一種體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法。本發(fā)明所提供的體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法，包括如下步驟：(1)制備具有極性的單層視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；(2)制備視網(wǎng)膜神經(jīng)層；(3)構(gòu)建視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)層的共培養(yǎng)體系。本發(fā)明所提供的RPE細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)層共培養(yǎng)的方法，形成Bruch膜?RPE細(xì)胞?視網(wǎng)膜神經(jīng)層的“三明治結(jié)構(gòu)”，既模擬了Bruch膜又保持RPE與視網(wǎng)膜神經(jīng)層直接共培養(yǎng)，完全模擬了RPE體內(nèi)生長環(huán)境，提供了一個(gè)有價(jià)值的研究體內(nèi)環(huán)境下RPE細(xì)胞生長、分化、功能的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
【專利說明】
一種體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)是具有極性的、單層上皮細(xì)胞，在視網(wǎng)膜中RPE基底部為Bruch膜，頂端為視網(wǎng)膜神經(jīng)層。RPE能夠吞噬感光細(xì)胞外節(jié)、分泌營養(yǎng)因子、參與視循環(huán)代謝，組成血一視網(wǎng)膜屏障，對(duì)于正常的視網(wǎng)膜功能具有十分重要的功能，許多致盲性眼病的發(fā)生都與RPE的功能障礙有關(guān)，如老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性等。因此，研究RPE的功能具有十分重要的意義。
[0003]將RPE細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)是研究RPE的必備方法，但一般的細(xì)胞培養(yǎng)方法是將RPE細(xì)胞培養(yǎng)在普通培養(yǎng)板上，該方法與真實(shí)的體內(nèi)環(huán)境有很大差異，無法真實(shí)有效地評(píng)估細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中的功能。許多研究致力于采用超薄的小孔徑PET膜人工模擬Bruch膜，并將RPE細(xì)胞培養(yǎng)在這種人工材料上(Sonoda,S.，et al.Nat Protoc，2009，4:662-673)，發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞能夠在這種材料上形成具有極性的、單層細(xì)胞。這種體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞的方法雖然一定程度上更接近于體內(nèi)生長環(huán)境，但仍然忽視了視網(wǎng)膜神經(jīng)層對(duì)于RPE生長、分化、功能的影響。而視網(wǎng)膜神經(jīng)層在體外培養(yǎng)過程中極易飄動(dòng)、卷縮，使得難以與RPE細(xì)胞進(jìn)行直接共培養(yǎng)。
[0004]因此，需要一種有效的培養(yǎng)體系，既模擬了Bruch膜又保持RPE與視網(wǎng)膜神經(jīng)層直接共培養(yǎng)，完全模擬RPE體內(nèi)生長環(huán)境，為深入研究RPE細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中的生長、分化和功能提供一種實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法。
[0006]本發(fā)明所提供的體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0007](I)制備具有極性的單層視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；
[0008](2)制備視網(wǎng)膜神經(jīng)層；
[0009](3)構(gòu)建視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)層的共培養(yǎng)體系:將所述步驟(2)制備的視網(wǎng)膜神經(jīng)層移到已接種了所述步驟(I)制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的Transwell培養(yǎng)小室，使所述視網(wǎng)膜神經(jīng)層的感光細(xì)胞層朝向所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)于37 0C和5 %⑶2條件下共培養(yǎng)，2?3天換液;所述培養(yǎng)基為以Neurobasal-A培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入如下質(zhì)量百分比濃度的組分:2%B-27添加劑、I %N-2添加劑和0.4%L_谷氨酰胺。
[0010]所述步驟(I)中所述制備具有極性的單層視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞包括如下步驟:將人胚胎干細(xì)胞Hl不傳代連續(xù)培養(yǎng)35?45天后，出現(xiàn)直徑Imm大小的色素灶，將色素灶挑出后接種在培養(yǎng)板中，從色素灶中長出的細(xì)胞即為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，待生長至融合時(shí)，經(jīng)質(zhì)量百分比濃度為0.25 %胰蛋白酶37 °C消化I Omin，計(jì)數(shù)，以I X 1 Vcm2的密度將所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞均勻接種于已包被過基質(zhì)膠的Transwell培養(yǎng)小室的上層;移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中，于37°C、5%C02培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞14天后形成具有極性的單層視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
[0011]所述培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所需的培養(yǎng)基為:高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比濃度為20%KSR、質(zhì)量百分比濃度I %非必需氨基酸和ImM L-谷氨酰胺。
[0012]所述步驟(2)中所述制備視網(wǎng)膜神經(jīng)層包括如下步驟:準(zhǔn)備好出生后30天LongEvens大鼠的離體眼球，利用視網(wǎng)膜取出器在5秒內(nèi)完整取出離體眼球的視網(wǎng)膜神經(jīng)層，將取出的視網(wǎng)膜神經(jīng)層剪成梅花狀，保持展平。
[0013]所述步驟(3)還包括將視網(wǎng)膜壓平器壓在所述視網(wǎng)膜神經(jīng)層上，以保持所述視網(wǎng)膜神經(jīng)層展平以及所述視網(wǎng)膜神經(jīng)層與所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的緊密接觸的步驟。
[0014]本發(fā)明中，RPE細(xì)胞是原代分離或經(jīng)過各種干細(xì)胞分化來的RPE細(xì)胞或經(jīng)基因修飾的RPE細(xì)胞。所述干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、各種成體干細(xì)胞、以及采用治療性克隆技術(shù)制備的干細(xì)胞等。
[0015]本發(fā)明中，若視網(wǎng)膜神經(jīng)層來源于不同種屬、不同遺傳背景，可進(jìn)行相關(guān)的免疫排斥研究。
[0016]根據(jù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)的需要，檢測(cè)RPE細(xì)胞的生長、分化及功能，包括細(xì)胞的增殖、分化、吞噬感光細(xì)胞外節(jié)、分泌營養(yǎng)因子，參與視循環(huán)代謝等，為深入研究RPE細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境中的功能提供可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[0017]本發(fā)明所提供的RPE細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)層共培養(yǎng)的方法，形成Bruch膜-RPE細(xì)胞-視網(wǎng)膜神經(jīng)層的“三明治結(jié)構(gòu)”，既模擬了Bruch膜又保持RPE與視網(wǎng)膜神經(jīng)層直接共培養(yǎng)，完全模擬了 RPE體內(nèi)生長環(huán)境，提供了一個(gè)有價(jià)值的研究體內(nèi)環(huán)境下RPE細(xì)胞生長、分化、功能的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。本發(fā)明為一種完全模擬體內(nèi)環(huán)境的RPE細(xì)胞培養(yǎng)方法，提供了一個(gè)有價(jià)值的研究體內(nèi)環(huán)境下RPE細(xì)胞生長、分化、功能的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
【附圖說明】
[0018]圖1中A-C為RPE細(xì)胞培養(yǎng)在Transwell膜上的示意圖，及細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞極性的免疫熒光鑒定圖。
[0019]圖2為分離的視網(wǎng)膜神經(jīng)層剪成梅花狀后的示意圖。
[0020]圖3為視網(wǎng)膜壓平器的結(jié)構(gòu)示意圖
[0021 ]圖4為具有極性的單層RPE細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)層共培養(yǎng)的示意圖。
[0022]圖5為共培養(yǎng)后檢測(cè)RPE細(xì)胞的吞噬功能。
[0023]圖6為共培養(yǎng)后Western blot檢測(cè)RPE細(xì)胞RPE65的表達(dá)。
[0024]圖7為共培養(yǎng)后檢測(cè)RPE細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下述實(shí)施例中所使用的檢測(cè)、鑒定、純化方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法;下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均從商業(yè)途徑得到。
[0026]實(shí)施例1、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)層共培養(yǎng)的方法
[0027]—、人胚胎干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)層共培養(yǎng)的方法
[0028]1、制備具有極性的單層RPE細(xì)胞:將人胚胎干細(xì)胞Hl(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，貨號(hào)為SCSP-306，記載過人胚胎干細(xì)胞Hl的非專利文獻(xiàn)是:郭新，秦潔，張鍵榮，唐愛發(fā)，余振東，石敏，桂耀庭，蔡志明；人胚胎干細(xì)胞Hl培養(yǎng)條件的優(yōu)化;解剖學(xué)雜志，2008年03期)不傳代連續(xù)培養(yǎng)35?45天后，出現(xiàn)直徑約Imm大小的色素灶，將色素灶挑出后接種在培養(yǎng)板中，從色素灶中長出的細(xì)胞即為RPE細(xì)胞，待生長至融合時(shí)，經(jīng)0.25 % (質(zhì)量百分比濃度)胰蛋白酶370C消化1min，計(jì)數(shù)，以I X 105/cm2的密度將RPE細(xì)胞均勻接種于已包被過基質(zhì)膠(354230，美國BD公司)的Transwell培養(yǎng)小室(3470，美國Corning公司)(孔徑為0.4um的PET膜)的上層。小心移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37°C，5%⑶2培養(yǎng)。2?3天半量換液，培養(yǎng)14天后可形成具有極性的單層RPE細(xì)胞，參見圖1。
[0029]RPE細(xì)胞培養(yǎng)所需的培養(yǎng)基為:高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，20% (質(zhì)量百分比濃度)KSR(KnockOut?Serum Replacement) ,1% (質(zhì)量百分比濃度)非必需氨基酸，ImML-谷氨酰胺，均購自美國Invitrogen公司。
[0030]2、制備視網(wǎng)膜神經(jīng)層:準(zhǔn)備好出生后30天Long Evens大鼠(購買自中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)的離體眼球，利用“視網(wǎng)膜取出器”(發(fā)明專利號(hào):ZL201310162184.7;公布號(hào):CN103211677)和“視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞層體外分離制備的方法”(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?201310162180.9;授權(quán)公告號(hào):CN 103234774B)，在5秒內(nèi)快速完整的取出離體眼球的視網(wǎng)膜神經(jīng)層，視網(wǎng)膜神經(jīng)層剪成梅花狀，保持展平，參見圖2。
[0031 ]取出視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞層的具體步驟如下:
[0032]A.清潔眼球:首先用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)充分沖洗眼球;根據(jù)眼球來源，選擇相應(yīng)的抗生素加入預(yù)冷的生理鹽水內(nèi)充分沖洗眼球(如使用慶大霉素則每毫升生理鹽水內(nèi)含有20IU);眼球放在裝有冰塊的離體眼球固定器(授權(quán)公告號(hào):CN 203341904U)上，去除眼球表面的所有血樣附屬物和其他附屬的組織，保留四條直肌。
[0033]注意事項(xiàng):
[0034]a.因?yàn)閬碜詣?dòng)物或遺體捐獻(xiàn)的眼球，眼球表面有許多血樣附屬物和其他附屬的組織，為了防止組織細(xì)胞之間的污染，小心用彎剪刀仔細(xì)剪除眼球表面的組織和血跡附屬物，保留四條直肌。因?yàn)檠矍虮谳^薄，小動(dòng)物眼球壁大約0.6-0.8mm，大動(dòng)物眼球壁大約0.8-1.2_，人的眼球壁大約1.0-1.5_，切記不要把眼球壁剪破。
[0035]b.該步驟要求動(dòng)作準(zhǔn)確迅速，確保在0°C-4°C低溫條件下操作，以保證眼球各種細(xì)胞的活性。
[0036]c.每一個(gè)眼球，需要更換一次眼球固定器的塑料覆蓋膜，以防污染。
[0037]B.固定眼球:將清潔處理過的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源的眼球或遺體捐獻(xiàn)的眼球的四條直肌固定在與眼球大小相應(yīng)的裝有冰塊的眼球固定器上。
[0038]注意事項(xiàng):
[0039]a.為了防止污染，每一只眼球在沖洗后，更換一張眼球固定器的塑料紙。
[0040]b.在固定眼球時(shí)，千萬注意不要強(qiáng)行牽拉四條直肌，因?yàn)橹奔§柲じ街c(diǎn)的鞏膜厚度大約為0.3mm，以免造成眼球破裂。
[0041]c.選擇大小合適的眼球固定器，以眼球的直徑大小為依據(jù)來選擇。如果眼球固定器大小不適宜，切開眼球壁的時(shí)候，嚴(yán)重者可造成眼內(nèi)容物的脫出，也可帶來造成操作的不便。
[0042]C.切開眼球壁:在解剖顯微鏡下，用視網(wǎng)膜取出器C端的一次性刀片在小鼠、大鼠或荷蘭豬的眼球，沿角鞏膜緣后Imm切開全層的眼球壁360度，大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小香豬、家兔、狗、獼猴等大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的眼球，或遺體捐獻(xiàn)的眼球，沿眼球的平坦部(角膜緣后4mm)切開全層眼球壁360度。
[0043]注意事項(xiàng):
[0044]a.—次性刀片必須確保其刀刃的鋒利，以確保手術(shù)時(shí)避免對(duì)眼球施加任何的壓力，避免重復(fù)使用，以防治污染。
[0045]b.根據(jù)不同眼球壁的厚度，掌握好切開球壁的深度，一般成年小動(dòng)物眼球壁厚度大約為0.6-0.8mm，大動(dòng)物眼球壁厚度大約為0.8-1.2mm，人的眼球壁厚度大約為1.0-1.5_，同一類眼球不同發(fā)育年齡其眼球壁的厚度也有所差異，應(yīng)注意。
[0046]c.該步驟必須在顯微鏡下仔細(xì)操作，不要切開的過淺或過深，二者均可造成眼球組織細(xì)胞的損傷。
[0047]d.小動(dòng)物眼球壁切開是沿著角膜緣外Imm切開，大動(dòng)物眼球壁切開是在角膜緣后4_處切開，預(yù)先用標(biāo)記筆畫出所要切開的部位，以免錯(cuò)位，造成視網(wǎng)膜和眼內(nèi)組織的損傷。
[0048]e.清除眼內(nèi)容物:掀起眼球的前部，用視網(wǎng)膜取出器B端的視網(wǎng)膜一次性取出勺，沿著眼球壁的切口進(jìn)入眼內(nèi)，把晶狀體和玻璃體輕輕托出。
[0049]注意事項(xiàng):
[0050]a.操作時(shí)，小動(dòng)物用視網(wǎng)膜取出勺從眼球壁的切口沿球壁的弧形進(jìn)入，輕輕將晶狀體和玻璃體一起托出；大動(dòng)物分兩步，先用視網(wǎng)膜取出勺沿眼球壁切口水平進(jìn)入將晶狀體托出，然后沿球壁的弧形進(jìn)入將玻璃體輕輕托出。
[0051]b.視網(wǎng)膜取出勺進(jìn)入眼內(nèi)操作時(shí)，動(dòng)作一定要輕柔，切記不可使用其攪動(dòng)眼內(nèi)物，以免牽拉視網(wǎng)膜，造成視網(wǎng)膜人為的脫離。
[0052]D.取出視網(wǎng)膜神經(jīng)層:此時(shí)剪除眼球的前部組織，用無齒鑷輕輕夾住眼球壁呈灰白色的內(nèi)層，沿眼球壁切口的全周給于充分的分離，分離深度大約5mm左右，用視網(wǎng)膜取出勺沿球壁的弧度進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔，取出完整的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞層，呈灰白色球形。用微型剪刀將視網(wǎng)膜神經(jīng)層切成“梅花形”，將視網(wǎng)膜神經(jīng)層展平。
[0053]注意事項(xiàng):
[0054]a.由于眼球離體后，尤其是人體捐獻(xiàn)的眼球，離體時(shí)間越長，視網(wǎng)膜神經(jīng)層越容易與視網(wǎng)膜色素上皮層脫離，該步驟操作時(shí)動(dòng)作一定要輕柔，沿著視網(wǎng)膜下腔的自然弧度進(jìn)入，將全層視網(wǎng)膜神經(jīng)層取出。
[0055]b.根據(jù)眼球的大小，選擇相適應(yīng)直徑的視網(wǎng)膜取出勺。調(diào)整視網(wǎng)膜取出勺恰當(dāng)?shù)慕嵌群?，沿著眼球壁的自然弧度進(jìn)入視網(wǎng)膜下腔，切記操作動(dòng)作不要粗暴，這一步最容易造成視網(wǎng)膜取出不完全或視網(wǎng)膜呈碎片狀。
[0056]3、構(gòu)建RPE與視網(wǎng)膜神經(jīng)層的共培養(yǎng)體系:將步驟2中準(zhǔn)備好的視網(wǎng)膜神經(jīng)層移到已接種了 RPE細(xì)胞的Transwe 11培養(yǎng)小室(購自Corning公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為3470)中，使得視網(wǎng)膜神經(jīng)層的感光細(xì)胞層朝向RPE細(xì)胞，再用視網(wǎng)膜壓平器壓在視網(wǎng)膜上方(圖4)。視網(wǎng)膜壓平器(參見圖3)，中空，圓錐狀，直徑較大的一端為底座，底座呈圓環(huán)狀，底座上方設(shè)有一圈流通孔，另一端為頂端。高18_，底座直徑為6mm，內(nèi)徑5mm。流通孔距離底座高1.5mm，直徑1mm，頂端直徑為5mm。整個(gè)視網(wǎng)膜壓平環(huán)采取有機(jī)塑料制成。
[0057]在TranswelI培養(yǎng)小室的上室和下室中加入適量適合視網(wǎng)膜生長的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基以Neurobasal-A培養(yǎng)基(購自Life Technologies公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為10888-022)為基礎(chǔ)，加入如下質(zhì)量百分比濃度的組分:2%B-27添加劑(質(zhì)量百分比濃度)(購自LifeTechnologies公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為17504044)，I %N-2添加劑(質(zhì)量百分比濃度)(購自LifeTechnologies公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為17502-048)，0.4%L-谷氨酰胺(質(zhì)量百分比濃度)，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)于37 °C和5 % CO2條件下共培養(yǎng)，2?3天換液。
[0058]二、共培養(yǎng)2天后檢測(cè)RPE細(xì)胞吞噬感光細(xì)胞外節(jié)功能
[0059]采用上述方法將RPE與視網(wǎng)膜神經(jīng)層共培養(yǎng)2天后，去除視網(wǎng)膜神經(jīng)層，將PET膜從Transwel I培養(yǎng)小室上剪下，對(duì)RPE細(xì)胞片進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。
[0060]具體步驟包括:PBS洗3遍后，4 %多聚甲醛室溫固定15分鐘后，再次用I3BS洗3遍，加A0.2%Trit1n X-100，室溫處理30min后，PBS洗3遍，5%山羊血清室溫封閉Ih，用封閉液稀釋兔來源Rhodopsin抗體(貨號(hào)ab81702，美國abeam公司)，4°C孵育過夜，次日I3BS洗3遍后，加二抗，370C孵育60min，加入5ug/ml的FITC-鬼筆環(huán)肽，室溫染色60分鐘，PBS洗3次，DAPI染細(xì)胞核10分鐘，PBS洗細(xì)胞3次后，加熒光封片液封片，熒光或共聚焦顯微鏡下觀察。如圖5中A所示，Rhodopsin陽性的、呈點(diǎn)狀的感光細(xì)胞外節(jié)全部被吞噬到RPE細(xì)胞中，結(jié)果特異性好。
[0061]而常規(guī)方法檢測(cè)RPE細(xì)胞吞噬感光細(xì)胞外節(jié)時(shí)，需要事先剝離、純化感光細(xì)胞外節(jié)，再用FITC標(biāo)記后與培養(yǎng)的RPE細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，采用同樣的免疫熒光方法，但不加Rhodopsin抗體，iFluor 594標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽用于顯示細(xì)胞輪廓。如圖5中B所示，F(xiàn)ITC標(biāo)記的、呈碎片狀的感光細(xì)胞外節(jié)部分被吞噬到RPE細(xì)胞中，結(jié)果特異性較差。
[0062]三、共培養(yǎng)14天后檢測(cè)RPE細(xì)胞的分化
[0063]RPE65是RPE細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)，標(biāo)記著細(xì)胞分化成熟度。用Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞共培養(yǎng)前后RPE65的表達(dá)，并以未進(jìn)行共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞進(jìn)行比較。具體步驟包括:
[0064]1.RPE與視網(wǎng)膜神經(jīng)層共培養(yǎng)14天后，去除視網(wǎng)膜神經(jīng)層，PBS洗3遍。再將共培養(yǎng)(Co-culture)和非共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞用0.25 %胰酶消化，培養(yǎng)基中和消化后，離心，棄上清，取出細(xì)胞沉淀，置于冰上，加入10ul RIPA裂解液(強(qiáng))(P0013B，Beyotime)，混勻后，14000rpm離心5min后，取上清及細(xì)胞總蛋白。
[0065]2.將提取的蛋白與蛋白上樣緩沖液混合(4:1)，100 °C變性1min。
[0066]3.配濃縮膠和12%分離膠后，上樣，電泳條件為80V，恒壓，當(dāng)跑至分離膠時(shí)，120V，恒壓，直至loading buffer跑到凝膠外。
[0067]4.切膠后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜條件為100V，恒壓，70min。
[0068]5.取出PVDF膜，加入Western封閉液(P0023B，碧云天)，封閉60分鐘。
[0069]6.用一抗稀釋液稀釋小鼠來源RPE65抗體(貨號(hào)為abl3826，abcam公司)一1:400,4°(:孵育過夜，內(nèi)參β-actin抗體(貨號(hào)為BM0627，Boster公司)一1:1000，4°C孵育過夜。
[0070]7.TBST(0.05%Tween_20)洗3遍，每遍 10分鐘。
[0071]8.用TBST稀釋HRP標(biāo)記羊抗小鼠抗體(Boster，BA1050)——1:1000，37°C孵育2h。
[0072]9.TBST(0.05 % Tween-20)洗3遍，每遍 10分鐘。
[0073]10.加入ECL顯色液(P0018，碧云天)，曝光。
[0074]如圖6所示，內(nèi)參表達(dá)水平相似，而共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞(Co-culture)的RPE65表達(dá)水平明顯高于未共培養(yǎng)的對(duì)照組(Control)，說明共培養(yǎng)有利于RPE細(xì)胞的分化成熟。
[0075]四、共培養(yǎng)30天后檢測(cè)RPE細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)
[0076]采用上述方法將RPE與視網(wǎng)膜神經(jīng)層共培養(yǎng)30天后，去除視網(wǎng)膜神經(jīng)層，與非共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞一起用投射電鏡檢測(cè)其超微結(jié)構(gòu)。具體步驟如下:
[0077]1.將PET膜從Transwe 11培養(yǎng)小室上剪下，2.5 %戊二醛固定；
[0078]2.0.1M PBS漂洗兩次，30分鐘/次；
[0079]3.1%鋨酸后固定2小時(shí)；
[0080]4.0.1M PBS漂洗;
[0081]5.丙酮梯度脫水；
[0082]6.環(huán)氧樹脂618包埋；
[0083]7.半薄切片定位；
[0084]8.超薄切片，鈾染，鉛染；
[0085]9.FEI公司TECNAI10透射電子顯微鏡觀察
[0086]如圖7所示，共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞形成了典型了RPE形態(tài)，其細(xì)胞頂端出現(xiàn)了豐富的微絨毛，色素顆粒集中在胞質(zhì)內(nèi)的上方，細(xì)胞核位于細(xì)胞質(zhì)下方，細(xì)胞呈單層，相連細(xì)胞之間形成了緊密連接。而非共培養(yǎng)的RPE細(xì)胞雖然也呈單層，但尚未出現(xiàn)明顯的色素顆粒和微絨毛。說明共培養(yǎng)更有利于使體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞形成典型的超微結(jié)構(gòu)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的方法，包括如下步驟: (1)制備具有極性的單層視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞； (2)制備視網(wǎng)膜神經(jīng)層； (3)構(gòu)建視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞與視網(wǎng)膜神經(jīng)層的共培養(yǎng)體系:將所述步驟(2)制備的視網(wǎng)膜神經(jīng)層移到已接種了所述步驟(I)制備的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的Transwell培養(yǎng)小室，使所述視網(wǎng)膜神經(jīng)層的感光細(xì)胞層朝向所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，加入培養(yǎng)基，于37°C和5 % C02條件下共培養(yǎng)，2?3天換液;所述培養(yǎng)基為以Neurobasal-A培養(yǎng)基為基礎(chǔ)加入如下質(zhì)量百分比濃度的組分:2%B-27添加劑、I %N-2添加劑和0.4% L-谷氨酰胺。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(I)中所述制備具有極性的單層視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞包括如下步驟:將人胚胎干細(xì)胞Hl不傳代連續(xù)培養(yǎng)35?45天后，出現(xiàn)直徑Imm大小的色素灶，將色素灶挑出后接種在培養(yǎng)板中，從色素灶中長出的細(xì)胞即為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，待生長至融合時(shí)，經(jīng)質(zhì)量百分比濃度為0.25%胰蛋白酶37°C消化lOmin，計(jì)數(shù)，以I X 1Vcm2的密度將所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞均勾接種于已包被過基質(zhì)膠的TranswelI培養(yǎng)小室的上層;移至細(xì)胞培養(yǎng)箱中，于37°C、5%C02培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞14天后形成具有極性的單層視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞所需的培養(yǎng)基為:高糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比濃度為20 %KSR、質(zhì)量百分比濃度I %非必需氨基酸和ImM L-谷氨酰胺。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(2)中所述制備視網(wǎng)膜神經(jīng)層包括如下步驟:準(zhǔn)備好出生后30天Long Evens大鼠的離體眼球，利用視網(wǎng)膜取出器在5秒內(nèi)完整取出離體眼球的視網(wǎng)膜神經(jīng)層，將取出的視網(wǎng)膜神經(jīng)層剪成梅花狀，保持展平。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 所述步驟(3)還包括將視網(wǎng)膜壓平器壓在所述視網(wǎng)膜神經(jīng)層上，以保持所述視網(wǎng)膜神經(jīng)層展平以及所述視網(wǎng)膜神經(jīng)層與所述視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的緊密接觸的步驟。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK106047792SQ201610436669
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】吳畏, 徐海偉, 曾玉曉, 彭廣華, 陰正勤
【申請(qǐng)人】中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第附屬醫(yī)院, 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院