專(zhuān)利名稱(chēng)：：干細(xì)胞衍生的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生產(chǎn)已分化的^L網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的方法和系統(tǒng)，并涉及由此獲得的RPE細(xì)胞的治療用途。相關(guān)技術(shù)的列表以下是被認(rèn)為是對(duì)描述本發(fā)明領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)水平相關(guān)的參考文獻(xiàn)的列表。(1)StraussO.，Theretinalpigmentepitheliuminvisualfunction;Physiol.Rev.85:845-881，2005.(2)LundRD.etal.,Celltransplantationasatreatmentforretinaldisease;iVog￡>eM20:415-449,2001.(3)HarutaM.，Embryonicstemcells:potentialsourceforocularrepair;20(1):17-23,2005.(4)HarutaM.etal.，Invitroandinvivocharacterizationofpigmentepithelialcellsdifferentiatedfromprimateembryonicstemcells;/wveW(9p/^/m/mo/r&45:1020-1024,2004.(5)AokiH.etal.，EmbryonicstemcellsthatdifferentiateintoRPEcellprecursorsinvitrodevelopintoRPEcellmonolayersinvivo;~￡>eM82(2):265-274，2006.(6)KlimanskayaI.etal.,Derivationandcomparativeassessmentofretinalpigmentepitheliumfromhumanembryonicstemcellsusingtranscriptomics;C7om'wg5YemCe〃s6(3):217-245,2004.(7)LundRD.etal.,Humanembryonicstemcell-derivedcellsrescuevisualfunctionindystrophicRCSrats;CloningStemCells8(3):189-199,2006.(8)PCT申請(qǐng)公開(kāi)No.WO06/070370。
背景技術(shù)：
：視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)的功能障礙、損傷和喪失是某些眼6部疾病和病癥的突出特征，例如年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)、遺傳性黃斑變性，包括Best病(卵黃樣黃斑營(yíng)養(yǎng)不良的早期發(fā)作的形式)和色素性視網(wǎng)膜炎(RP)的亞型。這些疾病的可能的治療是RPE(和光受體)移植到受疾病影響的那些的視網(wǎng)膜中。相信的是，通過(guò)RPE細(xì)胞移植的RPE細(xì)胞補(bǔ)充可以延緩、停止或逆轉(zhuǎn)退化，改善視網(wǎng)膜功能和預(yù)防源自這些狀況的失明。斑(macula)，視網(wǎng)膜的中心部分，對(duì)于精細(xì)的可視細(xì)節(jié)和色彩感覺(jué)負(fù)責(zé)，并且對(duì)于我們?cè)S多日常的視覺(jué)工作例如面部識(shí)別和閱讀是關(guān)鍵的。在普遍的視網(wǎng)膜退化例如色素性視網(wǎng)膜炎(RP)中，以及在更特異性地耙向斑區(qū)域的不同疾病如年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)和Best病中，作為疾病過(guò)程的部分，斑常常受影響。在許多這些疾病中，原發(fā)的功能障礙和衰竭在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)中發(fā)生，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞位于光受體的底部。高度專(zhuān)門(mén)化的RPE細(xì)胞在支持光受體功能方面起到重要作用它們從脈絡(luò)膜血管主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)物，參與維生素A的再循環(huán)，維生素A是光受體中發(fā)色團(tuán)所必需的，以及作為這些細(xì)胞的正常更新過(guò)程的一部分?jǐn)z取并再循環(huán)脫落的光受體外部片段、在RP的亞型Best病和AMD中，RPE的衰竭最終導(dǎo)致視覺(jué)喪失和失明。替換這些細(xì)胞是可能的治療介入2,但是從人類(lèi)供體或胚胎獲得這樣的細(xì)胞是困難的。如果可以闡明使人類(lèi)胚胎干細(xì)胞細(xì)胞定向分化成為功能性RPE細(xì)胞的方式，人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hESC)可以充當(dāng)RPE細(xì)胞潛在無(wú)限的供體來(lái)源3。早先已經(jīng)描述了使hESC定向分化成為神經(jīng)前體細(xì)胞(NP)高度富集的培養(yǎng)物的方法(ReubinoffBE.etal.，Neuralprogenitorsfromhumanembryonicstemcells;細(xì)&c/mo/19:1134-1140，2001;ItsyksonP.etal.，Derivationof腿mlprecursorsfromhumanembryonicstemcellsinthepresenceofnoggin;Mo/Ce〃A^w^wcZ.30(1):24-36，2005)。此外，已經(jīng)體外和體內(nèi)地顯示了hESC在嚙齒動(dòng)物中移植到視網(wǎng)膜下間隙之后產(chǎn)生視網(wǎng)膜細(xì)胞的〉替力(BaninE.etal.,RetinalIncorporationandDifferentiationofNeuralPrecursorsDerivedfromHumanEmbryonicStemCells;5V柳(2):246-257,2006.)已經(jīng)展現(xiàn)了小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)ESC分化成為RPE細(xì)胞，以及在7移植后存活和減慢視網(wǎng)膜退化的潛力4'5。顯示了hESC向RPE的自發(fā)的分化，然而，分化過(guò)程的效率是低的，需要相當(dāng)?shù)姆只瘯r(shí)間，在4-8周的分化后僅獲得僅很低百分比(<1%)的含RPE細(xì)胞的群集。此外，雖然在RCS大鼠中在這些RPE細(xì)胞的視網(wǎng)膜下移植之后觀察到改善的視網(wǎng)膜功能，移植的細(xì)胞作為真正的成熟RPE細(xì)胞的功能沒(méi)有展現(xiàn)，這種效應(yīng)可能潛在地與非RPE特異性營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)相關(guān)6'7'9'1Q。近來(lái)還顯示了，hESC可以被定向可再生地分化成為RPE細(xì)胞，其中hESC的定向的而非自發(fā)的分化成為RPE的結(jié)局在存在煙酰胺(NA)的情況下發(fā)生8。發(fā)明概述根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(3(TGF-P)超家族的成員用于制備培養(yǎng)系統(tǒng)的用途，所述培養(yǎng)系統(tǒng)用于促進(jìn)人類(lèi)干細(xì)胞(hSC)定向和增加分化為視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞。根據(jù)第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了促進(jìn)hSC定向分化為RPE結(jié)局的方法，所述方法包"l舌(a)提供包含hSC的細(xì)胞培養(yǎng)物；和(b)在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含補(bǔ)充有TGF(3超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從而所述hSC被促使趨向定向分化為RPE結(jié)局。根據(jù)第三個(gè)方面，提供了細(xì)胞培養(yǎng)物，其包含通過(guò)在存在TGF卩超家族的一種或更多種成員的情況下hSC的定向分化所獲得的RPE細(xì)胞。優(yōu)選的，所述RPE細(xì)胞是通過(guò)在此公開(kāi)的方法獲得的終末分化的(成熟的)RPE細(xì)胞。如在此將顯示的，這樣的RPE細(xì)胞展現(xiàn)了幾種特征性性狀，其不同于當(dāng)hSC自發(fā)地分化成RPE細(xì)胞時(shí)所獲得的性狀。優(yōu)選的，所述RPE細(xì)胞能夠在它們的分化期間響應(yīng)于TGF卩信號(hào)傳導(dǎo)。根據(jù)第四個(gè)方面，提供了將hSC衍生的RPE細(xì)胞移植到受試者的眼睛中的方法，所述RPE細(xì)胞通過(guò)所述hSC的定向分化獲得，所述方法包才舌(a)^是供包含hSC的細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)所述細(xì)胞培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含補(bǔ)充有TGFP超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從而所述hSC被誘導(dǎo)分化成RPE細(xì)胞；(c)從所述細(xì)胞培養(yǎng)物收獲RPE細(xì)胞；和(d)將所述RPE細(xì)胞移植到所述受試者的眼睛中。根據(jù)第五個(gè)方面，i是供了細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包含通過(guò)所述hSC的定向分化所獲得的可移植的hSC衍生的RPE細(xì)胞。所述移植的RPE細(xì)胞展現(xiàn)了一種或更多種參數(shù)，所述參數(shù)表明所述移植的細(xì)胞在所述受試者眼睛內(nèi)是功能性的。所述移植的RPE細(xì)胞的功能性通過(guò)它們攝取光受體的脫落的外部片段同時(shí)改善視網(wǎng)膜功能的能力來(lái)展現(xiàn)。在此公開(kāi)的方法的培養(yǎng)系統(tǒng)中的hSC是分化中的hSC，即，基本上處于未分化的狀態(tài)的hSC的群體，或者其中至少部分所述細(xì)胞已經(jīng)被誘導(dǎo)經(jīng)歷了定向分化的初始階段，以及有的時(shí)候，大部分所述細(xì)胞已經(jīng)被誘導(dǎo)經(jīng)歷了定向分化的初始階段。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，分化的初始階段通過(guò)先期將細(xì)胞暴露于NA來(lái)實(shí)現(xiàn)，而當(dāng)未分化的細(xì)胞共同暴露于NA和TGFP超家族的一種或更多種成員時(shí)分化的初始階段也將發(fā)生。不受理論的限制，假定的是，對(duì)NA的先期暴露(在與TGF|3超家族的一種或更多種成員孵育之前)引起細(xì)胞趨向定向分化(與自發(fā)的分化相對(duì))成為具有特定RPE形態(tài)的RPE細(xì)胞，這將在下文進(jìn)一步討論。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，hSC是人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hESC)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，在包含TGF(3超家族的一種或更多種成員的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞是在hSC具有初始的分化、定向分化，優(yōu)選的由NA導(dǎo)致定向分化之后至少兩天。根據(jù)第五個(gè)方面，提供了在受試者中治療或預(yù)防視網(wǎng)膜疾病或病癥(其包括視網(wǎng)膜色素上皮的功能障礙、損傷和/或喪失)的方法，所述方法包括向所述受試者眼內(nèi)移植hSC衍生的RPE細(xì)胞，所述RPE細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)hSC趨向定向分化來(lái)獲得。可移植的RPE細(xì)胞優(yōu)選的通過(guò)在此公開(kāi)的方法獲得。附圖的簡(jiǎn)要描述為了理解本發(fā)明和顯示它如何實(shí)際上進(jìn)行，現(xiàn)在將參考附圖通過(guò)僅非限制性的實(shí)例來(lái)描述優(yōu)選的實(shí)施方式，在附圖中附圖1A-1E:實(shí)時(shí)PCR，分析存在NA的情況下RPE標(biāo)志物的表達(dá)。hESC的分化通過(guò)將它們作為自由浮動(dòng)的群集(cluster)來(lái)培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)。在6周的分化時(shí)，RPE標(biāo)志物MiTF-A(附圖1A)和RPE65(附圖IB)的表達(dá)水平在存在NA的情況下顯著增加。在連續(xù)時(shí)點(diǎn)的實(shí)時(shí)PCR分析展現(xiàn)了，在存在NA的情況下MiTF-A(附圖1C)和RPE65(附圖ID)的表達(dá)水平隨著時(shí)間逐漸^是高。包括斑萎蛋白(Bestrophin)、CRALBP和Mertk的RPE標(biāo)志物的其他轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)通過(guò)平板接種的色素化的群集的RT-PCR分析來(lái)展現(xiàn)(附圖IE)。+/-分別表示逆轉(zhuǎn)錄酶的存在或缺乏。附圖2A-2F:NA的RPE分化誘導(dǎo)效應(yīng)不取決于特定的培養(yǎng)基組成。在KO培養(yǎng)基中(附圖2A),或在補(bǔ)充有N2的Neurobasal培養(yǎng)基中、其1周后用補(bǔ)充有B27的DMEM/F12(NN培養(yǎng)基)替換(附圖2C)，分化12周的hESC群集的暗視野顯微照片。在兩種培養(yǎng)基中，NA增加了朝向色素化細(xì)胞的分化(附圖2B，D)，而已分化的hESC群集的大小和它們的總數(shù)在用NN培養(yǎng)基時(shí)較小(白色箭頭標(biāo)出分化中的群集內(nèi)的色素化區(qū)域)。在RNA水平上，在兩種培養(yǎng)基中，NA增添提高了MiTF-A和RPE65的表達(dá)水平(分別附圖2E和F)。附圖3A-3L:hESC的自由浮動(dòng)群集內(nèi)的黑色素表達(dá)細(xì)胞是推定的RPE細(xì)胞。具有高度富集色素化細(xì)胞的限定區(qū)域的分化中的hESC的自由浮動(dòng)群集的暗視野顯微照片(附圖3A)。在解離和平板接種之后與抗Otx2和MiTF免疫反應(yīng)性的色素化細(xì)胞的熒光(附圖3B)和相差(附圖3C)圖像。顯示了在表明限制的色素化區(qū)域的平板接種之后分化中的群集的暗視野顯微照片(附圖3D)。在色素化區(qū)域內(nèi)具有RPE細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)特征的細(xì)胞的相差圖像(附圖3E)。間接的免疫熒光染色顯示了，這些細(xì)胞表達(dá)RPE細(xì)胞的標(biāo)志物，包括MiTF(附圖3F)、ZO-1(附圖3G)、斑萎蛋白(附圖3H)、RPE65(附圖31)和CRALBP(附圖3J)。在解離之后，低密度平板接種并培養(yǎng)，色素化細(xì)胞失去了色素沉著并獲得了纖維樣的形態(tài)學(xué)(相差圖像)(附圖3K)。在進(jìn)一步延長(zhǎng)培養(yǎng)和增殖成高密度培養(yǎng)物之后，細(xì)胞再次獲得了表示RPE細(xì)胞特征的形態(tài)和色素沉著(附圖3L)。附圖4A-4E:激活蛋白A誘導(dǎo)RPE分化。人類(lèi)ESC一皮容許作為自由浮動(dòng)群集在存在或不存在激活蛋白A的情況下分化6周，激活蛋白A在分化第一周之后添加。群集的暗視野顯微照片顯示了，激活蛋白A顯著地提高包括色素化細(xì)胞的群集的百分比(附圖4A、B)(白色箭頭標(biāo)出分化中的群集內(nèi)的色素化區(qū)域，某些群集內(nèi)色素化區(qū)域的邊界由虛線標(biāo)出)。在存在激活蛋白A的情況下，色素化的區(qū)域的邊界更為清晰地與群集內(nèi)圍繞的非色素化區(qū)域分開(kāi)。此外，色素化的細(xì)胞在存在激活蛋白A的情況下是更暗色的(附圖4B)。在RNA水平上，實(shí)時(shí)PCR分析顯示了，RPE65(附圖4D)和斑萎蛋白(附圖4E)的表達(dá)在存在激活蛋白A的情況下顯著提高。MiTF-A的表達(dá)不被激活蛋白A處理改變(附圖4C)。附圖5A-5G:BMPs和TGF(33在RPE分化中起作用。人類(lèi)ESC作為自由浮動(dòng)群集被誘導(dǎo)分化6周。偶爾觀察到自發(fā)分化成色素化細(xì)胞(附圖5A),但是當(dāng)培養(yǎng)基補(bǔ)充N(xiāo)A時(shí)顯著提高(附圖5B，最左側(cè)和左側(cè)暗視野圖像；白色箭頭標(biāo)出分化中的群集內(nèi)色素化的區(qū)域)。在不存在(附圖5D)和存在(附圖5C)NA的情況下，培養(yǎng)基補(bǔ)充頭發(fā)生素(noggin)阻斷了分化成為色素化細(xì)胞。在RNA水平上，實(shí)時(shí)PCR分析顯示了，在存在和不存在NA的情況下，頭發(fā)生素都降低了MiTF-A的表達(dá)水平(附圖5E)。當(dāng)在存在NA的情況下在hESC群集的分化期間將TGFP3添加給培養(yǎng)基時(shí)，它顯著地增加了MiTF-A(附圖5F)而非RPE65(附圖5G)的表達(dá)水平。附圖6A-6J:在大鼠眼中移植的hESC衍生的RPE細(xì)胞的存活和整合。在hESC衍生的RPE細(xì)胞的眼內(nèi)移植之后，色素化的細(xì)胞可以在白化大鼠的眼睛中容易地體內(nèi)鑒定(附圖6A，6B)。在剜出眼睛(附圖6B)和除去角膜和晶狀體之后，可以看見(jiàn)主要的移植物和其他分散的色素化斑點(diǎn)(附圖6CK在組織切片中，包括也共表達(dá)GFP的暗色色素化細(xì)胞的移植物可以被鑒定(附圖6D-6G)，證明了細(xì)胞是hESC衍生的的事實(shí)。移植的細(xì)胞可以在玻璃體內(nèi)區(qū)域中、視網(wǎng)膜和晶狀體之間(附圖6H)、視網(wǎng)膜中(偶爾地沿著注射的管道伸入玻璃體內(nèi))(附圖61)以及在視網(wǎng)膜下間隙(附圖61、60,6P)中找到。移植的hESC衍生的RPE細(xì)胞(用箭頭標(biāo)出的色素化的細(xì)胞)整合到白化大鼠的RPE層中(附圖6J)。在對(duì)照的非移植的眼的RPE層中沒(méi)有觀察到色素化細(xì)胞。在移植物內(nèi)，用ZO-l(附圖6K-6N)的免疫染色顯示了在移植的GFP+hESC衍生的細(xì)胞之間存在緊密連接。這種連接是RPE細(xì)胞的特征。在移植到患有RPE功能障礙和視網(wǎng)膜退化的RCS大鼠的視網(wǎng)膜下間隙中之后，與遠(yuǎn)離移植物的區(qū)域相比(由箭頭標(biāo)出)，光受體層的相對(duì)保存可以在靠近移植物處見(jiàn)到(附圖60;矩形內(nèi)的區(qū)域由星號(hào)標(biāo)記，在附圖6P中擴(kuò)大)。注意到大量移植的hESC衍生的RPE細(xì)胞具有多邊形的形狀和鵝卵石樣外觀(附圖6P)(星號(hào))。在此處顯示的所有情況中，RPE細(xì)胞來(lái)源于不存在激活蛋白A的情況下的hESC。附圖7:電子視網(wǎng)膜成像記錄顯示了，hESC衍生的RPE細(xì)胞的移植提供了在營(yíng)養(yǎng)不良的RCS大鼠的眼睛中視網(wǎng)膜功能的拯救。與同伴的非移植的對(duì)照眼相比，在來(lái)自hESC的RPE細(xì)胞的移植之后在RCS大鼠眼中全視野ERG反應(yīng)更高(n-ll只大鼠)。用于這些實(shí)驗(yàn)的RPE細(xì)胞是沒(méi)有向培養(yǎng)基添加激活蛋白A來(lái)衍生的。顯示了對(duì)不斷提高強(qiáng)度的四次刺激的暗適應(yīng)的混合的視錐4見(jiàn)桿反應(yīng)的b-波幅。附圖8A-8I:顯示了在誘導(dǎo)來(lái)自hESC的色素化細(xì)胞發(fā)育中NA的效果的形態(tài)學(xué)和標(biāo)志物表達(dá)的分析。暗視野顯微照片顯示了在存在(附圖8A、8C和8E)或不存在(附圖8B、8D或8F)NA(白色箭頭標(biāo)出分化中的群集內(nèi)的色素化區(qū)域)的情況下，在hESC衍生的群集培養(yǎng)4周(附圖8A、8B)、6周(附圖8C、8D)和8周(附圖8E、8F)期間色素化細(xì)胞的逐漸出現(xiàn)。在補(bǔ)充有NA的培養(yǎng)基中(粗線的柱)和在對(duì)照培養(yǎng)物(細(xì)線的柱)中在培養(yǎng)期間不同時(shí)點(diǎn)，含有色素化區(qū)域的群集的百分比的直方圖表示(附圖8G)。在具有NA補(bǔ)充的8周培養(yǎng)期間，色素化細(xì)胞(附圖8H)和對(duì)早期RPE標(biāo)志物抗MiTF免疫反應(yīng)性的細(xì)胞(附圖81)的百分比的直方圖表示。標(biāo)尺柱(A)200mm;*p<0.05;**pO.001。附圖9A-9S:顯示了在hESC分化中的群集中隨著時(shí)間的RPE發(fā)育進(jìn)展的實(shí)時(shí)PCR、免疫染色和流式細(xì)胞術(shù)分析。(附圖9A-9L)實(shí)時(shí)PCR，分析了在存在(粗線的柱)或不存在(細(xì)線的柱)NA的情況下培養(yǎng)的群集中RPE發(fā)育中關(guān)鍵基因的表達(dá)的時(shí)機(jī)。在hESC衍生的群集的8周分化期間在連續(xù)的時(shí)點(diǎn)分析了以下標(biāo)志物的逐步表達(dá)hESC特異性標(biāo)志物Oct4(附圖9A);早期神經(jīng)標(biāo)志物Otx2(附圖9B)、Musashi(附圖9C)和Pax6(附圖9D);視網(wǎng)膜祖代標(biāo)志物Six3(附圖9E)、Rxl(附圖9F)和Chx10(附圖9G);RPE標(biāo)志物MiTF-A(附圖9H)、RPE65(附圖91)和斑萎蛋白(附圖9J);光受體祖代標(biāo)志物Crx(附圖9K);黑色素細(xì)胞發(fā)育標(biāo)志物Soxl0(有橫條的柱，附圖9L)(M51黑素瘤細(xì)胞系被用作對(duì)照)。在具有(粗線)或缺乏(細(xì)線的柱)NA的情況下8周的群集分化中，展現(xiàn)了hESC特異性標(biāo)志物TRA-l-60(附圖9M)和神經(jīng)祖代標(biāo)志物PSA-NCAM(附圖90)的逐步表達(dá)的FACS分析。在存在NA的情況下分化2周和4周的群集內(nèi)，表達(dá)早期神經(jīng)標(biāo)志物PSA-NCAM(粗線的柱)、巢蛋白(有橫條的柱)、Musashi(細(xì)線的柱)、Pax6(縱條紋的柱)的細(xì)胞的百分比的間接免疫熒光分析(附圖9N)。免疫焚光圖像，表現(xiàn)了表達(dá)這些標(biāo)志物的細(xì)胞，PSA-NCAM(附圖9P)、巢蛋白(附圖9Q)、musashi(附圖9R)、Pax6(附圖9S)。附圖10A-10J:形態(tài)學(xué)、標(biāo)志物表達(dá)和功能的分析，顯示了hESC的自由漂浮的群集內(nèi)色素表達(dá)細(xì)胞是推定的RPE細(xì)胞。鬼筆環(huán)肽染色顯示了表現(xiàn)RPE的特征的hESC衍生的色素化子代內(nèi)F-肌動(dòng)蛋白的分布(附圖10A);在解離、低密度平板接種并培養(yǎng)之后，色素化細(xì)胞失去色素沉著并獲得纖維樣形態(tài)(相差圖像，1周培養(yǎng))(附圖IOB)。在進(jìn)一步延長(zhǎng)培養(yǎng)和增殖成高密度培養(yǎng)物之后，細(xì)胞再次獲得了表示RPE細(xì)胞特征的形態(tài)和色素沉著(1.5個(gè)月的培養(yǎng))(附圖10C)。hESC衍生的RPE細(xì)胞的電子顯微鏡分析，顯示了作為RPE的特性的特征微絨毛(附圖10D)、基膜(附圖10E)、黑色素顆粒(附圖10D)、緊密連接(附圖10F)。相差(附圖10G)和熒光圖像(附圖10H-J)顯示了hESC衍生的色素細(xì)胞的綠色熒光膠乳珠子的吞噬作用(白色箭頭)；細(xì)胞膜用紅色熒光染料PKH染色(灰色)。三幅共焦熒光圖像表現(xiàn)了連續(xù)的Z軸切片(附圖10H-J)。附圖11A-11P:形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)的分析，顯示了來(lái)自TGF卩家族的因子促進(jìn)朝向RPE結(jié)局的分化。分化4周的hESC衍生的群集的暗視野顯微照片顯示了在存在激活蛋白的情況下在這個(gè)早期階段色素化細(xì)胞的出現(xiàn)(附圖11A)，以及與僅有NA(附圖11B)相反的，在存在激活蛋白A和NA的情況下(附圖11C)色素化群集分化的數(shù)量的提高。與激活蛋白A類(lèi)似，補(bǔ)充TGF(31同樣提高了色素化群集的出現(xiàn)(附圖11D)。相比之下，激活蛋白信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制物SB431542與激活蛋白A和NA—起的應(yīng)用降低了激活蛋白A對(duì)色素13化群集出現(xiàn)的效力(附圖IIE)。色素化群集的發(fā)育還通過(guò)在存在FGF|3與NA的情況下培養(yǎng)細(xì)胞而被消除(附圖11F)。激活蛋白受體和激活蛋白A的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)通過(guò)在存在或缺少NA的情況下培養(yǎng)的2周齡群集、以及未分化的hESCs作為對(duì)照的RT-PCR分析來(lái)展現(xiàn)(附圖11G)。在存在NA、NA+ActA、NA+SB431542、NA+ActA+SB431542、NA+TGF卩1的情況下在培養(yǎng)4周后含有色素化區(qū)域的群集的百分比的直方圖分析(附圖11H)。在NA(粗線的柱)或激活蛋白A和NA(對(duì)角條紋的柱)添加的4周培養(yǎng)之后色素化細(xì)胞的百分比的直方圖分析(附圖111)。在不同濃度的激活蛋白A下色素化細(xì)胞的百分比的直方圖分析(附圖11J),以及RPE標(biāo)志物斑萎蛋白(附圖11K)和RPE65(附圖11L)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)水平，所述激活蛋白A濃度對(duì)于RPE誘導(dǎo)140ng/ml是最佳的。在有(對(duì)角條紋的柱)或沒(méi)有(粗線的柱)激活蛋白A添加、存在NA的情況下的hESC分化中，激活蛋白A對(duì)視網(wǎng)膜和RPE基因，斑萎蛋白(附圖11M)、MiTF-總(附圖11N)、Rxl(附圖110)和ChxlO(附圖IIP)的表達(dá)水平的作用的實(shí)時(shí)PCR時(shí)間-過(guò)程分析。**p<0.005.(白色箭頭標(biāo)出分化中的群集內(nèi)的色素化區(qū)域)。附圖12A-12E:來(lái)自用NA和激活蛋白A處理的hESC的RPE細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)不良的RCS大鼠眼睛中的^L網(wǎng)膜下移才直之后存活。色素化細(xì)胞的群集可以使用眼底成像系統(tǒng)(附圖12A-12C);眼底照像(附圖12A)和無(wú)紅光照像(附圖12B)來(lái)容易地在RCS大鼠的眼睛中體內(nèi)鑒定，其顯示了移植物的視網(wǎng)膜下的位置(注意到視網(wǎng)膜血管經(jīng)過(guò)色素化區(qū)域)。hESC衍生的GFP表達(dá)細(xì)胞可以在熒光激發(fā)和使用發(fā)射濾波器時(shí)被看見(jiàn)發(fā)射熒光(附圖12C)。在熒光顯微鏡中離體(exvivo)成像的眼杯制品中(附圖12D-12E),可以看見(jiàn)視網(wǎng)膜下的GFP陽(yáng)性細(xì)胞的大的群集(附圖12D)以及多個(gè)分散的較小的群集(附圖12E)。附圖13A-13F:在RCS大鼠眼睛中視網(wǎng)膜下hESC衍生的激活蛋白A處理的RPE細(xì)胞移植物的組織學(xué)外觀。蘇木素和曙紅(附圖13A和IB)染色的組織切片顯示了視網(wǎng)膜下的和偶爾地視網(wǎng)膜內(nèi)位置的移植的hESC衍生的色素化細(xì)胞，其以群集或作為分離的纟田胞出現(xiàn)(箭頭)。使用GFP的免疫染色(附圖13C-13F)確認(rèn)了這些細(xì)胞確實(shí)是hESC衍生的。移植物常常是十分大的和分散的(附圖13C,13E),14共同表達(dá)GFP的色素化細(xì)胞可以明顯地看出(附圖13D,13F)。注意到GFP陽(yáng)性色素化細(xì)胞整合在宿主的RPE層之內(nèi)(附圖13D，箭頭)。附圖14A-140:移植的hESC衍生的色素化細(xì)胞表達(dá)成熟RPE的標(biāo)志物。免疫染色揭示了，移植物內(nèi)大量的移植的細(xì)胞表達(dá)作為成熟RPE細(xì)胞的特征的蛋白質(zhì)，包括RPE特異性標(biāo)志物RPE65(附圖14A-14E)和斑萎蛋白(附圖14F-14J)以及緊密連接標(biāo)志物Z0-1(附圖14K-140)。附圖14A、14F和14K顯示了共表達(dá)GFP和相關(guān)標(biāo)志物的移植物的低放大率焚光圖像。在每一排的高放大率共焦圖像顯示了在單個(gè)細(xì)胞水平下色素(通過(guò)Nomarski光學(xué)器件)以及GFP和不同標(biāo)志物的共表達(dá)。這些系列確認(rèn)了這些細(xì)胞確實(shí)是hESC衍生的，以及它們?cè)隗w內(nèi)表達(dá)成熟RPE的標(biāo)志物。在附圖14M中，注意到宿主RPE對(duì)ZO-l染色(虛線箭頭)，而它在附圖14N、140中是GFP陰性的(相應(yīng)的區(qū)域是暗色的)，與ZO-l陽(yáng)性hESC衍生的細(xì)胞相反(附圖14M中的完整箭頭)其確實(shí)共表達(dá)GFP(附圖14N，140)。附圖15A-15C:移植的hESC衍生的、激活蛋白A處理的RPE細(xì)胞提供了RCS大鼠視網(wǎng)膜退化模型中的功能拯救。與同類(lèi)的非移植6勺對(duì)照眼相比，以及與單獨(dú)進(jìn)行培養(yǎng)基的視網(wǎng)膜下注射的眼睛相比，在8周齡記錄的全—見(jiàn)野ERG反應(yīng)在來(lái)自hESC的、激活蛋白處理的RPE細(xì)胞的移植之后的RCS大鼠眼晴中是更高的。在移植的眼(附圖15A)和它同類(lèi)的對(duì)照眼(附圖15B)中顯示了在暗適應(yīng)狀態(tài)下對(duì)一系列4是高強(qiáng)度的白色閃光的代表性的ERG反應(yīng)。附圖15C顯示了在移植的眼和不同組的對(duì)照眼之間平均幅度方面的顯著的區(qū)別("-注射的眼(n=13);J-未注射的眼(n-13);--培養(yǎng)基的未注射的眼(n==5);j匿培養(yǎng)基注射的眼(n=5))。如所示，與在沒(méi)有激活蛋白A而衍生的RPE細(xì)胞的移植之后實(shí)現(xiàn)的拯救效果(附圖7)相比，在激活蛋白A處理的RPE細(xì)胞的移植之后(在此顯示)視網(wǎng)膜功能傾向于更好的保存。附圖16A-16D:移植的hESC衍生的、激活蛋白A處理的RPE細(xì)胞提供了RCS大鼠視網(wǎng)膜退化模型中的結(jié)構(gòu)的拯救。利用蘇木素和曙紅染色的切片的高分辨率顯微鏡圖像檢查和定量移植的hESC衍生的激活蛋白處理的RPE細(xì)胞對(duì)退化的宿主視網(wǎng)膜的效果。與遠(yuǎn)離移植物的區(qū)域相比，在接近視網(wǎng)膜下RPE移植物處，觀察到外核(光受體)層(ONL)以及內(nèi)部和外部光受體片段(IS+OS)的相對(duì)保存(兩個(gè)實(shí)例在附圖16A、16B中顯示)。附圖16A中的插圖展現(xiàn)了這種差異(在接近移植物的右側(cè)插圖中顯示了拯救的視網(wǎng)膜具有相對(duì)厚的ONL;在遠(yuǎn)離移植物的左側(cè)插圖中可見(jiàn)ONL的嚴(yán)重的變薄)。與遠(yuǎn)離移植物的區(qū)域相比(灰色柱)，總體視網(wǎng)膜厚度(附圖16C)以及ONL和IS+OS厚度(附圖16D)在接近hESC衍生的RPE移植物處顯著地增加(黑色柱，平均土SEM，n=7)。這種類(lèi)型的結(jié)構(gòu)拯救僅在接近視網(wǎng)膜下和深部的視網(wǎng)膜內(nèi)移植物處觀察到，而當(dāng)移植物僅僅處于玻璃體內(nèi)時(shí)沒(méi)有觀察到(未顯示)。對(duì)于定量技術(shù)的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參見(jiàn)方法。附圖17A-17E:移植的hESC衍生的激活蛋白A處理的RPE細(xì)胞體內(nèi)攝取視紫紅質(zhì)。視網(wǎng)膜下移植的RPE細(xì)胞的共焦圖像顯示了色素、GFP、RPE65和視紫紅質(zhì)在同一單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的共同定位。RCS大鼠的天然的RPE細(xì)胞表達(dá)RPE65(附圖17C,箭頭)，但是不表達(dá)GFP(附圖17D,箭頭)并含有最小數(shù)量的視紫紅質(zhì)(附圖17B、17E)。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明當(dāng)前的公開(kāi)提供了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-|3(TGFP)超家族的一種或更多種成員用于制備培養(yǎng)系統(tǒng)的用途，所述培養(yǎng)系統(tǒng)用于促進(jìn)人類(lèi)干細(xì)胞(hSC)、優(yōu)選的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hESC)分化成視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞。要注意的是，除了在此詳細(xì)地討論的特定用途之外，還包含在當(dāng)前的公開(kāi)之內(nèi)的是通過(guò)在存在一種或更多種TGF(3超家族的情況下hSC的定向分化所獲得的RPE細(xì)胞；以及促進(jìn)hSC的定向分化為RPE結(jié)局的方法，以及生長(zhǎng)和維持這種hSC衍生的RPE細(xì)胞的方法，以及利用這種hSC衍生的RPE細(xì)胞的方法。根據(jù)某些優(yōu)選的實(shí)施方式，根據(jù)在此的教導(dǎo)獲得的RPE細(xì)胞是成熟的(換句話說(shuō)，終末分化的)和功能性的RPE細(xì)胞，以下將進(jìn)一步討論和說(shuō)明。當(dāng)前的公開(kāi)廣泛地涉及生長(zhǎng)因子TGF卩超家族的一種或更多種成員在促進(jìn)/誘導(dǎo)/增強(qiáng)hSC向RPE細(xì)胞、優(yōu)選的成熟RPE細(xì)胞的定向分化方面的用途。在下面的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，有時(shí)將使用各種術(shù)語(yǔ)，這些術(shù)語(yǔ)的含義應(yīng)當(dāng)根據(jù)在此的教導(dǎo)來(lái)解釋?zhuān)缦?轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(3(TGFP)超家族生長(zhǎng)因子"，如在此使用的，表示生長(zhǎng)因子的TGFp超家族的任何成員，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-p蛋白，包括TGF卩1、TGF卩2和TGF卩3亞型，以及同源配體，包括激活蛋白(例如，激活蛋白A、激活蛋白B和激活蛋白AB)、nodal、抗mullerian激素(AMH)、某些骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)，例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7，以及生長(zhǎng)和分化因子(GDF)。"人類(lèi)干細(xì)胞，，或"hSC",如在此使用的，是指人類(lèi)來(lái)源的細(xì)胞，其在適合的條件下能夠分化成為具有特定的專(zhuān)門(mén)化功能的其他細(xì)胞類(lèi)型，而在其他適合的條件下能夠自我更新并保持在未分化的多能狀態(tài)，如下文詳述的。在此使用的"細(xì)胞"是指單細(xì)胞以及細(xì)胞的群體(即，超過(guò)一個(gè)細(xì)胞)。所述群體可以是包含一種細(xì)胞類(lèi)型的純的群體。做為選擇，群體可以包含超過(guò)一種細(xì)胞類(lèi)型。hSC細(xì)胞優(yōu)選的是獲自任何年齡的個(gè)體的骨髓組織、或獲自新生個(gè)體的臍帶血或組織的造血或間質(zhì)干細(xì)胞，獲自出生后任何年齡的胎兒或尸體腦部的神經(jīng)干細(xì)胞、獲自受精后形成的胚胎組織(例如，卵裂球，胚泡)的胚胎干(ES)纟田胞、或獲自妊娠期間任何時(shí)間，優(yōu)選的妊娠10周之前的胎兒的生殖組織的胚胎生殖(EG)細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞可以表示單細(xì)胞或細(xì)胞的群集。如在此使用的，"胚胎干細(xì)胞"和"多能胚胎干細(xì)胞，，是指可以子)4細(xì)k。'。、、如在此使用的，"細(xì)胞培養(yǎng)物"或"培養(yǎng)的細(xì)胞"是指在人工的體外環(huán)境中被培養(yǎng)、培育或生長(zhǎng)的細(xì)胞或組織。如在此使用的，"未分化的多能hSC，，、"多能hSC"是指具有形成任何成年人細(xì)胞的能力的、人類(lèi)來(lái)源的前體細(xì)胞。這樣的細(xì)胞是真實(shí)的細(xì)胞系，因?yàn)樗鼈?i)能夠以未分化的狀態(tài)在體外大范圍的增殖；和(ii)甚至在延長(zhǎng)的培養(yǎng)之后能夠分化成所有三種胚胎胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的衍生物。hESC來(lái)自低于一周齡的受精的胚胎(處于裂解或胚細(xì)胞階段)或通過(guò)具有等效特征的人工方式產(chǎn)生(例如，通過(guò)核轉(zhuǎn)移)。其他多能hSC包括，多能成年人祖細(xì)胞(MAP)、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)和羊水干細(xì)胞，但不限于此。如在此使用的，"未分化的"是指當(dāng)群體中相當(dāng)大比例(至少20%和可能超過(guò)50%或80%)的細(xì)胞和它們的衍生物顯示了未分化細(xì)胞的特征性標(biāo)志物和形態(tài)學(xué)特征、將它們從胚胎或成年人來(lái)源的已分化的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)時(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在至少3周的培養(yǎng)時(shí)間期間經(jīng)歷至少l次群體倍增，而在所述培養(yǎng)時(shí)間之后保持至少約50%，或相同比例的細(xì)胞帶有未分化細(xì)胞的特征性標(biāo)志物或形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞被認(rèn)為在未分化的狀態(tài)中增殖。如在此使用的，"細(xì)胞懸浮液"或"自由漂浮的細(xì)胞"是指細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中大部分的細(xì)胞在基質(zhì)中、一般在培養(yǎng)基(系統(tǒng))中自由地漂浮，所述細(xì)胞作為單細(xì)胞、或作為細(xì)胞群集和/或作為細(xì)胞聚集體漂浮。換句話說(shuō)，所述細(xì)胞不附著于基底地在培養(yǎng)基中存活并增殖。如在此使用的，"培養(yǎng)系統(tǒng)"是指適合于SC的增殖的培養(yǎng)系統(tǒng)。該術(shù)語(yǔ)表示了成分的組合，最少包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基(通常包含規(guī)定的基礎(chǔ)溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基，其包括鹽、糖類(lèi)和氨基酸)以及生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(3(TGFp)超家族的一種或更多種成員。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)可以進(jìn)一步包含其他成分，例如而不限于此，血清或血清替代物，培養(yǎng)(營(yíng)養(yǎng)物)基質(zhì)和其他外源添加的因子，它們一起提供了支持SC生長(zhǎng)的適合的條件，以及一般用于細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的其他成分。，上述成分可以被共同地分類(lèi)為可溶的成分。然而，在本發(fā)明的情境中，所述成分還可以與載體，即，不溶的成分締合。所述締合可以是通過(guò)化學(xué)的或物理的附著/結(jié)合。例如，所述成分可以固定在基質(zhì)(例如，細(xì)胞外基質(zhì))上，通過(guò)添加到系統(tǒng)中或結(jié)合在生物可降解的材料上的細(xì)胞來(lái)呈遞。進(jìn)一步，所述成分可以從載體上釋放，所述載體可以是細(xì)胞或者封裝或包埋了所述成分的泡嚢。因而，在以下的文字中，補(bǔ)充基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)形成培養(yǎng)系統(tǒng)的成分包括可溶的和不溶的成分。如在此使用的，"分化"是指從一種細(xì)胞類(lèi)型到另一種細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞狀態(tài)的切換過(guò)程，更具體的在當(dāng)前公開(kāi)的上下文中是指人類(lèi)干細(xì)胞獲得視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型的過(guò)程，所述細(xì)胞類(lèi)型具有表明所述RPE細(xì)胞是成熟的(終末分化的)細(xì)胞的至少一種特征性特征。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞類(lèi)型"是指細(xì)胞的獨(dú)特形態(tài)學(xué)或功能形式。如在此使用的，"分化中的hSC"是指未分化的hSC,其在適合的條件下能夠以增加的、定向的方式分化為預(yù)定的結(jié)局；該術(shù)語(yǔ)還指hSC的群體，其中其至少部分已經(jīng)被誘導(dǎo)經(jīng)歷了至少初始的分化，即，疋向勿、1^冉^且勺、。"引起"、"增加"、"促進(jìn)"或"使......定向"在此可互換地使用，除非上下文另外地指示了，是指啟動(dòng)干細(xì)胞非自發(fā)的分化成為RPE纟田胞。"分化誘導(dǎo)物"或"分化啟動(dòng)子"、"分化引發(fā)試劑"或"分化促進(jìn)因子，，在此可互換地使用，表示能夠引發(fā)、增加、促進(jìn)多能SC分化為體細(xì)胞或使多能SC定向分化為體細(xì)胞、優(yōu)選的成為RPE細(xì)胞的任何試劑。"視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞"、"RPE細(xì)胞"、"RPE"在上下文容許時(shí)可以可互換地使用，是指功能上類(lèi)似于形成視網(wǎng)膜的色素化細(xì)胞層的天然RPE細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞(例如，在移才直到眼睛內(nèi)時(shí)，它們展現(xiàn)了類(lèi)似于天然RPE細(xì)胞的功能活性)。因而，術(shù)語(yǔ)"視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，，、"RPE纟田月包"或"RPE"可以用于指代視網(wǎng)膜的色素化層的天然RPE細(xì)胞和根據(jù)當(dāng)前的公開(kāi)直接分化自hSC的RPE纟田胞。術(shù)語(yǔ)"hSC衍生的RPE細(xì)胞，，在此使用是表示通過(guò)從hSC的定向分化所獲得的RPE細(xì)胞。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，hSC衍生的RPE細(xì)胞是成熟的(終末分化的)和功能性的RPE細(xì)胞，如下文定義的參數(shù)所展現(xiàn)的。術(shù)語(yǔ)"定向分化，，與術(shù)語(yǔ)"RPE誘導(dǎo)的分化"可互換地使用，被理解為是指在誘導(dǎo)/促進(jìn)僅分化成RPE細(xì)胞類(lèi)型的培養(yǎng)條件下操作hSC的過(guò)程。"功能性RPE纟田月包"在此使用是表示通過(guò)在存在TGFp超家族的一種或更多種成員的情況下hSC的定向分化所獲得的細(xì)胞，所述RPE細(xì)胞展現(xiàn)了至少一種以下的特征-在分化期間，培養(yǎng)的細(xì)胞響應(yīng)TGFp信號(hào)傳導(dǎo)；-所述RPE細(xì)胞是成熟的、終末分化的細(xì)胞，如通過(guò)指示終末分化的標(biāo)志物例如斑萎蛋白或RPE65的表達(dá)所展現(xiàn)的，同時(shí)地或作為選擇地，通過(guò)它們?nèi)狈υ隗w內(nèi)增殖的潛力所展現(xiàn)的。-在移植之后(即，原位)，RPE細(xì)胞展現(xiàn)了支持鄰近于RPE細(xì)胞的光受體的營(yíng)養(yǎng)效力；-進(jìn)一步的，在原位，所述RPE細(xì)胞能夠具有作為這些光受體的正常更新過(guò)程的一部分的脫落的光受體外部片段的吞噬作用的功能。因而，根據(jù)本發(fā)明的RPE細(xì)胞特別適合于宿主RPE的再生，從而在將其移植到受試者的眼睛內(nèi)之后提供改善的視力。"類(lèi)似的"，當(dāng)在分化中的RPE細(xì)胞的上下文中使用時(shí)，是指已分化的RPE細(xì)胞與天然RPE細(xì)胞共有一種或更多種獨(dú)特的形態(tài)學(xué)或功能特征。例如，足夠的相似性可以通過(guò)，例如確定所述已分化的細(xì)胞表達(dá)天然存在的RPE細(xì)胞的一種或更多種標(biāo)志物，例如MiTF、ZO-l、斑萎蛋白、RPE65、Otx2、Mertk和CRALBP;或細(xì)胞顯示RPE細(xì)胞的一種或更多種物理的形態(tài)特征，例如細(xì)胞內(nèi)典型的F-月幾動(dòng)蛋白分布、色素化微粒的色素沉著、多邊形的(例如，六角形的)形狀、鵝卵石樣外觀和由電子顯微鏡檢查所展現(xiàn)的RPE的超微結(jié)構(gòu)特征來(lái)指示。此外，可以包括任何一種上文列出的功能，例如，支持鄰近于RPE細(xì)胞的光受體的營(yíng)養(yǎng)效果；具有攜帶視紫紅質(zhì)或缺乏體內(nèi)增殖的潛力的脫落的光受體外部片段的吞噬作用的功能性。如在此使用的"大規(guī)模，，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增來(lái)說(shuō)，是指RPE細(xì)胞在一定條件下的生產(chǎn)，所述條件允許在4周后在細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞至少加倍，在4周后的細(xì)胞群體基本上由RPE細(xì)月包組成。如在此使用的，"細(xì)胞標(biāo)志物"是指細(xì)胞的任何表型特征，其可白質(zhì)(包括分泌的、細(xì)胞表面的或內(nèi)部的蛋白質(zhì)；被細(xì)胞合成的或攝取的)；核酸(例如mRNA,或酶活性核酸分子)或多糖。包括的是任何這些細(xì)胞成分的決定簇，其可以通過(guò)對(duì)感興趣的細(xì)胞類(lèi)型的標(biāo)志物特異的抗體、凝集素、探針或核酸擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。所述標(biāo)志物還可以取決于基因產(chǎn)物的功能通過(guò)生物化學(xué)的或酶學(xué)的分析或生物反應(yīng)來(lái)鑒定。與每種標(biāo)志物相關(guān)的是編碼轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的基因，以及導(dǎo)致標(biāo)志物表達(dá)的事件。如果標(biāo)志物的表達(dá)處于比可接受的對(duì)照物例如肌動(dòng)蛋白或甘油醛3-磷酸脫氬酶(GAPDH)至少高50%(對(duì)于在抗體或PCR分析中測(cè)量的總基因產(chǎn)物)或更頻繁30%(對(duì)于群體中的陽(yáng)性細(xì)胞而言)的水平，標(biāo)志物被稱(chēng)為在未分化的或已分化的細(xì)胞群體中優(yōu)先地表達(dá)。表達(dá)更高或更頻繁2、10、100或10,000倍的標(biāo)志物是遞20增地更為優(yōu)選的。當(dāng)前的公開(kāi)利用了衍生RPE的hSC，是由于在存在著被應(yīng)用于;l浮的hSC的獨(dú)特的培養(yǎng)系統(tǒng)的情況下hSC的誘導(dǎo)的和定向分化。hSC的非限制性的實(shí)例是獲自胎兒或出生后任何年齡或獲自尸體的神經(jīng)干細(xì)胞，獲自任何年齡的人類(lèi)個(gè)體的骨髓組織或獲自新生個(gè)體的臍帶血的造血干細(xì)胞，間質(zhì)干細(xì)胞，羊水干細(xì)胞，獲自受精后形成的胚胎組織(例如，來(lái)自單個(gè)卵裂球，或來(lái)自胚泡)的胚胎干(ES)細(xì)胞，獲自妊娠期間任何時(shí)間，優(yōu)選的妊娠10周之前的胎兒的生殖組織的胚胎生殖(EG)細(xì)胞，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，或獲自任何年齡的人類(lèi)個(gè)體的生殖腺的干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的人類(lèi)干細(xì)胞是人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hESC)。hSC可以使用公知的細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得。舉例來(lái)說(shuō)，hESC可以分離自卯裂期或桑椹胚期人類(lèi)胚胎的單個(gè)卵裂球，分離自卵裂期和桑椹胚人類(lèi)胚胎和人類(lèi)胚泡。人類(lèi)胚胎可以獲自體內(nèi)移植前胚胎，或更一般地獲自體外受精(IVF)的胚胎。做為選擇，未受精的人類(lèi)卵細(xì)胞可以被單性生殖地活化來(lái)裂解并發(fā)育到胚泡階段。此外，單細(xì)胞人類(lèi)胚胎可以被擴(kuò)增到胚泡階段。對(duì)于從胚泡分離hESC，透明帶被除去，通過(guò)免疫外科手術(shù)來(lái)分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM),其中滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞被裂解并通過(guò)柔和的吸移從完整的ICM中除去。ICM然后平板接種在含有允許它的生長(zhǎng)的合適的培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)燒瓶中。在9到15天后，ICM衍生的生長(zhǎng)物通過(guò)機(jī)械解離或通過(guò)酶消化被分離成塊，然后細(xì)胞重新平板接種在新鮮的組織培養(yǎng)基上。展現(xiàn)了未分化的形態(tài)的菌落通過(guò)微量移液管單獨(dú)地挑選，機(jī)械地解離成塊，并重新平板接種。產(chǎn)生的ESC然后每l-2周常規(guī)地分裂。對(duì)于hESC的制備方法的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見(jiàn)Thomsonetal.[U.S.Pat.No.5,843,780;Science282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998;Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:7844,1995];Bongsoetal.[HumReprod4:706，1989]。商業(yè)上可獲得的hSC也可以根據(jù)本發(fā)明使用。HSC可以購(gòu)自NIH人類(lèi)胚胎干細(xì)胞登記所。商業(yè)上可獲得的胚胎干細(xì)胞系的非限制性實(shí)施例有BGOl、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03和TE32。hESC和衍生自它們的細(xì)胞的潛在的應(yīng)用是廣泛的，包括藥物開(kāi)發(fā)和測(cè)試，用于移植的細(xì)胞、組織和器官的產(chǎn)生，生物分子的生產(chǎn)，測(cè)試化合物的毒性和/或致畸性，高通量篩選分子的有毒，再生、保護(hù)或其他效力，以及促進(jìn)發(fā)育和其他生物過(guò)程的研究。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)前預(yù)期可通過(guò)hESC或hESC衍生的細(xì)胞的治療性移植來(lái)治療的疾病包括帕金森氏病、心臟梗塞、幼年發(fā)作型糖尿病和白血病[GearhartJ.Science282:1061-1062，1998;RossantandNagy,NatureBiotech.17:23-24,1999]。然而，對(duì)于hESC的實(shí)際開(kāi)發(fā)存在著顯著的障礙。這樣的兩種障礙包括將hESC維持在未分化的、多能狀態(tài)而沒(méi)有自發(fā)的分化；以及使hESC定向分化成為特定類(lèi)型的體細(xì)胞。對(duì)于維持和增殖干細(xì)胞，特別是hESC在未分化的狀態(tài)已經(jīng)描述幾種培養(yǎng)系統(tǒng)8。由于衍生自干細(xì)胞的已分化細(xì)胞在無(wú)數(shù)的治療應(yīng)用中的潛力，使a.體細(xì)胞結(jié)局是很令人感興趣的。在某些眼部疾病和病癥中，例如視網(wǎng)膜和斑(macula)的疾病和病癥，RPE細(xì)胞的衰竭最終導(dǎo)致視覺(jué)喪失和甚至失明。RPE細(xì)胞的移植來(lái)替換和支持衰竭的宿主RPE已經(jīng)被暗示作為可能的治療性介入，但是從人類(lèi)供體或胚胎獲得這樣的細(xì)胞是困難的。如果可以闡明使hSC細(xì)胞定向分化成為功能性RPE細(xì)胞的方式，hSC因此可以充當(dāng)RPE細(xì)胞潛在無(wú)限的供體來(lái)源?，F(xiàn)在已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，用大量生長(zhǎng)因子的TGF(3超家族的成員接觸hSC強(qiáng)烈地促進(jìn)hSC朝向RPE結(jié)局的分化。換句話說(shuō)，這些生長(zhǎng)因子具有對(duì)hSC的誘導(dǎo)效果。因而，設(shè)想了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(3(TGF-卩)超家族的成員用于制備培養(yǎng)系統(tǒng)的用途，所述培養(yǎng)系統(tǒng)用于誘導(dǎo)人類(lèi)千細(xì)胞(hSC)分化為視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞。雖然生長(zhǎng)因子的TGFp超家族的許多成員是已知的(上文列出了某些非限制性的實(shí)例)，根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，TGF超家族的成員優(yōu)選的是TGFpi、TGFP3生長(zhǎng)因子或激活蛋白A或它們的組合。_外細(xì)胞具有抑制效應(yīng)，以及進(jìn)一步的，NA促進(jìn)朝向神經(jīng)、和進(jìn)一步朝向RPE細(xì)胞樣結(jié)局的體細(xì)胞分化8。NA也稱(chēng)為"煙酰胺"，是維生素B3(煙酸)的酰胺衍生形式，其被認(rèn)為保存和改善卩細(xì)胞功能。NA具有化學(xué)式C6H6N20。NA對(duì)于生長(zhǎng)和食物到能量的轉(zhuǎn)化是必不可少的，它已經(jīng)用于關(guān)節(jié)炎治療和糖尿病治療和預(yù)防。NH2煙酰胺(NA)在當(dāng)前的公開(kāi)的上下文中，術(shù)語(yǔ)NA還表示NA的衍生物。在此使用的術(shù)語(yǔ)"煙酰胺(NA)的衍生物"代表作為天然NA的化學(xué)上修飾的4汙生物的化合物?；瘜W(xué)修飾可以包括，例如，在基礎(chǔ)的NA結(jié)構(gòu)的吡啶環(huán)上的替換(通過(guò)環(huán)的碳或氮成員)，通過(guò)酰胺部分的氮或氧原子，以及基團(tuán)的刪除或替換，例如，來(lái)形成NA的硫代苯甲酰胺類(lèi)似物，所有這些都是有機(jī)化學(xué)的熟練技術(shù)人員理解的。本發(fā)明的上下文中的衍生物還包括NA的核苷書(shū)f生物(例如，煙酰胺腺噪呤)。描述了NA的多種衍生物，某些還涉及PDE4酶的抑制活性(WO03/068233;WO02/060875;GB2327675A)或作為VEGF受體酪氨酸激酶抑制物(WO01/55114)。例如，制備4-芳基-煙酰胺衍生物的過(guò)程(WO05/014549)。與上述相關(guān)，現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)hSC在存在NA的情況下分化時(shí)，它們的性質(zhì)被改變，因而它們獲得了響應(yīng)TGF卩超家族的一種或更多種成員的誘導(dǎo)效應(yīng)的能力，其使它們定向分化向RPE結(jié)局、優(yōu)選的成熟和功能性RPE細(xì)胞。因此，當(dāng)在之后將hSC暴露于生長(zhǎng)因子的TGFj3超家族的一種或更多種成員時(shí)，結(jié)合在培養(yǎng)物中細(xì)胞對(duì)NA的預(yù)先暴露，NA的RPE分化誘導(dǎo)效應(yīng)可以被顯著地提高。因而，根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述方法包括用生長(zhǎng)因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員處理細(xì)胞，并與對(duì)NA的在先暴露組合使用、。組合用于包含TGFp和NA的培養(yǎng)系統(tǒng)的制備；以及用于僅包含TGF卩超家族的一種或更多種成員的培養(yǎng)系統(tǒng)的制備，用于誘導(dǎo)/促進(jìn)已經(jīng)暴露于NA的hSC的分化和/或進(jìn)一步分化。不受理論的限制，相信的是NA充當(dāng)了分化i秀導(dǎo)物/啟動(dòng)物，以及類(lèi)似地，TGFP超家族的一種或更多種成員充當(dāng)了RPE分化促進(jìn)因子。此外，不受到理論的限制，相信的是，hSC對(duì)NA的在先暴露為細(xì)胞提供了性質(zhì)，所述性質(zhì)允許它們對(duì)TGF卩超家族的一種或更多種成員的RPE分化促進(jìn)效應(yīng)的響應(yīng)。因而，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，hSC首先在包含補(bǔ)充有NA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)至少幾個(gè)小時(shí)，優(yōu)選的至少一天，更優(yōu)選的至少2天，在將該細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞在補(bǔ)充有TGFp超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(相同的或不同的)中培養(yǎng)之前。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，未分化的hSC在包含補(bǔ)充有NA和TGF(3超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。注意的是，各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的，用于細(xì)胞培養(yǎng)物和優(yōu)選的用于SC培養(yǎng)物?？梢愿鶕?jù)當(dāng)前的公開(kāi)使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的非限制性列表包括NeurobasalTM(CAT#21103-049,Gibco1998/1999)、KO畫(huà)DMEM(CAT#10829-018,Gibco1998/1999)、DMEM(CAT#41965-039,Gibco2004)、DMEM/F12(CAT#21331-020,Gibco2004)、Cellgro干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CAT#2001，CellGenix2005)或X-Vivo(CAT弁04-380Q,LONZA2007)。當(dāng)前的公開(kāi)還提供了誘導(dǎo)hSC定向分化為RPE結(jié)局的方法，所述方法包括(a)提供包含hSC的細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)所述細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含補(bǔ)充有TGFP超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從而促進(jìn)hSC定向分化為RPE結(jié)局。分化可以在hSC的自由浮動(dòng)的群集或附著的培養(yǎng)物內(nèi)發(fā)生。描述了在附著的培養(yǎng)物中的體細(xì)胞分化[美國(guó)專(zhuān)利No.7,112,437]。這樣的附著的培養(yǎng)物因而可以充當(dāng)用于通過(guò)培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)RPE分化的基礎(chǔ)，所述培養(yǎng)系統(tǒng)補(bǔ)充有生長(zhǎng)因子的TGFP超家族的至少一種或更多種成貝。細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞可以是未分化的hSC的群體，或是其中至少部分hSC已經(jīng)開(kāi)始分化的細(xì)胞的群體。所述起始的分化是定向分化。因而，在本公開(kāi)的上下文中，所述方法中提供的細(xì)胞有時(shí)被稱(chēng)為分化中的細(xì)月包。導(dǎo)入可溶的成分和不溶成分來(lái)補(bǔ)充。對(duì)于具有生長(zhǎng)因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員的補(bǔ)充，所述成員可以以可溶的形式存在，或固定于或締合于添力口到培養(yǎng)系統(tǒng)的基質(zhì)或纟田月包，或所述成》、可以結(jié)冶、或復(fù)合于其1'也物質(zhì)。所述成員還可以從后者中存在的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)系統(tǒng)中。hSC可以以未分化的狀態(tài)、以及在暴露于分化促進(jìn)因子(分化引發(fā)試劑)例如NA之后提供。未分化的hSC可以從各種培養(yǎng)系統(tǒng)獲得，在所述培養(yǎng)系統(tǒng)中hSC可以被維持在未分化的多能狀態(tài)。例如，細(xì)胞可以被培養(yǎng)在無(wú)飼養(yǎng)物(feeder-free)的附著或懸浮系統(tǒng)(WO06/070370)中或飼養(yǎng)細(xì)胞上。通常使用的飼養(yǎng)細(xì)胞包括原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(PMEF)、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MFF)、人類(lèi)胚胎成纖維細(xì)胞(HEF)、獲自人類(lèi)胚胎干細(xì)胞的分化的人類(lèi)成纖維細(xì)胞、人類(lèi)胎兒肌細(xì)胞(HFM)、人類(lèi)胎兒皮膚細(xì)胞(HFS)、人類(lèi)成年人皮膚細(xì)胞、人類(lèi)包皮成纖維細(xì)胞(HFF)、獲自臍帶或胎盤(pán)的人類(lèi)細(xì)胞、人類(lèi)成年人輸卵管上皮細(xì)胞(HAFT)和人類(lèi)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(hMSC)。hSC的群集可以通過(guò)從飼養(yǎng)層或細(xì)胞外基質(zhì)解離細(xì)胞來(lái)從附著細(xì)胞培養(yǎng)物獲得來(lái)形成細(xì)胞的懸浮液。細(xì)胞的懸浮液可以包含自由浮動(dòng)的群集或基本上單細(xì)胞的懸浮液，從其中細(xì)胞的群集可以生長(zhǎng)形成細(xì)胞群集。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方式，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含細(xì)胞懸浮液，優(yōu)選的處于懸浮培養(yǎng)物中的自由浮動(dòng)的群集，即，來(lái)自人類(lèi)胚胎干細(xì)胞(hESC)的細(xì)胞的聚集物。自由浮動(dòng)的干細(xì)胞的來(lái)源早先在WO06/070370中描述了，通過(guò)引用將其全部合并在此。根據(jù)當(dāng)前的公開(kāi)的培養(yǎng)步驟可以包括用一種或更多種不同的培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞，至少一種所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含TGF卩超家族的一種或更多種成員。根據(jù)當(dāng)前的公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方式，培養(yǎng)物中的細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含除了所述生長(zhǎng)因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員之外補(bǔ)充有NA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，細(xì)胞首先在包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和NA的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，所述細(xì)胞是未分化的hSC，優(yōu)選的在hSC分化被誘導(dǎo)之后(即，在預(yù)定的時(shí)間之后，或通過(guò)本領(lǐng)域可用的技術(shù)確i人細(xì)胞分化之后)，細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞在包含生長(zhǎng)因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)。第二培養(yǎng)系統(tǒng)還可以包含NA，即，可以是與初始的培養(yǎng)系統(tǒng)相同的，向其中添加了TGF|3超家族的成員。結(jié)果，定向分化為RPE細(xì)胞被誘導(dǎo)。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方式，初始細(xì)胞培養(yǎng)物中的hSC在包含NA的培養(yǎng)系統(tǒng)中至少培養(yǎng)啟動(dòng)hSCs分化所需的時(shí)間。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，所述細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)在包含NA的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)幾天，優(yōu)選的至少兩天，優(yōu)選的至少一周，更優(yōu)選的至少兩周。不受到理論的限制，本發(fā)明人規(guī)定，NA誘導(dǎo)定向分化過(guò)程，與自發(fā)的分化(即，在沒(méi)有NA暴露或暴露于NA與TGF(3成員時(shí))相比其在它的發(fā)展中還被加速了。已經(jīng)在此顯示了，在定向分化中，未分化的干細(xì)胞更為快速地從培養(yǎng)系統(tǒng)中消除。因此，NA在分化中的hSC的培養(yǎng)系統(tǒng)中使用，作為促進(jìn)和加速定向分化過(guò)程的手段，用于未分化的干細(xì)胞的完全消除，據(jù)此預(yù)防潛在的并發(fā)癥，例如在移植后由于未分化細(xì)胞的存在的畸胎瘤腫瘤形成。在此已經(jīng)顯示的是，與自發(fā)地分化中的細(xì)胞(即，不存在這些因子)相比，hSC對(duì)NA的暴露，跟隨著對(duì)TGF(3超家族的一種或更多種成員的暴露誘導(dǎo)了分化為具有不同表型的細(xì)胞。進(jìn)一步的，不受到理論的限制，發(fā)明人假定的是，NA誘導(dǎo)了分化成為表達(dá)TGFJ3超家族的一種或更多種成員的受體(其不被自發(fā)地分化中的干細(xì)胞表達(dá))的細(xì)胞，從而容許定向分化成為成熟的和功能性的RPE細(xì)胞。這樣的受體表達(dá)容許TGFp超家族成員對(duì)培養(yǎng)物中的分化中的細(xì)胞趨向RPE結(jié)局的定向分化的誘導(dǎo)效應(yīng)，即，趨向成熟的和功能性的RPE細(xì)^<。如上文指出的，存在著生長(zhǎng)因子的TGF卩超家族的多種成員。例如，根據(jù)本發(fā)明的生長(zhǎng)因子可以是一種或更多種以下的，TGF卩1、TGF|32、TGF卩3、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、nodal、抗mullerian激素(AMH)、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7或生長(zhǎng)和分化因子(GDF)。然而，優(yōu)選的，TGF卩超家族的生長(zhǎng)因子是TGFP3或TGF卩1或激活蛋白A或它們的組合。根據(jù)本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知用于支持體外細(xì)胞生長(zhǎng)的任何已知的細(xì)胞培養(yǎng)基，一般地，是包含規(guī)定的基礎(chǔ)溶液的培養(yǎng)基，26其包含鹽、糖類(lèi)、氨基酸和維持培養(yǎng)物中的細(xì)胞處于存活狀態(tài)所需的任何其他營(yíng)養(yǎng)物?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的商業(yè)上可獲得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的非限制性實(shí)施例包括Neurobasal、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、CellgroTM干細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基或X-VivoTM?；A(chǔ)培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有本領(lǐng)域已知的處理細(xì)胞培養(yǎng)物的多種試劑。以下是可以包括在培養(yǎng)系統(tǒng)中根據(jù)當(dāng)前的公開(kāi)使用的各種添加物的非限制性參考的實(shí)例匿含有血清或血清替代物的培養(yǎng)基，例如而不限于，knockout血清替代物(KOSR)、Nutridoma-CS、TCHTM、N2、N2衍生物或B27或組合；-細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，例如而不限于，纖連蛋白、層粘連蛋白和明膠。ECM可以被用于攜帶生長(zhǎng)因子的TGF(3超家族的一種或更多種成員；-抗細(xì)菌試劑，例如但不限于，青霉素和鏈霉素；-非必需氨基酸(NEAA)，-已知在促進(jìn)培養(yǎng)物中的SC的存活方面起作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如而不限于BDNF、NT3、NT4。一旦細(xì)胞^皮促^f吏進(jìn)入RPE結(jié)局，RPE細(xì)l包可以通過(guò)已知的方法從培養(yǎng)物中收回/收獲，用于各種應(yīng)用。當(dāng)前的公開(kāi)還提供了通過(guò)在存在TGF(3超家族的一種或更多種成員的情況下hSC的定向分化所獲得的RPE細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，RPE細(xì)胞通過(guò)本發(fā)明的方法獲得。上文的進(jìn)一步的，通過(guò)根據(jù)當(dāng)前的公開(kāi)的定向分化所產(chǎn)生的RPE細(xì)胞具有與在自發(fā)的分化期間發(fā)育的RPE細(xì)胞相比的特定性質(zhì)。-分化中的細(xì)胞在它們的發(fā)育和分化中具有響應(yīng)TGF(3信號(hào)傳導(dǎo)的潛力。-產(chǎn)生的RPE細(xì)胞是成熟的細(xì)胞(終末分化的)；-與在自發(fā)的分化期間形成的RPE細(xì)胞相比，成熟的RPE細(xì)胞顯示了更暗的色素沉著。-與通過(guò)自發(fā)分化產(chǎn)生的RPE細(xì)胞中它們的表達(dá)相比較，成熟的RPE細(xì)胞表達(dá)顯著更高水平的成熟RPE細(xì)胞的標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，例如斑萎蛋白和RPE65。在這一點(diǎn)上，例如，參考附圖9J、IIM和IIK，顯示了與存在NA(附圖9J)的情況下的分化相比在自發(fā)的分化(無(wú)NA)中斑萎蛋白的表達(dá)，以及激活蛋白A對(duì)定向分化的增加的效力(附圖IIK、IIM和4E)。進(jìn)一步參考附圖1B和91,顯示了與存在NA的情況下的分化相比，進(jìn)一步與附圖4D中激活蛋白A的增加效力相比較，在自發(fā)的分化(無(wú)NA)中RPE65的表達(dá)。-在電子顯微鏡(EM)分析中，RPE細(xì)胞展示了成熟的真正的RPE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，其在來(lái)自自發(fā)分化中的hSC的RPE樣細(xì)胞中沒(méi)有展現(xiàn)，例如頂端的絨毛、緊密連接和基膜。通過(guò)當(dāng)前的公開(kāi)的方法產(chǎn)生的RPE細(xì)胞可以用于這些細(xì)胞的大規(guī)模和/或長(zhǎng)期培養(yǎng)。為此，本發(fā)明的方法在適合于細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)的生物反應(yīng)器中進(jìn)行，在其中未分化的hSC將根據(jù)本發(fā)明來(lái)培養(yǎng)。在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)細(xì)胞的一般需求是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。做為選擇，當(dāng)前的公開(kāi)的方法產(chǎn)生的RPE細(xì)胞可以在它們的衍生之后被擴(kuò)增。對(duì)于擴(kuò)增，它們被離解、以低密度平板接種在胞外基質(zhì),優(yōu)選的聚-D-賴(lài)氨酸和層粘連蛋白上，并在具有NA的無(wú)血清KOM中培養(yǎng)。在這些培養(yǎng)條件下，色素化細(xì)胞釋放色素沉著并獲得纖維樣形態(tài)。在進(jìn)一步延長(zhǎng)的培養(yǎng)和增殖為高密度培養(yǎng)物之后，細(xì)胞重新獲得RPE細(xì)胞的特征性的多邊形形狀形態(tài)學(xué)和色素沉著。RPE細(xì)胞可以在懸浮液中或以單層擴(kuò)增。RPE細(xì)胞以單層培養(yǎng)的擴(kuò)增可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法被修飾為在生物反應(yīng)器中的大規(guī)模擴(kuò)增。本領(lǐng)域技術(shù)人員很好地理解的是，RPE細(xì)胞從hSC的衍生化具有很大效益。它們可以用作體外模型用于開(kāi)發(fā)新的藥物來(lái)促進(jìn)它們的存活、再生和功能。hSC彩f生的RPE細(xì)胞可以用于對(duì)RPE細(xì)胞具有毒性或再生效果的化合物的高通量篩選。它們可以用于揭示對(duì)于光受體細(xì)胞的發(fā)育、分化、維持、存活和功能重要的的機(jī)制、新的基因、可溶的或膜結(jié)合的因子。'RPE細(xì)胞還可以充當(dāng)RPE細(xì)胞的無(wú)限的來(lái)源，用于移植、補(bǔ)充和支持視網(wǎng)膜退化中功能失?；蛲嘶腞PE細(xì)胞。此外，遺傳修飾的RPE細(xì)胞可以充當(dāng)載體來(lái)在移植之后在眼睛和視網(wǎng)膜中攜帶并表達(dá)基因。因而，根據(jù)當(dāng)前的公開(kāi)的進(jìn)一步的方面，提供了將RPE細(xì)胞移植到受試者的眼睛中的方法，所述方法包括(a)提供包含hSC的細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)在包含補(bǔ)充有TGF(3超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)細(xì)胞，從而所述hSC被促使分化成RPE細(xì)胞；(c)從所述細(xì)胞培養(yǎng)物收獲RPE細(xì)胞；和(c)將所述已分化的RPE細(xì)胞移植到所述受試者的眼睛中。細(xì)胞的收獲可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法來(lái)進(jìn)行。非限制性的實(shí)施例包括機(jī)械解剖和用木瓜蛋白酶解離。還可以應(yīng)用本領(lǐng)域已知的其他方法。hSC衍生的RPE細(xì)胞可以移植到受試者的眼睛中的各種目標(biāo)位置。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，RPE細(xì)胞的移植將到眼睛的視網(wǎng)膜下間隙，其是RPE的正常的解剖學(xué)位置(在光受體外部片段和脈絡(luò)膜之間)。此外，取決于細(xì)胞的遷移能力和/或主動(dòng)旁泌效應(yīng)，可以考慮移植到其他的眼睛區(qū)室，包括玻璃體間隙、外視網(wǎng)膜的內(nèi)部、視網(wǎng)膜外周部和月永絡(luò)月莫之內(nèi)。進(jìn)一步的，移植可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)進(jìn)行。進(jìn)行RPE移才直的方法在例如美國(guó)專(zhuān)利NO.5,962,027、6,045,791和5,941,250中，以及在EyeGraefesArchClinExpOpthalmolMarch1997;235(3):49-58;BiochemBiophysResCommimFeb.24,2000;268(3):842-6;OpthalmicSurgFebruary1991;22(2):102-8中描述了。進(jìn)行角膜移植的方法在例如美國(guó)專(zhuān)利NO.5,755,785中和在Eye1995;9(Pt6Su):6-12;CurrOpinOpthalmolAugust1992;3(4):473-81;OphthalmicSurgLasersApril1998;29(4):305-8;OphthalmologyApril2000;107(4):719-24;andJpnJOphthalmolNovember-December1999;43(6):502-8中描述了。如果要主要利用旁泌效應(yīng)，細(xì)胞還可以被遞送并維持在用半滲透容器密封的眼中，其將降低細(xì)胞對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的暴露(NeurotechUSACNTFdeliverysystem;PNASMarch7，2006vol.103(10)3896-3901)。才艮據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，移才直通過(guò)parspana玻璃體切除手術(shù)，隨后通過(guò)小的視網(wǎng)膜開(kāi)口遞送細(xì)胞入視網(wǎng)膜下間隙，或通過(guò)直接注射來(lái)進(jìn)行。做為選擇，細(xì)胞可以通過(guò)穿鞏膜的、穿脈絡(luò)膜的方法遞送到視網(wǎng)膜下間隙。此外，可以進(jìn)行直接穿鞏膜注射到玻璃體間隙中，或遞送29到接近睫狀體的前視網(wǎng)膜外周部。RPE細(xì)胞可以以各種形式移植。例如，RPE細(xì)胞可以以細(xì)胞懸浮液的形式導(dǎo)入目標(biāo)位點(diǎn)，或附著到基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)或基底如可生物降解的聚合物或其組合上。RPE細(xì)胞還可以與其他:枧網(wǎng)膜細(xì)胞，例如與光受體一起移才直(共移才直)。因而，本發(fā)明還涉及包含通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的hSC衍生的RPE細(xì)胞的組合物。所述組合物優(yōu)選的適合于移植到眼睛內(nèi)。通過(guò)將本發(fā)明的方法獲得的RPE細(xì)胞導(dǎo)入受試者的眼睛內(nèi)，可以治療或預(yù)防各種眼睛狀況。所述眼晴狀況可以包括一般地與視網(wǎng)膜功能障礙、視網(wǎng)膜損傷和/或視網(wǎng)膜色素上皮的喪失相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病或病癥?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明治療的狀況的非限制性列表包括色素性視網(wǎng)膜炎；先天性利伯氏黑矇、遺傳或獲得性黃斑變性、年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)、Best病、視網(wǎng)膜剝離、回旋形萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、模式營(yíng)養(yǎng)不良(patterndystrophy)以及RPE的其他營(yíng)養(yǎng)不良、Stargardt病、由于光、激光、炎癥、感染、放射、新血管或創(chuàng)傷性損傷的任一項(xiàng)所引起的損傷的RPE和視網(wǎng)膜損傷。不受到理論的限制，移植的RPE細(xì)胞可以通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮它們的治療效果。一種機(jī)制是促進(jìn)退化的光受體或視網(wǎng)膜內(nèi)的其他細(xì)胞的存活的營(yíng)養(yǎng)支持性效應(yīng)。通過(guò)本公開(kāi)的方法、以及在存在TGFP超家族成員的情況下來(lái)自hSC的RPE細(xì)胞能夠潛在地通過(guò)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)保護(hù)鄰近于它們的光受體。，移植的RPE細(xì)胞還可以通過(guò)補(bǔ)充功能失常和/或退化的宿主RPE細(xì)胞的再生機(jī)制來(lái)發(fā)揮它們的效果。通過(guò)本公開(kāi)的方法和在存在TGF卩超家族成員的情況下衍生于hSC的RPE細(xì)胞可以補(bǔ)充功能失常的宿主RPE。移植的細(xì)胞是成熟的，并具有吞噬包括視紫紅質(zhì)的光受體的脫落的外部片段的功能能力。如上所述，通過(guò)本公開(kāi)的方法和在存在TGFp超家族的成員的情況下衍生于hSC的RPE細(xì)胞是成熟的，并因而它們?cè)谝浦埠蟛辉隗w內(nèi)增殖。因此，通過(guò)本公開(kāi)的方法衍生于hSC的RPE細(xì)胞對(duì)于移植療法是更安全的，帶有發(fā)育成畸胎瘤腫瘤或增殖性前體細(xì)胞的腫瘤的降低的風(fēng)險(xiǎn)。如在此寸吏用的，術(shù)i吾"治療(treating)，(treatment)"是指本發(fā)明的hSC衍生的RPE細(xì)胞對(duì)受試者的眼睛狀況的治療性以及預(yù)防性效果，所述效果一般包括，改善與所述狀況相關(guān)的癥狀、降低狀況的嚴(yán)重度或治愈狀況，更具體地，所述效果可以包括逆轉(zhuǎn)對(duì)治療的受試者的視網(wǎng)膜和RPE的損傷、改善受試者的視網(wǎng)膜的功能、重建受試者的視網(wǎng)膜和RPE，其通過(guò)替換和/或支持衰竭的宿主視網(wǎng)膜和RPE細(xì)胞，直接地或通過(guò)旁泌效果，以及通過(guò)減弱、抑制或停止作為所述狀況的結(jié)果對(duì)受試者的視網(wǎng)膜造成的損傷而展現(xiàn)的預(yù)防性效果。如在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用的，形式"一，，和"該"包括單數(shù)和復(fù)數(shù)的指代物，除非上下文明確地相反指示。例如，術(shù)語(yǔ)"一種生長(zhǎng)因子"包括一種或更多種生長(zhǎng)因子，術(shù)語(yǔ)"生長(zhǎng)因子"包括一種生長(zhǎng)因子和超過(guò)一種生長(zhǎng)因子。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"或"是指兩種或更多種所列選擇的一種或組合。此外，使用隨后是由術(shù)語(yǔ)"和"分隔的一系列選項(xiàng)的用語(yǔ)"選自"包括兩種或更多種所列選項(xiàng)的一種或組合。進(jìn)一步，如在此使用的，術(shù)語(yǔ)"包含"意圖指所述方法或組合物包括所述的元素，但不排除其他的。類(lèi)似地，"基本上由……組成"被用于定義方法和系統(tǒng)，其包括所敘述的元素但是排除其他元素，所述其他元素可能對(duì)于本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)的功能性具有本質(zhì)的重要性。例如，基本上由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基添加物和飼養(yǎng)細(xì)胞組成的培養(yǎng)系統(tǒng)將不包括、或?qū)H包括無(wú)關(guān)緊要的數(shù)量(該數(shù)量將對(duì)培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞增殖和分化具有無(wú)關(guān)緊要的影響)的、對(duì)培養(yǎng)物中的細(xì)胞有影響的其他物質(zhì)。并且，基本上由在此定義的元素組成的組合物將不排除來(lái)自分離和純化方法的痕量染污物。"由……組成"將是指排除超過(guò)痕量的其他元素。這些過(guò)渡術(shù)語(yǔ)的每一個(gè)所定義的實(shí)施方式處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。進(jìn)一步的，所有的數(shù)值，例如濃度或劑量或其范圍，是近似值，其從聲明的值變化(+)或(-)最多達(dá)20%,有時(shí)最多達(dá)10%。要理解的是，即使不一定明確地聲明，所有的數(shù)字符號(hào)之前是術(shù)語(yǔ)"約"。還要理解的是，雖然不一定明確地聲明，在此描述的試劑僅僅是示范性的，它們的等同物是本領(lǐng)域已知的。某些示范性的實(shí)施方式材料和方法HES細(xì)胞培養(yǎng)物通過(guò)慢病毒載體來(lái)改造以持續(xù)表達(dá)eGFP的人類(lèi)ESC(HES1細(xì)胞系)和hESC[GroppM，ItsyksonP，SingerO,Ben-HurT，ReinhartzE,GalunE，andReubinoffBE.Stablegeneticmodificationofhumanembryonicstemcellsbylentiviralvectors.MolecularTherapy7:281-7(2003)]在KO培養(yǎng)基(KOM)中在人類(lèi)包皮成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，所述KO培養(yǎng)基由86%KO-DMEM(Gibco,Invitrogen，Gaithersburg,MD)、14%KOSR(Gibco)、lmM谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、50單位/ml青霉素(Gibco)、50jug/ml鏈霉素、(Gibco)和4ng/mlbFGF(R&DSystems,Inc.,Minneapolis,MN)組成。hES細(xì)胞每周用IV型膠原酶(1mg/ml;Gibco)傳代并平板接種在新鮮的飼養(yǎng)層上。分化的誘導(dǎo)前一周，通過(guò)用補(bǔ)充有0.05%EDTA(BiologicalIndustries,BeitHaemek，Israel)的無(wú)Ca/Mg++PBS解離成近乎單細(xì)胞懸浮液來(lái)傳代細(xì)胞，并在祠養(yǎng)物上重新平板接種。懸浮培養(yǎng)物中的EB形成在如上述將分離成單細(xì)^^的hES細(xì)l包平才反4妄種后六-八天；通過(guò)用IV型膠原酶處理將它們乂人飼養(yǎng)物上除下。在存在或缺少10mM煙酰胺(NA)(Sigma,St.Louis,MO,USA)的情況下，在用0.1%低熔點(diǎn)溫度瓊脂糖預(yù)先包被的細(xì)菌學(xué)平皿內(nèi)，在KO培養(yǎng)基(KOM)中，團(tuán)塊被懸浮培養(yǎng)各個(gè)時(shí)間最多到12周，所述KO培養(yǎng)基由86。/。KO-DMEM、14%KOSR、lmM谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、50單位/ml青霉素和50)ag/ml鏈霉素組成。在某些實(shí)驗(yàn)中，使用的培養(yǎng)基是補(bǔ)充有N2添加物(1:100)(Gibco)的NeurobasalTM培養(yǎng)基(Gibco)(NN培養(yǎng)基)，其在1周后用補(bǔ)充有B27(1:50)(Gibco)的DMEM/F12(Gibco)替換。在存在TGFP生長(zhǎng)因子或抑制物的情況下hESC分化成為RPE細(xì)胞人類(lèi)ESC被容許在存在煙酰胺(NA)10mM的情況下在如上述的KOM中作為自由漂浮的群集來(lái)分化最多到六周。在第一周或2周的分化之后，培養(yǎng)物補(bǔ)充激活蛋白A20-180ng/ml(PeproTechInc，RockyHill，NJ)、TGF(33(lng/ml;R&DSystemsInc,Minneapolis,MN)、TGF|31(lng/ml隱20ng/ml;R&DSystemsInc)或SB431542(5|aM-50|aM，Sigma)。對(duì)照培養(yǎng)基補(bǔ)充單獨(dú)的NA。在KOM中懸浮的人類(lèi)ESC還在一周后存在或不存在NA的情況下補(bǔ)充骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)拮抗劑頭發(fā)生素(700ng/mlR&DSystemsInc，Minneapolis,MN)，或者在第3和第4周在存在NA的情況下補(bǔ)充FGF|3(20ng/mlPeproTechInc)，并容許作為懸浮的自由漂浮群集分化最多到6周齡。RPE細(xì)胞的擴(kuò)增的描述為了擴(kuò)增RPE細(xì)胞，色素化的群集被輕輕地機(jī)械解離為小塊，在聚-D-賴(lài)氨酸(30-70kDa，10jug/ml)和層粘連蛋白(4jug/ml)上低密度平板接種，并在具有NA的KOM中培養(yǎng)。在這些培養(yǎng)條件下，色素化細(xì)胞失去色素沉著并獲得纖維樣形態(tài)。在進(jìn)一步培養(yǎng)1.5個(gè)月并增殖為高密度培養(yǎng)物之后，細(xì)胞重新獲得RPE細(xì)胞的特征性的多邊形狀形態(tài)和色素沉著。如下所述對(duì)所有培養(yǎng)物進(jìn)行免疫染色和實(shí)時(shí)RT-PCR。群集內(nèi)已分化的細(xì)胞的間接的免疫熒光染色為了表征聚集物內(nèi)細(xì)胞的免疫表型，使用0.04%胰蛋白酶/0.04%EDTA，或用木瓜蛋白酶解離系統(tǒng)(WorthingtonBiochemical,Lakewood，NJ)將培養(yǎng)了2、4、6或8周的群集輕輕地離解，產(chǎn)生的小塊和單細(xì)胞平板接種在單獨(dú)補(bǔ)充有聚-D-賴(lài)氨酸(30-70kDa,10-20lag/ml)上的NA的KO培養(yǎng)基中，或補(bǔ)充有層粘連蛋白(4jag/ml)或纖連蛋白(10-20|ag/mL;全部來(lái)自Sigma,St.Louis,http:〃www.sigmaaldrich.com)的KO培養(yǎng)基中。在2小時(shí)后細(xì)胞用4%多聚曱醛固定，并檢查巢蛋白(1:200)、聚唾液酸NCAM(PSA-NCAM)(1:100)、Musashi(1:200;全部來(lái)自Chemicon，Temecula,來(lái)自CA)、Pax6(DSHB,1:100或Chemicon,1:250)、Otx2(Chemicon,1:200)、MiTF(LabVisionCorporation,Fremont,CA;小鼠IgG，1:50)的表達(dá)。對(duì)于色素化細(xì)胞的富集制品的免疫染色，分化8-10周的漂浮塊內(nèi)的細(xì)胞的色素化(Brown)群集通過(guò)玻璃微量移液管或解剖刀片(No15;Swann-MortonSheffield,Eng)機(jī)械地解剖和分離。富集了色素化細(xì)胞的分離的群集通過(guò)有/沒(méi)有胰蛋白酶(0.025%，PBS中3mMEDTA)消化或木瓜蛋白酶解離(木瓜蛋白酶解離系統(tǒng)；WorthingtonBiochemicalCorporation,Lakewood，NewJersey)的壽乾助的研磨法來(lái)機(jī)械地解離成較小的塊。細(xì)胞的小的群集平板接種在聚-D-賴(lài)氨酸包被的(30-70kDa，10jug/ml;Sigma)和層粘連蛋白包被的(4Mg/ml;Sigma)玻璃蓋玻片上，并在用于hESC群集的懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)另外3-5周。生長(zhǎng)物內(nèi)已分化的細(xì)胞用4%多聚曱醛在室溫下固定30分鐘。對(duì)于用抗細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物抗體的免疫染色，細(xì)胞膜用補(bǔ)充有用于阻斷的正常山羊血清(5%，BiologicalIndustries)的PBS中的0.2%TritonX100(Sigma)滲透化30分鐘。細(xì)胞用以下初級(jí)抗體醉育抗MiTF(LabVisionCorporation,Fremont,CA;小鼠IgG!，1:50);抗RPE65(NovusBiologicals,Littleton,CO;小鼠IgG"1:300);抗斑萎蛋白(NovusBiologicals;小鼠IgG"1:150);抗ZO-1(ZymedLaboratoriesInc.,SanFrancisco，CA;兔多克隆，1:10);抗Ki67(DakoDenemarkA/S;，1:50)和抗CRALBP(由JohnC，Saari，UniversityofWashington,Seattle惠贈(zèng)；兔多克隆，1:100)。細(xì)胞還用鬼筆環(huán)肽(1:200Sigma)孵育。初級(jí)抗體定位通過(guò)使用熒光素異硫氰酸(FITC)綴合的山羊抗小鼠免疫球蛋白(DakoDenmarkA/S;1:20-1:50)、綴合到CyTH3的山羊抗小鼠IgG(1:500)(JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc,WestGrove，PA)、綴合到Cy2的兔抗山羊IgG(1:200;JacksonImmunoResearchLaboratoriesInc)和綴合到熒光素異硫氰酸(FITC)的豬抗兔Ig(Dako;1:50)來(lái)進(jìn)行。通過(guò)RT-PCR和實(shí)時(shí)PCR分析hESC群集從在無(wú)血清條件(傳代后1周)下生長(zhǎng)的、以及有或者沒(méi)有補(bǔ)充TGF(3超家族生長(zhǎng)因子或拮抗劑、在存在或缺少lOmM煙酰胺的情況下培養(yǎng)hESC衍生的群集期間最多到8周的連續(xù)時(shí)點(diǎn)生長(zhǎng)的hESC提耳又總RNA。4吏用TRIzol^式劑(Invitrogen,http:〃www.invitrogen.com)或TRI-試劑(Sigma)分離RNA。才艮據(jù)廠家的i兌明書(shū)(PromegaCorporation,Madison，WI，http:〃www.promega.com)<吏用Moloney鼠白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLVRT)和隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)使用TaqDNA聚合酶(GIBCO-BRL)用標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行。擴(kuò)增條件如下在94。C變性15秒，在55。C退火30秒，在72。C延伸45秒。取決于特定的mRNA豐度，循環(huán)數(shù)在18到40之間變動(dòng)。用于鑒定人類(lèi)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(正向和反向5，-3，)的引物人類(lèi)序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度如下(SEQIDNO:1-12):MiTF-A(GAGCCATGCAGTCCGAAT，GACATGGCAAGCTCAGGACT;486bp);RPE65(GCTGCTGGAAAGGATTTGAG,CAGGCTCCAGCCAGATAGTC;231bp);斑萎蛋白(GAATTTGCAGGTGTCCCTGT,ATCCTCCTCGTCCTCCTGAT;214bp);CRALBP(AGCTGCTGGAGAATGAGGAA，CAAGAAGGGCTTGACCACAT;218bp)MERTK(AAGTGATGTGTGGGCATTTG,TCTAAGGGATCGGTTCTCCA,189bp);ACTR1A(AATGTTGCCGTGAAGATCTTC,CTGAGAACCATCTGTTGGGTA;699bp);ACTRffi(CACGTGTGAGACAGATGGG,GGCGGTTGTGATAGACACG;346bp);ACTRIIA(AACCATGGCTAGAGGATTGGC,CTTTCACCTACACATCCAGCTG;551bp);ACTRUB(CACCATCGAGCTCGTGAAG,GAGCCCTTGTCATGGAAGG;611bp);激活蛋白A(CTTGAAGAAGAGACCCGAT;CTTCTGCACGCTCCACCAC;262bp);P-肌動(dòng)蛋白(TTCACCACCACGGCCGAGC,TCTCCTTCTGCATCCTGTCG;351bp);GAPDH(AGCCACATCGCTCAGACACC;GTACTCAGCGCCAGCATCG;301bp).對(duì)于實(shí)時(shí)PCR，使用來(lái)自商業(yè)上可獲得的TaqManRAssays-on-Demand基因表達(dá)產(chǎn)品(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)的TaqMan引物和探針監(jiān)視轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平Oct4,IDHs01895061;Musashi,IDHs01045894;Pax6，IDHs00240871;Six3，IDHs00193667;Rxl,IDHs00429459;ChxlO,IDHs01584048;MiTF-A,IDHsOl115553;MiTF-total,IDHsOl115557;Bestrophin,IDHs00188249;RPE65,IDHs00165642;SoxlO,IDHs00366918;Crx,IDHs00230899。使用ABIPrism7000HT和ABIPrism7900HT序列4企測(cè)系統(tǒng)和TaqMan⑧通用PCR主混合物(AppliedBiosystems)根據(jù)廠家的方案進(jìn)行定量PCR分析。持家基因卩-葡糖醛酸酶(GusB，分析IDHs99999908)被選作實(shí)時(shí)RT-PCR定量分析中標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)部參考物，每種基因的相對(duì)表達(dá)水平顯示為當(dāng)0天(或未處理的細(xì)胞)的表達(dá)水平被設(shè)為1時(shí)的相對(duì)值。擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)廠家的方案(AppliedBiosystems)—式兩份或三份地進(jìn)行。透射電子顯微鏡術(shù)和膠乳珠子的吞噬作用人類(lèi)ESC衍生的群集在KOM中懸浮培養(yǎng)。然后機(jī)械地分離色素化區(qū)域，并加工用于透射電子顯微鏡術(shù)。細(xì)胞用2%戊二醛和4%甲醛在0.1M二甲胂酸鹽緩沖液pH7.4中固定。在O.IM二甲胂酸鹽緩沖液中三次洗滌之后，組織用1%四氧化鋨和1.5%鐵氰化鉀后固定，用提高濃度的乙醇脫水，包埋在Agar100樹(shù)脂中。通過(guò)LKBultrotome3切割的超薄切片用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。用裝備有MegaviewIICCD攝像機(jī)和Analysis版本3.0軟件(SoftImagingSystem,http:〃www.soft-imaging.net)Tecnai12電子顯微鏡(Phillips,EindhoventheNetherlandshttp:〃www.philips.com)拍才聶顯孩吏照片。為了檢查吞噬能力，色素化群集與濃度l.Ox109個(gè)珠子/ml的1jum膠乳珠子(PolysciencesInc.,Warrington,PA)在37。C孵育18小時(shí)。色素化群集然后用PBS+洗滌，使用木瓜蛋白酶解離系統(tǒng)解離成單細(xì)胞或小塊并平板接種在聚-D-賴(lài)氨酸上。在固定之后，細(xì)胞膜用紅色焚光染料PKH(Sigma)染色。使用共焦顯微鏡(OlympusFluoviewFV1000)分析吞噬作用。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)分析來(lái)測(cè)定有或者沒(méi)有煙酰胺補(bǔ)充分化的hESC衍生的群集內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)的PSA-NCAM和TRA-1-60陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。群集用0.04%胰蛋白酶/0.04%EDTA離解。單細(xì)胞然后用抗-PAS-NCAM或抗-Tra-l-60抗體(都來(lái)自Chemicon;1:100)染色，用綴合到FITC的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Dako;1:100)沖全測(cè)，然后用細(xì)胞生存力染泮牛石典化丙4定(propidiumiodide)(0.005mg/ml;Sigma)復(fù)染。對(duì)照細(xì)胞僅與第二抗體孵育。細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)性使用CellQuest4欠4牛用FACScalibur(BectonDickinsonImmunocytometrySystems)分析。hESC衍生的已分化的RPE細(xì)胞的玻璃體內(nèi)和視網(wǎng)膜下的移植對(duì)于眼內(nèi)移植，被工程化來(lái)表達(dá)eGFP的hESC[如早先在Groppetal.，Stablegeneticmodificationofhumanembryonicstemcellsbylentiviralvectors.MolecularTherapy2003;7:281匿7.中描述的]被用于產(chǎn)生如上所述的培養(yǎng)物中的RPE細(xì)胞。簡(jiǎn)要地，在存在單獨(dú)的NA的情況下或存在補(bǔ)充有激活蛋白A的NA的情況下分化6-8周之后，富集了色素化細(xì)胞的群集通過(guò)解剖來(lái)機(jī)械地分離。為了容許通過(guò)小口徑玻璃毛細(xì)管的注射，團(tuán)塊通過(guò)木瓜蛋白酶(PapainDissociationSystem;WorthingtonBiochemicalCorporation,Lakewood，NewJersey)在37°C消化30分鐘隨后研磨來(lái)進(jìn)一步解離成細(xì)胞的較小的群集。十五只成年白化大鼠(體重230-250g)和超過(guò)100只1-3周遠(yuǎn)系36雜交的營(yíng)養(yǎng)不良的RCS大鼠被用于眼內(nèi)的移植。在RCS大鼠中，Mertk基因中的突變引起RPE功能障礙，這導(dǎo)致在生命的前幾個(gè)月中的視網(wǎng)膜退化。所有動(dòng)物試驗(yàn)根據(jù)眼科和視覺(jué)研究中使用動(dòng)物的ARVO聲明來(lái)進(jìn)行，由Hebrew大學(xué)Hadassah醫(yī)科學(xué)校的動(dòng)物研究機(jī)構(gòu)委員會(huì)批準(zhǔn)。對(duì)于移植(以及對(duì)于電視網(wǎng)膜圖像記錄)，動(dòng)物用氯胺酮HC1(Ketalar,ParkeDavis，UK;100mg/kg)麻醉，與松弛試劑賽4立嗦、(2.0mg/kg)—起腹腔內(nèi)地注射。施用局部麻醉滴劑(奧布卡因HC10.4%;FischerPharmaceuticals,Israel)。瞳孔用托吡卡胺0.5%(Mydramide，F(xiàn)isherPharmaceuticals,Israel)和去氧腎上l^素HC12.5%(FisherPharmaceuticals,Israel)擴(kuò)大。在解剖顯樣么鏡(StemiSV11，Zeiss,Germany)的可視化之下，4mL培養(yǎng)基中大約100,000個(gè)細(xì)胞通過(guò)穿鞏膜的、或穿脈絡(luò)膜的方法通過(guò)連接到氣動(dòng)Pico注射器(PLI-100;MedicalSystemCorp.,Greenvale,NY,http:〃www.medicalsystems.com)的玻璃毛細(xì)管注射到玻璃體中或一見(jiàn)網(wǎng)膜下間隙中，未注射的同類(lèi)的眼睛充當(dāng)一種類(lèi)型的對(duì)照。作為另外的對(duì)照，眼睛用鹽水(氯化鈉注射液BP,0.9%，B.BraunMelsungenAG,Melsungen，Germany)注射。在注射期間和之后，沒(méi)有觀察到脈絡(luò)膜的出血。使用加熱燈在整個(gè)操作和操作之后使動(dòng)物保持溫暖。在移植之后，所有動(dòng)物在它們的飲用水中以210mg/l的濃度接受免疫抑制試劑環(huán)孢霉素A(Sandimmune,NovartisPharmaAG，Basel,Switzerland)。移植的細(xì)胞的體內(nèi)和離體成像為了監(jiān)視在體內(nèi)移植的細(xì)胞的存活和位置，麻醉的動(dòng)物使用彩色眼底照相機(jī)(Zeiss,Germany)成像，使用掃描激光沖企眼鏡(HeidelbergHRA,Germany)上的熒光素濾波器檢測(cè)GFP表達(dá)細(xì)胞的熒光。在某些眼睛中，GFP陽(yáng)性移植物的位置還使用熒光顯微鏡(Canon，Japan)在眼杯制品中離體測(cè)定。在hESC衍生的RPE細(xì)胞的眼內(nèi)移植之后宿主視網(wǎng)膜功能的評(píng)定移植后四到六周，通過(guò)視網(wǎng)膜電描記術(shù)(ERG)在移植的和對(duì)照的RCS大鼠眼睛中評(píng)定視網(wǎng)膜功能。在暗適應(yīng)過(guò)夜之后記錄全視野ERG。動(dòng)物在暗淡紅光中用氯胺酮和賽拉。秦麻痹，瞳孔用托吡卡胺和37苯腎上腺素?cái)U(kuò)大。單極的大鼠ERG晶狀體電極(lenselectrode)(MedicalWorkshop,Amsterdam,Netherlands)在另外的局部麻醉之后置于每只眼上，參考電極和接地電極分別置于舌頭和尾部。商售的計(jì)算機(jī)化ERG系統(tǒng)(LKC技術(shù)，UTAS3000)被用于記錄對(duì)使用置于Ganzfeld碗上氣光頻閃器閃光(photostrobeflash)(Grass,PS-22)產(chǎn)生的全視野刺激的視網(wǎng)膜反應(yīng)。在暗視條件下暗淡的藍(lán)色閃光被用于SI發(fā)主要視桿驅(qū)動(dòng)的反應(yīng)。在暗適應(yīng)狀態(tài)下藍(lán)色的更強(qiáng)刺激強(qiáng)度和白色閃光下，記錄混合的視錐-視桿反應(yīng)。在燈光適應(yīng)的(適應(yīng)光的)條件下，使用對(duì)視桿抑制性34cd/n^白色背景的白色閃光，產(chǎn)生1Hz和16Hz視錐反應(yīng)。信號(hào)在0.3-500Hz之間過(guò)濾，使用信號(hào)平均。移植的眼睛的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的評(píng)估在移植后4-8周處死動(dòng)物，剜出眼睛用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的檢驗(yàn)。在Davidson溶液中固定之后，眼睛包埋入石蠟中，以4nm連續(xù)切片來(lái)切片。每五個(gè)切片用蘇木素和曙紅染色用于組織形態(tài)學(xué)評(píng)估和定量。對(duì)于間接免疫熒光法研究，為了表征移植的細(xì)胞的分化的狀態(tài)，樣本在二曱苯中去石蠟，并在梯度酒精中脫水，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS,pH7.4)漂洗，在1l(TC用10mM檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)孵育4分鐘。在用PBS洗滌之后，樣本用含有1。/o牛血清白蛋白(BSA)、0.1%TritonXI00(Sigma-Aldrich)和3%正常山羊或正常驢血清的PBS溶液在室溫下阻斷l(xiāng)小時(shí)。隨后，切片在濕潤(rùn)的房間中與以下初級(jí)抗體的合適的組合孵育1小時(shí)抗綠色熒光蛋白質(zhì)(抗-GFP)、其與熒光素(FITC)或羅丹明(TRITC)綴合(SantaCruzBiotechnology,Inc,SantaCruz,CA;小鼠單克隆的，1:100);抗RPE65(NovusBiologicals,Littleton,CO;小鼠IgG"1:100);抗斑萎蛋白(NovusBiologicals;小鼠IgG"1:100);抗ZO-1(ZymedLaboratoriesInc.，SanFrancisco,CA;兔多克隆的，1:100);和抗視紫紅質(zhì)(SantaCruzBiotechnology,Inc，SantaCruz,CA;兔多克隆的，1:100)。在PBS中洗滌之后，通過(guò)使用CyTM2綴合的山羊抗兔IgG(1:200)、CyTM2綴合的山羊抗小鼠IgG(1:200)、CyTM3綴合的山羊抗兔IgG(1:200)、CyTM2綴合的驢抗小鼠IgG(1:200)、CyTM5綴合的驢抗兔IgG(1:200;全部來(lái)自JacksonImmunoResearchLaboratories,Inc，WestGrove,PA)進(jìn)行初級(jí)抗體定位。用含有4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的封固劑38(VectorLaboratories,Burlingame,CA)或用石典4匕丙《定1jug/ml(BioLegend，SanDiego，CA)復(fù)染核。為了測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的特有DP70數(shù)字照相機(jī)(Olympus,Japan)的OlympusBX41顯微鏡被用于熒光和光學(xué)顯微成像。共焦圖像在圍繞1X70倒置顯微鏡構(gòu)造的OlympusFluoview300(FV300)共焦顯微鏡(Olympus，Japan)上采集。488-nmAr、543HeNe-綠色和633HeNe紅色激光器與Nomarski光學(xué)器件組合使用。在接近RPE移植物處光受體層拯救的定量為了定量hESC衍生的RPE移植對(duì)于退化的宿主視網(wǎng)膜的效力，獲得蘇木素和曙紅染色的切片的高分辨率顯微鏡圖像，使用Photoshop軟件(Adobe,USA)構(gòu)建視網(wǎng)膜的全長(zhǎng)的剪輯畫(huà)面?？傄暰W(wǎng)膜厚度、外核(光受體)層的厚度以及內(nèi)部和外部片段層的厚度使用J-圖像程序(NIH)在接近hESC衍生的RPE細(xì)胞的視網(wǎng)膜下移植物處測(cè)量。這些與遠(yuǎn)離移植物的視網(wǎng)膜相應(yīng)的對(duì)側(cè)中獲得的測(cè)量值相比。由于在RCS大鼠中的退化過(guò)程是位置依賴(lài)性的，在與睫狀體相等距離的區(qū)域中測(cè)量厚度。在每個(gè)區(qū)域中，至少三個(gè)等距離的測(cè)量值被平均。結(jié)果已分化的RPE的表征浮的群集來(lái)培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)。在這些培養(yǎng)條件下，高度濃i色素化細(xì)胞的限定的區(qū)域在分化中的群集內(nèi)發(fā)育，如附圖3A中所示。這些色素化區(qū)域在4周的分化后出現(xiàn)，在8周后72.9±2.5%的群集具有色素化區(qū)域。在沒(méi)有NA補(bǔ)充的情況下4周的分化后沒(méi)有觀察到色素化區(qū)域，'在這些條件下，僅13.1±4.8%在8周后發(fā)育為色素化區(qū)域(附圖8A和8B)。因而，與自發(fā)地分化中的hESC群集相比，NA處理增加/促進(jìn)了hESC群集內(nèi)向色素化細(xì)胞的分化。.在存在NIC的情況下分化了8周的群集內(nèi)，5.7±1.0%的細(xì)胞是色素化的，5.4±1.1%表達(dá)早期RPE標(biāo)志物MiTF,大多數(shù)情況下MiTF的表達(dá)與色素沉著相關(guān)(附圖8C)。已分化的hESC的部分離解和平板接種的群集，與其他類(lèi)型的已分化的細(xì)胞一同，發(fā)育成為由色素化細(xì)胞的單層組成的菌落，如暗視野顯微照片(附圖3D)和相差圖像(附圖3E)所示。這些菌落內(nèi)的細(xì)胞呈現(xiàn)了多邊形的形狀，形成了細(xì)胞的"鵝卵石"樣片層，在它們之間具有緊密連接(附圖3E)，具有天然RPE細(xì)胞的高度特征性的特征。細(xì)胞內(nèi)的F-肌動(dòng)蛋白分布接近它們的膜，與真正的RPE細(xì)胞相像，如通過(guò)用鬼筆環(huán)肽染色所展現(xiàn)的(附圖10A)。色素化的RPE細(xì)胞共表達(dá)RPE標(biāo)志物Otx2(附圖3B)和MiTF-A(附圖3B和附圖3F)以及ZO-l(附圖3G)、斑萎蛋白(附圖3H)、RPE65(附圖31)和CRALBP(附圖3J)。在解離、低密度平板接種并培養(yǎng)之后，色素化細(xì)胞失去了色素沉著并獲得了纖維樣的形態(tài)，如通過(guò)相差成像所示的(附圖3K和IOB)。在進(jìn)一步延長(zhǎng)的培養(yǎng)和增殖為高密度培養(yǎng)物之后，細(xì)胞重新獲得RPE細(xì)胞的多邊形形狀形態(tài)和色素沉著(附圖3L和10C)。電子顯微鏡檢查(EM)分析展現(xiàn)了，hESC衍生的色素化細(xì)胞具有天然RPE細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，包括它們的頂面上的微絨毛(附圖10D)和它們的基面上的基膜(附圖10E)。細(xì)胞含有黑色素微粒(附圖10D)并且通過(guò)緊密連接來(lái)附著(附圖10F)。RPE細(xì)胞的最重要的功能之一是光受體脫落的外部片段的吞噬作用。為了檢查hESC衍生的色素化細(xì)胞是否具有吞噬能力，它們與1ium熒光膠乳珠子孵育。三幅共焦熒光圖像表現(xiàn)了連續(xù)的Z軸切片(附圖10H-10J)。共焦顯微鏡分析顯示了，推定的RPE細(xì)胞能夠吞噬焚光珠子(附圖10G-10J)。煙酰胺的分化誘導(dǎo)效應(yīng)hESC朝向RPE結(jié)局的分化通過(guò)將它們?cè)谟谢蛘邲](méi)有NA的KOM中作為自由漂浮的群集培養(yǎng)來(lái)檢查(沒(méi)有提供自發(fā)地分化中的群集作為對(duì)照)。在6周的分化之后，RPE細(xì)J包的標(biāo)志物MiTF-A和RPE65的表達(dá)水平在存在NA的情況下顯著沖是高，如通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR所測(cè)定的(分別地，附圖1A和1B)。MiTF-A的表達(dá)在存在NA的情況下幾乎提高了兩倍，而RPE65的表達(dá)提高了幾乎30倍。由于大多數(shù)色素化細(xì)胞共表達(dá)MITF-A(附圖8C)，看來(lái)在存在NA的情況下，在每個(gè)色素化細(xì)胞的RPE65表達(dá)水平方面存在顯著的和突出的提高。因而，除了它朝向RPE結(jié)局的誘導(dǎo)效應(yīng)之外，NA還促進(jìn)RPE細(xì)胞的成熟，并對(duì)細(xì)胞的表型有影響。在2到6周之間連續(xù)的時(shí)點(diǎn)的Q-PCR分析顯示了在存在NA的情況下MiTF-A和RPE65表達(dá)水平(分別地，附圖1C和ID)方面的提高。標(biāo)志物的表達(dá)在四周的分化之后被增量調(diào)節(jié)，在接下來(lái)的四周期間表達(dá)的水平繼續(xù)提高(最后兩周未顯示)。通過(guò)在平板接種的、色素化群集中細(xì)胞的RT-PCR,顯示了RPE標(biāo)志物斑萎蛋白、CRALBP和Mertk的類(lèi)似提高的表達(dá)(附圖1E)。為了發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞的體外發(fā)育是否重演RPE在體內(nèi)的關(guān)鍵發(fā)育步驟，進(jìn)行了時(shí)程實(shí)驗(yàn)，包括分析RPE發(fā)育期間hESC群集內(nèi)關(guān)鍵標(biāo)志物的表達(dá)。在存在或缺少NA的情況下的群集分化通過(guò)未分化的hESC的標(biāo)志物的表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR、早期神經(jīng)分化、視網(wǎng)膜和RPE發(fā)育來(lái)分析(附圖9A-9L)。首先展現(xiàn)了未分化的hESC的標(biāo)志物Oct4的表達(dá)(附圖9A)在存在NA的情況下的分化期間更快速地的下降。一致地，F(xiàn)ACS分析展現(xiàn)了，未分化細(xì)胞的表面膜標(biāo)志物TRA-1-60的表達(dá)在NA處理的樣品中也更快速地降低(附圖9M)。因而，在存在NA的情況下的分化可以用于從培養(yǎng)物中消除未分化的細(xì)胞，并且可以幫助避免移植后的畸胎瘤胂瘤形成。此外，NA處理增強(qiáng)了早期神經(jīng)分化的過(guò)程。在存在NA的情況下，早期神經(jīng)標(biāo)志物Otx2(附圖9B)、Pax6(附圖9D)和Musashi(附圖9C)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)分別在2、2-6和4-6周的分化后顯著地提高。通過(guò)神經(jīng)前體的標(biāo)志物PSA-NCAM的表達(dá)的FACS分析，在蛋白水平上展現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果(附圖90)。在具有NA的4周分化之后，與對(duì)照群集中14.4±5.9%相比，81.4±6.3%的細(xì)胞表達(dá)PSA-NCAM，間接免疫熒光染色確認(rèn)了，在4周，NA處理的群集內(nèi)大部分細(xì)胞獲得了神經(jīng)表型并表達(dá)PSA-NCAM(74.2±4.1%)、巢蛋白(55.9±10.1%)和Musashi(71.4%;附圖9N)。視網(wǎng)膜特定化和形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因Rxl和Six3(分別為附圖9F和9E)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)在分化后2周展現(xiàn)。NA處理提高了這些基因的表達(dá)。在存在NA的情況下，早期RPE標(biāo)志物MiTFA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)在4周的分化后被誘導(dǎo)(附圖9H)。更為成熟的RPE的標(biāo)志物斑萎蛋白和RPE65的表達(dá)分別在4周和8周之后被主要地增量調(diào)節(jié)(分別為附圖9J和91)。與作為對(duì)照的自發(fā)地分化中的hESC群集相比，在NA處理的培養(yǎng)物中，這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)也更高(附圖9I和9J)。RPE65的表達(dá)增加超過(guò)100倍，進(jìn)一步確認(rèn)了除了誘導(dǎo)效應(yīng)之外，NA還對(duì)細(xì)胞的表型有影響。為了排除所獲得的色素化細(xì)胞不是神經(jīng)脊衍生的黑色素細(xì)胞，展現(xiàn)了Soxl0的表達(dá)，其是這些細(xì)胞的發(fā)育標(biāo)志物，與M51黑素瘤細(xì)胞系的對(duì)照細(xì)胞相比是低的，并且不取決于NA補(bǔ)充。因而所述培養(yǎng)物不由黑色素細(xì)胞組成。因而，斷定的是，NA促進(jìn)了朝向RPE結(jié)局的分化的誘導(dǎo)。NA處理還提高了Chxl0的表達(dá)，其調(diào)節(jié)神經(jīng)視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜祖代和光受體祖代標(biāo)志物Crx的增殖(附圖9K)?？傊?，發(fā)明人斷定的是，hESC群集內(nèi)的RPE分化過(guò)程經(jīng)歷了與真正的體內(nèi)RPE發(fā)育相似的步驟，并且^皮NA增加。此外，NA對(duì)所獲得的RPE細(xì)胞的表型有影響。這些細(xì)胞不同于在自發(fā)的分化后獲得的RPE細(xì)胞，并且以顯著更高的水平表達(dá)成熟RPE細(xì)胞的標(biāo)志物。NA顯示了與培養(yǎng)基無(wú)關(guān)的誘導(dǎo)效應(yīng)在KO培養(yǎng)基和NN/DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)12周的已分化的細(xì)胞中，NA補(bǔ)充提高了色素沉著，如分化中的hESC的群集的暗視野顯孩i照片所示(附圖2A-2D)。在一周后進(jìn)一步^皮DMEM/F12-B27(NN/DMEM)替換的NN培養(yǎng)基中，與KO相比，在存在NA的情況下，群集總數(shù)中色素化hESC群集的百分比是更高的，而相對(duì)于KO培養(yǎng)基中培養(yǎng)的群集它們的大小和總?cè)后w數(shù)量是較小的。RT-PCR分析顯示了NA補(bǔ)充l是高了MiTF-A的表達(dá)，在KOM中大約3倍，在NN/DMEM培養(yǎng)基中大約2.5倍(附圖2E)。補(bǔ)充N(xiāo)A與沒(méi)有NA相比，RPE65的表達(dá)在KOM中是近似加倍的，在NN/DMEM培養(yǎng)基中提高幾乎6倍(附圖2F)。因而，NA的分化誘導(dǎo)效應(yīng)在已分化的RPE細(xì)胞中顯示了，與在其中培養(yǎng)hESC并發(fā)生分化的培養(yǎng)基無(wú)關(guān)。TGFp超家族的成員對(duì)SC分化的效力首先分析的是在2周齡群集中激活蛋白受體以及激活蛋白A的表達(dá)。在這個(gè)時(shí)點(diǎn)進(jìn)行分析，因?yàn)樵缙谘劬^(qū)域(eyefield)標(biāo)志物的表達(dá)在這個(gè)時(shí)間出現(xiàn)，因而分化中的細(xì)胞可能處于與早期視泡平行的發(fā)育階段。展現(xiàn)的是，與細(xì)胞沒(méi)有NA的情況下分化時(shí)缺乏或較少的表達(dá)相比，受體ACTRIB和ACTRIIB的表達(dá)在存在NA的情況下是高的(附圖11G)。因而NA存在時(shí)對(duì)細(xì)胞分化的表型有影響。發(fā)現(xiàn)激活蛋白A增強(qiáng)朝向RPE結(jié)局的分化。分化4周的hESC衍生的群集的暗視野顯微照片顯示了在存在激活蛋白的情況下在這個(gè)42早期階段色素化細(xì)胞的出現(xiàn)(附圖11A)。進(jìn)一步顯示了在存在NA的情況下，激活蛋白A顯著地增強(qiáng)hESC朝向RPE細(xì)胞的分化(附圖4A-4B和11B-11C)。包括色素化細(xì)胞的群集的百分比(50.7土6.5vs17.7±3.2),以及來(lái)自細(xì)胞總數(shù)的色素化細(xì)胞的百分比(9.9土1.4vs2.4±1.2)，與補(bǔ)充有NA而沒(méi)有激活蛋白A的對(duì)照培養(yǎng)物相比，在存在激活蛋白A的情況下誘導(dǎo)分化時(shí)顯著更高(附圖IIH和III)。這個(gè)結(jié)果用RT-PCR確認(rèn)了，其顯示了激活蛋白A處理顯著地提高(分別超過(guò)五倍和超過(guò)四倍)對(duì)于成熟RPE細(xì)胞特異的標(biāo)志物RPE65(附圖4D)和斑萎蛋白(附圖4E)的表達(dá)。此外，在存在激活蛋白A的情況下發(fā)育的色素化細(xì)胞的群集的形態(tài)學(xué)特征是不同的。它們的色素沉著是更暗色的，它們顯示了與圍繞的非色素化的細(xì)胞的非常清楚的界限(附圖4B)。在RPE發(fā)育期間較早出現(xiàn)的標(biāo)志物MiTF-A的表達(dá)不受補(bǔ)充激活蛋白A的影響。因而，作為生長(zhǎng)因子的TGF卩超家族的成員的激活蛋白A增強(qiáng)了hESC向RPE細(xì)胞的分化。激活蛋白抑制物SB431542的補(bǔ)充顯著地降低在這些條件下色素化群集的出現(xiàn)(附圖11E和11H)。在各種濃度下研究了激活蛋白A對(duì)RPE分化的影響。對(duì)于色素化細(xì)胞的百分比和RPE標(biāo)志物斑萎蛋白(附圖11K)和RPE65(附圖11L)的表達(dá)，影響被發(fā)現(xiàn)是劑量依賴(lài)性的，最佳增強(qiáng)效果夸140ng/ml。在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，激活蛋白A在群集已經(jīng)分化2周后添加持續(xù)兩周(第3-4周)，因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)在這個(gè)時(shí)間應(yīng)用對(duì)于增強(qiáng)RPE分化是最佳的?？紤]到觀察結(jié)果，早期眼睛發(fā)育的標(biāo)志物的表達(dá)也在分化的2周后開(kāi)始(附圖9A-9L)，看起來(lái)激活蛋白增強(qiáng)了眼睛和RPE發(fā)育的過(guò)程。此外，由于在存在激活蛋白A的情況下色素化細(xì)胞的百分比提高5-6倍，而成熟RPE細(xì)胞的標(biāo)志物例如斑萎蛋白的表達(dá)提高約10倍，看起來(lái)激活蛋白A除了它的誘導(dǎo)效應(yīng)之外對(duì)細(xì)胞的成熟和表型有影響。這得到在存在激活蛋白A的情況下獲得的色素化細(xì)胞的形態(tài)學(xué)外觀的支持，它們是更暗色的，具有與周?chē)?xì)胞的清晰的界線。2周激活蛋白A處理對(duì)于基因表達(dá)的影響的Q-PCR時(shí)程分析顯示，激活蛋白A顯著地提高視網(wǎng)膜祖代標(biāo)志物Rxl和ChxlO以及RPE標(biāo)志物斑萎蛋白的表達(dá)。在分化的4周，激活蛋白A處理還提高了總MiTF同種型的表達(dá)水平(附圖11M-11P)。激活蛋白A對(duì)視網(wǎng)膜和RPE分化的誘導(dǎo)效果還用TGF卩超家族的其他成員觀察到。使用TGFP3處理分化中的群集顯著地增強(qiáng)MiTF-A的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)水平，MiTF-A在RPE體內(nèi)發(fā)育中起到關(guān)鍵作用(附圖5F)。此外，用TGF|3超家族的另一個(gè)成員TGF卩1處理也顯著地提高帶有色素化細(xì)胞的群集的出現(xiàn)(附圖11D和11H)。相比之下，在存在NA和基礎(chǔ)的FGF(bFGF)、而非來(lái)自TGF卩超家族的因子的情況下的分化消除了色素化細(xì)胞的出現(xiàn)(附圖11F)。此外，顯示的是屬于TGFf3超家族的第二亞族的骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)在hESC的RPE分化中起到作用。如在暗視野顯微照片中所示，在存在BMP拮抗劑頭發(fā)生素的情況下，hESC群集向色素化RPE細(xì)胞的分化被阻斷(附圖5D)。即使當(dāng)培養(yǎng)基也補(bǔ)充有NA時(shí)，向色素化細(xì)胞的分化也被頭發(fā)生素的添加所阻斷(附圖5C)。在RNA水平上，實(shí)時(shí)RT-PCR展現(xiàn)了，在培養(yǎng)基中存在和不存在NA的情況下，頭發(fā)生素都顯著地降低了MiTF-A的表達(dá)(附圖5E)。因而，BMP在誘導(dǎo)hESC向RPE細(xì)胞的分化中起到作用。衍生自hESC的已分化的RPE細(xì)胞可以用于眼內(nèi)的移植被工程化來(lái)表達(dá)eGFP的hESC衍生的RPE細(xì)胞的富集群體首先移植到白化大鼠的玻璃體和視網(wǎng)膜下間隙中，來(lái)便于色素化細(xì)胞的定位。在眼內(nèi)的移植之后，移植的色素化細(xì)胞可以在體內(nèi)容易地鑒定(附圖6A和6B)。在附圖6B顯示的眼睛剜出術(shù)、除去角膜和晶狀體以及分離視網(wǎng)膜之后，視網(wǎng)膜顯示了主移植物和其他分散的色素化細(xì)胞(附圖6C)。在組織切片中，存在著包括也表達(dá)GFP的活的色素化的移植細(xì)胞的移植物(附圖6D-6G)。移植的細(xì)胞可以在玻璃體間隙中、在視網(wǎng)膜中、沿著注射的通道、以及在視網(wǎng)膜下間隙中找到(附圖6H、61、60和6P)。移植的RPE細(xì)胞還從視網(wǎng)膜下的移植物遷移，整合到宿主大鼠的RPE層內(nèi)(附圖6J)。在移植物中，形成了作為RPE細(xì)胞的特征的緊密連接，如在移植的eGFP陽(yáng)性細(xì)胞中緊密連接標(biāo)志物ZO-l的表達(dá)所顯示的(附圖6K-6N)。移植物內(nèi)的細(xì)胞還維持了RPE65、斑萎蛋白和Mi丁F-A的表達(dá)。在移植到RCS大鼠的視網(wǎng)膜下間隙內(nèi)之后hESC衍生的RPE細(xì)胞存活、整合并維持已分化的RPE的特征移植實(shí)驗(yàn)的主體在RCS大鼠中進(jìn)行，其顯現(xiàn)了由于mertk基因中的突變引起的RPE和視網(wǎng)膜退化，以檢查hESC衍生的RPE細(xì)胞的遞送是否調(diào)節(jié)疾病的進(jìn)程。移植的色素化細(xì)胞可以使用標(biāo)準(zhǔn)的眼底成像系統(tǒng)在RCS大鼠的眼睛中容易地體內(nèi)鑒定(附圖12A-12C)。hESC書(shū)亍生的GFP表達(dá)細(xì)胞可以在焚光激發(fā)和使用發(fā)射濾波器時(shí)被看見(jiàn)發(fā)射熒光(附圖12C)。在熒光顯微鏡中離體成像的眼杯制品中(附圖12D-12E),可以看見(jiàn)視網(wǎng)膜下的GFP陽(yáng)性細(xì)胞的大的群集(附圖12D)以及多個(gè)分散的較小的群集(附圖12E)。組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的評(píng)估確認(rèn)了體內(nèi)和離體的宏觀觀察結(jié)果。移植的細(xì)胞存活并整合到視網(wǎng)膜下間隙中，維持了表征并對(duì)于成熟RPE常常是特異的蛋白質(zhì)的表達(dá)(附圖13和14)。重要的是注意到不存在顯著的炎癥或免疫反應(yīng)，并且在超過(guò)100個(gè)移植眼中沒(méi)有觀察到腫瘤或畸胎瘤。蘇木素和曙紅(附圖13A和13B)染色的切片顯示了視網(wǎng)膜下的和偶爾地視網(wǎng)膜內(nèi)位置的移植的hESC衍生的色素化細(xì)胞，其以群集或作為分離的細(xì)胞出現(xiàn)(箭頭)。使用GFP的免疫染色(附圖13C-13F)確認(rèn)了這些細(xì)胞實(shí)際上是hESC衍生的。移植物常常是十分大的和分散的(附圖13C和13E)，共同表達(dá)GFP的色素化細(xì)胞可以明顯地看出(附圖13D和13F)。免疫染色顯示了移植物內(nèi)大量的移植的細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)表征了成熟的、已分化的RPE細(xì)胞(附圖14)。這包括RPE特異性標(biāo)志物RPE65(附圖14A-14E)和斑萎蛋白(附圖14F-14J)的表達(dá)。細(xì)胞還能夠形成緊密連接(附圖14K-140),其是RPE細(xì)胞的重要功能并且對(duì)于維持血液-視網(wǎng)膜屏障是關(guān)鍵的。每一行中最左側(cè)欄顯示了共表達(dá)GFP和相關(guān)標(biāo)志物的移植物的低放大率熒光圖像。在每一排的高放大率共焦圖像顯示了在單個(gè)細(xì)胞水平下色素(通過(guò)Nomarski光學(xué)器件)以及GFP和不同標(biāo)志物的共表達(dá)。hESC衍生的RPE細(xì)胞提供了營(yíng)養(yǎng)不良的RCS大鼠中功能的和結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜拯救在視網(wǎng)膜退化的RCS大鼠模型中，視網(wǎng)膜功能到2-3月齡通常被嚴(yán)重?fù)p害。在結(jié)構(gòu)上，發(fā)生視網(wǎng)膜外核層(ONL)的相應(yīng)的喪失和變薄，它常常在這個(gè)年齡降低到低于1-2排光受體核。與對(duì)照的未處理的或培養(yǎng)基注射的眼睛相比，在用hESC衍生的RPE細(xì)胞移植的眼睛中，電視網(wǎng)膜圖像記錄顯示了視網(wǎng)膜功能的顯著的相對(duì)保存(附圖7和附圖15)。在移植的眼(附圖15A)和它同類(lèi)的對(duì)照眼(附圖15B)中顯示了在暗適應(yīng)(DA)狀態(tài)下對(duì)一系列提高強(qiáng)度的白色閃光的代表性的ERG反應(yīng)。附圖15C顯示了在移植的眼和不同組的對(duì)照眼之間平均幅度方面的顯著的區(qū)別。在最高強(qiáng)度下，在RPE移植的眼睛中平均DAb波幅是283.3±37.5(平均值±SEM;n=13),對(duì)比同類(lèi)的未處理的對(duì)照眼中的158.5±18.1(r產(chǎn)13,p<0.01)和培養(yǎng)基注射的眼中89.9±14.4(n=5,p<0.01)。重要的是注意到，與在沒(méi)有激活蛋白A時(shí)衍生的RPE細(xì)胞的移植后實(shí)現(xiàn)的拯救效果(附圖7)相比，在激活蛋白A處理的RPE細(xì)胞的移植之后存在著視網(wǎng)膜功能的更好的保存的傾向(附圖15)。視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的定性的和定量的評(píng)估證實(shí)了功能性的發(fā)現(xiàn)(附圖16)。與遠(yuǎn)離移植物的區(qū)域相比，在接近視網(wǎng)膜下RPE移植物處，觀察到光受體(ONL)層以及內(nèi)部和外部光受體片段(IS+OS)的相對(duì)保存(兩個(gè)實(shí)施例在附圖16A、16B中顯示)。與遠(yuǎn)離移植物的區(qū)域相比(灰色柱)，在接近hESC衍生的RPE移植物處總體視網(wǎng)膜厚度(附圖16C)以及ONL和IS+OS厚度(附圖16D)顯著地提高(黑色柱，平均土SEM,n=7)。這種類(lèi)型的結(jié)構(gòu)拯救僅在接近視網(wǎng)膜下和深部的視網(wǎng)膜內(nèi)移植物處觀察到，而當(dāng)移植物僅<又處于玻璃體內(nèi)時(shí)沒(méi)有觀察到(未顯示)。移植的hESC衍生的激活蛋白A處理的RPE細(xì)胞體內(nèi)攝取視紫紅質(zhì)健康的RPE的一個(gè)關(guān)鍵功能是攝取和再循環(huán)脫落的光受體外部片段，作為光受體的更新過(guò)程的一部分。視網(wǎng)膜下移植的RPE細(xì)胞的共焦圖像顯示了色素、GFP、RPE65和視紫紅質(zhì)在同一單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的共同定位。這表明，移植的細(xì)胞具有成熟RPE的表型并且能夠進(jìn)行脫落的外部片段(其含有視紫紅質(zhì))的攝取。注意到，RCS大鼠的天然的RPE細(xì)胞表達(dá)RPE65(附圖17C,箭頭)，但是不表達(dá)GFP(附圖17D，箭頭)并含有最小數(shù)量的視紫紅質(zhì)(附圖17B、17E)。因而上述結(jié)果提供了證據(jù)，通過(guò)在包含TGF(3超家族的成員的培養(yǎng)系統(tǒng)中、和優(yōu)選的在存在NA的情況下培養(yǎng)所獲得的hSC衍生的RPE細(xì)胞可以在體內(nèi)用于移植，來(lái)提供眼睛中基本上完全功能性的RPE纟田月包。4權(quán)利要求1.一種促進(jìn)hSC定向分化為RPE結(jié)局的方法，所述方法包括a.提供包含hSC的細(xì)胞培養(yǎng)物；b.在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含補(bǔ)充有TGFβ超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從而所述hSC被誘導(dǎo)分化為RPE結(jié)局。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)物包含hSC的自由浮動(dòng)的群集。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所迷hSC包含逸自未分化的hSC、分化中的hSC或其組合的SC群體。4.權(quán)利要求1到3的任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)包括使用包含煙酰胺(NA)的培養(yǎng)系統(tǒng)的第一培養(yǎng)階段，和使用包含所述TGFP超家族的一種或更多種成員的培養(yǎng)系統(tǒng)的第二培養(yǎng)階段。5.權(quán)利要求1到4的任一項(xiàng)的方法，包括在補(bǔ)充有所迷TGF(3超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞培養(yǎng)物之前，在包含補(bǔ)充有NA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)所述hSC至少兩天。6.權(quán)利要求1到3的任一項(xiàng)的方法，其中所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含所述TGFp的一種或更多種成員和NA。7.權(quán)利要求1到6的任一項(xiàng)的方法，其中所述TGF卩超家族的成員選自TGF(31、TGF(32、TGF(33、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、nodal、抗mullerian激素(AMH)、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、或生長(zhǎng)和分化因子(GDF)。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述TGFJ3超家族的成員是TGFIM、TGF卩3或激活蛋白A。9.權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞在懸浮液中培養(yǎng)。10.權(quán)利要求1到9的任一項(xiàng)的方法，其包括在存在TGFp超家族的一種或更多種成員的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞至少一周。11.權(quán)利要求1到10的任一項(xiàng)的方法，其包括收獲RPE細(xì)胞。12.權(quán)利要求1到11的任一項(xiàng)的方法，其用于RPE細(xì)胞的大規(guī)應(yīng)器中進(jìn)行。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述RPE細(xì)胞以單層擴(kuò)增。14.權(quán)利要求12或13的方法，其中所述RPE細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含補(bǔ)充有至少一種細(xì)胞外基質(zhì)成分、血清替代物和NA的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基。15.通過(guò)在存在TGF(3超家族的一種或更多種成員的情況下hSC的定向分化所獲得的RPE細(xì)胞。16.權(quán)利要求15的RPE細(xì)胞，其通過(guò)權(quán)利要求1到14的任一項(xiàng)的方法獲得。17.權(quán)利要求15或16的RPE細(xì)胞，其是終末分化的RPE纟田胞。18.權(quán)利要求15到17的任一項(xiàng)的RPE細(xì)胞，其表達(dá)選自斑萎蛋白和RPE65的一種或更多種標(biāo)志物。19.權(quán)利要求18的RPE細(xì)胞，其中所述一種或更多種標(biāo)志物的表達(dá)與通過(guò)SC的自發(fā)分化所獲得的RPE細(xì)胞中的標(biāo)志物表達(dá)相比被提高。20.權(quán)利要求15到19的任一項(xiàng)的RPE細(xì)胞，其分化自人類(lèi)胚胎干細(xì)月包。21.權(quán)利要求15到20的任一項(xiàng)的RPE細(xì)胞的培養(yǎng)物的用途，其用于治療組合物的制備。22.—種將RPE細(xì)胞移植到受試者的眼睛中的方法，所述方法包括a.提供包含hSC的細(xì)胞培養(yǎng)物；b.在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)所述培養(yǎng)物中的細(xì)胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)包含補(bǔ)充有TGFP超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從而所述hSC^z漆導(dǎo)分化成為RPE細(xì)月包；c.從(b)的所述細(xì)胞培養(yǎng)物收獲RPE細(xì)胞；和d.將所述已分化的RPE細(xì)胞移植到所述受試者的眼睛中。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述hSC是自由浮動(dòng)的群集。-24.權(quán)利要求22或23的方法，其中所述培養(yǎng)包括使用包含NA的培養(yǎng)系統(tǒng)的第一培養(yǎng)階段，和使用包含所述TGFP超家族的一種或更多種成員的培養(yǎng)系統(tǒng)的第二培養(yǎng)階段。25.權(quán)利要求22到24的任一項(xiàng)的方法，其包括在補(bǔ)充有所述TGFP超家族的一種或更多種成員的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞培養(yǎng)物之前，在包含所述補(bǔ)充有NA的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)hSC至少兩天。26，權(quán)利要求22到25的任一項(xiàng)的方法，其中所述TGF(3超家族的成員選自TGF卩1、TGF(32、TGF卩3、激活蛋白A、激活蛋白B、激活蛋白AB、nodal、抗mullerian激素(AMH)、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、或生長(zhǎng)和分化因子(GDF)。27.權(quán)利要求23的方法，其中所述TGFp超家族的成員是TGF卩3或激活蛋白A。28.權(quán)利要求22到27的任一項(xiàng)的方法，包括當(dāng)在懸浮液中時(shí)培養(yǎng)所述細(xì)月包。29,權(quán)利要求22到28的任一項(xiàng)的方法，包括在所述眼睛的^L網(wǎng)膜下間隙處移植所述RPE細(xì)胞。30,權(quán)利要求22到29的任一項(xiàng)的方法，其中所述RPE細(xì)胞在懸浮液中、或作為固定在基質(zhì)或基底上的細(xì)胞單層來(lái)移植。31，一種在受試者中治療或預(yù)防包括視網(wǎng)膜色素上皮的功能障礙、損傷和/或喪失的視網(wǎng)膜疾病或病癥的方法，所述方法包括向所舉受試者眼內(nèi)移植權(quán)利要求15到20的任一項(xiàng)的、或通過(guò)權(quán)利要求1到14的任一項(xiàng)的方法所獲得的REP細(xì)胞。32.權(quán)利要求31的方法，包括將所述RPE細(xì)胞移植到所述眼睛的視網(wǎng)膜下間隙。33.權(quán)利要求31或32的方法，其中所述RPE細(xì)胞當(dāng)在懸浮液中時(shí)、或作為固定在基質(zhì)或基底上的細(xì)胞單層被移植。34.權(quán)利要求31到33的任一項(xiàng)的方法，其中所述-見(jiàn)網(wǎng)膜疾病或病癥是選自色素性視網(wǎng)膜炎、先天性利伯氏黑矇、遺傳或獲得性黃斑變性、年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)、Best病、視網(wǎng)膜剝離、回旋形萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、模式營(yíng)養(yǎng)不良、RPE營(yíng)養(yǎng)不良、Stargardt病、由于光、激光、炎癥、感染、放射、新血管或創(chuàng)傷性損傷的任一項(xiàng)所引起的損傷的RPE和視網(wǎng)膜損傷的至少一種。35，一種治療組合物，其包含適合于向受試者眼內(nèi)移植的劑型的權(quán)利要求15到20的任一項(xiàng)的hSC衍生的RPE細(xì)胞。36.—種治療植入物，其包含權(quán)利要求15到20的任一項(xiàng)的hSC書(shū)f生的RPE細(xì)胞，或權(quán)利要求35的治療組合物，所述RPE細(xì)胞是在懸浮液中，或作為細(xì)胞單層固定在基質(zhì)或基底上。37.權(quán)利要求35的治療組合物或權(quán)利要求36的治療植入物，其用于—見(jiàn)網(wǎng)膜病癥或疾病的治療或預(yù)防。38.權(quán)利要求35的治療組合物或權(quán)利要求36的治療植入物，其中所述視網(wǎng)膜疾病或病癥是選自色素性視網(wǎng)膜炎、先天性利伯氏黑矇、遺傳或獲得性黃斑變性、年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)、Best病、視網(wǎng)膜剝離、回旋形萎縮、無(wú)脈絡(luò)膜、模式營(yíng)養(yǎng)不良、RPE營(yíng)養(yǎng)不良、Stargardt病、由于光、激光、炎癥、感染、放射、新血管或創(chuàng)傷性損傷的任一項(xiàng)所引起的損傷的RPE和視網(wǎng)膜損傷的至少一種。39.權(quán)利要求1到14或31到34的任一項(xiàng)的方法，其中所述hSC是人類(lèi)胚胎干細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及可通過(guò)從干細(xì)胞、特別是人類(lèi)干細(xì)胞定向分化獲得的RPE細(xì)胞。已經(jīng)特別發(fā)現(xiàn)的是，在存在TGF超家族的一種或更多種成員例如激活蛋白A的情況下培養(yǎng)干細(xì)胞誘導(dǎo)定向分化為成熟的和功能性的RPE細(xì)胞。這通過(guò)對(duì)成熟RPE細(xì)胞特異的標(biāo)志物，包括MiTF-A、RPE65或斑萎蛋白的表達(dá)被證明。根據(jù)一個(gè)特定的實(shí)施方式，所述細(xì)胞是在先用煙酰胺(NA)培養(yǎng)的，發(fā)現(xiàn)了這增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)TGF超家族的一種或更多種成員的誘導(dǎo)效應(yīng)的反應(yīng)。本發(fā)明還提供了進(jìn)行定向分化的方法，以及利用產(chǎn)生的RPE細(xì)胞的方法。文檔編號(hào)C12N5/071GK101688178SQ200880020748公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年4月27日優(yōu)先權(quán)日2007年4月18日發(fā)明者A·奧博倫斯基,B·魯比諾夫,E·巴寧,M·伊德?tīng)柹?R·阿爾珀-皮努斯申請(qǐng)人:哈達(dá)錫特醫(yī)學(xué)研究服務(wù)及發(fā)展有限公司