瘤率對比，有非常顯著差異(P < 0. 01)，結(jié)果如圖7所示；IL-2高劑量組有兩只動物死亡，SIL高劑量動物沒有死亡，說明SIL富集到腫瘤組織后，降低了對全身其它組織的毒副作用且SIL富集到腫瘤部位后，大大增強了其誘導(dǎo)CTL細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。實施例5 =SIL體內(nèi)抗腫瘤活性——生命延長率實驗 昆明小鼠腹腔接種小鼠肝癌(H22)，按5 X 106/ml，0. 2ml/只進(jìn)行接種，分為生理鹽水組、IL-2高劑量組(10000U/只/天)、IL中(5000U/只/天)、IL低(2500U/只/天)、 SIL 高(10000U/ 只 / 天)、SIL 中(5000U/ 只 / 天、)SIL 低(2500U/ 只 / 天)，每組 10 只， 接瘤后靜脈給藥連續(xù)給藥14天。停藥后繼續(xù)觀察，記錄各組小鼠生存及死亡情況。結(jié)果表明，截至實驗結(jié)束(40天)，生理鹽水組動物均已死亡，其它各給藥組存活動物只數(shù)分別為SIL高(9只)> SIL中(6只)> IL高(5只)=SIL低(5只)> IL中 (4只)=IL低(4只)，SIL各劑量組存活小鼠數(shù)目均多于IL各劑量組，說明增加IL-2的靶向性后，明顯增強了其抗腫瘤的活性，結(jié)果如圖8所示。以上結(jié)果說明，本發(fā)明所述連接了與生長抑素同源的靶向結(jié)合區(qū)的IL-2融合蛋白可與人胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，且呈劑量相關(guān)性，顯著增強IL-2的靶向性，富集到腫瘤組織后，降低了對全身其它組織的毒副作用且SIL富集到腫瘤部位后，大大增強了其誘導(dǎo)CTL細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，包括(1)特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向結(jié)合區(qū)；(2)白細(xì)胞介素。
2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白還包含由不多于10個氨基酸組成的連接區(qū)，用于連接所述靶向結(jié)合區(qū)和白細(xì)胞介素。
3.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述白細(xì)胞介素為人源白細(xì)胞介素2， 具有如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)為不少于3個但不多于50個氨基酸的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)為人源氨基酸序列。
6.如權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)與生長抑素同源。
7.如權(quán)利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)的氨基酸序列與生長抑素同源性不低于60%。
8.如權(quán)利要求6或7所述的融合蛋白，其特征在于，所述靶向結(jié)合區(qū)的氨基酸序列為 FCYWKSCT JBSEQ ID NO :2所示，或為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失、或添加一個或幾個氨基酸衍生的與SEQ IDN0. 2所示的氨基酸序列至少有80%的一致性，且具有特異結(jié)合腫瘤細(xì)胞或者腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性。
9.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，將如SEQID NO :2所示的靶向結(jié)合區(qū)中酪氨酸由任一含苯環(huán)或雜環(huán)的氨基酸替換，優(yōu)選替換為苯丙氨酸或色氨酸。
10.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其特征在于，將如SEQID NO :2所示的靶向結(jié)合區(qū)中絲氨酸由任一含有羥基的氨基酸替換或缺失，優(yōu)選替換為蘇氨酸。
11.如權(quán)利要求1-8任一項所述的融合蛋白，其特征在于，其中所述融合蛋白含有如 SEQ ID NO 3的氨基酸序列。
12.編碼權(quán)利要求1-11任一項所述融合蛋白的DNA分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的DNA分子，其特征在于，其含有如SEQIDNO :4所示的核苷酸序列。
14.一種表達(dá)盒，包括轉(zhuǎn)錄起始區(qū)；受轉(zhuǎn)錄起始區(qū)調(diào)控的編碼權(quán)利要求1-11任一項所述融合蛋白的DNA分子；以及轉(zhuǎn)錄中止區(qū)。
15.重組了編碼權(quán)利要求1-11任一項所述融合蛋白DNA分子的表達(dá)載體。
16.如權(quán)利要求15所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為質(zhì)?；虿《?。
17.重組了編碼權(quán)利要求1-11任一項所述融合蛋白的DNA分子的細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求17所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母菌或細(xì)菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞屬大腸桿菌，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 3867。
20.一種轉(zhuǎn)基因動物，其特征在于，轉(zhuǎn)染了編碼權(quán)利要求1-11任一項所述融合蛋白的 DNA分子且表達(dá)所述融合蛋白。
21.權(quán)利要求1-11任一項所述融合蛋白的制備方法，包括提供權(quán)利要求17-19任一項所述細(xì)胞或權(quán)利要求20所述轉(zhuǎn)基因動物；使細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)所述融合蛋白；以及分離所述融合蛋白。
22.如權(quán)利要求1-11任一項所述融合蛋白在制造治療細(xì)胞過度增生導(dǎo)致的疾病的藥物中的用途。
23.如權(quán)利要求22所述的用途，其特征在于，所述疾病為癌癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種具有靶向性的白細(xì)胞介素融合蛋白、編碼該融合蛋白的DNA分子、含有該DNA序列的載體、含該載體的宿主細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因動物、該融合蛋白的制備方法以及應(yīng)用。本發(fā)明所述融合蛋白從N端至C端包括靶向連接區(qū)、白細(xì)胞介素，根據(jù)情況可有不多于10個氨基酸組成的連接區(qū)，用于連接所述靶向結(jié)合區(qū)和白細(xì)胞介素。作為優(yōu)選，所述靶向結(jié)合區(qū)與生長抑素同源。實驗表明，本發(fā)明所述融合蛋白可以提高靶向組織白細(xì)胞介素濃度，同時降低其他組織白細(xì)胞介素濃度，提高療效的同時減低IL-2副作用，可用于腫瘤治療，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K47/48GK102260352SQ20101018550
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者劉武, 周兵, 周宇, 姜靜, 鄧?yán)谛?申請人:山東先聲麥得津生物制藥有限公司