一種聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒，由核酸共提取液、四重RT?qPCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、五個(gè)濃度的陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品組成。本發(fā)明可簡(jiǎn)便快速地在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)、平行地檢測(cè)四種常見兒童呼吸道病毒(RSV、INF、HMPV、ADV)的感染，實(shí)現(xiàn)了單管PCR同時(shí)檢測(cè)四種不同類型核酸的病毒，且能夠定量檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，特異性、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并可根據(jù)所檢測(cè)的病毒核酸拷貝數(shù)的大小為呼吸道病毒感染患者提供早期明確診斷和防治，監(jiān)測(cè)臨床療效，對(duì)阻斷傳染源、減少病毒感染或監(jiān)測(cè)及鑒別診斷多種病毒混合感染均有極大的臨床價(jià)值。
【專利說明】
一種聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及一種快速聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR (Reverse transcription quantitative PCR，RT_qPCR)試劑盒，尤其涉及檢測(cè)呼吸道合胞 病毒（Respiratory syncytial virus，RSV)，流感病毒（Influenza virus，INF)、人類偏肺 病毒(Human metapneumovirus，HMPV)、腺病毒(Human adenovirus，ADV)的四重逆轉(zhuǎn)錄定量 PCR試劑盒，具體地說，本發(fā)明涉及應(yīng)用四重RT-qPCR技術(shù)在一個(gè)PCR反應(yīng)管中快速、平行地 同時(shí)檢測(cè)RNA病毒和DNA病毒(1?￥、1即、圓?￥^0￥)的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，各種流感病毒的流行讓人們對(duì)呼吸道病毒性傳染病越發(fā)關(guān)注。兒童由于 免疫功能尚未發(fā)育完全，成為急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection, ARTI)的高發(fā)人群，據(jù)WHO最新統(tǒng)計(jì)，肺炎和腹瀉仍為5歲以下兒童死亡的首位病，該年齡段 死于上述兩者疾病的比例高達(dá)29%。兒童肺炎常見病原包括細(xì)菌、病毒、非典型病原體等， 其中，在嬰幼兒中，約50 %的肺炎由病毒引起。兒童急性呼吸道感染臨床表現(xiàn)通常相似，依 靠影像學(xué)技術(shù)和常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)難以鑒別診斷，但是如果病原學(xué)診斷不明確，將導(dǎo)致臨床醫(yī) 生對(duì)兒童急性呼吸道病毒感染盲目使用抗生素，不僅大大增加 ARTI兒童的診療時(shí)間和費(fèi) 用，而且造成細(xì)菌耐藥，給醫(yī)患雙方都帶來麻煩。
[0003] 大量流行病毒調(diào)查認(rèn)為兒童呼吸道感染中RSV感染率最高，在世界范圍內(nèi)，約22% 的急性下呼吸道感染與RSV有關(guān)，且至少10%會(huì)發(fā)展為重癥感染需住院治療。而ADV、INF、 HMPV均被認(rèn)為是重要的病原體，HMPV雖于2001年新近發(fā)現(xiàn)，但血清學(xué)研究提示HMPV在人群 中至少存在了50年。許多調(diào)查研究表明HMPV與兒童ARTI密切相關(guān)，是兒童肺炎的第二位病 因，僅次于RSV。
[0004] 在分子診斷技術(shù)未發(fā)展之前，檢測(cè)病毒手段主要包括病毒培養(yǎng)，血清學(xué)檢測(cè)等，但 病毒培養(yǎng)要求十分高，一般在實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用，且檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)，血清學(xué)方法技術(shù)成熟，有商 品試劑盒供應(yīng)，但是敏感性和特異性有待提高，同時(shí)，需要檢測(cè)急性期和恢復(fù)期雙份血清才 有診斷意義且容易漏診。PCR(Polymerase chain reaction)技術(shù)的出現(xiàn)改善了這種局面， 其中多重定量PCR(Multiplex quantitative PCR)更適合于多種病毒混合感染的鑒別診 斷，且取材方便，需用標(biāo)本量少，減少勞動(dòng)力，在需要同時(shí)檢測(cè)大量樣品的時(shí)候更具有優(yōu)越 性，有利于提高操作規(guī)程的標(biāo)準(zhǔn)化。目前多重PCR技術(shù)或許由于受核酸提取的限制，主要應(yīng) 用于檢測(cè)同一種類型核酸的病毒，而常見呼吸道病毒往往包括多種病毒核酸，如腺病毒 (Human adenovirus，ADV)為DNA病毒，而呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus，RSV)等為RNA病毒，其重要性相當(dāng)，因此同時(shí)檢測(cè)DNA病毒和RNA病毒具有重要意義。
[0005] 單管PCR同時(shí)定量檢測(cè)以上4種常見兒童呼吸道病毒，不僅快速準(zhǔn)確、節(jié)約成本，還 可根據(jù)病毒拷貝數(shù)為小兒肺炎患者提供早期明確診斷和防治，為臨床治療方案的制定提供 參考依據(jù)，從而提高臨床決策水平，有效降低抗生素的過度使用，監(jiān)測(cè)臨床療效，并最終改 善患者預(yù)后。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆 轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)試劑盒，由核酸共提取液、四重RT-qPCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性 質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、五個(gè)濃度的陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品組成，其中四重RT-qPCR反應(yīng)液為四組 引物、探針以及RT-qPCR反應(yīng)緩沖液、Hot Start Taq DNA聚合酶、PrimeScrip RT逆轉(zhuǎn)錄酶 構(gòu)成的混合液，陰性質(zhì)控品為滅菌注射用水，強(qiáng)、弱陽性質(zhì)控品為由1^、1即、圓?￥^0￥等量 混合的陽性質(zhì)粒樣品（ADV為質(zhì)粒，RSV、INF、HMPV為根據(jù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄而來的RNA片段），其中強(qiáng) 陽性質(zhì)控品濃度l〇 6Copies/yl，弱陽性質(zhì)控品濃度102Copies/yl，五個(gè)濃度陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品 是由RSV、INF、HMPV、ADV等量混合的質(zhì)粒樣品(ADV為質(zhì)粒，RSV、I NF、HMPV為根據(jù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄而 來的RNA片段），濃度分別為 102CopiesAU、103CopiesAU、104CopiesAU、10 5CopiesAU、 106Copies/yl〇
[0007] 所述的引物及其特異性定量PCR熒光探針序列、標(biāo)準(zhǔn)品序列如下：
[0024] 3六1\1^、兀？、陬?是41161〇探針的四種不同熒光素。
[0025] RSV標(biāo)準(zhǔn)品序列：
[0030] INF標(biāo)準(zhǔn)品序列：

[0042]所述的特異性四重RT-qPCR引物，是長(zhǎng)度為20 ± 3Nt的寡核苷酸鏈，與RSV、INF、 HMPV、ADV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補(bǔ)。
[0043]所述的特異性四重RT-qPCR熒光探針，是長(zhǎng)度為25 ±4Nt的寡核苷酸鏈，與RSV、 INF、HMPV、ADV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補(bǔ)，所有探針的5'端和3'端均使用 AllGlo探針進(jìn)行標(biāo)記，AllGlo探針的每種染料既是報(bào)告基團(tuán)又是粹滅基團(tuán)。
[0044]本發(fā)明四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒的快速檢測(cè)方法包括如下步 驟：
[0045] (1)引物和熒光探針設(shè)計(jì):在GenBank中檢索獲得呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)，流感病毒（Influenza virus，INF)、人類偏肺病毒（Human metapneumovirus，HMPV)、腺病毒（Human adenovirus，ADV)特異性保守基因，通過序列比 對(duì)，確定它們各自的高度保守序列區(qū)，作為四種病毒的待檢靶基因特異性核酸序列分別設(shè) 計(jì)特異引物和熒光探針；
[0046] (2)標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品：根據(jù)（1)中確定的特異引物，利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建四種分 別含有1^￥、1冊(cè)、腿?￥^0￥高度保守序列區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子；另將1?￥、1冊(cè)、腿?￥三種1?祖病 毒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子(DNA)體外轉(zhuǎn)錄成RNA片段，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品。
[0047] (3)四重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(Reverse transcription quantitative PCR，RT_qPCR) 反應(yīng)液:使用步驟（1)中的引物和探針及RT-qPCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等成分 組成四重RT-qPCR反應(yīng)液，利用正交設(shè)計(jì)篩選各個(gè)濃度的引物、探針、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、 模板的組合，優(yōu)化四重RT-qPCR反應(yīng)體系，根據(jù)反應(yīng)效率和曲線確定最終的PCR反應(yīng)體系； [0048] (4)標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用（3)中的四重RT-qPCR反應(yīng)體系，將RSV、INF、HMPV重組質(zhì)粒（已 知拷貝數(shù))體外轉(zhuǎn)錄而成的對(duì)應(yīng)RNA片段或ADV根據(jù)重組質(zhì)粒（已知拷貝數(shù))連續(xù)10倍倍比稀 釋，加入到四重RT-qPCR主反應(yīng)液中，綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值和基 線，進(jìn)行結(jié)果分析，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0049] (5)臨床驗(yàn)證：用含1?￥、1即、腿?￥^0￥的臨床呼吸道標(biāo)本0嫩或1?嫩提取液作為模 板，進(jìn)一步用本試劑盒確立的方法和條件進(jìn)行四重RT-qPCR擴(kuò)增。
[0050] 所述的特異性四重RT-qPCR熒光探針，指的是長(zhǎng)度為25 ±4Nt的寡核苷酸鏈，與 1?￥、1即、圓?￥^0￥待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補(bǔ)，所有探針的5/端和3 /端均 使用AllGlo探針進(jìn)行標(biāo)記，AllGlo探針的每種染料既是報(bào)告基團(tuán)又是粹滅基團(tuán)。
[0051] 所述的試劑盒包括如下成分:①核酸共提取液;②質(zhì)控品（陰性、強(qiáng)陽性、弱陽性） 及陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品;③四重焚光PCR反應(yīng)液。
[0052]所述的引物及其特異性定量PCR熒光探針序列、標(biāo)準(zhǔn)品序列同上。
[0053] 所述的多重定量PCR指的是四重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR (RT-qPCR)方法。
[0054] 所述的待檢靶基因特異性核酸序列，指的是針對(duì)每一種病毒所特有的一段基因序 列。
[0055] 所述的標(biāo)準(zhǔn)品，指的是利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建的人工重組質(zhì)粒，每種質(zhì)粒只重組 一種特異待檢靶基因序列，其中將RSV、INF、HMPV三種RNA病毒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子(DNA)體外轉(zhuǎn) 錄成RNA片段，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，ADV的標(biāo)準(zhǔn)品認(rèn)為人工重組質(zhì)粒(DNA)。
[0056] 所述的四重RT-qPCR反應(yīng)體系，指的是由四組引物、探針以及RT-qPCR反應(yīng)緩沖液、 四種核苷酸單體(dNTPs)、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等組成的混合液。
[0057]所述的四重RT-qPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，指的是不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子(ADV)和根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子轉(zhuǎn)錄而來的RNA片段(RSV、INF、HMPV)作為模板用四重RT-qPCR反應(yīng)液進(jìn)行檢 測(cè)所得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R 2均大于0.99,擴(kuò)增效率在0.91-0.98之間，基本滿足定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 的要求。
[0058] 所述的四種呼吸道病毒聯(lián)檢包括三種RNA病毒（呼吸道合胞病毒、流感病毒和人類 偏肺病毒以及DNA病毒(腺病毒），且采用一步法四重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR(RT-qPCR)單管同時(shí)定 量檢測(cè)四種上述不同核酸類型的病毒。
[0059] 本發(fā)明根據(jù)1^￥、1即、圓?￥^0￥特異性的保守基因，登錄66他&1^獲取相關(guān)序列，應(yīng) 用Clustalw軟件對(duì)所有序列比對(duì)分析，挑選最保守的基因序列用Primer Premiers 5.0軟 件設(shè)計(jì)引物，登錄NCBI通過BLAST程序比對(duì)分析，四種病毒各篩選出一對(duì)特異性最強(qiáng)的引物 和相應(yīng)的特異探針，用自制的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)分子(ADV為靶基因質(zhì)粒克隆載體，RSV、INF、 HMPV為根據(jù)基因質(zhì)粒克隆載轉(zhuǎn)錄而來的RNA片段)作為模板，在ABI 7500定量PCR儀中進(jìn)行 單、四重RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化四重RT-qPCR反應(yīng)體系，確定該方法的靈敏度、特異性、重復(fù)性 等，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后用該方法檢測(cè)臨床陰、陽性標(biāo)本各5份，并應(yīng)用SYRB Green RT-qPCR 法檢測(cè)標(biāo)本，測(cè)序驗(yàn)證，進(jìn)行結(jié)果比較，分析四重RT-qPCR方法的可靠性。
[0060] 本發(fā)明是一種主要針對(duì)引起小兒呼吸道感染的四種常見呼吸道病毒的早期、快 速、簡(jiǎn)便而有效的四重RT-qPCR檢測(cè)試劑盒，涉及的病原體包括RSV、INF、HMPV、ADV，采用 AllGlo熒光素標(biāo)記探針，建立了一種基于AllGlo探針技術(shù)的單管四重RT-qPCR同時(shí)檢測(cè)四 種病毒的方法，且檢測(cè)靈敏度仍較高，對(duì)于單個(gè)樣本檢測(cè)時(shí)間約為1個(gè)小時(shí)，操作簡(jiǎn)便，并且 可以進(jìn)行大批量的樣本分析檢測(cè)，較現(xiàn)有的病毒培養(yǎng)方法在檢測(cè)時(shí)間、鑒定程序、檢出率等 方面有了極大的提高，較血清學(xué)檢測(cè)在檢測(cè)靈敏度、特異性、定量等方面均有很大的提高或 改進(jìn)，對(duì)小兒呼吸道病毒的感染或混合感染的流行監(jiān)控、快速鑒定、療效判斷等方面具有很 大幫助。
[0061] 本發(fā)明可以簡(jiǎn)便快速地在一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)、平行地檢測(cè)不同類型核酸四種病毒 的感染，并可根據(jù)病毒拷貝數(shù)，為小兒呼吸道感染患者提供早期明確診斷和防治，為臨床治 療方案的制定提供參考依據(jù)，從而提高臨床決策水平，有效降低因誤診為細(xì)菌感染而導(dǎo)致 的抗生素過度使用，對(duì)阻斷傳染源、減少1?￥、1即、圓?￥^0￥感染或混合感染、監(jiān)測(cè)臨床療效 均有很大的臨床價(jià)值。采用本發(fā)明提供的試劑盒，解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法的諸多缺陷:包括檢 測(cè)速度慢、不能檢測(cè)多重感染、不能定量、特異性較差或者成本高、操作繁瑣等，實(shí)現(xiàn)了單管 PCR同時(shí)定量檢測(cè)DNA病毒和RNA病毒。本試劑盒操作簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，特異性好，重復(fù)性 好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，其應(yīng)用前景看好。
【附圖說明】
[0062]圖1是呼吸道合胞病毒在四重RT-qPCR中的標(biāo)準(zhǔn)曲線（斜率為-3.541，截距為 40.693，R2為0.995)。
[0063]圖2是甲型流感病毒在四重RT-qPCR中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(斜率為-3.482，截距為41.023， R2為0.997)。
[0064]圖3是人類偏肺病毒在四重RT-qPCR中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(斜率為-3.351，截距為41.005， R2為0.993)。
[0065]圖4是腺病毒在四重定量PCR(實(shí)際應(yīng)用為RT-qPCR)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(斜率為-3.351， 截距為41.005，R2為0.993)。
[0066] 注：上述模板為1^￥、1冊(cè)、腿?￥)0￥等量混合質(zhì)粒(40￥為靶基因質(zhì)?？寺≥d體， RSV、INF、HMPV為根據(jù)基因質(zhì)粒克隆載轉(zhuǎn)錄而來的RNA片段，下同），濃度(Copies/test)為 106、105、104、103，102 平行3管。
[0067]圖5是呼吸道合胞病毒(RSV)在四重RT-qPCR中的敏感性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增圖。
[0068]圖6是甲型流感病毒（INF)在四重RT-qPCR中的敏感性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增圖。
[0069] 圖7是人類偏肺病毒(HMPV)在四重RT-qPCR中的敏感性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增圖。
[0070] 圖8是腺病毒(ADV)在四重定量PCR(實(shí)際應(yīng)用為RT-qPCR)中的敏感性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增圖。
[0071] 注：上述模板為1^￥、1陬、圓?￥^0￥等量混合質(zhì)粒，濃度(0^丨68八68〇為107、10 6、 105、104、10^10^101，平行3管。
【具體實(shí)施方式】
[0072]本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
[0073] 實(shí)施例1
[0074] -種快速聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒，由核酸共提取液、四 重RT-qPCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、五個(gè)濃度的陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品 組成，其中四重?zé)晒釶CR反應(yīng)液為四組引物、探針以及RT-qPCR反應(yīng)緩沖液、Hot Start Taq DNA聚合酶、PrimeScrip逆轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)成的混合液，陰性質(zhì)控品為滅菌注射用水，強(qiáng)、弱陽性質(zhì) 控品為由RSV、INF、HMPV、ADV等量混合的陽性質(zhì)粒樣品（ADV為靶基因質(zhì)?？寺≥d體，RSV、 INF、HMPV為根據(jù)基因質(zhì)粒克隆載轉(zhuǎn)錄而來的RNA片段，下同），其中強(qiáng)陽性質(zhì)控品濃度 106CopiesAU，弱陽性質(zhì)控品濃度102CopiesAU，五個(gè)濃度陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品是由RSV、INF、 HMPV、ADV等量混合的質(zhì)粒樣品，濃度分別為 102CopiesAil、103CopiesAa、104CopiesAU、 105Copies/yl、lC^Copies/yl。
[0075] 所述的引物及其特異性定量PCR熒光探針序列、標(biāo)準(zhǔn)品序列如下：
[0076] RSV：

[0110] 實(shí)施例2
[0111] 四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒的檢測(cè)方法包括如下步驟：
[0112] (1)引物設(shè)計(jì):在GenBank中檢索獲得呼吸道合胞病毒(RSV)，甲型流感病毒（INF)、 人類偏肺病毒(HMPV)、腺病毒(ADV)特異性的保守基因，通過序列比對(duì)，確定它們各自的高 度保守序列區(qū)，作為待檢靶基因特異性核酸序列分別設(shè)計(jì)特異引物；
[0113] (2)熒光探針設(shè)計(jì):根據(jù)步驟(1)中的四種病毒的待檢靶基因特異性核酸序列設(shè)計(jì) 熒光探針；
[0114] (3)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建:根據(jù)步驟（1)確定的特異引物，利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建四種分 別含有RSV、INF、HMPV、ADV高度保守序列區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，另將RSV、INF、HMPV三種RNA病 毒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子(DNA)體外轉(zhuǎn)錄成RNA片段，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)品（下同）；
[0115] (4)四重RT-qPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與建立:使用步驟(1)中的引物和步驟(2)中的探 針及RT-qPCR反應(yīng)緩沖液、Hot Start Taq DNA聚合酶、PrimeScrip逆轉(zhuǎn)錄酶等成分組成四 重RT-qPCR反應(yīng)液，利用正交設(shè)計(jì)篩選80-320nM范圍內(nèi)各個(gè)濃度的引物、探針、DNA聚合酶、 逆轉(zhuǎn)錄酶、模板的組合，優(yōu)化四重定量PCR反應(yīng)體系，根據(jù)反應(yīng)效率和曲線確定最終的四重 RT-qPCR反應(yīng)體系；
[0116] (5)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:使用步驟(4)中的四重RT-qPCR反應(yīng)體系，將已知拷貝數(shù)的含有 RSV、INF、HMPV、ADV目的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒連續(xù)10倍倍比稀釋，加入到四重RT-qPCR主反 應(yīng)液中，綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值和基線，進(jìn)行結(jié)果分析，制備標(biāo)準(zhǔn) 曲線；
[0117] (6)臨床驗(yàn)證:提取RSV、INF、HMPV和/或ADV臨床呼吸道標(biāo)本中的DNA或RNA作為模 板，進(jìn)一步用步驟(4)和(5)的方法和條件進(jìn)行四重RT-qPCRR擴(kuò)增；
[0118]所述的特異性四重定量PCR熒光探針，指的是長(zhǎng)度為25±4Nt的寡核苷酸鏈，與 1?￥、1即、圓?￥^0￥待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補(bǔ)，所有探針的5/端和3/端均 使用AllGlo探針進(jìn)行標(biāo)記，AllGlo探針的每種染料既是報(bào)告基團(tuán)又是粹滅基團(tuán)；
[0119] 所述的試劑盒包括如下成分:①核酸共提取液;②質(zhì)控品（陰性、強(qiáng)陽性、弱陽性） 及陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品；③四重RT-qPCR反應(yīng)液。
[0120] 所述的待檢靶基因特異性核酸序列，指的是針對(duì)每一種病毒所特有的一段基因序 列。
[0121] 所述的標(biāo)準(zhǔn)品，指的是利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建的人工重組質(zhì)粒，每種質(zhì)粒只重組 一種特異待檢靶基因序列，其中將RSV、INF、HMPV三種RNA病毒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子(DNA)體外轉(zhuǎn) 錄成RNA片段，構(gòu)成標(biāo)準(zhǔn)品，ADV的標(biāo)準(zhǔn)品為人工重組質(zhì)粒(DNA)。
[0122] 所述的四重RT-qPCR反應(yīng)體系，指的是由四組引物、探針以及RT-qPCR反應(yīng)緩沖液、 Hot Start Taq DNA聚合酶、PrimeScrip逆轉(zhuǎn)錄酶等組成的混合液
[0123] 所述的四重RT-qPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，指的是不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子用四重RT-qPCR 反應(yīng)液進(jìn)行檢測(cè)所得 ，標(biāo)準(zhǔn) 曲線的R2均大于0.99 ， 擴(kuò)增效率在0.91-0 .98之間， 基本滿 足定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。
[0124] 實(shí)施例3
[0125] 1.四種病毒(1?￥、1吧、!》^^0￥)目的基因質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建
[0126] 采用T-A載體克隆方案，將四種目的基因 PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳確認(rèn)擴(kuò)增片段分子量 后，擴(kuò)增片段經(jīng)2%瓊脂糖凝膠回收純化，克隆至pUC57質(zhì)粒中，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受 態(tài)大腸埃希菌中，在LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上篩選陽性菌落，經(jīng)回收、抽提、純化重組質(zhì) 粒，將經(jīng)驗(yàn)證完全正確的目的質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)定量后，用1ΧΤΕ(ρΗ8.0)緩沖液稀釋 到1 〇1Q拷貝/μL作為儲(chǔ)存液，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0127] 2.三種RNA病毒(RSV、INF、HMPV)目的基因質(zhì)?？寺≥d體轉(zhuǎn)錄為RNA片段
[0128] 使用用限制性內(nèi)切酶Quickcut BamHI將含有RSV、INF、HMPV目的基因質(zhì)粒線性化， 應(yīng)用RNA生產(chǎn)系統(tǒng)T7試劑盒對(duì)RSV、HMPV、INF質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，將經(jīng)驗(yàn)證完全正確的目的 片段用微量核酸蛋白分析儀檢測(cè)定量后，用DEPC水稀釋到108拷貝/μL作為儲(chǔ)存液，-20°C保 存?zhèn)溆谩?br>[0129] 3.核酸模板共提取
[0130] 3.1痰液:痰液中加入4倍體積的生理鹽水，混勻后取200μ1痰液加入EP管中，離心 5min，棄上清。加入300μ1病毒裂解液(2m〇VL異硫氰酸胍，25mmol/L檸檬酸鈉，20μg/ml糖 原，0.4mol/LDTT)，加入6μ1 RNA助沉劑振蕩混勻，置于60°C保溫lOmin冷卻至室溫后，加入 20μ1磁珠，加入1倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勾充分，室溫放置5min，每隔2-3min混勾一 次。將離心管于離心機(jī)中高速短時(shí)離心，去除壁上的殘液。磁鐵吸附納米磁珠，棄上清，用 200μ1 70%乙醇清洗2-5次。加入50微升RNase-free H20,用移液器吸頭吹打均勻，室溫放 置5min。磁鐵吸附納米磁珠，將含有核酸的上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中備用。
[0131] 3.2分泌物拭子:加滅菌生理鹽水lml到無菌管，充分震蕩混勻，擠干棉拭子，立即 將液體全部轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，取200μ1加入離心管中，離心5min，棄上清。加入300μ1病 毒裂解液（2m〇VL異硫氰酸胍，25mmol/L檸檬酸鈉，20μg/ml糖原，0 · 4mol/LDTT)，加入6μ1 RNA助沉劑振蕩混勻，置于60°C保溫lOmin冷卻至室溫后，加入20μ1磁珠，加入1倍體積的無 水乙醇，上下顛倒混勻充分，室溫放置5min，每隔2-3min混勻一次。將離心管于離心機(jī)中高 速短時(shí)離心，去除壁上的殘液。磁鐵吸附納米磁珠，棄上清，用200μ1 70%乙醇清洗2-5次。 加入50μ1 RNase-free Η20,用移液器吸頭吹打混勻，室溫放置5min。磁鐵吸附納米磁珠，將 含有核酸的上清液轉(zhuǎn)移至一新的離心管中備用。
[0132] 3.3質(zhì)控品和陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品處理:8000rpm離心數(shù)秒，備用。
[0133] 4.A11G1。探針?biāo)闹?RT-qPCR
[0134] 4.1引物及探針
[0135] 查閱相關(guān)的專業(yè)文獻(xiàn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道獲取1^、1即、腿?￥^0￥特異性保守基因，登 錄GenBank獲取相關(guān)序列，應(yīng)用Clustalw軟件對(duì)所有序列比對(duì)分析，挑選最保守的基因序列 用Primer Premiers 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，登錄NCBI通過BLAST程序比對(duì)分析，每種細(xì)菌篩選 出一對(duì)特異性最強(qiáng)的引物和相應(yīng)的特異探針(見表1)。
[0136] RSV、INF、HMPV、ADV單管四重RT-qPCR引物和相應(yīng)的AllGlo探針分別由 LifeTechnologies公司和上海奕躍生物科技有限公司合成。為了確保四重RT-qPCR的特異 性和靈敏度，所有的引物和探針均與GenBank里的擴(kuò)增靶序列進(jìn)行BLAST，所有引物和探針 的Tm值基本一致。采用ABI 7500定量PCR儀進(jìn)行四重定量PCR實(shí)驗(yàn)。
[0137] 表1 AllGlo探針?biāo)闹豏T-qPCR檢測(cè)1?￥、1陬、!》^、厶0￥引物和探針
[0139] 341\1^、幾？、呢？均為不同波長(zhǎng)的41161〇探針標(biāo)記熒光素，分別對(duì)應(yīng)于目前使用 的 CY3、FAM、VIC 和 CY5 熒光。
[0140] 4.2四重1^-9?0?條件優(yōu)化
[0141] 采用正交設(shè)計(jì)對(duì)四重RT-qPCR中的引物、探針、Hot Start Taq DNA聚合酶、 PrimeScrip RT逆轉(zhuǎn)錄酶、模板加入量進(jìn)行優(yōu)化，25μ1基礎(chǔ)反應(yīng)體系如表2,于ABI 7500定量 PCR儀擴(kuò)增，循環(huán)條件：Stagel反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42°C5min 95°C10s(lcycle)，Stage2 95°C5s、60 〇C34s(40cycles) 〇
[0142] 表2四重定量RT-qPCR反應(yīng)體系
[0144] 以上述反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，陽性模板為ADV重組質(zhì)粒105Copies/test和RSV、HMPV、 INF質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄的RNA 105Copies/test等份混合物，陰性對(duì)照以雙蒸水代替模板。
[0145] 4 · 2 · 1四重RT-qPCR中引物濃度的優(yōu)化
[0146] 首先在加入RT-PCR反應(yīng)緩沖液12 · 5μ1、各病毒探針（ΙΟμ mol/L)量0· 4μ1、Hot Start Taq DNA聚合酶0.5μ1、PrimeScrip逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μ1、核酸模板4μ1的情況下對(duì)各病毒 引物共四個(gè)因素利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化選擇，根據(jù)單重RT-qPCR的結(jié)果選擇這四個(gè)因 素的濃度范圍設(shè)計(jì)4個(gè)水平(見表3)，正交試驗(yàn)見表4。
[0147] 表3引物因素與水平（引物濃度為lOymol/L)
[0149] 表4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(45)
[0151] 4.2.2四重1^-9?0?中探針的優(yōu)化
[0152] 本實(shí)驗(yàn)在加入各病毒引物（ΙΟμ mol/L)量0.5yl、Hot Start Taq DNA聚合酶0.5μ1、 PrimeScrip逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μ1、核酸模板4μ1的情況下對(duì)各病毒探針共四個(gè)因素利用正交試驗(yàn) 設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化選擇，根據(jù)單重RT-qPCR的結(jié)果，選擇這四個(gè)因素的濃度范圍設(shè)計(jì)加入量分別 為0.2μ1、0.4μ1、0.6μ1、0.8μ1四個(gè)水平，正交試驗(yàn)如表4，其中A為ADV探針，B為RSV探針，C為 HMPV探針，D為INF探針。
[0153] 4.2.3四重RT-qPCR中模板及酶的優(yōu)化
[0154] 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的各病毒引物與探針的最優(yōu)值對(duì)TaKaRa Ex Taq HS、 PrimeScrip RT Enzyme Mix Π 、模板濃度三個(gè)因素利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化選擇，根據(jù) 單重RT-qPCR的結(jié)果選擇這3個(gè)因素的濃度范圍設(shè)計(jì)4個(gè)水平(見表5)，正交試驗(yàn)如表6。
[0155] 表5四重RT-qPCR體系優(yōu)化的因素與水平
[0157] 表6正交試驗(yàn)表二L16(45)
[0159] 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用綜合加權(quán)評(píng)分法評(píng)價(jià)四重RT-qPCR的擴(kuò)增結(jié)果，以一個(gè)綜合指標(biāo) (overall desirability，0D)將各個(gè)考察指標(biāo)綜合考察，即以ADV、RSV、INF、HMPV病毒的Ct 值權(quán)重相加的綜合評(píng)價(jià)作為指標(biāo)，考慮到這些指標(biāo)對(duì)觀察四重RT-qPCR體系擴(kuò)增效果的重 要性相當(dāng)，各自權(quán)重定為25%計(jì)算。0D值=ADV(Ct值）X0.25+RSV(Ct值）X0.25+INF(Ct值） X 0.25+HMPV(Ct值）X 0.25，以0D值進(jìn)行直觀分析和方差分析，其中在分析酶與模板優(yōu)化的 正交試驗(yàn)時(shí)同時(shí)查看其對(duì)四種病毒擴(kuò)增的影響。采用SPSS17.0軟件對(duì)各個(gè)正交試驗(yàn)分別進(jìn) 行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用正交設(shè)計(jì)的方差分析，P〈〇.05表示差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[0160] 4 · 3四重RT-qPCR的特異性、敏感性試驗(yàn)
[0161] 將已知拷貝數(shù)的含ADV目的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒及根據(jù)含RSV、INF、HMPV目的擴(kuò)增 片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄而來的RNA，使用時(shí)連續(xù)10倍倍比稀釋至濃度在10 1~107Copies/test 之間作為單病毒四重RT-qPCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品；同時(shí)，將以ADV、RSV、INF、HMPV 1:1:1:1混合后 進(jìn)行10倍倍比稀釋成101~l〇7Copies/test之間，作為多病毒四重RT-qPCR檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品。取 不同載量的標(biāo)準(zhǔn)品4μ1作為四重RT-qPCR的模板，同時(shí)用滅菌注射用水做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)各稀 釋度模板按照(3.3)確立的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同時(shí)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，所有檢測(cè)標(biāo)本至少 檢測(cè)三次，擴(kuò)增完成后用儀器自帶的軟件自動(dòng)分析結(jié)果，從而確定該方法的最低檢出限，評(píng) 估快速聯(lián)檢四種呼吸道病毒多重RT-qPCR試劑盒的檢測(cè)靈敏度。
[0162] 4.4四重RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
[0163] 將濃度在((：〇?丨68八68〇103、104、10 5、106、107的六0￥質(zhì)粒0嫩和其他三種病毒體外 轉(zhuǎn)錄RNA作為制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品，按照(4.2)確立的反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同時(shí)進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)， 所有檢測(cè)標(biāo)本至少檢測(cè)三次 ，擴(kuò)增完成后用儀器自帶軟件分析結(jié)果 ，制備標(biāo)準(zhǔn)曲 線。
[0164] 4.5四重RT-qPCR的重復(fù)性試驗(yàn)
[0165] 將已知拷貝數(shù)的ADV重組質(zhì)粒及根據(jù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄而來的RNA片段（105C〇pies/te St) 分別平均分成10份，-20 °C冷凍保存作為模板，按制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的四重RT-qPCR的反應(yīng)體系 和擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)按照(4.4)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，每周檢測(cè)一次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線儀器自 動(dòng)給出定量檢測(cè)結(jié)果，連續(xù)5周，最后統(tǒng)計(jì)軟件分析5次檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性(CV%)。
[0166] 4.6結(jié)果判定
[0167] 分析條件設(shè)定:根據(jù)儀器所帶分析軟件自動(dòng)分析結(jié)果，閾值設(shè)定以閾值線剛好超 過陰性對(duì)照品擴(kuò)增線和儀器噪音進(jìn)行調(diào)整。
[0168] 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陰性質(zhì)控品無擴(kuò)增曲線和Ct值;陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品均為陽性，Ct值〈35,且 0.98 <R2 < 1;陽性質(zhì)控品全部陽性，Ct值應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值相對(duì)應(yīng)，并且 出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線；以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無效，需重新進(jìn) 行。
[0169] A.陰性:無擴(kuò)增曲線無 Ct值。
[0170] B.陽性及定量判斷：出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線且Ct值<37判定為陽性，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線自動(dòng)獲取定量值，表示樣品中存在ADV、RSV、INF、HMPV。
[0171 ] C.有效原則:Ct值>37的樣品定量結(jié)果不可靠，需重做實(shí)驗(yàn)。無 Ct值為陰性，有Ct值 但仍>37需重新取標(biāo)本復(fù)查。
[0172] 4.7臨床驗(yàn)證
[0173] 取臨床陰、陽性以0￥、1?￥、1冊(cè)、圓?￥)標(biāo)本各5份。將臨床分離菌株菌液混入呼吸道 標(biāo)本中，按照（2)的方法提取標(biāo)本中的核酸，使用本試劑盒的A1 lGlo探針?biāo)闹豏T-qPCR方法 對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并與應(yīng)用SYRB Green RT-qPCR法的檢測(cè)結(jié)果相比較，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法 的可靠性。
[0174] 4.8實(shí)施例3檢測(cè)結(jié)果
[0175] 4.8.1四重RT-qPCR條件優(yōu)化結(jié)果:反應(yīng)體系配制優(yōu)選方案見表7，儀器擴(kuò)增條件： Stagel反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42°C5min 95°C10s(lcycle)，Stage2 95°C5s、6CTC34s(40cycles)。 [0176]表7反應(yīng)體系配制優(yōu)選方案
[0179] 4.8.2四重RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制備結(jié)果:RSV、INF、HMP V、AD V分子的標(biāo)準(zhǔn)曲線在經(jīng)過 優(yōu)化的四重定量PCR反應(yīng)體系進(jìn)行制備，它們的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2分別為0.995、0.997、0.993、 0.998,擴(kuò)增效率(Efficiency)分別為 0·916、0·937、0·988、0.973(見附圖 1-4)。
[0180] 4.8.3四重RT-qPCR的特異性、敏感性試驗(yàn)結(jié)果:RSV、INF、HMPV、ADV標(biāo)準(zhǔn)分子在四 重RT-qPCR體系中進(jìn)行擴(kuò)增后，其特異性均為100% ASV、INF、HMPV在四重定量PCR體系中檢 測(cè)靈敏度均為l〇2Copies/test，ADV在四重定量PCR體系中檢測(cè)靈敏度為10Copies/test(見 附圖5-8)。
[0181] 4.8.4四重RT-qPCR的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果:相同的RSV、INF、HMPV、ADV標(biāo)準(zhǔn)分子混合液 (105Copies/test)在四重定量PCR體系檢測(cè)5次，檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，RSV、INF、HMPV、 ADV五次檢測(cè)的CV均小于5%，詳見表8。
[0182] 表8A11G10探針?biāo)闹豏T-qPCR檢測(cè)病毒核酸的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（105C〇pie S/teSt)

[0184] 3.9.5臨床驗(yàn)證結(jié)果:采用本試劑盒(A1 lGlo探針?biāo)闹豏T-qPCR)對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行檢 測(cè)的結(jié)果與SYBR鑒定結(jié)果一致。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒，其特征在于：由核酸共提取 液、四重RT-qPCR反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、強(qiáng)陽性質(zhì)控品、弱陽性質(zhì)控品、五個(gè)濃度的陽性定量 標(biāo)準(zhǔn)品組成，其中四重RT-qPCR反應(yīng)液為四組引物、探針以及RT-qPCR反應(yīng)緩沖液、Hot Start Taq DNA聚合酶、PrimeScrip RT逆轉(zhuǎn)錄酶構(gòu)成的混合液，其中強(qiáng)陽性質(zhì)控品濃度 106CopiesAU，弱陽性質(zhì)控品濃度102CopiesAU，五個(gè)濃度陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品是由RSV、INF、 HMPV、ADV等量混合的質(zhì)粒樣品，濃度分別為 102CopiesAil、103CopiesAa、104CopiesAU、 10 5Copies/yl、lC^Copies/yl; 所述的引物及其特異性定量PCR焚光探針序列、標(biāo)準(zhǔn)品序列如下： RSV： 上游引物:GCACCGCCAAGACACTAGAA 下游引物:GTGGITTGCCGAGGCTATGA 探針：JUP(VIC)-GGA CCT GGG ACA CTC TCA ATC ATC T-JUP INF： 上游引物:ACACCATCTGTGTGGGCTAC 下游引物:CCGTTCAGACTGCAGAGCTT 探針:MAR(FAM)-CTC TAC AGA CAC TGT TGA CAC AGT ACT AG-MAR HMPV 上游引物:GGGAGCAAAGCAGAAAGTTTGT 下游引物：TTGCACAGACACATGCCCTA 探針：NEP-GCT TAT GGA GCT GGT CAA ACA CTG C-NEP ADV： 上游引物：TAAGACTCTCGTCCATTTGGTCA 下游引物:CTTAACATCGCCGCCAAGGAG 探針：SAT-CACAATCTTCTTGTTGTCCAGCTTGG-SAT RSV標(biāo)準(zhǔn)品序列： GCACCGCC AAGACACTAG AAAGGACCTG GGACACTCTCAATCATCTAT TATTCATATC ATCGTGCTTA TACAAGTTAA ATCTTAAATC TATAGCACAA ATCACATTAT CTATTTTGGC AATGATAATC TCAACCTCAC TTATAATTGC AGCCATCATA TTCATAGCCT CGGCAAACCA C INF標(biāo)準(zhǔn)品序列： ACACCATCTGTGTGGGCTACCATGCA AACAACTCTA CAGACACTGT TGACACAGTA CTAGAAAAGAATGTGACCGTGACTCACTCAGTGAATTTGCTCGAAGACAGCCATAATGG G AAGCTCTGCA GTCTGAACGG HMPV標(biāo)準(zhǔn)品序列： GGAG CAAAGCAGAA AGTTTGTTTGTAAATATATT TATGCAAGCT TATGGAGCTG GTCAAACACT GCTAAGGTGG GGTGTCATTGCCAGATCATC CAACAACATA ATGCTAGGGC ATGTGTCTGT GCAA ADV標(biāo)準(zhǔn)品序列： T AAGACTCTCGTCCATTTGGT CAGAAAACAC AATCTTCTTG TTGTCCAGCT TGGTAGCAAA TGATCCATAGAGGGCATTGG ATAGAAGCTT GGCGATGGAG CGCATGGTTT GGTTCTTTTC CTTGTCCGCGCGCTCCTTGG CGGCGATGTT AAG。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒，其特 征在于：陰性質(zhì)控品為滅菌注射用水，強(qiáng)、弱陽性質(zhì)控品為由RSV、INF、HMPV、ADV等量混合的 陽性質(zhì)粒樣品。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒，其特 征在于：所述的特異性四重RT-qPCR引物，是長(zhǎng)度為20±3Nt的寡核苷酸鏈，與RSV、INF、 HMPV、ADV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補(bǔ)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聯(lián)檢四種呼吸道病毒的多重逆轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒，其特 征在于:所述的特異性四重RT-qPCR熒光探針，是長(zhǎng)度為25 ± 4Nt的寡核苷酸鏈，與RSV、INF、 HMPV、ADV待檢靶基因特異性核酸序列完全相同或互補(bǔ)，所有探針的5'端和3'端均使用 AllGlo探針進(jìn)行標(biāo)記，AllGlo探針的每種染料既是報(bào)告基團(tuán)又是粹滅基團(tuán)。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK105936945SQ201610458407
【公開日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年6月20日
【發(fā)明人】余道軍, 何慧, 陳懿
【申請(qǐng)人】杭州市第人民醫(yī)院, 杭州市第一人民醫(yī)院