實時定量和終點比色的pcr裝置的制造方法
【專利摘要】提供了一種基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其包括檢測器模塊、處理器和存儲器。所述檢測器模塊被設(shè)置為記錄由光源照明的DNA樣本的圖像。所述存儲器包括計算機程序代碼，所述存儲器和所述計算機程序代碼被配置為利用所述處理器執(zhí)行(a)發(fā)送信號以將所述DNA樣本的溫度調(diào)整到所述DNA樣本的顏色發(fā)生變化的近似溫度范圍內(nèi)，(b)向所述檢測器模塊發(fā)送信號以在所述近似溫度范圍內(nèi)以定義的間隔捕獲所述DNA樣本的圖像，(c)對捕獲的圖像進行處理以提取顏色信息，以及(d)對提取的顏色信息進行處理以客觀確定所述DNA樣本的顏色發(fā)生變化時的所述近似溫度范圍內(nèi)的解鏈溫度。
【專利說明】
實時定量和終點比色的PCR裝置
[0001 ]本發(fā)明要求2013年11月12日提交的申請?zhí)枮?01308391-0的新加坡專利申請的優(yōu) 先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)生物測定。特別的，其涉及一種用于終點解鏈曲線 分析的實時定量比色的PCR系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0003] 基因分型傳統(tǒng)上包括昂貴的測定法的使用，例如，實時PCR和DNA排序。在實時PCR 中已經(jīng)嘗試了各種策略，例如，修改退火溫度以使得在探針和目標(biāo)靶擴增子之間的堿基不 匹配的情況下不會擴增PCR產(chǎn)物。也可以通過使用野生型特異性(wild type-specific)探 針和突變特異性(mutant-specific)探針被固定在固體基板上的DNA微陣列系統(tǒng)的終點雜 合來執(zhí)行基因分型。DNA排序開辟了在很長的序列和潛在的整個基因組檢測突變的可能性。 但是，由于在上述的方法中使用了熒光團和熒光成像裝置而導(dǎo)致造價昂貴，這是主要的限 制?？商鎿Q的，通過在常規(guī)的PCR中，將引物設(shè)計為使得3'側(cè)落在一個突變位點，從而如果該 位點確實突變也不會發(fā)生PCR擴增，這樣可以避免熒光團的使用。然而，這將需要大量的手 工操作并且需要執(zhí)行耗時的凝膠電泳以驗證PCR產(chǎn)物是否已經(jīng)擴增。
[0004] -種傳統(tǒng)的方法提出了用于基因分型的簡單且經(jīng)濟的比色分析法。該分析通過對 雜合為金納米顆粒嗎啉代(morpholino)探針的單鏈DNA(ssDNA)目標(biāo)物執(zhí)行解鏈曲線分析 來進行基因突變檢測。雜合使得溶液呈粉紅色色調(diào)。然而，一旦溶解，ssDNA探針溶液將變成 無色。該分析高度敏感，從而野生型和突變之間的約5到12攝氏度的解鏈溫度差導(dǎo)致單堿基 對突變。使用的DNA探針比傳統(tǒng)的熒光團偶聯(lián)的探針便宜的多。因為其是比色法，所以不需 要昂貴且笨重的光源、光學(xué)過濾器和高端成像設(shè)備。實際上，根據(jù)這種傳統(tǒng)方法的基因分型 如同將DNA探針和鹽添加到PCR擴增的產(chǎn)物并且利用肉眼觀察粉紅色色調(diào)消失的溫度那么 簡單明確。
[0005] 然而，顏色的變化的視覺評估是非常主觀的，并且這可能導(dǎo)致不同操作者所記錄 的解鏈溫度不同。該分析也可受到外界因素(例如，環(huán)境照明）的影響而出現(xiàn)偏差。視覺評估 還顯著地限制可以在任意給定的時間監(jiān)測的樣本的數(shù)量，這是因為操作者可能無法同時監(jiān) 測大量樣品的顏色變化，除非多個操作者一起執(zhí)行該任務(wù)。另一個缺點是該過程是勞動密 集型的，這是因為其要求操作者連續(xù)地監(jiān)視顏色變化，從而使他/她不能執(zhí)行手邊的其他實 驗室任務(wù)。它也是繁瑣的并引起疲勞，這又不利地影響視覺分析。因為在某些情況下顏色發(fā) 生細微變化，所以操作者可能不能夠精確地識別的解鏈溫度。
[0006] 通過如在標(biāo)準(zhǔn)熒光解鏈曲線分析中計算顏色變化的衍生物，可以獲得更準(zhǔn)確的結(jié) 果，這在視覺評估中是不可能的?；跓晒獾腜CR成像技術(shù)從而在分子診斷空間占據(jù)主導(dǎo)地 位，但是用于實時PCR和終點PCR的基于比色法分析(例如，解鏈曲線分析）的出現(xiàn)已經(jīng)突出 了對定量比色裝置的需要。
[0007] 因此，需要一種可以在設(shè)有終點解鏈曲線分析的實時PCR中執(zhí)行圖像采集、圖像分 析和熱循環(huán)的低成本的實時定量的比色法PCR系統(tǒng)。另外，通過結(jié)合附圖和本公開的該背景 技術(shù)的隨后的詳細描述和所附的權(quán)利要求，其他期望的特征和特性將變得顯而易見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 根據(jù)詳細描述，提供了基于比色法的DNA診斷系統(tǒng)。該基于比色法的DNA診斷系統(tǒng) 包括檢測器模塊、處理器和存儲器。探測器模塊被設(shè)置為記錄由光源照射的DNA樣本的圖 像。存儲器包括計算機程序代碼，所述計算機程序代碼和存儲器一起被配置為利用所述處 理器至少執(zhí)行：（a)發(fā)送信號以將DNA樣本的溫度調(diào)整到DNA樣本的顏色發(fā)生變化的近似溫 度范圍內(nèi)，（b)向檢測器模塊發(fā)送信號以捕獲在近似溫度范圍內(nèi)以定義的間隔捕獲DNA樣本 的圖像，（c)對捕獲的圖像進行處理以提取顏色信息，以及(d)對提取的顏色信息進行處理 以客觀地確定DNA樣本的顏色發(fā)生變化時的近似溫度范圍內(nèi)的解鏈溫度。
【附圖說明】
[0009] 附圖與下面的詳細描述被合并到說明書中并作為說明書的一部分，附圖用于示出 各種實施例并解釋根據(jù)本發(fā)明實施例的各個原理和優(yōu)點，其中，貫穿各個視圖，相同的參考 標(biāo)號表示相同或者功能類似的元件。
[0010] 圖1示出了根據(jù)本實施例的、用于及時現(xiàn)場護理(point-of-care) (P0C)應(yīng)用的實 時比色和終點聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)的前右透視圖。
[0011] 圖2描述了根據(jù)本實施例的臺式PCR系統(tǒng)的前平面視圖。
[0012]圖3包括圖3A和3B，其示出了用于根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的菲涅耳透鏡和 微量滴定板組件，其中，圖3A描述了菲涅爾透鏡和微量滴定板組件的示意圖，以及圖3B描述 了菲涅爾透鏡和微量滴定板組件的前平面視圖。
[0013]圖4示出了用于初始化、成像和終止根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的成像會話的 Mat lab代碼。
[0014]圖5示出了用于與根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的溫度控制器通信的Matlab代 碼。
[0015] 圖6示出了根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的第一溫度控制方案的部件流向。
[0016] 圖7示出了根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的第二溫度控制方案的部件流向。
[0017]圖8包括圖8A和8B，其示出了用于通過根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)攝像 機和熱循環(huán)儀的軟件控制完成解鏈曲線的Matlab代碼。
[0018]圖9描述了由根據(jù)本實施例的圖1的PCR系統(tǒng)形成的三種不同單鏈DNA探針（ssDNA-probe)雜合溶液的解鏈曲線輪廓的曲線圖。
[0019] 圖10描述了根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的第一和第二溫度控制方案的溫度感 測的曲線圖。
[0020] 圖11描述了在根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的微量滴定板的不同孔中的兩個相 同單鏈DNA探針(ssDNA-probe)雜合溶液的解鏈曲線輪廓的曲線圖。
[0021] 圖12描述了由根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的LED照明的96孔微量滴定板的俯視 平面圖。
[0022] 以及圖13描述了使用根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的紅色色度所進行的解鏈曲 線分析中的顏色變化的曲線圖。
[0023] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，出于簡單明了表示圖中元件的目的，圖中元件并不一 定是按比例進行繪制的。例如，圖示說明、框圖或者流程圖中的某些元件的尺寸可以相對于 其他元件而增大，以有助于提高對本實施例的理解。
【具體實施方式】
[0024] 下面的詳細描述本質(zhì)上僅是示例性的，并不旨在限制本發(fā)明或本發(fā)明的應(yīng)用和使 用。此外，不受本發(fā)明的前述【背景技術(shù)】或下面的詳細描述所提出的任何理論的束縛。因此， 根據(jù)本實施例提出了低成本并且實時定量比色的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)。該PCR系統(tǒng)能夠 在實時PCR設(shè)置和終點解鏈曲線分析中執(zhí)行圖像采集、圖像分析和熱循環(huán)。一個實施例被設(shè) 計為及時現(xiàn)場護理(P0C)應(yīng)用，而另一實施例是實驗室使用的臺式裝置。
[0025] 這兩種PCR系統(tǒng)通常包括（i)彩色攝像機，例如，瑞士羅技國際S.A.出售的高清網(wǎng) 絡(luò)攝像機C525，（ ii )珀爾帖（Pe 11 ier)加熱模塊，例如，美國加利福尼亞州的熱磁公司 (Ferrotec Corporation)所出售的，（iii)軟件系統(tǒng)的軟件控制，例如，美國馬薩諸塞州的 MathWorks公司授權(quán)的Matlab圖像采集工具箱，（iv)輕質(zhì)絕緣裝置，例如，新加坡的Whits Technlogies所出售的，以及(v)LED光源，例如，新加坡的Elementl4出售的冷白24cd LED光 源。
[0026]軟件同時控制珀爾帖加熱模塊和彩色攝像機，以將單鏈DNA探針(ssDNA-probe)溶 液從室溫加熱到預(yù)定溫度。在固定的溫度間隔，獲得樣本圖像并提取和量化其顏色信息。光 絕緣裝置防止環(huán)境光照射樣本，并且內(nèi)置的LED用于樣本照明，以使得整個過程是可重復(fù)的 并且不受在環(huán)境光的影響。
[0027] 兩種PCR系統(tǒng)都包括比色基因分型分析，其用于通過對雜合到DNA探針的單鏈DNA (ssDNA)目標(biāo)物進行解鏈曲線分析來檢測基因突變。雜合溶液最初具有可見的顏色，一旦解 鏈就變成無色。然而，盡管比色分析可以使得能夠利用肉眼觀察顏色變化，但是她們?nèi)匀痪?有高度的主觀性，對顏色變化的情況和程度的解釋因人而異。
[0028]根據(jù)本實施例的PCR系統(tǒng)是有成本效益的，這是因為它們沒有移動部件，并且各種 部件(例如，網(wǎng)絡(luò)攝像機、菲涅爾透鏡、LED和絕緣裝置)都是低成本的。PCR系統(tǒng)也是完全自 動化的，從而軟件提供了對珀爾帖加熱模塊/熱循環(huán)儀和攝像機的實時控制。軟件還結(jié)合了 圖像和信號處理程序，以產(chǎn)生解鏈曲線輪廓并精確計算解鏈溫度。菲涅耳透鏡、偏振濾光器 和LED的組合確保了由臺式裝置捕獲整個視場，從而無需掃描儀。該裝置還確保比色分析是 定量的并且可重復(fù)的。因此，根據(jù)本實施例的PCR系統(tǒng)能夠潛在的適于任何比色分析，例如， 酶聯(lián)免疫吸收測定(ELISA)和聚合酶鏈反應(yīng)-酶聯(lián)免疫吸收測定(PCR-ELISA)。
[0029]參考圖1，前右頂部透視圖100示出了根據(jù)用于P0C應(yīng)用的本實施例的實時比色和 終點PCR裝置1021CR裝置102包括加熱模塊104,所述加熱模塊104包括珀爾帖加熱器106、 散熱器108和銅座110 WCR裝置102還包括超亮白光LED 112、偏振濾光器114、聚焦透鏡116 和網(wǎng)絡(luò)攝像機118。整個設(shè)置包含在環(huán)境光絕緣外殼(未示出）內(nèi)。成像和熱加熱/循環(huán)都由 軟件控制。
[0030]根據(jù)本實施例，PCR裝置102是用于在及時現(xiàn)場護理執(zhí)行比色基因分型的集成設(shè) 計。它使得在同一個平臺執(zhí)行PCR和隨后的基因分型步驟。由電池供電的LED 112提供了照 明樣本的白色寬帶光源，以使得產(chǎn)生的吸光顏色（即，粉紅色的色調(diào)）可以由攝像機118捕 獲。如視圖100所示，LED 112以45°的方向傾斜以防止光使攝像機118的視場飽和。PCR裝置 102需要5伏直流低壓電源并且獲取少于2安培的電流，并且潛在的可以從偏僻戶外的汽車 電池中獲取電力。
[0031]已經(jīng)開發(fā)出一些常規(guī)的基于熒光的實時PCR裝置用于P0C診斷，但是根據(jù)本實施 例，實現(xiàn)了比色實時PCR裝置102。該POC PCR裝置102被設(shè)計的便攜性更好。其可以由5伏直 流電源而不是典型的12伏電源供電。另外，加熱模塊104具有用于200微升PCR管中的三個樣 本的相同患者吞吐量的較小引腳，其中，每個樣本由指定的一個白光L E D光源112照明。此 外，沒有使用典型的光電倍增管(PMT)，在PCR裝置102中代替使用了聚焦透鏡116、激發(fā)和發(fā) 射濾光片114和低成本的網(wǎng)絡(luò)攝像機118。
[0032]雖然P0C裝置被設(shè)計為便攜性的，但是臺式裝置被設(shè)計為通過將該裝置連接到常 規(guī)的熱循環(huán)儀而用于96或384樣本的較大吞吐量，其中，加熱塊容納高達96或384個樣本。參 考圖2,描述了根據(jù)本實施例的實時比色和終點臺式PCR系統(tǒng)202的前平面視圖200 JCR系統(tǒng) 202包括光絕緣裝置204、內(nèi)置LED光源、網(wǎng)絡(luò)攝像機208、菲涅耳透鏡、白色不透明微量滴定 板和4.5伏的直流電池電源210。使用了標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀212，例如，美國加利福尼亞州的B i 〇 -Rad實驗室出售的Bio-Rad PTC 200熱循環(huán)儀，并且成像、LED照明和熱加熱/循環(huán)由計算機 214上的軟件進行軟件控制。網(wǎng)絡(luò)攝像機由計算機/筆記本電腦的USB接口通過USB電纜216 供電，而LED光源既可以由4.5伏的直流電池電源210供電或者也可以替換的由計算機214的 USB接口通過USB電纜216供電。通過USB串口端口接口 218與熱循環(huán)儀212和網(wǎng)絡(luò)攝像機208 直接軟件通信。菲涅耳透鏡與偏振濾光器一起使用，以使得攝像機208捕獲96孔的板的整個 視場，而沒有來自菲涅耳表面的光反射和眩光，將參考圖3對此作更詳細的描述。
[0033]傳統(tǒng)上，常規(guī)的臺式實時PCR裝置是基于熒光的，因此，需要昂貴的成像部件。在大 多數(shù)情況下，這些裝置也包含昂貴的光學(xué)掃描儀。根據(jù)本實施例，提供了包括攝像模塊的低 成本臺式PCR系統(tǒng)202,其可以潛在地與實驗室和醫(yī)院常用的各種熱循環(huán)儀連接。PCR系統(tǒng) 202被設(shè)計為具有成本效益的，正因為如此，低成本的網(wǎng)絡(luò)攝像機208用于成像。鑒于色度信 號具有的對比度通常比熒光信號的對比度較差，并且網(wǎng)絡(luò)攝像機208不同于科學(xué)攝像機，其 靈敏度較差，在不影響攝像機208覆蓋整個板的情況下，將攝像機208安裝的盡可能的靠近 微量滴定板。攝像機208、內(nèi)置LED光源、光絕緣裝置204、電池電源210、菲涅耳透鏡和微量滴 定板的功能為作為可以被插入到標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)儀212中并耦合到標(biāo)準(zhǔn)計算機214以對比色分 析進行測量和定量的模塊。
[0034] 參考圖3A，示意圖300示出了菲涅耳透鏡302和微量滴定板304組件。菲涅爾透鏡 302可以是這樣的菲涅耳透鏡，例如，美國新澤西州的EdmundOptics所出售的，并且白色不 透明微量滴定板304可以是白色微孔板，例如，美國馬薩諸塞州的Thermo Fisher Scientific公司所出售的并且具有96個孔306或者384個孔306的白色微孔板。菲涅耳透鏡 302使得能夠獲得整個孔板（即，使得整個96或者384孔微量滴定板304廣角成像）。菲涅耳透 鏡302被牢固地安裝在微量滴定板304的右上方，其中，假設(shè)孔306中的樣本反射的光線308 都垂直于菲涅爾透鏡302。菲涅爾透鏡302折射光線308以使得折射光線310形成檢測器模塊 312 (檢測器模塊312包括攝像機212)的成像平面中的良好分辨率點。來自菲涅爾透鏡304的 光的反射和眩光是比色系統(tǒng)關(guān)注的問題，比色系統(tǒng)與基于熒光的系統(tǒng)不同，其不具有克服 該問題的帶通濾波器。根據(jù)本實施例，偏振濾光器用于解決這個問題。
[0035]圖3B描述了作為插入到熱循環(huán)儀212中的模塊的一部分的菲涅耳透鏡302和微量 滴定板304組件的前平面視圖320。根據(jù)本實施例，菲涅耳透鏡302直接位于微量滴定板304 的上方，微量滴定板304的尺寸約為12.8厘米X 8.6厘米，并且菲涅爾透鏡302的焦距為10英 寸，厚度約為〇. 15厘米。菲涅爾透鏡302使得微量滴定板304中的外圍的孔306的底部是可見 的。實際上，假設(shè)菲涅耳透鏡302和檢測器模塊312之間的垂直距離約為14.5厘米，則5英寸 的焦距應(yīng)使得外圍的孔306的底部更好的可見。
[0036]菲涅耳透鏡302是丙烯酸類，其被直接置于微量滴定板304上，從而有利地確保從 孔306中的每個樣本中發(fā)出的光線308和影響孔306中的每個樣本的LED光線大約在如視圖 300所示的對象上是遠心的。白色不透明的96孔微量滴定板304為比色讀出提供了良好的對 比度。另外，每個孔306有利地具有圓形的底部以將雜合溶液濃縮到小區(qū)域，以進一步增加 吸收強度。根據(jù)本實施例，8個LED燈被置于光絕緣裝置204內(nèi)的頂板的角落和側(cè)面，并且為 了檢測清晰度，所述絕緣裝置204由黑色的陽極電鍍鋁制造。所有LED燈并聯(lián)到4.5伏的直流 電池210，并且攝像機212安裝在位于模塊的中心頂部的檢測器模塊312中。
[0037]在Matlab中通過USB接口 218實現(xiàn)攝像機212和熱循環(huán)儀212和珀爾帖加熱模塊的 實時控制。參考圖4,描述了用于初始化、成像和終止根據(jù)本實施例的圖2的PCR系統(tǒng)的成像 會話的Matlab代碼400 Jatlab圖像采集工具箱用于通過其窗口視頻驅(qū)動器從網(wǎng)絡(luò)攝像機 212獲得實時視頻播放和靜態(tài)圖像。網(wǎng)路攝像機212通過USB電纜218連接到電腦/筆記本電 腦 214。
[0038]珀爾帖加熱模塊包括PCR系統(tǒng)2 0 2的溫度控制器，例如，美國加利福尼亞州的 八(^111:1161'1]1〇技術(shù)公司出售的？1'(]100?10控制器，其也是通過計算機214的串行端口驅(qū)動器 使用串行端口電纜218和USB轉(zhuǎn)串口適配器進行控制。參考圖5，描述的Matlab代碼500用于 與根據(jù)本實施例的PCR系統(tǒng)202的溫度控制器進行通信。代碼500是用于執(zhí)行實時熱循環(huán)或 終點解鏈曲線分析的程序例程。圖6和圖7示出了根據(jù)本實施例的遠程溫度控制兩種設(shè)計。 [0039]圖6示出了PCR 202的第一溫度控制方案的部件流向圖600。溫度控制器602通過熱 電偶傳感器606感測加熱板604(例如，銅座）的加熱板溫度，并且產(chǎn)生發(fā)送到放大器610的脈 沖寬度調(diào)制（PWM)信號608,例如，放大器610是美國加利福尼亞州的熱磁公司出售的 FTA600H-橋放大器板，放大器610反過來又產(chǎn)生反饋給珀爾帖加熱器614的輸出電壓612。前 端Matlab程序500從溫度控制器602讀取加熱板溫度616,并將一組溫度信號618和使能信號 620提供給溫度控制器602,以啟動加熱或冷卻過程。
[0040]圖7示出了PCR202的第二溫度控制方案的部件流向圖700。由美國馬薩諸塞州的模 擬器件公司出售的AD595CDZ集成電路芯片702通過K型熱電偶傳感器704感測珀爾帖溫度。 將溫度706以模擬電壓信號讀出，其隨后又由前端Matlab程序500通過輸入-輸出（I/O) Arduino UNO板708 (例如，由美國科羅拉多州的SparkFun電子所銷售的）讀出。Mat lab程序 500實現(xiàn)了PID控制器，并產(chǎn)生發(fā)送到H-橋放大器板610的PWM信號710和控制信號(例如，使 能信號620和DIR??信號712)，所述控制信號再次通過接口板708,以對發(fā)送到珀爾帖加熱器 614的輸出電壓612進行調(diào)節(jié)。
[00411圖8包括圖8A和8B，其示出了用于通過根據(jù)本實施例的PCR系統(tǒng)202的網(wǎng)絡(luò)攝像機 208和熱循環(huán)儀212的軟件控制來完成解鏈曲線的Matlab代碼800。最初提示用戶輸入溫度 范圍和增量，以及樣本保持在給定溫度以進行解鏈曲線分析的持續(xù)時間。前端Matlab程序 800通過指示熱循環(huán)儀212在輸入的溫度中循環(huán)來遠程控制熱循環(huán)儀212,其中，每個溫度的 保持時間由用戶指定。當(dāng)保持時間結(jié)束時，由網(wǎng)絡(luò)攝像機208捕獲整個微量滴定板304的圖 像并將該圖像存儲在計算機214的硬盤上。對每個溫度重復(fù)該循環(huán)。
[0042]解鏈曲線是x_y曲線圖，由此y軸表示相對吸光度單位(a.u.)，并且x軸表示以°C為 單位的溫度。解鏈溫度(Tm)被定義為單鏈DNA探針雜合溶液從粉紅色色調(diào)變?yōu)闊o色時的溫 度。
[0043]通過利用Matlab圖像處理工具箱首先將獲得的圖像轉(zhuǎn)換到亮度(Y)-藍色色度 (Cb)_紅色色度(Cr)或者YCbCr顏色空間，來提取顏色信息。這樣做是為了從亮度信息中分離 出顏色。接著，提取紅色色度信息作為監(jiān)測顏色變化的代理，這是因為紅色是雜合溶液的粉 紅色色調(diào)的主要成分。鑒于解鏈曲線由紅色色度Cr和溫度T表示，所以將解鏈溫度T m定義為 解鏈曲線上的-
為最大值的點。
[0044]圖9描述了由PCR系統(tǒng)102形成的三種不同單鏈DNA探針雜合溶液的解鏈曲線輪廓 902、904、906的曲線圖900。沿x軸910繪制的是溫度，并且沿y軸912繪制的是相對吸光度單 位中的紅色通道相對于基線（即，在35°C處的值）的值的減小。如從曲線圖900看出的，解鏈 溫度(T m)的范圍為35-53°C，以2°C遞增。還可以觀察到，顏色變化是漸進的并且在6-8°C以 上發(fā)生。該P〇C PCR系統(tǒng)102使得能夠?qū)θ齻€樣本進行高對比度成像，其中，粉紅色色調(diào)和背 景或無色溶液之間的對比是視覺上清晰可見的。
[0045]圖10描述了根據(jù)PCR系統(tǒng)202的第一和第二溫度控制方案的溫度感測的曲線圖 1000,其中，沿x軸1002繪制的是一組溫度，并且沿y軸1004繪制的是感測溫度。在第一熱感 測方案中使用的熱感測單元606沿著跡線1006繪制，在第二熱感測方案中使用的熱感測單 元704沿著跡線1008繪制，商用K型參考熱電偶（例如，臺灣臺北的路創(chuàng)電子（Lutron Electronic)企業(yè)公司出售的TM-947SD)沿著跡線1010繪制?？梢钥闯觯瑹岣袦y單元606、704 在25-95°C的整個溫度范圍內(nèi)具有線性輪廓1006、1008,并且它們的讀數(shù)與商業(yè)參考熱電偶 (跡線1010)密切相關(guān)，在95°C的最大誤差容限約為±2°C。沿著x軸的該組溫度由商業(yè)恒溫 混勾儀(例如，德國Eppendorf的舒適系列所出售的)定義。
[0046]圖11描述了在PCR系統(tǒng)202的微量滴定板304的不同孔306中的兩個相同單鏈DNA探 針雜合溶液的解鏈曲線輪廓圖1102、1104的曲線圖1100。沿x軸1110繪制的是溫度，并且沿y 軸1112繪制的是相對吸光度單位中的紅色通道相對于基線（即，在35°C處的值）的值的減 小。通過將光絕緣裝置204提高至距離熱循環(huán)儀212的加熱板614約10厘米，允許環(huán)境照明進 入到光絕緣裝置204內(nèi)部。4個孔306的2個(孔A1120和孔B 1122)裝載有相同的單鏈DNA探針 雜合溶液。盡管兩個孔1120、1122中的顏色變化的幅度不同，但是解鏈溫度1130 (約等于47 °C)卻是相同的。
[0047]圖12描述了由安裝在PCR系統(tǒng)202光絕緣裝置204中的LED照明的96孔微量滴定板 304的俯視平面圖1200。相對于暴露于環(huán)境光的孔1120、1122 (圖1 )，觀察到信號對比度的改 進。然而，該對比度在四個角落孔1202、1204、1206、1208中明顯較弱。這歸因于對這些孔(例 如，參見角落孔1208)中的樣本的部分遮擋。在視圖1200中還可以觀察到非均勻照明1210和 光反射熱點1212。通過在攝像機208的光軸的周圍環(huán)形布置LED，可以解決非均勻照明1210 的問題?？商鎿Q的，增加 LED到微量滴定板304的距離和/或增加安裝的LED的數(shù)量，可提升更 好的光均勻性，這是因為這增加了單個LED燈在微量滴定板304上的投影的重疊。反射熱點 1212歸因于光跳離菲涅耳透鏡302,這可以通過加入沿光軸的偏振濾光器來解決。外圍的孔 1202、1204、1206、1208中的樣本的部分遮擋，可以通過使用具有更強的折射能力（即，焦距 較短）的菲涅耳透鏡302來解決。
[0048] 參考圖13,其描述了使用PCR系統(tǒng)202的紅色色度所進行的解鏈曲線分析中的自動 顏色變化的曲線圖1300。除了相對于亮度變化來說是穩(wěn)定的之外，紅色色度與在曲線圖 1100(圖11)中提取的紅色信道信息相似。首先將原始圖像的紅-綠-藍(RGB)顏色空間轉(zhuǎn)換 到亮度-藍色色度-紅色色度(YCbCr)顏色空間，之后，提取紅色色度(C r)并且相對于基線歸 一化，在這種情況下，基線對應(yīng)于在30°C的值。溫度沿著x軸1302繪出，并且歸一化的紅色色 度沿著y軸1304繪出。隨著從粉紅色到無色的顏色變化，孔1306中的紅色色度降低，這證明 紅色色度(C r)的使用有利地提高了對比度，同時減少了非均勻照明對比色信號的影響。
[0049] 因此，可以看出，低成本、快速、自動化以及基于比色的基因分型裝置的系統(tǒng)已經(jīng) 用于P0C和臺式機。盡管P0C裝置具有有限的吞吐量，但是能夠一次分析3種DNA樣本，因此它 是便攜的并且可以由電池供電。與此相反，臺式裝置具有高吞吐量，這是因為它利用標(biāo)準(zhǔn)熱 循環(huán)儀的格式，但是它用于實驗室。
[0050] 另外，本實施例能夠生成解鏈曲線并定位解鏈溫度。LED的排列對于確保視場的均 勻照明來說至關(guān)重要，例如，96孔微量滴定板304。不是將LED放置在光絕緣裝置204內(nèi)的頂 板的角落和側(cè)面，圍繞攝像機208的光軸的LED的環(huán)形配置產(chǎn)生更均勻的照明。另外，增加 LED到微量滴定板304的距離和/或增加安裝的LED的數(shù)量，將增加單個LED燈在微量滴定板 304上的投影的重疊，并且這又反過來提升更好的光均勻性。
[0051] 同樣的，根據(jù)本實施例，菲涅耳透鏡302提供了在不需要掃描系統(tǒng)的情況下對整個 微量滴定板成像的具有成本效益的方法。來自菲涅爾透鏡302的光滑的表面的內(nèi)部反射和 眩光可以不利地影響比色讀出，通過在攝像機208入口處安裝偏振濾光器，可以消除或者顯 著減少所述內(nèi)部反射和眩光。可以通過增加 LED的數(shù)量來抵消由于偏振濾波器而導(dǎo)致的傳 輸損耗。可替換的，可以以反射不會遮蔽孔的方式來設(shè)置LED的位置。
[0052]雖然焦距為10英寸的菲涅爾透鏡302可能僅使得在微量滴定板的拐角處的孔的基 座部分可見，但是使用焦距較短的菲涅耳透鏡或者增加微量滴定板304到攝像機208的距 離，可以有利的使外圍孔1202、1204、1206、1208的基座出現(xiàn)在攝像機208的視場內(nèi)。盡管在 對本發(fā)明的前述的詳細描述中已經(jīng)提出了示例性的實施例，但是應(yīng)當(dāng)理解，存在大量的變 化。
[0053]還應(yīng)當(dāng)理解，示例性實施例僅僅是示例，并且不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范 圍、應(yīng)用、操作或者配置。相反，前面的詳細描述將為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供實現(xiàn)本發(fā)明的示 例性實施例的方便的路線圖，應(yīng)當(dāng)理解，在不背離如所附的權(quán)利要求書所提出的本發(fā)明的 范圍的情況下，可以對在示例性的實施例中描述的操作方法和元件的功能和配置作出各種 改變。
【主權(quán)項】
1. 一種基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其包括： 檢測器模塊，其被設(shè)置為記錄由光源照明的DNA樣本的圖像； 處理器;和 包括計算機程序代碼的存儲器，其中，所述存儲器和所述計算機程序代碼被配置為利 用所述處理器至少執(zhí)行： 發(fā)送信號以將所述DNA樣本的溫度調(diào)整到所述DNA樣本的顏色發(fā)生變化的近似溫度范 圍內(nèi)； 向所述檢測器模塊發(fā)送信號以在所述近似溫度范圍內(nèi)以定義的間隔捕獲所述DNA樣本 的圖像； 對捕獲的圖像進行處理以提取顏色信息；以及 對提取的顏色信息進行處理以客觀地確定所述DNA樣本的顏色發(fā)生變化時的所述近似 溫度范圍內(nèi)的解鏈溫度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述存儲器和所述計算機程 序代碼被配置為利用所述處理器進一步執(zhí)行:通過對提取的顏色信息執(zhí)行微分數(shù)學(xué)運算獲 得所述解鏈溫度。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述存儲器和所述計算機程 序代碼被配置為利用所述處理器進一步執(zhí)行： 利用提取的顏色信息構(gòu)建解鏈曲線；以及 利用所述微分數(shù)學(xué)運算分析所述解鏈曲線以獲得所述解鏈溫度。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述解鏈溫度對應(yīng)于所述 微分數(shù)學(xué)運算得到最大的極大值的溫度。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述存儲器和 所述計算機程序代碼被配置為利用所述處理器進一步執(zhí)行:通過屬于所述DNA樣本顏色落 入的波長范圍的一部分提取的顏色信息，客觀地確定所述解鏈溫度。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述DNA樣本具有粉紅色顏 色，以便通過屬于紅色波長范圍的提取的顏色信息，客觀地確定所述解鏈溫度。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，在所述DNA樣本 經(jīng)歷的每個聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)循環(huán)中的退火或延伸步驟捕獲所述圖像。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，通過當(dāng)所述DNA 樣本的溫度被調(diào)整到在所述近似溫度范圍內(nèi)時捕獲的所述DNA樣本的圖像，客觀地確定所 述解鏈溫度。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，在捕獲了在所 述近似溫度范圍內(nèi)的所述DNA樣本的所有圖像之后，客觀地確定所述解鏈溫度。10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括用于所 述DNA樣本的加熱模塊，其中，所述加熱模塊接收所述信號，以將所述DNA樣本的溫度調(diào)整到 所述DNA樣本的顏色發(fā)生變化的所述近似溫度范圍內(nèi)。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括溫度控制裝置，所述 處理器與所述溫度控制裝置通信以控制所述DNA樣本的溫度，所述溫度控制裝置耦合到所 述加熱模塊和所述處理器。12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括： 用于檢測所述DNA樣本的溫度的傳感器，其中，所述存儲器和所述計算機程序代碼被配 置為利用所述處理器進一步執(zhí)行： 當(dāng)從所述傳感器讀出的所述DNA樣本的溫度沒有落入所述溫度范圍時，發(fā)送所述信號 以將所述DNA樣本的溫度調(diào)整到所述DNA樣本的顏色發(fā)生變化的所述溫度范圍內(nèi)。13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括被設(shè)置 為照明所述DNA樣本的光源。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括位于所述DNA樣本的 上游并且在所述檢測器模塊透鏡前面的透鏡。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括設(shè)置在所述檢測器模 塊透鏡處的偏振濾光器。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括設(shè)置在所述光源處的 偏振濾光器，其中，確定設(shè)置在所述檢測器模塊透鏡處的所述偏振濾光器和設(shè)置在所述光 源處的所述偏振濾光器的方向，以建立布魯斯特角，所述布魯斯特角使在位于所述DNA樣本 的上游和所述檢測器模塊前面的所述透鏡處發(fā)生反射衰減。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括光絕緣體，其覆蓋所 述光源、透鏡、設(shè)置在所述檢測器模塊透鏡處的所述偏振濾光器、至少所述檢測器模塊透鏡 和所述加熱模塊。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述光絕緣體進一步覆蓋 設(shè)置在所述光源處的所述偏振濾光器。19. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括光絕緣外殼，所述透 鏡、設(shè)置在所述檢測器模塊透鏡處的所述偏振濾光器、至少所述檢測器模塊透鏡和所述加 熱模塊設(shè)置在所述光絕緣外殼內(nèi)。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述光源位于所述光絕緣 外殼外部并相對于所述DNA樣本沿著其定向的軸傾斜。21. 根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，進一步包括用于安裝所述光 絕緣外殼的所有部件的基座。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述處理器和所述存儲器 被設(shè)置在所述基座上。23. 根據(jù)權(quán)利要求1-19中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述處理器 和所述存儲器位于單獨的計算機終端上。24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述檢測器 模塊是USB攝像機。25. 根據(jù)權(quán)利要求12-23中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述光源是 一個或多個白光LED。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述一個或多個白光LED被 布置成環(huán)狀。27. 根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述一個或多個白光 LED適于由計算機USB接口供電。28. 根據(jù)權(quán)利要求14-27中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述透鏡是 菲涅耳透鏡。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述菲涅耳透鏡的焦距為 從約IO cm到約20 cm。30. 根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述光絕緣體的高度 為從約IOcm到約20cm。31. 根據(jù)權(quán)利要求17、18和30中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所述光 絕緣體的長度為從約13 cm到約20 cm 〇32. 根據(jù)權(quán)利要求17、18、30或31中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所 述光絕緣體的寬度為從約8 cm到約14cm。33. 根據(jù)權(quán)利要求17、18和30-32中的任一項所述的基于比色的DNA診斷系統(tǒng)，其中，所 述光絕緣體的尺寸符合標(biāo)準(zhǔn)微孔板。
【文檔編號】G01N33/53GK105917227SQ201480073007
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2014年11月7日
【發(fā)明人】應(yīng)儀如, S·K·庫馬拉薩米
【申請人】新加坡科技研究局