專利名稱：一種增強(qiáng)型熒光定量pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法。
背景技術(shù)：
隨著生命科技的不斷進(jìn)步，人類改變了植物常規(guī)育種的方法，通過基因工程的手段，將外源基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)，從而培育出一批高產(chǎn)、抗逆性性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物品種。自90 年代起到2010年，全世界轉(zhuǎn)基因植物的種植面積累計(jì)達(dá)10億公頃。轉(zhuǎn)基因作物已成規(guī)模。 盡管如此，世界各國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基植物的態(tài)度仍很謹(jǐn)慎，并出臺(tái)了很多的政策法規(guī)，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測(cè)，并要求檢測(cè)結(jié)果為陽性者需要標(biāo)識(shí)。目前，常用的檢測(cè)方法有實(shí)時(shí)熒光PCR，普通凝膠PCR等檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光 PCR(RT-PCR):是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR 進(jìn)程，最后通過檢測(cè)到的熒光信號(hào)對(duì)未知模板進(jìn)行分析的方法。然而這些檢測(cè)方法都存在自身的不足，如對(duì)某些深加工產(chǎn)品及轉(zhuǎn)基因含量較低的產(chǎn)品存在判定盲區(qū)，即無法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一次性判定。這就需要開發(fā)高效、準(zhǔn)確、更靈敏的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法。這對(duì)于國(guó)家的進(jìn)出口貿(mào)易、 轉(zhuǎn)基因安全性以及對(duì)于海關(guān)、商檢、出入境檢驗(yàn)檢疫部門、食品加工部門來說都是至關(guān)緊要需要解決的一個(gè)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)無法檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因植物DNA分子含量較低的樣品或因深加工轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品造成DNA分子的嚴(yán)重破壞的樣品以及應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)方法無法判定陰性陽性的灰區(qū)的樣品，提供一種增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，其靈敏度、準(zhǔn)確度更高，可廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物及其加工產(chǎn)品的檢測(cè)。本發(fā)明提供的一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系BTll的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，將包含引物組0. 5 μ Μ、探針0. 5 μ Μ、模板1 IOOng的總體積25 μ 1的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C，2min;95 °C IOmin ；95°C 15s，45°C 30s，72°C 30s，10 個(gè)循環(huán)；95°C 15s,60°C Imin0作為優(yōu)選，檢測(cè)目的基因?yàn)锽Tll結(jié)構(gòu)特異基因crylAb與adhl-IVS6的邊界序列， 所述引物組中上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示。更優(yōu)選地，所述探針序列如SEQ ID No. 3所示。所述探針可以利用本領(lǐng)域已知各種核酸標(biāo)記方法使探針分子標(biāo)記信標(biāo)分子，所述方法包括但不限于，PCR、RT-PCR、體外轉(zhuǎn)錄、 隨機(jī)引物標(biāo)記、缺口平移以及末端轉(zhuǎn)移標(biāo)記等方法。所述信標(biāo)分子可以為選擇合適熒光素；
3所述熒光素包括但不限于，Cy3, Cy5、異硫氰酸熒光素、德克薩斯紅等。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系TT51-1的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，將包含引物組0. 5 μ Μ、探針0. 25 μ Μ、模板1 IOOng的總體積25 μ 1的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C,2min ；95 "C IOmin95"C 15s，45°C 30s，72°C 30s，10 個(gè)循環(huán)；95°C 15s,60°C Imin0作為優(yōu)選，檢測(cè)目的基因?yàn)門T51外源基因cryIAb，所述引物組中上游引物序列如 SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No. 5所示。更優(yōu)選地，所述探針序列如SEQ ID No. 6所示。本發(fā)明針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因水稻品系TT51-1篩選出適合的引物及探針，且對(duì)整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，包括引物探針濃度與配比的優(yōu)化，通過選用不同引物濃度，及在相同引物濃度下不同的引物、探針濃度比得出結(jié)論在相同引物及探針濃度比情況下，引物及探針濃度越高，實(shí)時(shí)PCR曲線的Afo1值也就相對(duì)越高，同時(shí)Ct值也呈現(xiàn)相應(yīng)變化。當(dāng)引物與探針的比例在2 1的時(shí)候擴(kuò)增曲線形狀較好，重復(fù)性好，Ct值更小。而改變退火溫度對(duì)Ct值和熒光值影響不大。而中間的循環(huán)數(shù)越多，則Ct值越小而對(duì)熒光值影響不大。通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，ERT-PCR內(nèi)源基因和外源基因的擴(kuò)增效率都達(dá)到要求，并且線性關(guān)系好，R2 > 0. 98。擴(kuò)增效率在100%左右，說明ERT-PCR反應(yīng)條件已達(dá)到優(yōu)化。通過ERT-PCR和RT-PCR比較發(fā)現(xiàn)，RT-PCR具有檢測(cè)方法靈敏度高，其檢測(cè)下限較普通RT-PCR高出10倍左右。ERT-PCR與RT-PCR采用相同的模板，ERT-PCR的Ct值范圍在 12-30，而普通RT-PCR的Ct值范圍則位于22-39之間，而一般認(rèn)為Ct值在40左右就很難判定陰性或者陽性，從這個(gè)角度上分析，ERT-PCR提高了檢測(cè)的靈敏度。另外，我們分別采用 ERT-PCR以及RT-PCR分別對(duì)轉(zhuǎn)基因種子(0. 5%，1 %，5% )進(jìn)行定量定值結(jié)果符合要求，顯示ERT-PCR檢測(cè)結(jié)果比RT-PCR更接近真實(shí)值，說明ERT-PCR的準(zhǔn)確性要比RT-PCR高。綜上，與目前轉(zhuǎn)基因檢測(cè)普遍使用的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明所述 ERT-PCR具有檢測(cè)方法靈敏度高，約為RT-PCR靈敏度的10倍。針對(duì)轉(zhuǎn)基因含量較低或深加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品造成的DNA分子的嚴(yán)重破壞，提取樣品中含有大量PCR抑制劑以及由于目前所應(yīng)用的熒光定量PCR檢測(cè)方法無法判定陰性陽性的灰區(qū)的樣品特別適合，并可在多種轉(zhuǎn)基因品系的檢測(cè)中應(yīng)用，具有廣泛的應(yīng)用前景。定義和一般術(shù)語本發(fā)明將會(huì)把確定的具體化的內(nèi)容詳細(xì)列出。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將識(shí)別許多類似或等同于在此所描述的方法和物質(zhì)，這些可以應(yīng)用于本發(fā)明的實(shí)踐中去。本發(fā)明絕非限于方法和物質(zhì)的描述。增強(qiáng)型熒光定量PCR(ERT-PCR)對(duì)熒光定量PCR方法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)方面包括 退火溫度、循環(huán)數(shù)等，而大大提高熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性的一種檢測(cè)方法。實(shí)時(shí)熒光PCR(RT-PCR)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過檢測(cè)到的熒光信號(hào)對(duì)未知模板進(jìn)行分析的方法?；覅^(qū)當(dāng)熒光定量PCR的CT值位于35-40之間將無法判定陰性及陽性，此區(qū)間稱為灰區(qū)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)驗(yàn)中所用試劑耗材材料陽性轉(zhuǎn)基因玉米種子BT11，陽性轉(zhuǎn)基因水稻種子TT51-1，以上樣品由香港海康生命科技有限公司提供。IRMM購買的NK603標(biāo)準(zhǔn)品(分別為0. 1 %、0. 5%、1 %、2%、 5% )轉(zhuǎn)基因植物及深加工產(chǎn)品提取方法(In house)，購自?？瞪萍加邢薰荆?Taqman基因表達(dá)預(yù)混液(Master mix)，購自ABI公司。實(shí)施例1 針對(duì)BT11的ERT-PCR條件優(yōu)化-探針、引物濃度優(yōu)化材料=BTllGenome ；BT11SSIIB 引物 F, R(10 μ Μ)，SSIIB 探針(10 μ Μ) ；Specific 引物 F，R(10 μ Μ)，Specific 探針(10 μ Μ)；試劑ABI2 XMaster Mix，ddH20儀器:ABI7500檢測(cè)目的基因?yàn)锽T11結(jié)構(gòu)特異基因crylAb與adhl_IVS6的邊界序列。引物探
針序列如下
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系BTll的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，其特征在于，將包含引物組0. 5 μ Μ、探針0. 5 μ Μ、模板I-IOOng的總體積25 μ 1的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C,2min ；95 0C IOmin ；950C 15s，45°C 30s, 72°C 30s，10 個(gè)循環(huán)；95°C 15s，60°C lmin，40 個(gè)循環(huán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，其特征在于，所述引物組中上游引物序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物序列如SEQ ID No. 2所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，其特征在于，所述探針序列如 SEQ ID No. 3 所示。
4.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系TT51-1的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，其特征在于，將包含引物組0. 5 μ M、探針0. 25 μ Μ、模板IOOng的總體積25 μ 1的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C,2min ；95 0C IOmin950C 15s，45°C 30s, 72°C 30s，10 個(gè)循環(huán)；95°C 15s，60°C lmin，40 個(gè)循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，其特征在于，所述引物組中上游引物序列如SEQ ID No. 4所示，下游引物序列如SEQ ID No. 5所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法，其特征在于，所述探針序列如 SEQ ID No. 6 所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的增強(qiáng)型熒光定量PCR方法。本發(fā)明所述方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，樣本范圍廣，尤其適用于轉(zhuǎn)基因植物的定量檢測(cè)及定性檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102424863SQ20121000410
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者于常海, 劉樂庭, 楊濱 申請(qǐng)人:北京大學(xué), ?？瞪锟萍?北京)有限公司