一種熒光定量PCR檢測miR-100含量的引物及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種熒光定量PCR檢測miR?100含量的引物及檢測方法，利用熒光定量PCR檢測樣品中miR?100含量，本發(fā)明方法能夠快速準確的檢測樣品中miR?100的含量，由于胃癌患者的發(fā)病都伴隨著miR?100在病變組織以及血清中含量的顯著上調(diào)，因此，快速有效的miR?100檢測對于胃癌患者的監(jiān)測是具有重要的意義的。
【專利說明】
一種熒光定量PCR檢測m i R-100含量的引物及檢測方法 (一)
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及miR-100的檢測，特別涉及熒光定量PCR檢測引物。 (二)
【背景技術】
[0002] 胃癌是一種消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，在我國，致死率居各種惡性腫瘤 之首，胃癌標志物的發(fā)現(xiàn)及應用對于提高胃癌的早期診斷率有著重大的意義。MicroRNAs (miRNAs)是最近被發(fā)現(xiàn)的一類非編碼小RNA，研究表明，多數(shù)癌癥的發(fā)生都與miRNA的異常 調(diào)控有關，miRNA的含量發(fā)生了明顯的變化，其中，本實驗室發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的發(fā)病都伴隨著 miR-100在病變組織以及血清中含量的顯著上調(diào)，因此，在胃癌患者的治療過程中，對miR-100含量的監(jiān)控變得非常重要，急需建立一種快速準確的miR-100檢測方法。 (三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是提供一種熒光定量PCR檢測miR-100含量的引物及檢測方法。
[0004] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0005] 本發(fā)明提供一種熒光定量PCR檢測miR-100含量的引物，所述引物包括miR-100反 轉錄引物及miR-100熒光定量PCR引物F和引物R;
[0006] 所述miR-100的核苷酸序列為5' -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'，
[0007] 所述miR-100反轉錄引物的核苷酸序列為：
[0008] 5 '-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCACAAGT-3 '，
[0009] 所述miR-100熒光定量PCR引物F的核苷酸序列為：
[0010] 5，-CGCCGAACCCGTAGATCCG-3，，
[0011 ]所述miR-100熒光定量PCR引物R的核苷酸序列為：
[0012] 5 '-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3 '。
[0013] 本發(fā)明還提供一種利用所述熒光定量PCR檢測miR-100含量的引物檢測miR-100含 量的方法，所述方法為：
[0014] (1)提取待測樣品中的miRNA，利用miRNA反轉錄試劑(AB公司）及miR-100反轉錄引 物將提取的miRNA通過PCR反應反轉錄成cDNA;所述反轉錄PCR的反應程序為：16°C反應30分 鐘，42 °C反應30分鐘，最后85 °C反應5分鐘；
[0015] (2)以反轉錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用熒光定量PCR試劑(AB公司）及miR-100熒光定 量PCR引物進行PCR反應;所述熒光定量PCR的反應程序為:95 °C反應10分鐘后，進行50個循 環(huán)的95 °C 5秒，60 °C 1分鐘。
[0016] (3)采用絕對定量的方法，將步驟（1)中待測樣品改為含miR-100標準品的混合液 進行反轉錄及焚光定量PCR反應，根據(jù)含miR-100標準品的混合液中miR-100標準品的濃度 對應的起飛CT值，得到miR-100含量與熒光定量PCR反應CT值之間的線性關系，繪制成濃度 與CT值之間的標準曲線;根據(jù)待測樣品CT值，即可檢測出miR-100的含量。
[0017] 本發(fā)明所述待測樣品包括:細胞、組織或血清。
[0018] 采用總RNA提取試劑提取待測樣品中的miRNA，如果是組織，加入少量液氮研磨后 加入Trizol進行裂解，如果是貼壁細胞或者血清，則直接用Trizol進行消化裂解，裂解后， 12000rpm離心五分鐘，棄沉淀，后加入氯仿震蕩混勻靜置15分鐘，4°C離心15min，取水相至 新的離心管中，加入異丙醇混勻，放置5-10分鐘，離心，棄上清，RNA即沉于管底，加入50yL的 水溶解RNA樣品，55-60°C放置5分鐘后進行下一步反應。
[0019] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本方法與現(xiàn)有的檢測方法相比，由于是miR-100 含量的特異性檢測實驗，那么miR-100的特異性反轉錄與定量PCR的引物最為關鍵，以前的 miRNA的引物全部依賴美國Invitrogen公司的進口，不僅價格昂貴(單對引物價格超2000人 民幣），且由于從國外進口，貨期長(時間不少于一個月），因此進行miRNA含量的檢測十分的 不便，本發(fā)明針對該實驗最為關鍵的miR-100的特異性反轉錄與定量PCR的引物入手，經(jīng)過 對miRNA莖環(huán)結構的實驗及分析，成功的得到了miR-100的特異性反轉錄與定量PCR的引物 序列，后續(xù)實驗驗證了該引物的可靠性，且貨期短（國內(nèi)合成1到2天），價格便宜（幾十人民 幣），該發(fā)明為miRNA的研究提供了便利。
[0020] 本發(fā)明提供一種熒光定量PCR檢測miR-100含量的引物，利用熒光定量PCR檢測樣 品中miR-100含量，本發(fā)明方法能夠快速準確的檢測樣品中miR-100的含量，由于胃癌患者 的發(fā)病都伴隨著miR-100在病變組織以及血清中含量的顯著上調(diào)，因此，快速有效的miR-100檢測對于胃癌患者的監(jiān)測是具有重要的意義的。 (四）
【附圖說明】
[0021] 圖1為篩選驗證miR-100引物是否可用的定量PCR溶解曲線。
[0022] 圖2為標準曲線。
[0023]圖3利用本發(fā)明引物檢測胃癌組織與正常組織中miR-100含量的結果圖。
[0024]圖4利用本發(fā)明引物檢測胃癌患者血清與正常血清中miR-100含量的結果圖。
[0025] 圖 5 為miRNA 莖環(huán)。 (五)
【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0027] 實施例1:
[0028] 根據(jù)實驗室對miRNA莖環(huán)（圖5)的測序，結合miRNA的轉錄機制，設計出了miRNA的 反轉錄及定量PCR引物。
[0029]反轉錄引物：
[0030] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACXXXXXXX
[0031] XXXXXXX表示將miR-100成熟序列最后7個堿基反向互補得到的序列。
[0032] 定量PCR正向引物:CGCCGXXXXXXXXXXXXX
[0033] XXXXXXXXXXXXX表示miR-100成熟序列的前13個堿基序列。
[0034] 定量PCR反向引物：TGCAGGGTCCGAGGTCACTG
[0035]利用該引物設計規(guī)則，可以設計出任何一條miRNA的引物。
[0036] miR-100引物的驗證
[0037] (1)將miR-100 標準品用 DEPC 水配制成10-3、10-2、10-\ 10°、101、102、103μΜ 的 mi-100 標準品溶液，利用miRNA反轉錄試劑(AB公司）及miR-100反轉錄引物將提取的miRNA通過PCR 反應反轉錄成cDNA;所述反轉錄PCR的反應程序為：16 °C反應30分鐘，42 °C反應30分鐘，最后 85 °C反應5分鐘；
[0038] (2)以反轉錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用熒光定量PCR試劑(AB公司）及miR-100熒光定 量PCR引物進行PCR反應;所述熒光定量PCR的反應程序為:95 °C反應10分鐘后，進行50個循 環(huán)的95 °C 5秒，60 °C 1分鐘。
[0039]結果見圖1所示，PCR溶解曲線很單一，說明引物特異性好，可以有效的檢測miR-1〇〇含量。
[0040] 實施例2標準曲線
[0041 ] (1)將miR-100 標準品用 DEPC 水配制成10-3、10-2、10-\ 10°、101、102、103μΜ 的 mi-100 標準品溶液，利用miRNA反轉錄試劑(AB公司）及miR-100反轉錄引物將提取的miRNA通過PCR 反應反轉錄成cDNA;所述反轉錄PCR的反應程序為：16 °C反應30分鐘，42 °C反應30分鐘，最后 85 °C反應5分鐘；
[0042] (2)以反轉錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用熒光定量PCR試劑(AB公司）及miR-100熒光定 量PCR引物進行PCR反應;所述熒光定量PCR的反應程序為:95 °C反應10分鐘后，進行50個循 環(huán)的95 °C 5秒，60 °C 1分鐘。根據(jù)含mi R-100標準品溶液中mi R-100標準品的濃度對應的起飛 CT值，得到miR-100含量與熒光定量PCR反應CT值之間的線性關系，繪制成濃度與CT值之間 的標準曲線，結果見圖2所示。
[0043] CT = 3.259 Xlgx+33.777，x 為miR-100 標準品溶液中 miR-100 含量。
[0044] 所述miR-100的核苷酸序列為5' -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'，
[0045] 所述miR-100反轉錄引物的核苷酸序列為：
[0046] 5 '-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCACAAGT-3 '，
[0047]所述miR-100熒光定量PCR引物F的核苷酸序列為：
[0048] 5，-CGCCGAACCCGTAGATCCG-3，，
[0049] 所述miR-100熒光定量PCR引物R的核苷酸序列為：
[0050] 5 '-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3 '。
[0051]實施例3待測樣品的檢測方法：
[0052]待測樣品：胃癌患者胃組織，胃癌患者血清的獲取完全符合醫(yī)學或者倫理的要求， 都是在醫(yī)院中獲取的，是得到了病人的同意的。
[0053] (1)提取待測樣品中的miRNA，利用miRNA反轉錄試劑(AB公司）及miR-100反轉錄 引物將提取的miRNA通過PCR反應反轉錄成cDNA，以包含引物的miRNA反轉錄試劑(AB公司） 為對照;所述反轉錄PCR的反應程序為：16°C反應30分鐘，42°C反應30分鐘，最后85°C反應5 分鐘；
[0054] (2)以反轉錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用熒光定量PCR試劑(AB公司）及miR-100熒光定 量PCR引物進行PCR反應，以包含引物的熒光定量PCR試劑(AB公司）為對照；所述熒光定量 PCR的反應程序為:95 °C反應10分鐘后，進行50個循環(huán)的95 °C 5秒，60 °C 1分鐘。
[0055] (3)依據(jù)實施例2制作的標準曲線；根據(jù)待測樣品CT值，即可檢測出miR-100的含 量，結果見圖3和圖4。
[0056] 采用總RNA提取試劑提取待測樣品中的miRNA，如果是組織，加入少量液氮研磨后 加入Trizol進行裂解，如果是貼壁細胞或者血清，則直接用Trizol進行消化裂解，裂解后， 12000rpm離心五分鐘，棄沉淀，后加入氯仿震蕩混勻靜置15分鐘，4°C離心15min，取水相至 新的離心管中，加入異丙醇混勻，放置5-10分鐘，離心，棄上清，RNA即沉于管底，加入50yL的 水溶解RNA樣品，55-60°C放置5分鐘后進行下一步反應。
[0057] 圖3是胃癌患者胃組織中miR-100含量> 100fM的共57例，miR-100含量< 100fM的 共8例，非胃癌患者組織中miR-100含量>100fM的有11例，miR-100含量<100fM的有55例。 特異性為83.8% (57/68)，敏感性為86.4% (57/66)。以0. lfM為臨界值，血清中miR-100含量 超過O.lfM或者胃組織中超過100fM，可以有效地鑒別胃癌患者與正常人。
[0058] 圖4是胃癌患者血清中miR-100含量>0.1fM的共24例，miR-100含量<0.1fM的共5 例，非胃癌患者血清中miR-100含量>0. lfM沒有，全部小于0. lfMJiR-100作為診斷指標的 特異性為100%(24/24)，敏感性為82.8%(24/29)。后面的這些結論是用本發(fā)明的引物做出 來的結果，與現(xiàn)有的方法相比，僅僅是引物的區(qū)別，而該引物通過溶解曲線的驗證，能夠特 異有效的檢測出miR-100的表達量，說明該引物的可靠性，至于這些結論，都是因為miR-100 這條miRNA在癌癥患者與正常人中是差異表達的，不論是用購買的進口引物還是本發(fā)明的 引物，得到的結論應該都是一致的。
[0059] 以O.lfM為臨界值，血清中miR-100含量超過O.lfM或者胃組織中超過100fM，可以 有效地鑒別胃癌患者與正常人。
【主權項】
1. 一種熒光定量PCR檢測miR-100含量的引物，其特征在于所述引物包括miR-100反轉 錄引物及miR-100熒光定量PCR引物F和引物R; 所述miR-100的核苷酸序列為5 ' -AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3 '， 所述miR-100反轉錄引物的核苷酸序列為： 5 '-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCA CAAGT-3，， 所述miR-100熒光定量PCR引物F的核苷酸序列為： 5，-CGCCGAACCCGTAGATCCG-3，， 所述miR-100熒光定量PCR引物R的核苷酸序列為： 5 '-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3 '。2. -種利用權利要求1所述熒光定量PCR檢測miR-100含量的引物檢測miR-100含量的 方法，其特征在于所述方法為： (1) 提取待測樣品中的miRNA，利用miRNA反轉錄試劑及miR-100反轉錄引物將提取的 miRNA通過PCR反應反轉錄成cDNA;所述反轉錄PCR的反應程序為：16 °C反應30分鐘，42 °C反 應30分鐘，最后85 °C反應5分鐘； (2) 以反轉錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用熒光定量PCR試劑及miR-100熒光定量PCR引物進行 PCR反應;所述熒光定量PCR的反應程序為:95°C反應10分鐘后，進行50個循環(huán)的95 °C 5秒，60 °C1分鐘。 (3) 采用絕對定量的方法，將步驟（1)中待測樣品改為用DEPC水配制的miR-100標準品 溶液進行反轉錄及焚光定量PCR反應，根據(jù)含miR-100標準品的混合液中miR-100標準品的 濃度對應的起飛CT值，得到miR-100含量與熒光定量PCR反應CT值之間的線性關系，繪制成 濃度與CT值之間的標準曲線;根據(jù)待測樣品CT值，即可檢測出miR-100的含量。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述待測樣品包括:細胞、組織或血清。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950708SQ201610195171
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年3月31日
【發(fā)明人】章曉波, 龔燚, 楊耿, 王雨濛
【申請人】浙江大學