一種茄病鐮刀菌熒光定量pcr檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用。專用于檢測(cè)瓜類、菜豆、豌豆、胡椒、山椒農(nóng)作上的茄病鐮刀菌。該技術(shù)包括如下步驟：樣本中DNA提取，特異性引物設(shè)計(jì)，應(yīng)用以SYBRGreenI為基礎(chǔ)的染料法熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)茄病鐮刀菌的ITS區(qū)基因片段進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣本中的ITS區(qū)基因片段拷貝數(shù)和茄病鐮刀菌的濃度。該檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速；特異性強(qiáng)、靈敏度高；檢測(cè)靈敏度最高可達(dá)到40個(gè)拷貝數(shù)每個(gè)反應(yīng)，并且可以同時(shí)進(jìn)行大批量的土壤、種子樣本分析，為病害的早期預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供了良好的基礎(chǔ)，因此該方法適于在植物病害診斷檢測(cè)領(lǐng)域廣泛推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】-種茄病鐮刀菌熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明為一種茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用，專用于檢測(cè)瓜類、菜 豆、豌豆、胡椒、山椒農(nóng)作上的茄病鐮刀菌，屬于農(nóng)作物病害診斷與防治【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 爺病鐮刀菌[/7W1Sariiffl? (Mart. ) Sacc.]是一類世界性分布重要 的植物病原真菌，在真菌分類系統(tǒng)中隸屬于無(wú)性型真菌（Anamorphic fungi)、絲孢綱 、瘤座抱目、瘤座抱科、鎌刀菌屬 (/7W1SarittT?)，馬特組（Section Martiella)。有性階段屬于肉座菌科（Hypocreaceae)、叢赤 殼屬(Afeciria)。茄病鐮刀菌分布非常廣泛，普遍存在于土壤，植物和動(dòng)物體內(nèi)等，對(duì)人類的 生產(chǎn)、生活造成了很大的危害。引起各種糧食作物、園藝作物、中草藥等的根腐、莖腐、莖基 腐，造成作物萎蔫死亡，侵染寄主植物維管束系統(tǒng)，破壞植物的輸導(dǎo)組織維管束，并在生長(zhǎng) 發(fā)育代謝過(guò)程中產(chǎn)生毒素危害作物，其寄主范圍廣泛，僅蔬菜上的寄主就包括5類蔬菜，分 別由瓜類、菜豆、豌豆、胡椒、山椒，是生產(chǎn)上最難防治的重要病害之一(李鵬，2009 ;林清洪， 2007 ;周黎，2008 ;薛彩云，2007)。
[0003] 在病害癥狀明顯表現(xiàn)之前不容易預(yù)測(cè)和避免茄病鐮刀菌的侵染，而且土壤中的病 原菌也會(huì)隨著灌溉水從一個(gè)地方的土壤傳播到另一個(gè)地方，病害表現(xiàn)前是防治的最佳時(shí) 期，一旦發(fā)病癥狀顯現(xiàn)就難以治愈，嚴(yán)重威脅到產(chǎn)量，因此，發(fā)展有效且快速的茄病鐮刀菌 快速檢測(cè)技術(shù)，有效的避免該病的蔓延和傳播，對(duì)于茄病鐮刀菌引起的土傳病害的防治具 有十分重要的意義。
[0004] 實(shí)時(shí)突光定量 PCR 技術(shù)（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 簡(jiǎn)稱（RT-PCR))是在常規(guī)定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。通常實(shí)時(shí)熒光定 量PCR技術(shù)所使用的熒光化學(xué)劑包括TaqMan熒光探針和SYBR熒光染料。該技術(shù)作為一種 快速，靈敏，特異性高并且可以定量檢測(cè)病原菌的檢測(cè)方法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物真菌的檢 測(cè)。采用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)小麥種傳病害進(jìn)行檢測(cè)取得了較好效果（McEwan et al.，2000)，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)不同感染比例小麥種子上的鐮刀菌的含量，表 明種子感染的程度與種子上鐮刀菌的含量的相關(guān)性（Glynn et al.，2010)。這為我們檢測(cè) 茄病鐮刀菌技術(shù)的研究提供了有力基礎(chǔ)。
[0005] RT-PCR是通過(guò)PCR在指數(shù)擴(kuò)增期間連續(xù)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)即時(shí)檢測(cè)特異性 產(chǎn)物的量，并據(jù)此評(píng)估目的基因的起始模板量。與常規(guī)PCR相比，具有操作簡(jiǎn)便、高效快速、 敏感性強(qiáng)、可重復(fù)性好和特異性高的優(yōu)點(diǎn)。SYBR Green I熒光定量PCR的工作原理是在常 規(guī)PCR的體系中加入熒光染料SYBR Green I，SYBR Green I是一種結(jié)合于雙鏈DNA小溝 中的熒光染料，與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光大大增強(qiáng)。在PCR反應(yīng)體系中加入過(guò)量的SYBR Green I熒光染料，熒光染料能夠特異性地?fù)饺氲紻NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈 中的熒光染料分子不發(fā)射任何熒光信號(hào)。從而隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，保證熒光信號(hào)的增強(qiáng) 與PCR產(chǎn)物增加完全同步，信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值的循環(huán)次數(shù)(用循環(huán)閾值Ct表示)被記錄下 來(lái)，Ct值和PCR體系中起始模板的對(duì)數(shù)之間有嚴(yán)格的線性關(guān)系，利用陽(yáng)性定量標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增 的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值就可以準(zhǔn)確計(jì)算出起始模板中某核酸的存在 及數(shù)量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種爺病鐮刀菌的突光定量PCR快速檢測(cè)的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在瓜類、菜豆、豌豆、胡 椒、山椒茄病鐮刀菌引起的土傳病害流行監(jiān)測(cè)預(yù)報(bào)，土壤帶菌以及種子帶菌檢測(cè)方面的應(yīng) 用。
[0008] 該檢測(cè)技術(shù)，在植物病害診斷與防治領(lǐng)域可以大規(guī)模推廣。
[0009] 本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)： 該方法的實(shí)驗(yàn)步驟為：從待測(cè)樣本提取DNA ;將加入標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的熒光定量反 應(yīng)液上機(jī)，用熒光定量檢測(cè)儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；通過(guò)比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值，根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品的起始DNA濃度。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)具體包括如下步驟： 1、 取田間自然發(fā)病土壤、發(fā)病植株、蔬菜種子，進(jìn)行總DNA的提取純化，得到DNA樣本； 2、 特異性引物設(shè)計(jì)，為避免由于引物?；暂^低，PCR反應(yīng)中出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果或 對(duì)非目標(biāo)真菌產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，本發(fā)明在系統(tǒng)分析茄病鐮刀菌的ITS區(qū)、18SrRNA和 5. 8SrRNA核酸序列系統(tǒng)發(fā)育的基礎(chǔ)上，對(duì)已經(jīng)發(fā)表在GenBank上的不同國(guó)家和地區(qū)茄病 鐮刀菌rDNA-ITS基因的序列進(jìn)行比較，利用Primer render 5.0軟件在茄病鐮刀菌基 因的 rDNA-ITS 區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物 FSFl :5' -GCTAACAATCATCTACAGAC-3' ；FSR1 :5' -GACGGATGAGAGAGC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為 487 bp (圖 1)。
[0011] 腫 18S rRNA、ITS1、5. 8S rRNA 和 ITS2 部分序列 NCBI 登錄號(hào)為 (DQ986152. 1)。
[0012] 3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25μ1，其中 SYBR Premix Ex Taq(內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I ) 12. 5μ1，濃度為lOMmol/L的正義引物FSFl和反義引物FSRl各0. 5μ1，標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀 釋液或待檢測(cè)樣品DNA溶液2μ1，CldH2O補(bǔ)齊至25μ1 ; 4、 PCR反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR采用兩步法，95°C預(yù)變性3min，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán) 包括95°C變性30s、60 °C退火30s、72 °C延伸1.5min;PCR完成后，按0. 1°C s-1升溫速 率從72°C升至95°C進(jìn)行融解曲線的分析驗(yàn)證； 5、 插入ITS區(qū)的pMD-18T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α增殖后提取的質(zhì)?；蚪MDNA，DNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)A260定量并10倍梯度稀釋，稀釋成6個(gè)濃度梯度，按照上述PCR反應(yīng)體 系和程序進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各個(gè)濃度梯度的循環(huán)閾值（Ct)采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線； 6、 取步驟1)中得到的DNA樣本作為模板，按上述熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序在 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增，其中陰性對(duì)照 采用ddH 20,陽(yáng)性對(duì)照采用質(zhì)?；蚪MDNA ;反應(yīng)結(jié)束后，將DNA樣本的循環(huán)閾值（Ct)與標(biāo) 準(zhǔn)曲線對(duì)照，得到DNA樣本中的ITS區(qū)基因片段拷貝數(shù)，進(jìn)而得到原來(lái)樣本中根腫病菌的濃 度。
[0013] 檢測(cè)茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)可以轉(zhuǎn)化成商品化的試劑盒，包括標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性DNA模板、熒光定量反應(yīng)液。
[0014] 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性DNA模板由含有插入目的片段的pGM-T (購(gòu)自天根公司）載體制備而成。 標(biāo)準(zhǔn)品的制備過(guò)程為：采用引物ITSl和ITS4擴(kuò)增根腫病菌的ITS區(qū)，PCR產(chǎn)物電泳后切下 含有目標(biāo)片段的凝膠，目標(biāo)片段用凝膠試劑盒回收純化后與PGM-T載體16°C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂平板培養(yǎng)，挑去白斑，采用引物為FSF1/FSR1進(jìn) 行PCR鑒定。陽(yáng)性克隆通過(guò)序列分析進(jìn)一步鑒定結(jié)果的可靠性。選擇PCR和序列分析均為 陽(yáng)性的克隆，接種到含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，采用質(zhì)粒小提試劑盒(購(gòu)自天 根公司)制備質(zhì)粒DNA。DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)A260定量，經(jīng)10倍梯度稀釋為200ng-200fg/ UL，保存于-20°C。
[0015] 熒光定量反應(yīng)液由正義引物FSFl、反義引物FSRl、熒光染料SYBR Premix Ex Taq 內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq TM HS, dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I 組成。
[0016] 本發(fā)明提供的茄病鐮刀菌熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，針對(duì)茄病鐮刀菌基因組ITS區(qū) 特異的靶序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系（引物濃度、擴(kuò)增程序等）的優(yōu)化，采用定量檢測(cè) 系統(tǒng)(包括ABI Prism系統(tǒng)、PE Applied Bioasystems、Bio_Rad)，可用于各種來(lái)源的爺病鐮 刀菌的定量檢測(cè)。引物對(duì)的檢測(cè)限點(diǎn)為13個(gè)細(xì)胞每個(gè)反應(yīng)。
[0017] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果： 1)特異性好、鑒定快速 引物包括茄病鐮刀菌的特異性序列，檢測(cè)特異性高。環(huán)境中，特別是蔬菜根際微生物種 類繁多，不容易進(jìn)行分離培養(yǎng)后檢測(cè)，本發(fā)明克服了這一不足之處，并且檢測(cè)快速。
[0018] 2)準(zhǔn)確定量、靈敏度高 與普通PCR檢測(cè)相比，本發(fā)明可以準(zhǔn)確定量，目標(biāo)DNA在200ng-200fg/ μ L濃度范 圍內(nèi)，都有良好的線性關(guān)系；同時(shí)檢測(cè)具有重復(fù)性好的特點(diǎn)。
[0019] 3)實(shí)用性好、應(yīng)用范圍廣 可以定量檢測(cè)植物植株、土壤、種子以及水中的茄病鐮刀菌，結(jié)合蔬菜茄病鐮刀菌的田 間發(fā)病閾值，可以為病害的早期預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)提供有力參考。
[0020]

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】 圖1是引物對(duì)FSF1/FSR1特異性檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。1的模板為茄病鐮刀菌基因組DNA， 2-10的模板分別為馬鈴薯粉痂菌DNA、禾谷多粘霉菌DNA、尖孢鐮刀菌基因組DNA、串珠鐮 刀菌基因組DNA、辣椒疫霉菌基因組DNA、瓜果腐霉菌基因組DNA、立枯絲核菌基因組DNA、西 瓜殼二孢基因組DNA、核盤菌基因組DNA、西瓜炭疽菌基因組DNA，N為陰性對(duì)照，M為250bp DNA Ladder (Takara 公司）； 圖2實(shí)施例3熒光定量PCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線 縱軸為Ct，橫軸為L(zhǎng)og CO ;標(biāo)準(zhǔn)誤為0. 9985 ; 圖3實(shí)施例3熒光定量PCR陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線 縱軸為 Delta Rn ;橫軸為 Cycle Number ; 曲線1，2, 3,4, 5和6的模板為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，反應(yīng)體系中DNA含量分別為I. 36ng，136pg， 13. 6pg，I. 36pg，136fg，13. 6fg ; 圖4實(shí)施例2熒光定量PCR檢測(cè)威百畝處理后定制黃瓜前土壤中茄病鐮刀菌動(dòng)態(tài)變 化 縱軸為茄病鐮刀菌孢子數(shù)量；橫軸為處理時(shí)間； 圖5實(shí)施例2熒光定量PCR檢測(cè)威百畝處理后定制黃瓜后土壤中茄病鐮刀菌動(dòng)態(tài)變 化 縱軸為茄病鐮刀菌孢子數(shù)量；橫軸為處理時(shí)間。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡述發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，下列實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明要求保護(hù)范圍。應(yīng)用實(shí)例中DNA提取采用的是試劑盒，實(shí)際應(yīng)用中也可以 采用改良CTAB等方法。
[0022] 實(shí)施例1 :爺病鐮刀菌的特異性引物檢測(cè) 茄病鐮刀菌及其他病原菌真菌和細(xì)菌菌菌株見表1。病原真菌菌株用PDA(每1000 ml 培養(yǎng)基馬鈴薯200 g，葡萄糖20g，瓊脂20 g)或Η)液體培養(yǎng)基(每1000 ml培養(yǎng)基馬鈴薯 200 g，葡萄糖20g)培養(yǎng)；土傳病原細(xì)菌菌株用NA培養(yǎng)基(每1000 ml培養(yǎng)基牛肉膏5g，蛋 白胨l〇g，氯化鈉5g，瓊脂20g)或NA液體培養(yǎng)基海1000 ml培養(yǎng)基牛肉膏5g，蛋白胨10g， 氯化鈉5g)培養(yǎng)。所有菌株先在固體培養(yǎng)基上活化，然后轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，1周后收集 菌絲或菌體提取DNA。DNA的提取采用改良的CTAB提取法（Sambr 〇〇k，1989)。
[0023] 對(duì)已經(jīng)發(fā)表在GenBank上的不同國(guó)家和地區(qū)茄病鐮刀菌rDNA-ITS基因的序列 進(jìn)行比較，利用Primer render 5.0軟件在茄病鐮刀菌基因的rDNA-ITS區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特 異性引物 FSFl :5' -GCTAACAATCATCTACAGAC-3 ' ；FSR1 :5' -GACGGATGAGAGAGC-3'，擴(kuò)增片 段長(zhǎng)度為487bp，引物由上海生工科技有限公司合成。使用時(shí)引物用雙蒸滅菌水稀釋至 10 μ mol · L、
[0024] 以茄病鐮刀菌及其它病原菌真菌及細(xì)菌的基因組DNA為模板，利用引物FSFl/ FSRl進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)該引物的特異性。普通PCR反應(yīng)體系如下：總反應(yīng)體積 25 μ L，10 XPCR buffer2. 5 μ L，dNTP (10 μ mol/L) 0· 5 μ L，引物（10 μ mol/L)各 0· 5 μ L，模 板DNA3. 0 μ L，TapDNA聚合酶1 μ L，最后以ddH20補(bǔ)足至25 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù) 變性 3min ;94°C變性 30s，52°C退火 lmin，72°C延伸 I. 5min，共 40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7 min。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)（圖1)。
[0025] 表1弓丨物特異性檢測(cè)菌株

【權(quán)利要求】
1. 一種茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，其特征在于包括以下步驟： 1) 取田間自然發(fā)病土壤、發(fā)病植株、茄果類蔬菜種子，進(jìn)行總DNA的提取純化，得到DNA 樣本； 2) 特異性引物設(shè)計(jì)，對(duì)已經(jīng)發(fā)表在GenBank上的不同國(guó)家和地區(qū)茄病鐮刀菌rDNA-ITS 基因的序列進(jìn)行比較，利用Primer render 5.0軟件在茄病鐮刀菌基因的rDNA-ITS區(qū)設(shè) 計(jì)一對(duì)特異性引物，根據(jù)Genbank中公布的爺病鐮刀菌rDNA-ITS區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物 對(duì) EF1/EF2 : 引物對(duì)：正向引物 5' -GCTAACAATCATCTACAGAC-3' 反向引物 5 ' -GACGGATGAGAGAGC-3 ' 3) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為：熒光定量PCR反應(yīng)體系總體積為25W，其中SYBR Premix Ex Taq(內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I ) 12. 5W，濃度為10Mm〇l/L的正義引物EF1和反義引物EF2各0. 5W，標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋 液或待檢測(cè)樣品DNA溶液2W，ddH20補(bǔ)齊至25W ; 4. PCR反應(yīng)程序?yàn)椋篜CR采用兩步法，95°C預(yù)變性3min，接著進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán) 包括95°C變性30s、60 °C退火30s、72 °C延伸1.5min;PCR完成后，按0. 1°C s-1升溫速 率從72°C升至95°C進(jìn)行融解曲線的分析驗(yàn)證； 5) 插入ITS區(qū)的pMD-18T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a增殖后提取的質(zhì)粒基因組DNA，DNA 經(jīng)紫外分光光度計(jì)A260定量并10倍梯度稀釋，稀釋成7個(gè)濃度梯度，按照上述PCR反應(yīng)體 系和程序進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各個(gè)濃度梯度的循環(huán)閾值（Ct)采用計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線； 6) 取步驟1)中得到的DNA樣本作為模板，按上述熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序 在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并同時(shí)進(jìn)行陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增，其中陰性對(duì) 照采用ddH20,陽(yáng)性對(duì)照采用茄病鐮刀菌菌株基因組DNA ;反應(yīng)結(jié)束后，將DNA樣本的循環(huán)閾 值（Ct)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，得到DNA樣本中的ITS區(qū)基因片段拷貝數(shù)，進(jìn)而得到原來(lái)樣本中 茄病鐮刀菌的濃度。
2. 權(quán)利要求書1所述的檢測(cè)茄病鐮刀菌的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)可以轉(zhuǎn)化成商品化 的試劑盒，試劑盒包括：正義引物EF1、反義引物EF2、熒光染料SYBR Premix Ex Taq內(nèi)含 TaKaRa Ex Taq TM HS，dNTP Mixture，Mg2+和 SYBR Green I、以及由插入 ITS 區(qū)的pMD-18T 載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a增殖后提取的質(zhì)粒DNA，DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)A260定量并10倍 梯度稀釋。
3. 該技術(shù)可以應(yīng)用于對(duì)農(nóng)田環(huán)境中，包括對(duì)土壤中越冬菌量和發(fā)病植株瓜類、菜豆、豌 豆、胡椒、山椒5類蔬菜上茄病鐮刀菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以及檢測(cè)瓜類、菜豆、豌豆、胡椒、山椒 等5類蔬菜種子帶菌和田間灌溉水中的茄病鐮刀菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104372068SQ201310348495
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】石延霞, 李寶聚, 趙一杰, 謝學(xué)文, 柴阿麗 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所