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一種快速定量檢測c-反應蛋白的均相熒光免疫試劑組及其制備方法

文檔序號:8255440閱讀:594來源:國知局
一種快速定量檢測c-反應蛋白的均相熒光免疫試劑組及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域,具體設及一種快速定量檢測C-反應蛋白的均相巧光 免疫試劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] C-反應蛋白(c-reactive protein, CRP)被公認為是最有價值的急性時相反應蛋 白,它的升高可W提示許多炎癥事件的發(fā)生,因此,很久W來被廣泛應用于臨床感染性疾病 的檢測。近年來有研究者發(fā)現(xiàn),炎癥在動脈粥樣硬化的起始、形成、發(fā)展過程中扮演了重要 的角色,所WC-反應蛋白該個極其靈敏的炎癥指標在各種類型屯、血管疾病中得到了廣泛 的研究。由于CRP在感染發(fā)生后6?她即開始升高,24?4她達到高峰,高峰值可達正常 的數(shù)百倍,在感染消除后其含量急驟下降,一周內可恢復正常。而CRP在病毒感染時無顯著 升高,該為疾病早期感染類型的鑒別提供了極其重要的依據(jù)。
[0003] 常規(guī)CRP檢驗方法可在感染或組織損傷時檢測出CRP〉10mg/l,但不能很好地檢測 出低水平(0. 1?lOmg/L)的CRP變化。該水平的CRP與屯、血管疾病的發(fā)生有著密切的關 系,所W日益受到研究者的關注。隨著一些高靈敏度檢測方法的出現(xiàn),低水平的CRP也可 W被檢測出來,由于應用的檢測方法具有較高的靈敏度,因此,該個水平的C-反應蛋白又 被稱為較高的超敏C-反應蛋白(hi曲sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)。研究 顯示,在無明顯癥狀的健康男性中,CRP的升高程度與初次發(fā)生冠屯、病的危險性呈正相關, hs-CRP濃度處于高值的那部分人群未來發(fā)生中風、屯、肌梗死、周圍血管疾病的危險分別是 低值的 2 倍化R=l. 9,95% CI 1.1 ?3.3)、3 倍化R = 2. 9,95%)CI 1.8 ?6.0)和 4 倍 (RR = 4. 1,95% CI 1. 2?6. 0),并且證實不受吸煙因素的影響而獨立于冠屯、病的其他危險 因子之外。Hs-CRP對于女性也是一個強有力的未來屯、血管發(fā)病的預測因子(RR = 4. 4, 95 % CI 2. 2?8.9)。hs-CRP對于急性冠脈綜合征的診斷也有十分重要的作用。不穩(wěn)定性屯、絞 痛或非ST段抬高的屯、肌梗死患者有hs-CRP升高、則示來可能會發(fā)生各種不利事件,如屯、絞 痛的再發(fā)、ST段抬高的屯、肌梗死或冠屯、病引起的死亡。
[0004] 臨床實驗室CRP檢測一直采用透射免疫和散射免疫方法,該些方法的參考值范圍 變動很大,從3mg/L到超過200mg/L。隨著人們對于低水平CRP與屯、血管疾病關系的認識, 該些測定方法的靈敏度遠遠不能滿足要求。疾病的早期診斷和及時治療是至關重要的。但 目前的檢測方法,不能兼顧高值和低值的檢測要求,且需要昂貴的儀器設備和試劑。因此, 建立一種檢測時間盡量縮短,并且檢測除了能在實驗室進行外,還要求能夠進行床旁檢測, 同時對高值和低值CRP都適用的檢測方法,從而為臨床提供準確的診斷依據(jù),是十分必要 的。
[0005] 均相巧光分析法化omogeneous fluoroimmunoassay, HFIA)是在時間分辨巧光免 疫分析(time-resolued fluoroimmunoassay, TRFIA)技術的基礎上形成的一種新的巧光免 疫分析技術。TRFIA技術采用的巧光物質與傳統(tǒng)的巧光染料完全不同,采用的是銅系元素 館巧u)、得(Tb)等作為巧光材料,靈敏度非常高,穩(wěn)定性好,低溫條件可保存=年,因而成 為二十一世紀最熱口的免疫分析技術。
[0006] 均相巧光免疫檢測法是用同一抗原的兩個抗體分別標記化和巧光染料 Alexa647?;瘶擞浛贵w在游離狀態(tài)時,受到340nm光線激發(fā),只發(fā)射平均波長為615nm 巧光,而在抗原、抗體復合物形成時,發(fā)生能量傳遞,激發(fā)巧光染料Alexa647發(fā)射出665nm 巧光。標記抗體直接與待測樣品進行抗原、抗體反應,如果能形成抗原、抗體復合物,則在 665nm出可測得巧光信號。該種方法省卻了酶聯(lián)免疫法反復解育和洗板等煩瑣操作步驟,幾 分鐘就能獲得結果,省時省力。并且,此法也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境 等外界因素的干擾,穩(wěn)定性和重復性都較好,能較真實地反映被測物質的含量。此外,Eu 3+和 Alexa647該對巧光物質的最大發(fā)射光波長之間相差較大,未發(fā)生抗原抗體反應的本底巧光 值就非常低。而人血清中非特異性物質產(chǎn)生的300?500nm巧光,不能激發(fā)Alexa647發(fā)射 巧光信號650nm激發(fā)光。因此非特異性巧光非常低。
[0007] 本發(fā)明采用均相巧光免疫快速檢測技術,利用巧光的高靈敏特點,同樣也避免了 膠體金或者巧光CRP干式免疫試紙中的硝酸纖維素膜本身孔隙不均一特性對檢測準確度 和重復性的不良影響。由于均相巧光免疫檢測中樣品與巧光標記抗體全過程都在液相中全 面接觸,反應充分,因此可大幅度提高檢測靈敏度和線性范圍,同時反應在液相進行也增加 了樣品的稀釋倍數(shù),消除了樣品的基質效應影響,使定量結果有很好的可重復性,提高了定 量結果的精密度和準確度,可滿足臨床診斷大規(guī)模檢測的要求。

【發(fā)明內容】

[000引本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有CRP檢測技術的不足,提供一種快速定量檢測CRP的 均相巧光免疫試劑組。本發(fā)明根據(jù)巧光免疫技術特點和CRP抗原抗體系統(tǒng)特點,設計新的 原材料,試劑和工藝流程,應用本發(fā)明提供的試劑組檢測CRP水平,具有簡單,快速,靈敏和 特異性好等特點,可同時定量檢測高值和低值樣品,并且性價比高,適用于臨床快速檢測。
[0009] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種快速定量檢測C-反應蛋白的均相巧光免疫試劑 組,包括稀±元素馨合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體(anti-CRP)、近紅外巧光化合物 標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體和系列濃度的C-反應蛋白校準品。
[0010] 優(yōu)選地,稀上元素馨合物為化馨合物。
[0011] 更優(yōu)選地,稀±元素馨合物為BH肥T-化或1,2-二(1",1",1",2",2",3",3"-走 氣-4",6"-己二酬-6"-基-對節(jié)基)-4-氯橫酷基苯與館(III)的配合物炬HHBCB-Eu 3+)。
[0012] 優(yōu)選地,所述近紅外巧光化合物為Alexa系列近紅外巧光化合物、DyLi曲t系列近 紅外巧光化合物和CF系列近紅外巧光化合物中的至少一種。
[0013] 更優(yōu)選地,所述近紅外巧光化合物Alexa647、DyLi曲t-DY647和CF647中的至少一 種。
[0014] 優(yōu)選地,所述系列濃度的C-反應蛋白校準品由校準品稀釋液稀釋C-反應蛋白配 制而成,所述校準品稀釋液為含0. 01-0. 5wt%陽G、l-5wt% BSA、0. 01-0. 05wt%表面活性 劑的磯酸鹽緩沖液。
[0015] C-反應蛋白校準品可用塑料瓶密封包裝。
[0016] 本發(fā)明的第二個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的均相巧光免疫試劑組的制 備方法,包括w下步驟:
[0017] 1)稀±元素馨合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體的制備:
[00化]取0. 5-5mg/ml的抗C-反應蛋白單克隆抗體溶液,加入0. 05-0. 5mol/L的Na肥〇3 溶液后,調抑至8. 5-10,滴加10-100 y g/ml配體化合物溶液,攬拌反應0. 6-化,分離得 到配體化合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體,加入終濃度為0. 05-0. 5wt %的BSA和 0. 01-lwt %的NaNs,調抑至5. 5-6. 5,免疫分析前,加入Eu3+溶液,使配體化合物與化等 摩爾濃度,即得,其中,抗C-反應蛋白單克隆抗體溶液、NaHC〇3溶液和配體化合物溶液的體 積比為 0. 1-1 : 1 : 0.01-0. 05 ;
[0019] 2)近紅外巧光化合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體的制備:
[0020] 將抗C-反應蛋白單克隆抗體用0. 05-0. 5mol/L的NaHC〇3溶液稀釋至0. 5-5mg/ml, 加入近紅外巧光化合物溶解液,攬勻,室溫解育0. 5-化,分離得到近紅外巧光化合物標記的 抗C-反應蛋白單克隆抗體;
[0021] 3)系列濃度的C-反應蛋白校準品的制備;
[002引將C-反應蛋白用校準品稀釋液稀釋配制成系列濃度,即得,
[0023] 其中,1)、2)和3)的順序可W任意顛倒。
[0024] 其中,稀±元素馨合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體用于免疫分析時,用標記 物稀釋液稀釋使用,2-8 °C分裝保存。
[0025] 其中,近紅外巧光化合物標記的抗C-反應蛋白單克隆抗體用磯酸鹽緩沖液稀釋, 2-6 °C保存。
[0026] 其中,C-反應蛋白校準品2-6 °C保存。
[0027] 優(yōu)選地,抗C-反應蛋白單克隆抗體在于配體化合物反應之前,先進行透析處理。
[0028] 優(yōu)選地,步驟1)中配體化合物為BHHCT或BHHBCB。
[0029] 優(yōu)選地,步驟1)中分離得到配體化合物標記的anti-CRP通過離屯、和柱層析方式 進行。柱層析采用Se地adexG-SO柱,0. 01-0. Imol/L畑4肥〇3(p服.0)洗脫。
[0030] 優(yōu)選地,步驟2)中,分離得到近紅外巧光化合物標記的anti-CRP通過柱層析的方 式進行。
[0031] 進一步優(yōu)選地,步驟2)中,柱層析采用G25凝膠柱。
[003引優(yōu)選地,步驟2)中,室溫解育時,每隔10-20min混勻一次。
[0033] 本發(fā)明的均相巧光免疫試劑的使用;先將稀±元素馨合物標記的anti-CRP溶液 加入反應微孔中,再加入近紅外巧光化合物標記的anti-CRP溶液,最后分別加入CRP校準 品和臨床檢測樣品,37°C反應20分鐘后,用均相巧光免疫分析儀檢測判讀結果。
[0034] 本發(fā)明提供的快速定量檢測C-反應蛋白的均相巧光免疫試劑組,其反應原理為 雙抗體夾屯、法的均相巧光免疫法。待測樣品與適當比例的稀±元素(例如化 3+)和巧光 標記抗體在液相均質介質中充分混和均勻,在此過程中樣品中的CRP既能專一性地與稀 ±元素標記的抗CRP抗體充分結合,也能與巧光標記的CRP抗體充分反應,形成"稀±元 素-anti-CRP-CRP-anti-CRP-巧光化合物"免疫復合物,巧光強度可
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