利用ssr指紋圖譜鑒別舒茶早茶樹品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用SSR指紋圖譜鑒別舒茶早茶 樹品種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 舒茶早無性系，灌木型，中葉類，早生種，由安徽省舒城縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心于 1975-1994年從舒城舒茶鎮(zhèn)九一六茶場采用單株育種法選育而成，1995年安徽省農(nóng)作物品 種審定委員會審定為省級品種，2002年舒茶早由全國農(nóng)作物品種審定委員會審定為國家品 種。樹姿半開張，分枝較密，葉片稍上斜狀著生，葉片長橢圓，葉色深綠，有光澤，葉質(zhì)厚較 軟。芽葉生育力強，發(fā)芽整齊，長勢強。一芽三葉盛期在4月上旬，產(chǎn)量高，主要分布在安徽江 北茶區(qū)，安徽岳西、金寨、東至山東茶區(qū)已有大面積種植。適合制作茶樹，如舒城小蘭花和岳 西翠蘭，制蘭花茶，外形色澤翠綠，香氣清鮮持久，滋味醇厚。
[0003] 隨著國家對植物新品種保護制度不斷的完善，越來越多的育種者對新品種權(quán)保護 的意識增強，積極申請新品種保護。由舒茶早所制成的"小蘭花茶"是當(dāng)?shù)孛?，每年都會?不同的新品種出現(xiàn)，而僅憑肉眼從外觀形態(tài)上很難辨別真?zhèn)?，隨著國家對植物新品種保護 制度的不斷完善，急需開發(fā)有效的技術(shù)措施對舒茶早優(yōu)良品種進行精準(zhǔn)鑒定。本發(fā)明利用 SSR指紋圖譜技術(shù)對舒茶早品種進行鑒定，從DNA水平上給予舒茶早獨特的指紋身份，有效 防止其他品種冒充舒茶早，從而達到保護舒茶早優(yōu)良品種的目的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種利用SSR指紋圖譜鑒別舒茶早茶樹品種的方法。
[0005] 本發(fā)明利用SSR指紋圖譜技術(shù)鑒別舒茶早品種，其中涉及茶樹基因組中三個特異 的微衛(wèi)星SSR標(biāo)記，該標(biāo)記的重復(fù)單元是由二堿基和三堿基組成，是茶樹基因組中比較豐富 的微衛(wèi)星標(biāo)記，分別為:① SSR-54:5' -AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAG-3';②SSR-256:5'-AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG-3' ; ?SSRISSj^ATGATGATGATGATGATGATGATGATG-37 〇(SEQ ID No:1-3)〇
[0006] 上述標(biāo)記SSR-54、SSR-256和SSR-285的左、右側(cè)翼保守序列分別如SEQ ID Νο:6和 7、SEQIDNo:l(^Pll&&SEQIDNo:l^P15m*。
[0007] 基于SSR引物設(shè)計原則，根據(jù)上述SSR標(biāo)記的側(cè)翼序列設(shè)計引物，引物序列為：
[0008] SSR-54引物序列為：
[0009] 上游引物：5' -AGACACGAAATAGGTAGG-3'，Tm: 51 · 4°C (SEQ ID No: 4)
[0010] 下游引物:5/-AGACACGAAATAGGTAGG-3 /，Tm:51·4°C(SEQIDNo:5)
[0011] SSR-256引物序列為：
[0012] 上游引物：5/-ACTGGTAGGCGACAAACT-3 /，Tm:53°C(SEQIDNo:8)
[0013] 下游引物：5/-GCGACCCAAATCACTTAG-3 /，Tm:53°C(SEQIDNo:9)
[0014] SSR-285引物序列為：
[0015] 上游引物：5/-GCCATAAAGAGCAACAAG-3 /，Tm:51·4。C(SEQIDNo:12)
[0016] 下游引物：5/-CCTCACCATAACAACACC-3 /，Tm:53。C(SEQIDNo:13)
[0017] SSR引物的篩選步驟如下：以32份來自12個省份的優(yōu)良茶樹品種作為樣本材料，進 行樣品總DNA的提取，根據(jù)茶樹全基因組序列進行SSR位點的選擇和引物的設(shè)計篩選，通過 PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳初篩，然后采用Fragment Analyzer ?全自動毛細管電泳系統(tǒng)復(fù) 篩，根據(jù)電泳結(jié)果篩選出核心引物。
[0018] 本發(fā)明中茶樹總DNA提取是采用改良的CTAB法從干茶或茶樹葉片中提取基因組 DNA。對茶樹全基因組序列進行SSR標(biāo)記的選擇和引物設(shè)計篩選，在獲得10萬個含SSR位點的 序列中，二堿基和三堿基是茶樹基因組中比較豐富的微衛(wèi)星類型，從中選取2923條含有SSR 位點的序列，成功設(shè)計了415對引物，其中SSR引物篩選的原則如下：
[0019] ①引物的長度為18-23bp，目的片段在250bp左右。
[0020] ②GC含量為45%-55%，引物序列中避免出現(xiàn)3或4個連續(xù)堿基。
[0021] ③退火溫度在45°c-55°c，最好在50°C左右，上、下游引物Tm值相差不大于4°C。
[0022] ④引物3 '端避免出現(xiàn)A或出現(xiàn)3個以上連續(xù)堿基，盡量避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié) 構(gòu)。
[0023] 所述的PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳初篩，具體是將PCR產(chǎn)物通過2 %瓊脂糖凝膠電 泳，選取擴增率大于等于75%、條帶單一的PCR產(chǎn)物進行測序，通過與目的片段比對進行引 物的初篩。并通過Fragment Analyzer ?全自動毛細管電泳系統(tǒng)進行復(fù)篩，能夠精確地反映 等位位點間的差異，篩選出多態(tài)性高的引物，最終確定了三對核心引物SSR-54(SEQ ID No: 4和5)、SSR-256(SEQIDNo:8和9)和SSR-285(SEQIDNo:12和13)，其PIC值分別為0·882、 0.900和0.886，用于舒茶早品種的鑒定。
[0024] 本發(fā)明還提供一種利用SSR指紋圖譜鑒別舒茶早茶樹品種的方法，包括如下步驟：
[0025] 1)提取待測植株的基因組DNA;
[0026] 2)以待測植株的基因組DNA為模板，利用所述核心引物，進行PCR擴增反應(yīng)；
[0027] 3)檢測PCR擴增產(chǎn)物，如果用引物SSR-54能夠擴增出193bp和221bp大小的特征條 帶，則待測植株為舒茶早茶樹品種。
[0028] PCR擴增體系：50ng/yL基因組DNA 2yL，ΙΟμΜ上、下游引物各0.5yL，10 X EasyTaq酶 緩沖液2yL，EasyTaq DNA聚合酶lU，2.5mM dNTP 2yL，ddH20加至總量20yL。
[0029] PCR 程序：94 °C 預(yù)變性 5min; 94 °C 變性 30s，55 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，共 30 個循 環(huán);72°C延伸10min，4°C保存。
[0030] 步驟3)中采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，然后銀染顯色;或者通過毛 細管電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
[0031] 優(yōu)選用Fragment Analyzer ?全自動毛細管電泳系統(tǒng)檢測PCR擴增產(chǎn)物，由于 Fragment Analyzer ?全自動毛細管電泳系統(tǒng)最低分辨為2bp，因此利用所述核心引物對待 測植株擴增出的特征條帶分別是193 ± 3bp、221 ± 3bp，均可判定為舒茶早品種。
[0032]本發(fā)明進一步提供用于篩選或鑒別舒茶早茶樹品種的PCR檢測試劑盒，所述檢測 試劑盒包含上述核心引物SSR-54(SEQ ID No:4和5)和/或SSR-256(SEQ ID No:8和9)和/或 SSR-285(SEQIDNo:12和13)。
[0033]本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0034](一)本發(fā)明基于茶樹基因組開發(fā)出SSR引物，與EST-SSR相比，具有多態(tài)性高、數(shù)量 多的特點。通過大量的引物篩選，最終確定三對核心引物用于對舒茶早品種的鑒定。
[0035](二)本發(fā)明采用SSR指紋圖譜技術(shù)，該技術(shù)具有穩(wěn)定性好、操作簡單，準(zhǔn)確率高的 特點，對舒茶早優(yōu)良品種鑒定提供一種精確、快速、簡單的方法。
[0036](三)本發(fā)明所選用的材料不受季節(jié)、環(huán)境和測試時間的限制，可以對舒茶早品種 生長任何時期內(nèi)的任意器官，或制作好儲存一段時間的干茶進行DNA提取，均不會影響鑒定 結(jié)果。
[0037](四）本發(fā)明進行引物篩選優(yōu)選用Fragment Analyzer ?全自動毛細管電泳系統(tǒng)， 該系統(tǒng)具有高通量、安全方便、靈敏度高等特點，對構(gòu)建一套快速、精確的SSR指紋圖譜技術(shù) 起到重要作用，并縮短了舒茶早優(yōu)良品種鑒定的周期。
【附圖說明】
[0038]圖1為本發(fā)明實施例1中干茶或鮮葉總DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。
[0039]圖2為本發(fā)明實施例3中利用核心SSR引物對32個茶樹品種進行PCR檢測的瓊脂糖 凝膠電泳結(jié)果。
[0040] 圖3-圖5分別為本發(fā)明實施例3中32個茶樹品種的SSR指紋圖譜。
[0041] 圖6為本發(fā)明實施例3中三對核心引物的PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與目的片段比對 圖，旨在驗證引物的真實性，即擴增產(chǎn)物序列中是否包含SSR位點。
【具體實施方式】
[0042] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0043] 以下實施例中引物序列由上海生工合成，PCR擴增產(chǎn)物測序工作由上海生工完成。 PCR反應(yīng)試劑購自Transgeng公司。
[0044] 以下實施例中使用的CTAB提取液配方如下：20mM EDTA，100mM Tris-HCl，0.075v/ ν%〇β-巰基乙醇，1 .OmM NaCl，4w/v%PVPP-40，CTAB/SDS 2w/v% (十六烷基三甲基溴化銨和 十二烷基硫酸鈉質(zhì)量比1:6)。
[0045] 實施例1干茶或鮮葉總DNA的提取
[0046]實驗對象:所用茶樹品種見表1。
[0047] 表1茶樹品種
[0048]
[0049] 注:其中編號1、2、3、4、15、16、17、24、25、30對應(yīng)的品種為國家級品種，5、6、7、8、9、 10、14、19、20、21、22、23、26、27、28、29對應(yīng)的品種為省級品種，12、13為黃山野生茶樹。 [0050]用改良的CTAB法從干茶或鮮葉中提取總DNA，具體操作如下：
[00511①取2ml離心管加磨碎的干茶粉末O.lg，加900mL預(yù)熱至65°C的CTAB提取液，加 2OmL0-疏基乙醇，65°C水浴20min，每隔lOmin輕輕上下?lián)u勾幾次，然后加10mL RNAase置于 65°C水浴15min，每隔5min上下?lián)u勾幾次。
[0052] ②13000r/min，離心10min，取上清液800mL，加400mL Tris平衡酚，加等體積的氯 仿:異戊醇（氯仿和異戊醇體積比為24:1)至2mL，上下顛倒混勻，13000r/min離心10min，取 上清液