一種快速篩查我國(guó)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因油菜外源基因的六重pcr檢測(cè)引物及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種快速篩查我國(guó)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因油菜外源基 因的六重PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)農(nóng)業(yè)部官方網(wǎng)站提供的信息，目前我國(guó)已進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因油菜轉(zhuǎn) 化事件有9個(gè)。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在市場(chǎng)上所占份額的不斷增加給轉(zhuǎn)基因檢測(cè)帶來更多需求 的。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因作物的多樣性和復(fù)雜性，也給轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)帶來了挑戰(zhàn)。如何快速、準(zhǔn) 確、科學(xué)地對(duì)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定，是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)行業(yè)所面臨的一個(gè)關(guān)鍵問題。轉(zhuǎn)基因 篩查是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中最基礎(chǔ)的一步，篩查得到的正確結(jié)果，可有效指導(dǎo)轉(zhuǎn)化事件的進(jìn)一步 鑒定。
[0003] 在轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)中主要有蛋白質(zhì)檢測(cè)和核酸檢測(cè)兩類，核酸檢測(cè)技 術(shù)中普通PCR技術(shù)在實(shí)際檢測(cè)需求中運(yùn)用較多，其特點(diǎn)為敏感、快速、簡(jiǎn)便，主要用于檢測(cè)轉(zhuǎn) 基因作物及產(chǎn)品中的單個(gè)外源基因。然而在產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)，往往需要對(duì)多個(gè)外源基因進(jìn)行檢 測(cè)來確認(rèn)其含哪些轉(zhuǎn)基因成分W及是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，用普通PCR技術(shù)分別對(duì)運(yùn)些外源基 因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，存在時(shí)間和試劑耗費(fèi)大、操作繁瑣等缺點(diǎn)。
[0004] 多重PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型擴(kuò)增技術(shù)，即可在一個(gè)反應(yīng)體系中加 入兩對(duì)或W上引物，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)核酸片段，解決了普通PCR存在的缺點(diǎn)。多重PCR已在病理 學(xué)、微生物、基因組學(xué)等學(xué)科中得到了廣泛應(yīng)用。多重PCR檢測(cè)技術(shù)主要利用多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)生 長(zhǎng)度不同的擴(kuò)增片段，采用普通瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管凝膠電泳分辨出長(zhǎng)度不同的片 段。普通瓊脂糖凝膠電泳存在操作繁雜，試驗(yàn)周期長(zhǎng)，易造成試驗(yàn)室污染等缺點(diǎn)，而毛細(xì)管 凝膠電泳可在PCR后直接上機(jī)電泳，無需其他點(diǎn)樣等操作，節(jié)約時(shí)間，減少污染?？蒞說多重 PCR相比單一PCR反應(yīng)更快捷、更經(jīng)濟(jì)，只需要1次PCR反應(yīng)就能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)祀標(biāo)基因，運(yùn)種 方法具有更大的可靠性和適應(yīng)性，并能降低檢測(cè)成本。
[0005] 目前關(guān)于我國(guó)進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因油菜的檢測(cè)技術(shù)，主要集中在單一調(diào)控 元件或單個(gè)轉(zhuǎn)化事件PCR方法和標(biāo)準(zhǔn)，也有學(xué)者針對(duì)目前我國(guó)進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因 油菜進(jìn)行單一PCR篩查檢測(cè)技術(shù)研究，但尚無針對(duì)目前我國(guó)進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因油 菜的多重PCR篩查檢測(cè)技術(shù)。通過對(duì)目前我國(guó)進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因油菜基因元件分 析發(fā)現(xiàn)，每種轉(zhuǎn)基因油菜都含有多個(gè)外源基因元件，并且為了增加檢測(cè)的可靠性，開發(fā)一種 能同步篩查檢測(cè)我國(guó)進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因油菜外源基因至少兩次的多重PCR檢測(cè)方 法就顯得非常有必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的主要是提供一種準(zhǔn)確、快速、可靠、省時(shí)省力的六重PCR快速篩查我 國(guó)進(jìn)口用作加工原料的轉(zhuǎn)基因油菜外源基因的檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種快速篩查我國(guó)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因油菜外源基因的六重PCR檢測(cè)引物，包括W下引物 序列：
[0021] 一種快速篩查我國(guó)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因油菜外源基因的六重PCR檢測(cè)方法，包括W下步驟：
[0022] (1)合成W下引物：
[0035] (2)制備待測(cè)油菜的DNA稀釋液；
[0036] (3)配制PCR反應(yīng)體系；
[0037] (4)進(jìn)行 PCR 檢測(cè)；
[0038] (5)取PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳。
[0039] 進(jìn)一步地，步驟（1)中pat引物的濃度為0.3皿ol/L，P-CaMV 35S引物的濃度為0.15 皿01 /L，T-E9 3 '引物的濃度為0.35 '，P-FMV 35巧I物、T-NO巧I物、bar引物的濃度均為0.化 mo 1/1;步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為SOngAiL。
[0040] 再進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)條件為:94°C變性5min;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94°C 30s，58 1：3〇3,721：3〇3;循環(huán)結(jié)束后72°(：延伸3111111。
[0041 ] 更進(jìn)一步地，引物退火溫度為58°C。
[0042] 本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0043] 本發(fā)明在同一次PCR反應(yīng)中可W同時(shí)檢出轉(zhuǎn)基因油菜中使用頻率較高的6種外源 基因，并且每種轉(zhuǎn)基因油菜可W檢出至少兩次。
[0044] 本發(fā)明采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行結(jié)果分析，不僅分辨率可達(dá)幾個(gè)堿基(普通凝膠電 泳幾乎不能將其分開），而且相對(duì)普通凝膠電泳的分離效果更好，并且只需要一次電泳分析 即可得知樣品是否含有轉(zhuǎn)基因油菜中使用頻率較高的6種外源基因。
【附圖說明】
[0045] 圖1為本發(fā)明六重PCR引物濃度梯度和退火溫度梯度正交優(yōu)化試驗(yàn)擴(kuò)增圖譜。
[0046] 圖2為本發(fā)明六重PCR靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增圖譜。
[0047] 圖3為本發(fā)明六重PCR已知樣品驗(yàn)證擴(kuò)增圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0048] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。
[0049] 實(shí)施例
[0050] -種快速篩查我國(guó)進(jìn)口轉(zhuǎn)基因油菜外源基因的六重PCR檢測(cè)方法，包括W下步驟：
[0051] (1)合成W下引物：
[0064] (2)制備待測(cè)油菜的DNA稀釋液；
[0065] (3)配制PCR反應(yīng)體系；
[0066] (4)進(jìn)行 PCR 檢測(cè)；
[0067] (5)取PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳。
[006引其中，步驟（1)中pat引物的濃度為0 .化mo 1 /L，P-CaMV 35S引物的濃度為0.15y mo 1 /L，T-E9 3 '引物的濃度為0.35皿01 /L，P-FMV 35S引物、T-NOS引物、bar引物的濃度均為 0.2皿ol/L;步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/化;所述PCR反應(yīng)條件為:94 °C變 性5min;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94°C30s，58°C30s，72°C30s;循環(huán)結(jié)束后72°C延伸3min;引物退 火溫度為58 °C。
[0069]為了驗(yàn)證本發(fā)明的篩查檢測(cè)效果W及相應(yīng)的參數(shù)選取的真實(shí)性，對(duì)各步驟進(jìn)行具 體的驗(yàn)證試驗(yàn)，其具體情況如下：
[0070] (1)擴(kuò)增檢測(cè)引物的合成：
[0071] 表1引物序列信息表
[0074] (2)待測(cè)轉(zhuǎn)基因 DNA的小量提?。?br>[00巧]采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)提 取樣品基因組DNA，稱取轉(zhuǎn)基因粉末樣品200mg，加入70iU洗脫液TE洗脫樣品基因組DNA，其 他提取步驟參照試劑盒說明書操作。
[0076] 采用化ermo Nano Drop 1000紫外分光光度計(jì)測(cè)定樣品基因組DNA的濃度和純度， 并將樣品DNA濃度稀釋至SOngAiL待測(cè)。
[0077] (3)六重 PCR
[0078] ①引物濃度梯度和引物退火溫度梯度正交試驗(yàn)：
[00巧]PCR反應(yīng)體系組成為：PCR Master Mix終濃度為lX，pat、P-FMV35S、T-N0S、P-CaMV 35S、T-E9 3'、bar引物終濃度梯度見表2,待測(cè)DNA模板3.化L，補(bǔ)充dd也0至體積為25ii L。
[0080]表2反應(yīng)體系引物終濃度(皿ol/L)梯度
[0082] 在定性PCR儀上運(yùn)行如下反應(yīng)程序:94 °C變性5min;然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94 °C 30s， 退火 303,721：303;循環(huán)結(jié)束后72°(：延伸5111111。退火溫度梯度為50