一種抗核糖體P蛋白抗體IgG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒及制備和檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種抗核糖體P蛋白抗體IgG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒，該試劑盒包括：抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品；抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品；含生物素標(biāo)記的核糖體P蛋白抗原和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；含堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；含有鏈霉親和素標(biāo)記的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；清洗液。該試劑盒的檢測(cè)方法在傳統(tǒng)的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法的基礎(chǔ)上，將靈敏度和線性范圍再提高3?5個(gè)數(shù)量級(jí)、實(shí)現(xiàn)真正意義的定量檢測(cè)，反應(yīng)迅速，結(jié)果可靠，并能夠配合全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)使用，對(duì)于臨床診斷具有無(wú)可替代的重要價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
-種抗核糖體P蛋白抗體I gG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑 盒及制備和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，設(shè)及一種抗核糖體P蛋白抗體IgG的磁 微粒化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒及制備和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗核糖體P蛋白抗體直接作用于特定的核糖體憐酸化蛋白。Anti-Rib-P IgG是系 統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)診斷的高特異性指標(biāo)，在其它自身免疫性疾病中幾乎檢測(cè)不到，Anti- Rib-P IgG在SLE患者中的陽(yáng)性率介于5%~46%之間。
[0003] 目前臨床上抗核糖體P蛋白抗體IgG的檢測(cè)有膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法。膜條 免疫法應(yīng)用的是膜條顯色技術(shù)，其特點(diǎn)為固定幾個(gè)項(xiàng)目在同一膜條測(cè)定，一般通過(guò)手工或 者半自動(dòng)膜條儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，最終通過(guò)肉眼進(jìn)行定性判定，該技術(shù)靈敏度低，反應(yīng)時(shí)間 長(zhǎng)，檢測(cè)項(xiàng)目只能固定搭配組合，靈活性差。酶聯(lián)免疫吸附法的靈敏度在膜條免疫法基礎(chǔ)上 有所提升，但仍然較低，并且線性范圍窄，重復(fù)性差，反應(yīng)時(shí)間也較長(zhǎng)，仍然不能很好滿足臨 床的應(yīng)用。
[0004] 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，較W前的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法，在檢測(cè)靈 敏度、檢測(cè)范圍、檢測(cè)時(shí)間及自動(dòng)化操作上有了大大提高，且沒(méi)有污染，臨床應(yīng)用廣。目前， 使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光分析法在抗核糖體P蛋白抗體IgG免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用仍未見(jiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種抗核糖體P蛋白抗體IgG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量 測(cè)定試劑盒，本發(fā)明提供的試劑盒將化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)與磁性微粒分離技術(shù)相結(jié)合，采用 生物素和堿性憐酸酶(ALP)分別標(biāo)記抗原和抗體，W直徑1-3皿的包被鏈霉親和素的超順磁 性微粒作為分離試劑。ALP催化底物發(fā)光后，通過(guò)儀器測(cè)量發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算出待測(cè)物濃度。該 檢測(cè)方法在傳統(tǒng)的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法的基礎(chǔ)上，將靈敏度和線性范圍再提高3- 5個(gè)數(shù)量級(jí)、實(shí)現(xiàn)真正意義的定量檢測(cè)，反應(yīng)迅速，結(jié)果可靠，并能夠配合全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免 疫分析儀實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)使用，對(duì)于臨床診斷具有無(wú)可替代的重要價(jià)值。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種上述試劑盒的制備方法及檢測(cè)方法。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[000引一種抗核糖體P蛋白抗體IgG的磁微粒化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒，所述試劑盒包 括：
[0009] 1)抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品，含抗核糖體P蛋白抗體IgG和牛血清白蛋白的 化is緩沖液，所述抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品為6個(gè)水平的液體校準(zhǔn)品，所述6個(gè)水平的 液體校準(zhǔn)品中抗核糖體P蛋白抗體IgG的濃度分別為0，5，20，50，100，200RU/mL
[0010] 2)抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品，含抗核糖體P蛋白抗體IgG和牛血清白蛋白的 化is緩沖液，所述抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品包含2個(gè)水平的液體質(zhì)控品，所述2個(gè)水平 的液體質(zhì)控品中抗核糖體P蛋白抗體IgG的祀值濃度范圍分別為(20 ± 4)RU/mL和（100 ± 20) 抓/ml^;
[0011] 3)試劑1號(hào)，含生物素標(biāo)記的核糖體P蛋白抗原和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；
[0012] 4)試劑2號(hào)，含堿性憐酸酶標(biāo)記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖 液；
[0013] 5)磁分離試劑，含有鏈霉親和素標(biāo)記的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；
[0014] 6)清洗液；
[0015] 所述試劑盒中試劑1號(hào)，試劑2號(hào)和磁分離試劑的含量比為1:3:1，所述含量比為體 積比。
[0016] 進(jìn)一步的，所述磁微粒的材質(zhì)為化2〇3;所述磁微粒表面包被有簇基基團(tuán)，包被物中 簇基基團(tuán)含量大于20wt%，所述磁微粒的大小為
[0017] -種制備所述抗核糖體P蛋白抗體IgG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒的方法， 該方法包括如下步驟：
[0018] (1)配制抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品：
[0019] a.配制抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液：
[0020] 將純化水、TriS、氯化鋼和Procl in300加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙猓琓riS濃 度為Iwt%，氯化鋼濃度為Iwt%，Proclin300濃度為0.2V% ;用4M的肥L將溶液的pH值調(diào)為 7.0- 7.5 ;將牛血清白蛋白加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙?，牛血清白蛋白的濃度?4wt % ;再用4M的肥L將溶液的抑值調(diào)為7.0-7.5;用孔徑為0.2WI1的濾器過(guò)濾得抗核糖體P蛋 白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液，2-8°C保存待用；
[0021] b.配制抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品：
[0022] 將抗核糖體P蛋白抗體IgG用抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至各濃度 點(diǎn)為0,5,20,50，100,200抓/1111^;
[0023] (2)配制抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品：
[0024] 將抗核糖體P蛋白抗體IgG用上述抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至各 濃度點(diǎn)為20,100抓/ml^;
[00劇 （3)配制試劑1號(hào)：
[0026] a.配制試劑1號(hào)稀釋液：
[0027] 將純化水、Tris、氯化鋼和Proclin300加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙?，Tris的 濃度為Iwt %，氯化鋼濃度為0.5wt %，Proclin300的濃度為0.2v% ;將牛血清白蛋白加入容 器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙?，牛血清白蛋白的濃度?.5wt % ;用4M的肥L將溶液的抑值調(diào)為 7.0- 7.5;用孔徑為0.2WI1的濾器過(guò)濾得試劑1號(hào)稀釋液，2-8°C保存待用；
[002引 b.配制試劑1號(hào)：
[0029]將Rib-P抗原用純化水溶解，2-8°C條件下用濃度為0.2M，抑為9.0的碳酸鹽緩沖液 透析化，然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液，用濃度為0.2M，pH為8.5-9的碳酸鹽緩沖 液配制濃度為0.5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照Rib-P抗原與生物素質(zhì)量比為10:1的比例 在Rib-P抗原溶液中加入生物素溶液，混合均勻，室溫靜置12-1化，反應(yīng)生成Rib-P抗原-生 物素連接物;將含有化b-p抗原-生物素連接物的反應(yīng)液在2-8°C條件下用濃度為0.2M，pH為 9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天，期間進(jìn)行4次換液，從而除去未反應(yīng)的生物素，得到含有Rib-P 抗原-生物素連接物的溶液;用試劑I號(hào)稀釋液將含有Rib-P抗原-生物素連接物的溶液稀釋 至IjO. 1-0.3iig/mL，制得試劑1號(hào)；
[0030]本步驟配制的試劑1號(hào)可降低實(shí)驗(yàn)成本，而且能有效分離游離生物素和連接物，得 到的連接物較純，減少了后續(xù)反應(yīng)的非特異；
[00川 （4)配制試劑2號(hào)：
[0032] a.配制試劑2號(hào)稀釋液：
[0033] 將純化水、4-徑乙基贓嗦乙橫酸、氯化鋼、牛血清白蛋白、ZnCb、Proclin300加入 容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙猓?-徑乙基贓嗦乙橫酸的濃度為0.6wt %，氯化鋼濃度為 0.8訊1%，牛血清白蛋白的濃度為0.5訊1%，211(：12的濃度為0.1訊1%〇，口'〇(31111300的濃度為 0.2v%。,MgCb的濃度為0.1%。；用4M的肥L將溶液的抑值調(diào)為7.5-8.0;用孔徑為0.2皿的濾 器過(guò)濾得試劑2號(hào)稀釋液，2-8°C保存待用；
[0034] b.配制試劑2號(hào)：
[0035] 將Img羊抗人多克隆抗體加入到2-化L濃度為lOmg/mL的2-亞氨基硫燒鹽酸鹽溶液 中，室溫靜置20min，再加入0 . ImoL/L的甘氨酸溶液10化，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除 鹽，收集活化后的羊抗人多克隆抗體，2-8°C保存?zhèn)溆?將1.5mg的堿性憐酸酶加入到10-2化 L的濃度為5mg/血的4-(N-馬來(lái)酷亞胺基甲基)環(huán)己燒-1-簇酸班巧酷亞胺醋溶液中，室溫靜 置30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的堿性憐酸酶，2-8°C保存?zhèn)溆?；將活化的羊抗?多克隆抗體與活化的堿性憐酸酶混合，2-8°C條件下靜置12-2地，用Supperdex200凝膠純化 柱純化偶聯(lián)物，獲得羊抗人多克隆抗體-堿性憐酸酶連接物濃溶液，2-8°C保存?zhèn)溆?將羊抗 人多克隆抗體-堿性憐酸酶連接物濃溶液用試劑2號(hào)稀釋液稀釋到0.02-0.化g/mL，制得試 劑2號(hào)；
[0036] (5)配制磁分離試劑：
[0037] a.配制磁微粒緩沖液：
[003引將純化水、Tris和氯化鋼加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙猓琓ris的濃度為Iwt%， 氯化鋼的濃度為0.8wt % ;再將牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中，充分 攬拌至完全溶解，牛血清白蛋白的濃度為0.5wt%，新生牛血清濃度為5v%，Proclin300濃 度為0.2v%。;用4M的肥L將溶液的抑值調(diào)為7.9-8.1;用孔徑為0.2皿的濾器過(guò)濾得磁微粒緩 沖液，2-8 °C保存待用；
[0039] b.配制磁分離試劑：
[0040] 取IOOmg磁微粒，使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L，pH為4.5-5的2-(N-嗎啡嘟）乙橫酸緩沖液10mL，充分混勻;再加入0.5-l血新配 審揃濃度均為lOmg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-徑基班巧酷亞胺水溶 液，室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系；使用2-(N-嗎啡嘟）乙橫酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液，然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素，4°C條件下混懸16-2化;再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入IOmL 濃度為lM，pH為8.5的乙醇胺溶液，室溫反應(yīng)1-化，再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上 清，向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL，制得磁分離試劑；
[0041] 本步驟中，加入N-徑基班巧酷亞胺能夠?qū)ε悸?lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亞胺起到穩(wěn)定作用；加入鏈霉親和素后在4度條件下混懸，能夠更好的保留蛋白質(zhì)活性， 同時(shí)減少室溫變化對(duì)偶聯(lián)效果的影響，使批次之間偶聯(lián)結(jié)果更加穩(wěn)定;加入乙醇胺，可使乙 醇胺分子中的氨基與磁珠活化后未結(jié)合蛋白的活性位點(diǎn)反應(yīng)，起到終止反應(yīng)和封閉作用， 能夠產(chǎn)生更低的本底值；
[0042] (6)配制清洗液：
[0043] 將純化水、Tris和氯化鋼加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙猓琓ris的濃度為Iwt%， 氯化鋼的濃度為〇.8wt%;再將Tween-20和化itonlOO加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆靹颍?Tween-20的濃度為0.5wt % ,TritonlOO的濃度為0 . Swt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調(diào)為 7.5-8.0，用孔徑為0.2WI1的濾器過(guò)濾得清洗液，2-8 °C保存。
[0044] 抗核糖體P蛋白抗體IgG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒的檢測(cè)方法，該方法包 括如下步驟：
[0045] 1)將抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品放到全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)試位置，得 到由全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀輸出的擬合曲線；
[0046] 2)將抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品放到上述分析儀測(cè)試位置，得到由全自動(dòng)化學(xué) 發(fā)光免疫分析儀輸出的所述質(zhì)控品的測(cè)試發(fā)光值和通過(guò)步驟1得到的擬合曲線擬合得到抗 核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品的濃度值；
[0047] 3)將待測(cè)樣本放到上述分析儀測(cè)試位置，由所述分析儀自動(dòng)按1:20將樣本稀釋， 得到由全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀輸出的待測(cè)樣本的濃度值。
[004引進(jìn)一步的，該檢測(cè)方法包括如下步驟：：
[0049] 1)加2化L抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品或質(zhì)控品或1:20稀釋后的待測(cè)標(biāo)本至檢 測(cè)管中；
[(K)加]2)加50化的試劑1號(hào)至步驟1)所述檢測(cè)管中，混勻后，37±0.5°C溫育IOmin;
[0051 ] 3)加50化的磁分離試劑至步驟2)所述檢測(cè)管中，混勻后，37±0.5°C溫育5min，進(jìn) 行磁分離，去上清；
[0052] 4)加3(K)化的清洗液至步驟3)檢測(cè)管中，混勻，進(jìn)行磁分離，去上清；
[0化3] 5)重復(fù)步驟4)兩遍；
[0054] 6)加15化L試劑2號(hào)至步驟5)檢測(cè)管中，混勻后，37 ± 0.5°C溫育IOmin，進(jìn)行磁分 離，去上清；
[0055] 7)加3(K)化的清洗液至步驟6)檢測(cè)管中，混勻，進(jìn)行磁分離，去上清；
[0化6] 8)重復(fù)步驟7)兩遍；
[0057] 9)加2(K)化的化學(xué)發(fā)光底物至步驟8)檢測(cè)管中，混勻，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，
[0058] 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的全自動(dòng)檢測(cè)步 驟。
[0059] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0060] 本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定抗核糖體P蛋白抗體IgG的新技術(shù)，使得反應(yīng)過(guò)程更加快速 可靠，提高了靈敏度和線性范圍，實(shí)現(xiàn)真正意義的定量測(cè)定，并可搭配全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫 分析儀實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)的使用，大大提高工作效率;試劑盒中的校準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記試劑、酶標(biāo) 記試劑、磁分離試劑和清洗液等均是該反應(yīng)體系下的最優(yōu)配方，給該試劑盒的使用效期及 檢測(cè)性能提供了有力保障。
【附圖說(shuō)明】
[0061] 圖Ia為實(shí)施例7空白限評(píng)價(jià)中零濃度校準(zhǔn)品與相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度值與發(fā)光值 結(jié)果進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出的一次方程；
[0062] 圖化為對(duì)比例1空白限評(píng)價(jià)中零濃度校準(zhǔn)品與相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度值與發(fā)光值 結(jié)果進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出的一次方程；
[0063] 圖2為實(shí)施例7線性范圍評(píng)價(jià)中樣本濃度平均值和稀釋比例用最小二乘法進(jìn)行直 線擬合方程；
[0064] 圖3為實(shí)施例7同已有的商品化的試劑盒臨床樣本測(cè)值相關(guān)性散點(diǎn)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0065] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō) 明。
[0066] 實(shí)施例1
[0067] 抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品的制備：
[0068] a.配制抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液：
[0069] 將800ml的純化水、11.2g的Tris、8.6g氯化鋼和2ml Proclin300加入容器中，充分 攬拌至完全溶解；用4M的HCL將溶液的pH值調(diào)為7.0-7.5;將40g牛血清白蛋白加入容器中， 充分?jǐn)埌柚镣耆芙?再用4M的肥L將溶液的抑值調(diào)為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至IL， 用0.2WI1濾器過(guò)濾得抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液，2-8 °C保存待用；
[0070] b.配制抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品：
[0071] 將抗核糖體P蛋白抗體IgG用抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至各濃度 點(diǎn)為0,5,20,50，100,200抓/1111^。
[0072] 實(shí)施例2
[0073] 抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品的制備：
[0074] 將抗核糖體P蛋白抗體IgG用上述抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至各 濃度點(diǎn)為20,100抓/mL。
[00巧]實(shí)施例3
[0076] 試劑1號(hào)的制備：
[0077] a.配制試劑1號(hào)稀釋液：
[0078] 將8001111純化水、12.1旨的化13、5.始氯化鋼和21111?'〇(31111300加入容器中，充分?jǐn)?拌至完全溶解;將5g牛血清白蛋白加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙?；?M的HCL將溶液的 pH值調(diào)為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L，用0.2WI1濾器過(guò)濾得試劑1號(hào)稀釋液，2-8°C保 存待用；
[0079] b.配制試劑1號(hào)：
[0080] 將R化-P抗原用純化水溶解，2-8°C條件下用濃度為0.2M，抑為9.0的碳酸鹽緩沖液 透析化，然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液，用濃度為0.2M，pH為8.5-9的碳酸鹽緩沖 液配制濃度為0.5-1. Omg/ml的生物素溶液;按照Rib-P抗原與生物素質(zhì)量比為10:1的比例 在Rib-P抗原溶液中加入生物素溶液，混合均勻，室溫靜置12-1化，反應(yīng)生成Rib-P抗原-生 物素連接物;將含有化b-p抗原-生物素連接物的反應(yīng)液在2-8°C條件下用濃度為0.2M，pH為 9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天，期間進(jìn)行4次換液，從而除去未反應(yīng)的生物素，得到含有Rib-P 抗原-生物素連接物的溶液;用試劑1號(hào)稀釋液將含有Rib-P抗原-生物素連接物的溶液稀釋 至IjO. 1-0.3iig/mL，制得試劑1號(hào)；
[0081] 本步驟配制的試劑1號(hào)可降低實(shí)驗(yàn)成本，而且能有效分離游離生物素和連接物，得 到的連接物較純，減少了后續(xù)反應(yīng)的非特異。
[0082] 實(shí)施例4
[0083] 試劑2號(hào)的制備：
[0084] a.配制試劑2號(hào)稀釋液：
[0085] 將800ml純化水、6.06g的4-徑乙基贓嗦乙橫酸、8.5g氯化鋼、5g牛血清白蛋白、 0.1拉nCl2、0.2ml Proclin300和O.lg MgCb加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙?；?M的肥L 將溶液的pH值調(diào)為7.5-8.0;用純化水將溶液定容至IL，用0.化m濾器過(guò)濾得試劑2號(hào)稀釋 液，2-8 °C保存待用；
[0086] b.配制試劑2號(hào)：
[0087] 將Img羊抗人多克隆抗體加入到2-化L濃度為lOmg/mL的2-亞氨基硫燒鹽酸鹽溶液 中，室溫靜置20min，再加入0 . ImoL/L的甘氨酸溶液10化，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除 鹽，收集活化后的羊抗人多克隆抗體，2-8°C保存?zhèn)溆?將1.5mg的堿性憐酸酶加入到10-2化 L的濃度為5mg/血的4-(N-馬來(lái)酷亞胺基甲基)環(huán)己燒-1-簇酸班巧酷亞胺醋溶液中，室溫靜 置30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的堿性憐酸酶，2-8°C保存?zhèn)溆?；將活化的羊抗?多克隆抗體與活化的堿性憐酸酶混合，2-8°C條件下靜置12-2地，用Supperdex200凝膠純化 柱純化偶聯(lián)物，獲得羊抗人多克隆抗體-堿性憐酸酶連接物濃溶液，2-8°C保存?zhèn)溆?將羊抗 人多克隆抗體-堿性憐酸酶連接物濃溶液用試劑2號(hào)稀釋液稀釋到0.02-0.化g/mL，制得試 劑2號(hào)。
[0088] 實(shí)施例5
[0089] 磁分離試劑的制備：
[0090] a.配制磁微粒緩沖液：
[0091] 將SOOmL純化水、12.1 g化i S和8.5g氯化鋼加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙?再 將5g牛血清白蛋白、50血新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆?解；用4M的肥L將溶液的抑值調(diào)為7.9-8.1;用純化水將溶液定容至1L，用0.2皿濾器過(guò)濾得 磁微粒緩沖液，2-8 °C保存待用；
[0092] b.配制磁分離試劑：
[0093] 取IOOmg磁微粒，使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L，pH為4.5-5的2-(N-嗎啡嘟）乙橫酸緩沖液10mL，充分混勻;再加入0.5-l血新配 審揃濃度均為lOmg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-徑基班巧酷亞胺水溶 液，室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系;使磁微粒充分活化，使用2-(N-嗎啡嘟）乙橫酸緩沖 液配制濃度為5mg/mL的鏈霉親和素溶液，然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8- 1.6mL的鏈霉親和素，4°C條件下混懸16-2化;再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向 磁微粒中加入1 OmL濃度為IM，抑為8.5的乙醇胺溶液，室溫反應(yīng)1-化，再使用磁力架吸附，靜 止2min后吸去上清，向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL，制得磁 分離試劑；
[0094]本步驟中，加入N-徑基班巧酷亞胺能夠?qū)ε悸?lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亞胺起到穩(wěn)定作用；加入鏈霉親和素后在4度條件下混懸，能夠更好的保留蛋白質(zhì)活性， 同時(shí)減少室溫變化對(duì)偶聯(lián)效果的影響，使批次之間偶聯(lián)結(jié)果更加穩(wěn)定;加入乙醇胺，可使乙 醇胺分子中的氨基與磁珠活化后未結(jié)合蛋白的活性位點(diǎn)反應(yīng)，起到終止反應(yīng)和封閉作用， 能夠產(chǎn)生更低的本底值。
[00巧]實(shí)施例6
[0096] 清洗液的制備：
[0097] 將SOOmL純化水、12. Ig化is和8.5g氯化鋼加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙?再 將5g Tween-20和5g TritonlOO加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆靹颍挥?M的肥L將溶液的pH 值調(diào)為7.5-8.0用純化水將溶液定容至IL，用0.2WI1濾器過(guò)濾得清洗液，2-8°C保存。
[009引實(shí)施例7
[0099] 抗核糖體P蛋白抗體IgG的磁微粒化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒：
[0100] 該試劑盒包括：
[0101] 按照實(shí)施例1方法制備的抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品，每個(gè)水平的校準(zhǔn)品用量 為0.5ml;
[0102] 按照實(shí)施例2方法制備的抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品，質(zhì)控品用量為1ml;
[0103] 按照實(shí)施例3方法制備的試劑1號(hào)，試劑1號(hào)的用量為5ml;
[0104] 按照實(shí)施例4方法制備的試劑2號(hào)，試劑2號(hào)的用量為15ml;
[0105] 按照實(shí)施例5方法制備的磁分離試劑，磁分離試劑的用量為5ml;
[0106] 按照實(shí)施例6方法制備的清洗液，清洗液用量為1L。
[0107] 實(shí)施例8
[0108]采用實(shí)施例7的試劑盒對(duì)抗核糖體P蛋白抗體IgG進(jìn)行定量檢測(cè)：
[0109] 檢測(cè)方法包括如下步驟：
[0110] 1)加2化L抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品或質(zhì)控品或1:20稀釋后的待測(cè)標(biāo)本至檢 測(cè)管中；
[0111] 2)加5化L的試劑1號(hào)至步驟1)所述檢測(cè)管中，混勻后，37±0.5°C溫育IOmin;
[0112] 3)加50化的磁分離試劑至步驟2)所述檢測(cè)管中，混勻后，37±0.5°C溫育5min，進(jìn) 行磁分離，去上清；
[0113] 4)加3(K)化的清洗液至步驟3)檢測(cè)管中，混勻，進(jìn)行磁分離，去上清；
[0114] 5)重復(fù)步驟4)兩遍；
[0115] 6)加150化試劑2號(hào)至步驟5)檢測(cè)管中，混勻后，37 ± 0.5°C溫育IOmin，進(jìn)行磁分 離，去上清；
[0116] 7)加3(K)化的清洗液至步驟6)檢測(cè)管中，混勻，進(jìn)行磁分離，去上清；
[0117] 8)重復(fù)步驟7)兩遍；
[0118] 9)加2(K)化的化學(xué)發(fā)光底物至步驟8)檢測(cè)管中，混勻，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，
[0119] 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的全自動(dòng)檢測(cè)步 驟。
[0120] 對(duì)比例1
[0121] 與實(shí)施例7制備的試劑盒不同的是試劑盒中的試劑I號(hào)和磁分離試劑，其余成分相 同，
[0122] 試劑1號(hào)的制備如下：
[0123] a.配制試劑1號(hào)稀釋液：
[0124] 將8001111純化水、12.1旨的化13、5.始氯化鋼和21111?'〇(31111300加入容器中，充分?jǐn)?拌至完全溶解;將5g牛血清白蛋白加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙?；?M的HCL將溶液的 pH值調(diào)為7.0-7.5;用純化水將溶液定容至1L，用0.2WI1濾器過(guò)濾得試劑1號(hào)稀釋液，2-8°C保 存待用；
[0125] b.配制試劑1號(hào)：
[01 %]用濃度0.2M，pH為9的碳酸鹽緩沖液配制0.5mg/ml的生物素溶液；按照Rib-P抗原 與生物素質(zhì)量比為10:1的比例在Rib-P抗原溶液中加入生物素溶液，混合均勻，室溫靜置 1她，反應(yīng)生成Rib-P抗原-生物素連接物;將含有Rib-P抗原-生物素連接物的反應(yīng)液通過(guò)G- 25凝膠柱進(jìn)行分離，除去未反應(yīng)的生物素，得到含有Rib-P抗原-生物素連接物的溶液;用試 劑1號(hào)稀釋液將含有Rib-P抗原-生物素連接物的溶液稀釋到0.1-0.化g/mL，制得試劑1號(hào)； [0127]磁分離試劑的制備如下：
[012引a.配制磁微粒緩沖液：
[0129] 將SOOmL純化水、12. Ig化iS和8.5g氯化鋼加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆芙?再 將5g牛血清白蛋白、50血新生牛血清和0.2mL Proclin300加入容器中，充分?jǐn)埌柚镣耆?解；用4M的肥L將溶液的抑值調(diào)為7.9-8.1;用純化水將溶液定容至1L，用0.2皿濾器過(guò)濾得 磁微粒緩沖液，2-8 °C保存待用；
[0130] b.配制磁分離試劑：
[0131] 取IOOmg磁微粒，磁分離去上清，用濃度為0.025mol/L，pH為4.5-5的2-(N-嗎啡嘟） 乙橫酸緩沖液IOmL重懸;加入0.5-lmL新配制的濃度為lOmg/mL的抓C水溶液，室溫混懸30- 60min;使磁珠充分活化，磁分離，去上清，用濃度為0.025mol/L，抑為4.5-5 2-(N-嗎啡嘟） 乙橫酸緩沖液IOmL重懸；加入4-8mg的鏈霉親和素，室溫混懸16-2化;再進(jìn)行磁分離，去上 清，用磁微粒緩沖液稀釋重懸到0.5mg/mL，制得磁分離試劑。
[0132] 實(shí)施例9
[0133] 對(duì)實(shí)施例7和對(duì)比例1的試劑盒進(jìn)行性能評(píng)價(jià)：
[0134] 1.實(shí)施例7的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)
[0135] 將濃度約為200RU/mL(允許其濃度偏差為± 20 % )的抗核糖體P蛋白抗體IgG樣品A 加入到血清或其他相應(yīng)基質(zhì)的樣品B中，所加入A的體積不超過(guò)總體積(A+B)的10%，根據(jù)公 式(1)計(jì)算回收率R，本方法的回收率在85-115%范圍內(nèi)，數(shù)據(jù)參見(jiàn)表1，評(píng)價(jià)結(jié)果符合要求。
[0136' .............................................(1)
[0137] R:回收率；
[0138] V:加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積；
[0139] Vo:人源樣品的體積；
[0140] C:人源樣品加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后的檢測(cè)濃度；
[0141] Co:人源樣品的檢測(cè)濃度；
[0142] Cs:標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度。
[0143] 表1準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)
[0144]
[0145] 2.實(shí)施例7和對(duì)比例1的空白限評(píng)價(jià)
[0146] 用零濃度校準(zhǔn)品作為樣本進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定20次，得出20次測(cè)量結(jié)果的化U值 (相對(duì)發(fā)光值），計(jì)算其平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，得出M+2SD所對(duì)應(yīng)的化U值，根據(jù)零濃度校 準(zhǔn)品與相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-RLU值結(jié)果進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將M+2SD所對(duì) 應(yīng)的化U值帶入上述方程中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為空白限。本方法的空白限不大于IRU/ mL，數(shù)據(jù)參見(jiàn)表2，A、B點(diǎn)連點(diǎn)擬合曲線及擬合方程見(jiàn)圖la,對(duì)比例1制備的試劑盒測(cè)得的空 白限數(shù)據(jù)見(jiàn)表2-l，A、B點(diǎn)連點(diǎn)擬合曲線及擬合方程見(jiàn)圖化，由數(shù)據(jù)可見(jiàn)，實(shí)施例7與對(duì)比例1 相比，得到的本底值更低，從而得到的空白限更低，代表試劑盒的靈敏度更好。
[0147] 表2空白限評(píng)價(jià)
[0150] 表2-1空白限評(píng)價(jià)
[014 引
[0149]
[0151]
[0152] 3.實(shí)施例7的線性范圍評(píng)價(jià)
[0153] 將接近線性范圍上限（200RU/mL)的高值樣本按一定比例稀釋為至少5種濃度，其 中低值濃度的樣本須接近線性范圍的下限。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，對(duì)每一濃度的樣本 均重復(fù)檢測(cè)2次，計(jì)算其平均值，將結(jié)果平均值和稀釋比例用最小二乘法進(jìn)行直線擬合，并 計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)r，本方法的測(cè)量范圍為[2,200]RU/mL，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)>0.9900。數(shù)據(jù)參見(jiàn) 表3,擬合曲線及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)圖2,評(píng)價(jià)結(jié)果符合要求。
[0154] 表3線性范圍評(píng)價(jià)
[0155]
[0156] 4.實(shí)施例巧日對(duì)比例1的重復(fù)性評(píng)價(jià)
[0157] 取實(shí)施例7中的試劑盒重復(fù)檢測(cè)濃度為(20 ± 4 )RU/mL和（100 ± 20) RU/mL的樣本各 10次，計(jì)算10次測(cè)量結(jié)果的平均值M和標(biāo)準(zhǔn)差SD，根據(jù)公式CV = SD/MX 100%得出變異系數(shù) CV，本方法變異系數(shù)(CV)不大于8%。數(shù)據(jù)參見(jiàn)表4,對(duì)比例1制備的試劑盒測(cè)得的重復(fù)性數(shù) 據(jù)見(jiàn)表4-1，由數(shù)據(jù)可見(jiàn)，實(shí)施例7與對(duì)比例1相比，得到的CV值更低，代表試劑盒的重復(fù)性更 好，
[015 引 CV = SD/MX100%......................................(2)
[0159] 式中：CV-變異系數(shù);SD-IO次測(cè)量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差;M -10次測(cè)量結(jié)果的平均值。
[0160] 表4重復(fù)性評(píng)價(jià) 「rn 么4 I LU 104」 日.頭她1列Y卿X了化1列i的化間左評(píng)巧廣
[0165] 將實(shí)施例7的試劑盒取S批，每批試劑盒均測(cè)定濃度在(20 ± 4) RU/mL和（100 ± 20) RU/mL范圍內(nèi)的樣本，每批重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算30次測(cè)定結(jié)果的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，根 據(jù)公式(3)計(jì)算變異系數(shù)(CV)，本方法變異系數(shù)(CV)不大于15%，數(shù)據(jù)參見(jiàn)表5,對(duì)比例1制 備的試劑盒測(cè)得的批間差數(shù)據(jù)見(jiàn)表5-1，由數(shù)據(jù)可見(jiàn)，實(shí)施例7與對(duì)比例1相比，得到的CV值 更低，代表試劑盒的批間差更好，
[0166] CV = SDZMX 100%......................................(3)
[0167] 式中：CV-變異系數(shù);SD-30次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差;M-30次測(cè)定結(jié)果的平均值。
[0168] 表5批間差評(píng)價(jià) 「01691
[0172] ~6.實(shí)施例7的特異性評(píng)價(jià)
[0173] 取7份Anti-R化-P IgG含量為0的樣本，分別加入抗nRNP/Sm抗體、抗Sm抗體、抗SS- A抗體、抗SS-B抗體、抗Scl-70抗體、抗Jo-I抗體、抗著絲點(diǎn)抗體，使樣本中交叉反應(yīng)物濃度 為200RU/mL，使用該試劑盒對(duì)該樣本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定樣本中的Anti-Rib-P IgG含量。結(jié)果見(jiàn) 表6，本方法與抗nRNP/Sm抗體、抗Sm抗體、抗SS-A抗體、抗SS-B抗體、抗Sc 1 -70抗體、抗化-1 抗體、抗著絲點(diǎn)抗體無(wú)交叉反應(yīng)。數(shù)據(jù)參見(jiàn)表6，評(píng)價(jià)結(jié)果符合要求。
[0174] 表6特異性實(shí)驗(yàn) 「01751

[0177] 用實(shí)施例7的試劑盒和商品化的抗核糖體P蛋白抗體IgG檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸 附法)對(duì)240份人血清樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。其檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)附圖3, W抗核糖體P蛋白抗體IgG 檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)測(cè)定的結(jié)果為橫坐標(biāo)，W本發(fā)明方法的測(cè)定的結(jié)果為縱坐標(biāo) 作回歸分析，相關(guān)方程為:y = 0.9939X+0.6632，相關(guān)系數(shù)為R2:0.9885。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果 表明，本方法同其他方法的試劑盒臨床樣本測(cè)值相關(guān)性良好。
[0178] 8.實(shí)施例7的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
[0179] 對(duì)試劑盒分別進(jìn)行4°C12個(gè)月和37°C7天的加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明試劑盒標(biāo)準(zhǔn) 品發(fā)光強(qiáng)度的變化、批內(nèi)和批間精密度、準(zhǔn)確度等指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)，試劑盒有效期可 達(dá)12個(gè)月。
[0180] 顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì) 本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還能 夠做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，運(yùn)里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予W窮舉，凡是屬于本發(fā) 明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗核糖體P蛋白抗體IgG的磁微粒化學(xué)發(fā)光定量測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述 試劑盒包括： 1) 抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品，含抗核糖體P蛋白抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩 沖液，所述抗核糖體P蛋白抗體I gG校準(zhǔn)品為6個(gè)水平的液體校準(zhǔn)品，所述6個(gè)水平的液體校 準(zhǔn)品中抗核糖體P蛋白抗體IgG的濃度分別為O，5，20，50，100，200RU/mL; 2) 抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品，含抗核糖體P蛋白抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩 沖液，所述抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品包含2個(gè)水平的液體質(zhì)控品，所述2個(gè)水平的液體 質(zhì)控品中抗雙鏈DNA抗體I gG的靶值濃度范圍分別為(20 ± 4) RU/mL和（100 ± 20) RU/mL; 3) 試劑1號(hào)，含生物素標(biāo)記的核糖體P蛋白抗原和牛血清白蛋白的Tris緩沖液； 4) 試劑2號(hào)，含堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液； 5) 磁分離試劑，含有鏈霉親和素標(biāo)記的磁性微粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液； 6) 清洗液； 所述試劑盒中試劑1號(hào)，試劑2號(hào)和磁分離試劑的含量比為1:3:1，所述含量比為體積 比。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述磁微粒的材質(zhì)為Fe2O3;所述磁微粒 表面包被有羧基基團(tuán)，包被物中羧基基團(tuán)含量大于20wt%，所述磁微粒的大小為1-3μπι。3. -種制備如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述試劑盒的方法，其特征在于，該方法包括如下步 驟： (1) 配制抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品： a. 配制抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液： 將純化水、Tris、氯化鈉和Pr〇clin300加入容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，Tris濃度為 lwt%，氯化鈉濃度為lwt%，Proclin300濃度為0.2v% ;用4M的HCL將溶液的pH值調(diào)為7.0-7.5;將牛血清白蛋白加入容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，牛血清白蛋白的濃度?wt % ;再 用4M的HCL將溶液的pH值調(diào)為7.0-7.5;用孔徑為0.2μπι的濾器過(guò)濾得抗核糖體P蛋白抗體 IgG校準(zhǔn)品稀釋液，2-8°C保存待用； b. 配制抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品： 將抗核糖體P蛋白抗體IgG用抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至各濃度點(diǎn)為 0,5,20,50，100,200RU/mL; (2) 配制抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品： 將抗核糖體P蛋白抗體IgG用上述抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液稀釋至各濃度 點(diǎn)為 2〇，100RU/mL; (3) 配制試劑1號(hào)： a. 配制試劑1號(hào)稀釋液： 將純化水、Tris、氯化鈉和ProcI in300加入容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，Tris的濃度 為Iwt %，氯化鈉濃度為0.5wt %，Procl in300的濃度為0.2v % ;將牛血清白蛋白加入容器 中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓Ｑ灏椎鞍椎臐舛葹椹?. 5wt% ;用4M的HCL將溶液的pH值調(diào)為 7.0-7.5;用孔徑為0.2μπι的濾器過(guò)濾得試劑1號(hào)稀釋液，2-8°C保存待用； b. 配制試劑1號(hào)： 將Rib-P抗原用純化水溶解，2-8°C條件下用濃度為0.2M，pH為9.0的碳酸鹽緩沖液透析 2h，然后濃縮至濃度為2-4mg/mL的抗原溶液，用濃度為0.2M，pH為8.5-9的碳酸鹽緩沖液配 制濃度為0.5-1. Omg/ml的生物素溶液；按照Rib-P抗原與生物素質(zhì)量比為10:1的比例在 Rib-P抗原溶液中加入生物素溶液，混合均勻，室溫靜置12-18h，反應(yīng)生成Rib-P抗原-生物 素連接物;將含有Rib-P抗原-生物素連接物的反應(yīng)液在2-8°C條件下用濃度為0.2M pH為 9.0的碳酸鹽緩沖液透析2天，期間進(jìn)行4次換液，從而除去未反應(yīng)的生物素，得到含有Rib-P 抗原-生物素連接物的溶液;用試劑1號(hào)稀釋液將含有Rib-P抗原-生物素連接物的溶液稀釋 至IjO · I-0 · 3yg/mL，制得試劑1號(hào)； (4) 配制試劑2號(hào)： a. 配制試劑2號(hào)稀釋液： 將純化水、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、牛血清白蛋白、ZnCl2、Proclin300加入容器 中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓?-羥乙基哌嗪乙磺酸的濃度為0.6wt %，氯化鈉濃度為0. Swt %， 牛血清白蛋白的濃度為0.5wt %，ZnCl2的濃度為0 . lwt%。，Proclin300的濃度為0.2v%〇， MgCl2的濃度為0.1%。；用4M的HCL將溶液的pH值調(diào)為7.5-8.0;用孔徑為0.2μπι的濾器過(guò)濾得 試劑2號(hào)稀釋液，2-8°C保存待用； b. 配制試劑2號(hào)： 將Img羊抗人多克隆抗體加入到2-4yL濃度為10mg/mL的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽溶液中， 室溫靜置20min，再加入0. lm〇L/L的甘氨酸溶液IOyL，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除鹽，收 集活化后的羊抗人多克隆抗體，2-8°C保存?zhèn)溆?將1.5mg的堿性磷酸酶加入到10-20yL的濃 度為5mg/mL的4-(N-馬來(lái)酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液中，室溫靜置 30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后的堿性磷酸酶，2-8°C保存?zhèn)溆?將活化的羊抗人多 克隆抗體與活化的堿性磷酸酶混合，2-8°C條件下靜置12-24h，用SupperdeUOO凝膠純化柱 純化偶聯(lián)物，獲得羊抗人多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液，2-8 °C保存?zhèn)溆?將羊抗人 多克隆抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液用試劑2號(hào)稀釋液稀釋到0.02-0. lyg/mL，制得試劑2 號(hào)； (5) 配制磁分離試劑： a. 配制磁微粒緩沖液： 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓琓ris的濃度為lwt%，氯化 鈉的濃度為〇. 8wt % ;再將牛血清白蛋白、新生牛血清和Proclin300加入容器中，充分?jǐn)嚢?至完全溶解，牛血清白蛋白的濃度為0.5wt %，新生牛血清濃度為5v%，Procl in300濃度為 0.2v%。；用4M的HCL將溶液的pH值調(diào)為7.9-8.1;用孔徑為0.2μπι的濾器過(guò)濾得磁微粒緩沖 液，2-8 °C保存待用； b. 配制磁分離試劑： 取IOOmg磁微粒，使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入濃度為 0.025mol/L，pH為4.5-5的2-0-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液1〇11^，充分混勻;再加入〇.5-11^新配 制的濃度均為10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺水溶 液，室溫混勻30-60min得磁珠混懸體系；使用2-(N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液配制濃度為5mg/ mL的鏈霉親和素溶液，然后向磁珠混懸體系中直接加入所述濃度的0.8-1.6mL的鏈霉親和 素，4°C條件下混懸16-20h;再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上清，向磁微粒中加入IOmL 濃度為1M，pH為8.5的乙醇胺溶液，室溫反應(yīng)1-2h，再使用磁力架吸附，靜止2min后吸去上 清，向磁微粒中加入適量磁微粒緩沖液稀釋使終濃度為0.5mg/mL，制得磁分離試劑； (6)配制清洗液： 將純化水、Tris和氯化鈉加入容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，Tris的濃度為lwt%，氯化 鈉的濃度為〇 · 8wt% ;再將Tween-20和TritonlOO加入容器中，充分?jǐn)嚢柚镣耆靹颍琓ween-20的濃度為0.5wt % ,TritonlOO的濃度為0.5wt % ;用4M的HCL將溶液的pH值調(diào)為7.5-8.0， 用孔徑為〇. 2μπι的濾器過(guò)濾得清洗液，2-8°C保存。4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： 1) 將抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品放到全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)試位置，得到由 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀輸出的擬合曲線； 2) 將抗核糖體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品放到上述分析儀測(cè)試位置，得到由全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光 免疫分析儀輸出的所述質(zhì)控品的測(cè)試發(fā)光值和通過(guò)步驟1得到的擬合曲線擬合得到抗核糖 體P蛋白抗體IgG質(zhì)控品的濃度值； 3) 將待測(cè)樣本放到上述分析儀測(cè)試位置，由所述分析儀自動(dòng)按1:20將樣本稀釋，得到 由全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀輸出的待測(cè)樣本的濃度值。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，該方法具體包括如下步驟： 1) 加20yL抗核糖體P蛋白抗體IgG校準(zhǔn)品或質(zhì)控品或1:20稀釋后的待測(cè)標(biāo)本至檢測(cè)管 中； 2) 加50yL的試劑1號(hào)至步驟1)所述檢測(cè)管中，混勻后，37 ±0.5°C溫育IOmin; 3) 加50yL的磁分離試劑至步驟2)所述檢測(cè)管中，混勻后，37±0.5°C溫育5min，進(jìn)行磁 分離，去上清； 4) 加300yL的清洗液至步驟3)檢測(cè)管中，混勻，進(jìn)行磁分離，去上清； 5) 重復(fù)步驟4)兩遍； 6) 加15 0 μ L試劑2號(hào)至步驟5)檢測(cè)管中，混勻后，3 7 ± 0.5 °C溫育10 m i η，進(jìn)行磁分離，去 上清； 7) 加300yL的清洗液至步驟6)檢測(cè)管中，混勻，進(jìn)行磁分離，去上清； 8) 重復(fù)步驟7)兩遍； 9) 加200yL的化學(xué)發(fā)光底物至步驟8)檢測(cè)管中，混勻，檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度； 所述步驟1)、步驟2)和步驟3)均包括全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀的全自動(dòng)檢測(cè)步驟。
【文檔編號(hào)】G01N33/532GK105954266SQ201610248726
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】北京中航賽維生物科技有限公司