基于在線氧消耗速率和電導率協(xié)同控制的輔酶q10發(fā)酵生產(chǎn)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地涉及一種優(yōu)化的類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides)等微生物發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10方法以及相關(guān)的操作控制工藝方法，具體涉及一 種將代謝參數(shù)氧消耗速率和營養(yǎng)供給指數(shù)電導率協(xié)同控制的發(fā)酵生產(chǎn)輔酶Q10新工藝。
【背景技術(shù)】
[0002] 輔酶Q1q (C〇Q1Q)又名泛醌、癸烯醌，化學名稱為2, 3-二甲氧基-5-甲基-6-癸異戊 烯苯醌。輔酶Q1(]是一種代謝激活劑，其生物活性來自于其醌環(huán)的氧化還原特性及其側(cè)鏈的 理化性質(zhì)，具有抗氧化性、消除自由基、提高機體免疫力、抗衰老等功能。臨床上廣泛應(yīng)用于 各類心臟病、癌癥、糖尿病、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的治療，而且在化妝品及抗衰老保 健品方面也有很多的應(yīng)用。
[0003]微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶仏。是國內(nèi)外主要采用的生產(chǎn)方法，具有生物活性高、沒有 原材料的限制，并可通過菌種選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化等提高發(fā)酵生產(chǎn)能力。但生物發(fā)酵法具有 不易掌控的特性，傳統(tǒng)的發(fā)酵過程控制參數(shù)如pH、D0、菌濃、含量等已經(jīng)很難精確的反映和 控制整個發(fā)酵過程，因此有必要引入更多更可靠和快捷的參數(shù)來反映發(fā)酵狀態(tài)，同時根據(jù) 這些參數(shù)做出積極有效的措施控制整個發(fā)酵過程。
[0004] 已報道的輔酶Q10發(fā)酵相關(guān)的技術(shù)研究主要集中在通過基因過程技術(shù)改造來提 高輔酶Q10的生產(chǎn)水平，或通過菌種誘變處理、簡單的氮源優(yōu)化、過程中磷酸鹽的添加量等 單一因素優(yōu)化調(diào)整實驗來考察其對產(chǎn)物合成的影響，也有的專利文獻報道采用通過調(diào)整過 程的補糖速率來控制和優(yōu)化發(fā)酵過程。這些研究和技術(shù)只從單一因素來研究提高輔酶Q10 的產(chǎn)量，雖然也起到了一定的作用，但都缺乏從根本上對輔酶Q10生產(chǎn)菌體動態(tài)的生理過 程和營養(yǎng)需求的分析，都沒有找到合適的辦法來考察和控制對輔酶Q10發(fā)酵影響最重要的 兩個參數(shù)，氧消耗和營養(yǎng)供給水平，來達到提高產(chǎn)能的目的。
[0005]在已報道的補料工藝中，一般通過分批補料或者流加補料的方式補加，而補加時 間以及補加量則是通過經(jīng)驗值，或者離線取樣測試底物濃度的方式來指導補料時間以及補 加量，客觀上存在補加不及時以及補料過量以及不足的情況發(fā)生。利用電導率可以來表征 發(fā)酵體系中離子濃度，從而直接反映菌體在培養(yǎng)體系中營養(yǎng)消耗情況，尤其是無機離子的 消耗情況，利用在線電導率電極實現(xiàn)了實時在線反映菌體對營養(yǎng)的消耗水平，從而實現(xiàn)指 導補料工藝的補加時間以及補加速率。已報道的在發(fā)酵過程中電導率，只用來監(jiān)控發(fā)酵過 程變化，而鮮見于反饋補料控制。
[0006]輔酶Q10生產(chǎn)菌在不同時期對氧氣和營養(yǎng)有不同的需求，合理控制過程中的氧氣 和營養(yǎng)供給水平，就能從本源上控制整個發(fā)酵，并且過程易于控制，保證生產(chǎn)穩(wěn)定，降低生 產(chǎn)成本。
[0007]專利CN102876743A公開了基于在線氧消耗速率分段控制工藝，輔酶Q10積累得到 了明顯提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供了一種將氧消耗速率OUR和營養(yǎng)供應(yīng)參數(shù) 電導率相結(jié)合協(xié)同控制的輔酶Q10發(fā)酵新工藝，該工藝能夠穩(wěn)定地提高輔酶Q10的發(fā)酵生 產(chǎn)水平，并且有數(shù)據(jù)可參照整個發(fā)酵過程，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0009] -種基于在線氧消耗速率和電導率協(xié)同控制輔酶Q10發(fā)酵生產(chǎn)的工藝，在輔酶 Q10生產(chǎn)菌株的發(fā)酵過程中，氧消耗速率穩(wěn)定在30-150mmol/L·h之間，同時電導率穩(wěn)定在 5. 0-30.Oms/cm之間，以促進菌體生長和輔酶Q10合成的啟動并積累。
[0010] 本申請的發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)輔酶Q10在發(fā)酵過程中，通過 在線控制氧消耗速率（0UR)，在發(fā)酵過程維持發(fā)酵體系的穩(wěn)定的高水平的氧消耗速率 (30_150mmol/L·h)，并通過補料維持穩(wěn)定的電導率水平（5. 0-30.Oms/cm)，可以大幅度提 高輔酶Q10的產(chǎn)量。電導率是介質(zhì)中的傳導電流密度，它可以一定程度的反應(yīng)溶液中的離 子濃度，如果在發(fā)酵液中它就代表了微生物的營養(yǎng)參數(shù)和環(huán)境指數(shù)，合適的電導率能維持 微生物生長環(huán)境的穩(wěn)定，從而保證微生物的的生長及產(chǎn)物積累；0UR是微生物的氧消耗速 率，它能夠精確的表征微生物對氧氣的需求量，用電導率結(jié)合0UR共同控制的新方法，從而 保證輔酶Q10生產(chǎn)菌株的快速增長及產(chǎn)物積累提供充足的營養(yǎng)和氧氣。
[0011] 作為優(yōu)選，在輔酶Q10生產(chǎn)菌株的發(fā)酵過程中，控制氧氣消耗速率在30~90mmol/ L·h〇
[0012] 作為優(yōu)選，在輔酶Q10生產(chǎn)菌株的發(fā)酵過程中，控制發(fā)酵液的電導率10-20mS/cm。
[0013] 本發(fā)明中，所述的氧消耗速率通過攪拌轉(zhuǎn)速和空氣流量進行調(diào)節(jié)，所述的電導率 通過流加補料或分批補料的方式進行調(diào)節(jié)。
[0014] 其中，流加補料或分批補料時所用的補料液的配方如下：
[0015] 以一升補料液計，酵母粉8~12g，硫酸銨5~10g，硫酸鎂1~2g，氯化鈉3~6g， 磷酸二氫鉀2~4g，磷酸氫二鉀2~4g，氯化鈣1~2g，生物素0. 013~0. 025g，pH值7. 0， 補料培養(yǎng)基電導率為13. 5~23ms/cm。
[0016] 本發(fā)明的發(fā)酵工藝包括：將由種子培養(yǎng)所得的輔酶Q10生產(chǎn)菌株接種到裝有發(fā)酵 培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，在適合發(fā)酵的條件下培養(yǎng)輔酶Q10的生產(chǎn)菌株，培養(yǎng)過程中對氧消耗 速率以及培養(yǎng)液電導率進行檢測，并根據(jù)檢測結(jié)果對發(fā)酵條件進行調(diào)節(jié)。
[0017] 進一步的，所述的發(fā)酵過程分階段進行，包括以下步驟：
[0018] (1)在0~24小時之間，控制攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，空氣流量9L/min，氧消耗速率由低 位快速上升到并維持在30-50mmol/L·h，電導率由高位下降至7-16ms/cm;
[0019] (2)在24~36小時之間，增加攪拌轉(zhuǎn)速至450rpm，空氣流量9L/min，氧消耗速率 為 5〇-60mmol/L·h;
[0020] (3)在36~60小時之間，攪拌轉(zhuǎn)速為450rpm，空氣流量16L/min，氧消耗速率為 60_70mmol/L·h;
[0021] (4)在60~90小時之間，攪拌轉(zhuǎn)速為450rpm，增加空氣流量至20L/min，氧消耗速 率為 70_90mmol/L·h;
[0022] (5)在90~100小時之間，攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，氧消耗速率為70-90mmol/L·h;
[0023] (6) 100小時以后，空氣流量為16L/min，氧消耗速率為50-60mmol/L·h;
[0024] 步驟（2)~（6)中隨著菌體生長，培養(yǎng)基中基質(zhì)的消耗，電導率下降，當培養(yǎng) 基電導率小于等于15mS/cm時，開始分批加補料或者流加補料，使發(fā)酵液電導率維持在 l〇-20ms/cm〇
[0025] (7)通過固液分離收集發(fā)酵液中的微生物細胞；
[0026] (8)微生物細胞通過有機溶劑提取輔酶Q10。
[0027] 上述發(fā)酵過程中，使氧消耗速率維持在30-90mmol/L·h和電導率維持在10~ 20mS/cm，通過氧消耗速率與電導率反饋補料的協(xié)同控制，輔酶Q10菌體干重DCW增長速率 在0· 8-1.Og/L·h，輔酶Q10產(chǎn)物合成速率在50-100mg/L·h。
[0028] 本發(fā)明中，所述的氧消耗速率，按以下公式計算：
[0031] Fin進氣流量L/min;V發(fā)酵液體積L;Cwιη \(：。21"\(^。21" :分別為進氣中惰性氣體、氧 氣及二氧化碳的質(zhì)量分率C(j2c]Ut\Cra2c]Ut:分別為排氣中氧及二氧化碳的質(zhì)量分率；Pin:進氣 的絕對壓強Pa，tin:進氣的溫度°C，h:進氣的相對濕度％。
[0032] 輔酶Q10發(fā)酵是一個耗氧耗基質(zhì)生產(chǎn)發(fā)酵過程，供氧與營養(yǎng)的變化對菌體生長和 產(chǎn)物的合成有著重要的影響。本申請發(fā)明人在l〇L、15L、40L發(fā)酵罐中考察了以0UR為控制 變量進行分段供氧同時，只流加葡萄糖及磷酸鉀鹽、流加葡萄糖及磷酸鉀鹽同時分批補加 補料培養(yǎng)基、流加葡萄糖