一種尿液微量蛋白檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫學和生物技術領域，具體涉及一種用于尿液多種微量蛋白聯合檢測的試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明的檢測試劑盒藕聯有7種蛋白的磁性熒光微球等，可以一次性聯合檢測7種尿微量蛋白，極大的提高了檢測效率，降低檢測成本，而且靈敏度高，具有免疫比濁等方法無可比擬的優(yōu)越性。
【專利說明】
一種尿液微量蛋白檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學免疫學和生物技術領域，具體涉及一種用于尿液多種微量蛋白聯 合檢測的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 腎臟疾病是嚴重危害人民群眾生命健康的常見病。在病理條件下，腎小球濾過膜 通透性、所帶電荷的改變或腎小管重吸收功能障礙，以及特定蛋白質合成的增加都會導致 尿液中蛋白質濃度升高，機體蛋白質不正常地經尿排泄是原發(fā)腎臟病及其他相關疾病引發(fā) 腎臟病變最重要的病理生理紊亂之一。根據發(fā)病機制的不同可將蛋白尿分為溢出性蛋白 尿、腎小球性蛋白尿、腎小管性蛋白尿、混合性蛋白尿、組織性蛋白尿。
[0003] 尿微量蛋白是指尿中蛋白的排出量超過正常限值，但又未達到臨床蛋白尿的中間 階段，用常規(guī)定性或定量方法難以檢出的一些蛋白質，是早期腎損害的敏感指標。尿微量蛋 白的實驗室檢查對腎臟疾病的早期篩查診斷、病情監(jiān)測、療效觀察以及預后判斷等方面均 具有重要作用。
[0004] 尿微量白蛋白（microalbumin，MA)、尿轉鐵蛋白（transferrin,TRF)、02_微球蛋白 (02-microglobulin, 02-MG)、a2_巨球蛋白（a2-macroglobul in，a2_MG)、胱^屯素-C (Cystatin C)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)等是目前臨床較常用的尿微量蛋項 目，它們對早期腎臟損傷的提示價值得到諸多文獻的肯定。MA是檢測糖尿病、高血壓、心血 管疾病和腎病血管損傷的重要指標，對疾病的早期診斷、早期治療有重要的參考價值和臨 床意義，而聯合尿液al_MG、TRF的檢測可以根據蛋白質分子量的大小來提示腎臟損傷的部 位和嚴重程度。Cystatin C由所有的有核細胞恒定產生，經腎小球濾過后被腎小管重吸收 后代謝，不進入尿液中，當急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)時，尿液中的Cystatin C升高，并且早于血清肌酐的變化。02-微球蛋白（02-microglobulin，02-MG)在接觸腎毒性 物質、心臟手術或腎移植等多種原因導致的腎小管損傷時尿液中濃度升高，并且比血清肌 酐的增加早4-5天。
[0005]腎臟病變可以由多種原因導致，且存在很大的個體差異，僅僅根據一個指標對疾 病進行診斷、病情監(jiān)測、療效觀察、預后判斷是遠遠不夠的，因此，有必要整合多項檢測指標 對患者進行綜合評估，并提供更多的早期腎損傷指標來輔助臨床早診斷、早治療，以提高患 者的生活質量。傳統(tǒng)臨床應用的尿微量蛋白檢測方法有免疫擴散、免疫電泳、免疫比濁、放 射免疫、酶聯免疫等，均為低通量檢測，檢測周期長，且基本依賴于國外進口的檢測系統(tǒng)及 配套的試劑進行分析，價格高昂。一些高效檢測技術(如高效液相層析、毛細管電泳、質譜 等）由于儀器昂貴、檢測復雜而難以在臨床得到推廣。雖然目前尿蛋白檢測項目已在各級醫(yī) 院檢驗科廣泛開展，但均為單項測定，尚無成熟的多指標聯合測定試劑盒獲得國家食品藥 品監(jiān)督管理局注冊認證。
[0006] Luminex技術平臺是高度集成、高通量檢測和多功能生物技術平臺的較好代表。 Luminex xMAP液態(tài)芯片(又稱懸浮陣列、流式焚光技術)檢測系統(tǒng)由聚苯乙稀材料制作的大 小均一的圓形微球(直徑為5.6wn)組成，包覆不同比例的兩種紅色熒光染料，產生100種不 同比例熒光顏色的微球，可依不同研究目的而偶聯100種探針(如抗原、抗體、核酸、酶、各種 受體等），樣本懸液中靶分子與微球表面偶聯探針特異性的結合，從而實現同時對一個待測 樣本中的100種不同目標分子進行檢測。微球逐一通過檢測通道，受到兩束激光的同時照 射，第一束激光激發(fā)微球內熒光物質，確定微球的類別(分類）；第二束激光激發(fā)報告分子上 的熒光素，確定目標分子數量(定量）。液態(tài)芯片技術具有雜交動力學快、微陣列應用靈活、 費用低廉、操作簡便的優(yōu)點。
[0007] 現有技術中報道的利用Luminex平臺檢測的有：中國專利申請CN201510264780.5 公開了一種檢測樣本中脂蛋白磷脂酶A2濃度的試劑盒及其制備方法，所用的檢測儀器為 Luminex的MAGPIX和Luminex 200,3D (公開號為CN104820097A);中國專利申請 CN201510264522.7公開了一種檢測樣本中髓過氧化物酶(MP0)濃度的試劑盒及其制備方 法，所用的檢測儀器為Luminex的MAGPIX(公開號為CN104950 1 1 1A);中國專利 CN200510030338.2公開了一種人乳頭瘤病毒檢測分型方法及試劑盒，所用的技術平臺為 Luminex xMAP(公開號為CN1948503A)。
[0008] 然而，目前尚未見基于Luminex技術平臺實現尿液中多種微量蛋白聯合檢測的相 關報道。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種尿液微量蛋白檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明的檢 測試劑盒具有靈敏度高，多種尿微量蛋白一管式聯合檢測等優(yōu)點。該檢測方法一次性聯合 檢測7種尿微量蛋白，極大的提高了檢測效率，降低檢測成本，具有免疫比濁等方法無可比 擬的優(yōu)越性。
[0010] 本發(fā)明的第一方面，是提供了一種尿液七種微量蛋白聯合檢測試劑盒，主要包括：
[0011] (1)藕聯有七種微量蛋白抗體的磁性熒光微球混合液；
[0012] (2)由生物素標記的七種微量蛋白抗原混合液；
[0013] ⑶由鏈霉親和素標記的藻紅蛋白；
[0014] (4)校準品，至少包括七種微量蛋白混合液；
[0015] (5)緩沖液；
[0016] 所述的七種微量蛋白為 MA、TRF、02-MG、a2-MG、al-MG、CystatinC、IgG;
[0017] 所述的緩沖液由氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、牛血清白蛋白和Procl in-300 組成;其中，氯化鈉的濃度為6.0-10.Og/L，磷酸氫二鈉的濃度為2.5-3.5g/L，磷酸二氫鈉的 濃度為0.2-0.4 8/1，牛血清白蛋白的濃度為8.0-12.(^/1，？仰(31111-300的濃度為0.01- 0 ? 03ml/L，Triton X-100的濃度為0 ? 1-0 ? 3ml/L〇
[0018] 所述的磁性熒光微球，其藕聯時抗體濃度為:每106個磁性熒光微球，每種抗體用 量為 2-lOug。
[0019]所述的磁性焚光微球，通過如下方法制得:將磁性焚光微球在由MES、NHS和EDC組 成的活化體系中活化處理15-20分鐘，加磁場，靜置分離5分鐘，用MES洗滌3次后加入抗體2- 1 Oug/106個熒光微球，室溫藕聯2小時后，用MES洗滌1遍除去游離的抗體，加入1 % BSA溶液， 置2-8°C冰箱封閉過夜，封閉結束后，用1 %BSA溶液洗滌1遍，加入Proc 1 in 300，2-8°C保存。
[0020] 所述活化體系中，當微球數量為2.5 X 106時，MES的體積為230ul，EDC為lOul，NHS 為10ul;或當微球數量為2.5 X 106時，MES的體積為480ul，EDC為10ul，NHS為10ul。
[0021 ]所述藕聯有七種微量蛋白抗體的磁性熒光微球混合液中，用緩沖液配置各微球的 濃度均為100個八11。
[0022]所述的由生物素標記的七種微量蛋白抗原混合液中，每種蛋白抗原與生物素的摩 爾比為1:20-100，室溫孵育30分鐘，將標記生物素的蛋白抗原裝入透析袋，用?83溶液充分 透析，以除去游離的生物素，生物素標記蛋白抗原加入50%甘油，-20°C保存。
[0023]所述生物素為琥珀酰亞胺酯，每種蛋白抗原與生物素的摩爾比為1:50。
[0024] 所述生物素標記的七種微量蛋白抗原混合液中，各蛋白抗原用緩沖液稀釋比例如 下： 生物素標記抗原 稀釋比例（濃度）
[0025] MA： 1:3000 ~6000 TRF: 1:1000 ~3000 IgG： 1:3000(卜 60000 Cystatin C： 1:30000 ~60000
[0026] al- MG： 1:30000~60000 a,2- MG： 1:10000~30000 p2- MG： 1:40000~80000,
[0027] 優(yōu)選的，各蛋白抗原用緩沖液稀釋比例如下： 生物素標記抗原 稀釋比例（濃度） MA： 1:5000 TRF： 1:2000 IgG： 1:50000
[0028] Cystatin C： 1:40000 al-MG： 1:40000 a2- MG： 1:20000 {32-MG: 1_00 D
[0029]所述鏈霉親和素標記的藻紅蛋白用緩沖液配置其濃度為2mg/L。
[0030] 所述校準品，包括:七種微量蛋白混合液SI-S6，混合液S1中七種微量蛋白的濃度 分別為：60mg/L 的 MA、50mg/L 的TRF、2.5mg/L 的 P2-MG、90mg/L 的 a2-MG、70mg/L 的 al-MG、3mg/ L的Cystatin C，以及100mg/L的IgG;混合液S2-S6為由混合液S1按照1:2或1:3梯度稀釋;還 包括緩沖液S7，作為空白參照。
[0031] 所述的緩沖液中，氯化鈉的濃度為8.Og/L，磷酸氫二鈉的濃度為2.9g/L，磷酸二氫 鈉的濃度為〇 . 296g/L，牛血清白蛋白的濃度為10.0 g/L，Proclin-300的濃度為0.02ml/L， Triton X-100的濃度為0.2ml/L。
[0032] 所述試劑盒還包括清洗緩沖液，成分為0 ? 1M PBS，0 ? 05 % Tween-20，0 ? 1 %Procl in 300 〇
[0033]本發(fā)明的第二方面，提供了采用上述尿液微量蛋白檢測試劑盒檢測尿液微量蛋白 的方法，包括：
[0034] a.在酶標板微孔內加入1 Ou 1尿液樣本，同時取校準品S1-S6各1 Ou 1作為標準參照 以及緩沖液S7 10ul作為空白參照；
[0035] b.取生物素標記的七種微量蛋白抗原混合液10ul加入酶標板微孔內，混合均勻；
[0036] c.取藕聯有七種微量蛋白抗體的磁性熒光微球混合液1 Ou 1加入酶標板微孔內，震 蕩混勻后于37°C第一次孵育30分鐘，孵育結束后在磁分離板上靜置2-5鐘后洗滌3遍；
[0037] d.取鏈霉親和素標記的藻紅蛋白20ul加入酶標板微孔內，混勻后置于37°C第二次 孵育20分鐘，孵育結束后在磁分離板上靜置2-5鐘后洗滌3遍；
[0038] e.加入50ul的緩沖液，Luminex 200儀器上讀取平均熒光強度，測得七種尿微量蛋 白的含量。
[0039] 本發(fā)明利用Luminex 200液態(tài)芯片技術平臺高效快速、高通量的特點，開發(fā)了尿液 中多種微量蛋白聯合檢測的方法和技術，制備MA、TRF、02-MG、a2_MG、al-MG、CystatinC& IgG 7種特異性捕獲抗體交聯的磁性熒光微球，加入尿液樣本后，樣本中的待測物與生物素 標記的抗原形成競爭反應。反應結束后，上機讀取平均熒光強度，通過熒光強度一劑量曲線 建立的線性方程，同時得到7種特異性尿微量蛋白的測定結果。該方法一次性聯合檢測7種 尿微量蛋白，極大的提高了檢測效率，降低檢測成本，具有免疫比濁等方法無可比擬的優(yōu)越 性。
【附圖說明】
[0040] 圖1為本發(fā)明微球偶聯抗體的原理圖；
[0041] 圖2為白蛋白標準品標準曲線圖；
[0042] 圖3為轉鐵蛋白標準品標準曲線圖；
[0043] 圖4為IgG標準品標準曲線圖；
[0044] 圖5為脫抑素〇標準品標準曲線圖；
[0045]圖6為a2_巨球蛋白標準品標準曲線圖；
[0046]圖7為02-微球蛋白標準品標準曲線圖；
[0047]圖8為a 1 -微球蛋白標準品標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0048]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0049] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所 建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的 所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似 或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之 用。
[0050] 試劑來源說明如下：
[0051 ] l、Sulfo_NHS:中文名稱：N-羥基硫代琥珀酰亞胺，英文全稱：N-Hydroxysul fosuccinimide sodium salt，貝勾自Thermo SCIENTIFIC公司
[0052] 2、EDC:中文名稱：l-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，英文全稱：N- Hydroxysulfosuccinimide sodium salt，貝勾自Thermo SCIENTIFIC公司
[0053] 3、實施例中涉及的緩沖液，若無特別說明，均為本發(fā)明試劑盒中的緩沖液配方。
[0054] 實施例1通過交叉反應驗證7種蛋白之間的干擾性
[0055] 1、目的：7種蛋白為 1^、了1^、02-]\?；、€[2-]\?；、€[1-]\^丄78七&衍11(：、186中，為了驗證這 些蛋白的檢測是否存在相互干擾，進行了交叉反應實驗。
[0056] 2、方案：用抗體偶聯微球和對應生物素蛋白，測試其是否會與其它蛋白反應。將其 MFI值與空白MFI值比較，若以比值低于90%認為有交叉反應，反之則不存在交叉反應。 [0057] 3、方法：
[0058] 1)配制藕聯有抗體的磁性熒光微球混合液:將藕聯有7種不同抗體的磁性熒光微 球，加入到緩沖液中，稀釋后使各種抗體的微球濃度均為100個/ul;
[0059] 2)配制生物素標記蛋白抗原混合液：用緩沖液進行稀釋，各蛋白抗原稀釋濃度為 MA(1:5000)、TRF(1:2000)、IgG(1:50000)、Cys-C(1:40000)和 ca-MG(l:40000)，a2-MG(l: 20000)和02-MG(1:60000);
[0060] 3)取7種蛋白抗原用緩沖液分別配制濃度為lOOug/ml的蛋白溶液；
[0061] 4)在微孔板將上述蛋白樣本分別加入到不同微孔內，加樣量為10ul，再在所有微 孔內加入生物素標記蛋白抗原混合液l〇ul，震蕩混勻后再加入磁性熒光微球混合液10ul， 混勻，置37°C孵育30分鐘，孵育結束后在磁分離板上靜置2-5鐘后洗滌3遍；
[0062] 5)用緩沖液稀釋鏈霉親和素藻紅蛋白（SAPE)，濃度為2ug/ml;
[0063] 6)在微孔內加入SAPE 20ul，震蕩混勻，37 °C孵育20分鐘，孵育結束后在磁分離板 上靜置2-5鐘后洗板3遍。加入緩沖液50ul，在Luminex 200儀器上讀數。測得MFI值見表1;將 表1的MFI值與空白MFI值比較，計算結果見表2。

[0068] 4、結論:將7種蛋白進行了混合檢測，結果證明其不存在交叉反應，因此在實際聯 檢中不會存在相互干擾的情形。
[0069]抗體種類的篩選 [0070]抗體種類篩選方法：
[0071] 1、如表1、表2所述，所選抗體不應存在交叉反應，對混合抗原復合物中的祀抗原是 特異性、有效性。
[0072] 2、不同公司的抗體間，在抗原梯度稀釋的標準品中，抗體效價最優(yōu)者為選擇的標 準，即在Luminex平臺最終檢測結果的MFI值最大。
[0073] 根據以上兩種原則，抗體的篩選結果如表3所示：
[0074] 表 3
[0076]
[0077]實施例2抗體用量的優(yōu)化
[0078] 1、目的:7種蛋白中，對每種蛋白對應的抗體，進行抗體用量的優(yōu)化篩選。
[0079] 2、方案:根據Luminex公司提供的偶聯方法，參考Luminex公司提供的操作手冊，名 稱為xMAP Cookbook A collection of methods and protocols for developing multiplex assays with xMAP Technology.
[0080] (http://cdn2.hubspot.net/hubfs/ 1 28032/Cookbook/ BR574.0915.xMAP? Cookboo k.3rdEdition.WR.pdf?t = 1458937217219，pagel5-19)，對抗 體用量因素進行工藝優(yōu)化。
[0081 ] 3、方法:根據Luminex公司提供的偶聯方法，實驗抗體量時，在2.5 X 106磁珠中分 別加入抗體5ug，10ug，15ug，20ug，25ug，其他工藝條件一致，比較測試其MFI值。
[0082]以蛋白IgG為例，具體工藝條件及結果如表4所示：
[0083]表 4
[0086] 4、結論:抗體量在2-10ug時的MFI值沒有明顯差異，即抗體使用量2-10ug/106磁珠 對實驗結果影響不明顯。
[0087] 實施例3微球活化反應體系的優(yōu)化
[0088] 1、目的：7種蛋白中，每種蛋白對應的抗體，進行微球活化反應體系體積的優(yōu)化篩 選。
[0089] 2、方案:根據Luminex公司提供的偶聯方法，對微球活化反應體積進行優(yōu)化。
[0090] 3、方法:根據Luminex公司提供的偶聯方法，測試實驗反應體積時，其他工藝條件 一致，僅在對微球活化時的反應體積分別設為250ul，500ul，750ul，lOOOul，1250ul，比較最 終檢測結果MFI值。
[0091] 以蛋白IgG為例，具體工藝條件及結果如表5所示：
[0092] 表 5
[0094] 4、結論:在微球數量為2.5 X 106時，活化體積為250微升或500微升時，結果最佳。
[0095] 實施例4檢測過程中反應體系的工藝優(yōu)化
[0096] 1、方案:試劑盒采用競爭反應模式進行設計，反應體系的實驗對孵育溫度、孵育 時間、加樣量、孵育方式四個方面進行實驗，以得到條件最佳的反應體系。
[0097] 2、方法:采用上述尿液微量蛋白檢測試劑盒，在酶標板微孔內加入樣本量的尿液 樣本，接著加入l〇ul的生物素標記蛋白，混勻后再加入藕聯有抗體的磁性熒光微球，進行第 一次孵育。第一次孵育結束后，在磁分離板上靜置2-5鐘后洗滌3遍，加入20ul的鏈霉親和素 藻紅蛋白SAPE，混勻后進行第二次孵育;孵育結束后在磁分離板上靜置2-5鐘后洗滌3遍，加 入50ul的緩沖液，上機讀取平均熒光強度，測得7種尿微量蛋白的含量。
[0098] 1)孵育溫度(控制兩次孵育溫度相同）：取7例尿液樣本，對比室溫和37°C兩個反應 條件，控制相同孵育時間（第一次60分鐘與第二次20分鐘），在Luminex平臺上，檢測到最終 MFI值如表6所示：
[0099] 表 6
[0101] 注:A代表37°C孵育條件下，Luminex平臺檢測樣本所得MFI值，B代表室溫孵育條件 下，Luminex平臺檢測樣本所得MFI值，A/B-1所得數值為兩種孵育條件下，MFI值的差異度。 [0102] 結論:孵育溫度分別為室溫和37 °C的條件下，MFI值沒有明顯差異，考慮到37 °C的 孵育條件相對穩(wěn)定，后續(xù)實驗均使用37°C孵育條件。
[0103] 2)孵育時間和加樣量實驗:針對同1例尿液樣本，對比不同孵育時間30min+10min、 30min+20min、40min+10min、40min+20min、50min+10min;并比較加樣量為 10ul和20ul加樣 (每個加樣量平行實驗2次）；控制相同孵育溫度37°C，在Luminex平臺上，檢測到最終MFI值 如表7所示：
[0104] 表7
[0106] 結論:從表7的MFI值來看，孵育時間30min+20min的MFI值基本就達到最大，因此， 選擇實驗反應模式為30min+20min;對于加樣量，20ul加樣的MFI值明顯大于10ul加樣的MFI 值，為了擴大檢測線性范圍，加樣量選擇10微升加樣。
[0107] 3)孵育方式:取7例尿液樣本，根據上述實驗方法，在反應前是否需要對反應板進 行震蕩，進行實驗比較，孵育時間為第一次30min+第二次20min，孵育溫度37°C，在Luminex 平臺上，最終檢測結果，MFI值如表8所示：
[0108] 表8

[0111] 結論:實驗數據表明，孵育過程中震蕩與否對樣本的MFI值有明顯的影響，但是通 過MFI值擬合曲線反算樣本濃度，則兩者沒有明顯差異，因此，為了考慮到實驗操作的簡易 性，采取不震蕩的孵育方式。
[0112] 實施例5尿液微量蛋白檢測試劑盒的制備
[0113] 1、配制緩沖液：
[0114] 緩沖液由氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、酪蛋白和Proclin-300組成。所述的氯 化鈉濃度為8. Og/L，磷酸氫二鈉濃度為2.9g/L，磷酸二氫鈉濃度為0.296g/L，酪蛋白濃度為 40.(^/1，？1〇(：1111-300體積百分比為0.021111/1，1>^〇11乂-100體積百分比為0.21111/1。按照 配方用純化水配制緩沖液，
[0115] 2、藕聯有七種微量蛋白抗體的磁性熒光微球混合液
[0116] 以白蛋白抗體偶聯2.5 X 106個熒光微球為例：
[0117] 取200ul的磁性熒光微球溶液（微球濃度為12.5X106個/ml)，加入到2ml的離心 管，將離心管放到磁分離器上1-2分鐘，用移液管吸去上清液，加入1.0ml的MEST緩沖液(含 0.05 %的Tween20的MES緩沖液，pH= 5.0)，渦旋10-20秒，超聲10-20秒。再放到磁分離器上 1-2分鐘，用移液管吸去上清液，重復清洗3次，用480ul的MES緩沖液重新分散磁性熒光微 球，再加入50mM的Sulfo-NHS溶液10ul和40mM的EDC溶液10ul，活化20分鐘，放到磁分離器上 1-2分鐘，用移液管吸去上清液，加入1.0ml的MES緩沖液，渦旋10-20秒，超聲10-20秒。再放 到磁分離器上1-2分鐘，用移液管吸去上清液；用480ul的MES緩沖液重新分散磁性熒光微 球，加入白蛋白抗體20ul (抗體濃度為2mg/ml)，室溫藕聯2小時后，將離心管放到磁分離器 上1-2分鐘，用移液管吸去上清液，加入1.0ml的封閉液(含1%BSA的MES溶液），置2-8°C冰 箱封閉過夜。封閉結束后，用1 %BSA溶液洗滌1遍，加入Proc 1 in 300，2-8°C保存。
[0118] 其余6種抗體以相同方式進行偶聯，制備完畢后用緩沖液配置藕聯有七種微量蛋 白抗體的磁性熒光微球混合液，具體步驟如下:各種偶聯抗體的微球，等體積混合，最終混 合液中每種微球的濃度為每微升100個微球。
[0119] 3、生物素標記的七種微量蛋白抗原混合液
[0120] 以用白蛋白抗原標記為例：
[0121]將白蛋白抗原透析后與生物素琥珀酰亞胺酯按摩爾比為1:50混合，室溫孵育30分 鐘。將標記生物素的白蛋白抗原裝入透析袋，用PBS溶液充分透析，以除去游離的生物素，生 物素標記白蛋白抗原加入50 %甘油，-20 °C保存。
[0122] 其余6種抗原以相同方式進行生物素琥珀酰亞胺酯標記，制備完畢后用緩沖液配 置生物素標記的七種微量蛋白抗原混合液，具體步驟如下：按照表9中注明的抗原稀釋比 例，設定最終混合液總體積，進行每個抗原的稀釋。
[0123] 表9各生物素標記抗原稀釋濃度

[0125] 4、七種微量蛋白的混合液校準品S1-S7
[0126] 在緩沖液中加入蛋白，配制成濃度為:MA(6Omg/L)、TRF(5Omg/L)、02-MG(2.5mg/ L)、a2-MG(90mg/L)、al-MG(70mg/L)、Cystatin C(3mg/L)及IgG(100mg/L)的蛋白混合液，作 為校準品S1，再用該緩沖液按1:2比例梯度稀釋成6個濃度，S7為緩沖液。6個校準品中各蛋 白濃度如表10所示：
[0127] 表10抗原標準品濃度對照表(單位:mg/L)
L0129」7種標準品標準曲線的方程如下，標準曲線見圖2-8。
[0130] 白蛋白：y = -1.1011x+0.1731，R2 = 0.9908
[0131] 轉鐵蛋白：y = -0.8965x_0.4437，R2 = 0.9909
[0132] I gG：y = -l. 211x+0.5533,R2 = 0.9813
[0133] 胱抑素c :y = -l ? 3192x-l ? 0848，R2 = 0 ? 997
[0134] a2_ 巨球蛋白：y = _0.8205x+0.3195，R2 = 0.9989
[0135] 02-微球蛋白：y = -1.0953x-0.4606，R2 = 0.9952
[0136] al-微球蛋白：y = -0.7219x+0.2032，R2 = 0.9934
[0137] 注：圖2至圖8中，橫坐標為檢測靶蛋白的校準品經依次梯度稀釋后，每個濃度稀釋 點的濃度值取對數值，即LogCi，Ci為各蛋白每個稀釋點濃度值?？v坐標為.
，其中 Ai為每種祀蛋白校準品各梯度稀釋點在Luminex平臺的讀數MFI值，A0是對應每個梯度校準 品的空白對照品在Luminex平臺的讀數MFI值。
[0138] 5、鏈霉親和素標記的藻紅蛋白SAPE
[0139] SAPE購買自Lifetechnologies公司，貨號：S866,將SAPE用緩沖液稀釋至2ug/ml， 即為工作濃度。
[0140]實施例6采用尿液微量蛋白檢測試劑盒對尿液樣本進行檢測
[0141] 采用實施例5制備的試劑盒進行尿液微量蛋白的檢測：
[0142] (1)使用前，先將試劑盒取出，放置于室溫下平衡至室溫；
[0143] (2)在微孔板中加入10u 1待測試樣本，同時取校準品S1-S7各10u 1作為標準參照； 待測試樣本為2015年10月20日從長海醫(yī)院收集，經新華醫(yī)院重新測定7項檢測結果；
[0144] (3)加入lOul生物素標記的七種微量蛋白抗原混合液，震蕩混合均勻；
[0145] (4)加入lOul的藕聯有七種微量蛋白抗體的磁性熒光微球混合液，震蕩后置于37 °C孵育30分鐘；
[0146] (5)孵育結束后，將微孔板置于磁分離洗板機上洗滌3次；
[0147] (6)加入20ul的濃度2mg/L鏈霉親和素藻紅蛋白SAPE溶液，混勻后置于37°C孵育20 分鐘；
[0148] (7)孵育結束后，將微孔板置于磁分離洗板機上洗滌3次；
[0149] (8)加入緩沖液50ul，震蕩混勻后在Luminex 200儀器上讀取平均熒光強度，測得7 種尿微量蛋白的含量。
[0150] 經上述檢測方法測得的數據與臨床檢測結果進行比對，結果如表11所示：
[0152]比較上表中的檢測結果，本發(fā)明的檢測方法，相較于傳統(tǒng)的檢測方式，檢測技術和 方法的優(yōu)越性如下：
[0153] 1、可以一次性聯合檢測7種尿微量蛋白，極大的提高了檢測效率，降低檢測成本。
[0154] 2、樣本檢測靈敏度高，具有免疫比濁等方法無可比擬的優(yōu)越性。
[0155] 以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述 實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的 變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。
【主權項】
1. 一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，包括： (1) 截聯有屯種微量蛋白抗體的磁性巧光微球混合液； (2) 由生物素標記的屯種微量蛋白抗原混合液； (3) 由鏈霉親和素標記的藻紅蛋白； (4) 校準品，至少包括屯種微量蛋白混合液； (5) 緩沖液； 所述的屯種微量蛋白為 M、TRF、02-MG、a2-MG、al-MGXystatinC、IgG; 所述的緩沖液由氯化鋼、憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、牛血清白蛋白和Proc 1 in-300組成； 其中，氯化鋼的濃度為6.0-10.0 g/L，憐酸氨二鋼的濃度為2.5-3.5g/L，憐酸二氨鋼的濃度 為0.2-0.4g/L，牛血清白蛋白的濃度為8.0-12. Og/L，Procl in-300的濃度為0.0 l-0.03ml/ UTriton X-IOO的濃度為0.1-0.3ml/L。2. 根據權利要求1所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所述的 磁性巧光微球，其截聯時抗體濃度為:每IO6個磁性巧光微球，每種抗體用量為2-lOug。3. 根據權利要求1或2所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所 述的磁性巧光微球，通過如下方法制得:將磁性巧光微球在由MES、NHS和抓C組成的活化體 系中活化處理15-20分鐘，加磁場，靜置分離5分鐘，用MES洗涂3次后加入抗體2-lOug/lO6個 巧光微球，室溫截聯2小時后，用MES洗涂1遍除去游離的抗體，加入1 %BSA溶液，置2-8°C冰 箱封閉過夜，封閉結束后，用1 %BSA溶液洗涂1遍，加入Proc 1 in 300，2-8°C保存。4. 根據權利要求3所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所述活 化體系中，當微球數量為2.5 X IO6時，MES的體積為230ul，邸C為IOul，N服為IOul;或當微球 數量為2.5 X 1〇6時，MES的體積為480ul，EDC為IOul，NHS為IOul。5. 根據權利要求1所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所述截 聯有屯種微量蛋白抗體的磁性巧光微球混合液中，各種抗體微球的濃度均為100個All。6. 根據權利要求1所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所述生 物素標記的屯種微量蛋白抗原混合液中，每種蛋白抗原與生物素的摩爾比為1:20-100。7. 根據權利要求6所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所述生 物素為班巧酷亞胺醋，每種蛋白抗原與生物素的摩爾比為1:50。8. 根據權利要求1所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所述生 物素標記的屯種微量蛋白抗原混合液中，各種蛋白抗原的濃度如下：9. 根據權利要求1所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所述鏈 霉親和素標記的藻紅蛋白的濃度為2mg/L。10. 根據權利要求1所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所述 的校準品，包括： 屯種微量蛋白混合液Sl，其中屯種微量蛋白的濃度分別為:60mg/L的MA、50mg/L的TRF、 2.5mg/L的的-MG、90mg/L的a2-MG、70mg/L的a 1-MG、3mg/L的 Cys tat in C，1 OOmg/L的 IgG; 屯種微量蛋白混合液S2-S6,將所述混合液SI按照1: 2或1:3梯度稀釋后的系列校準品； W及， 緩沖液S7,作為空白參照。11. 根據權利要求1所述的一種尿液屯種微量蛋白聯合檢測試劑盒，其特征在于:所述 的緩沖液中，氯化鋼的濃度為8. Og/L，憐酸氨二鋼的濃度為2.9g/L，憐酸二氨鋼的濃度為 0.296g/L，牛血清白蛋白的濃度為10.0g/L，Proclin-300的濃度為0.02ml/L，TritonX-100 的濃度為〇.2ml/L。12. 使用權利要求1-11任一項所述的試劑盒聯合檢測尿液屯種微量蛋白的方法，包括： a. 在酶標板微孔內加入IOul尿液樣本，同時取校準品各IOul作為標準參照，其中緩沖 液作為空白參照； b. 取生物素標記的屯種微量蛋白抗原混合液IOul加入酶標板微孔內，混合均勻； C.取截聯有屯種微量蛋白抗體的磁性巧光微球混合液IOul加入酶標板微孔內，震蕩混 勻后于37°C第一次解育30分鐘，解育結束后在磁分離板上靜置2-5鐘后洗涂3遍； d. 取鏈霉親和素標記的藻紅蛋白20ul加入酶標板微孔內，混勻后置于37°C第二次解育 20分鐘，解育結束后在磁分離板上靜置2-5鐘后洗涂3遍； e. 加入50ul的緩沖液，Luminex 200儀器上讀取平均巧光強度，測得屯種尿微量蛋白的 含量。
【文檔編號】G01N33/68GK105911291SQ201610265806
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】朱明 , 吳敏華, 朱留偉, 徐非, 徐非一, 褚皓, 李駿, 李駿一, 于慧
【申請人】上海中信亞特斯診斷試劑有限公司