專利名稱：細胞培養(yǎng)容器和細胞培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)容器和細胞培養(yǎng)方法。
背景技術：
將從組織分離的細胞用于試驗、檢查的方法正在成為生物科技相 關領域中不可缺少的方法。廣泛被應用于疾病、病情的診斷，新藥的 探索和藥效的判定或動物檢查、植物檢查、環(huán)境污染物質的試驗等中。
因此，生物科技領域中所使用的細胞種類變得極為多樣化。
經分離的細胞雖然有時可直接用于試驗，但多數(shù)情況下是在培養(yǎng) 皿或試驗管中進行細胞培養(yǎng)。使用該培養(yǎng)細胞來進行各種檢查。用于
細胞培養(yǎng)試驗的細胞培養(yǎng)抹要求與生物體內的試驗即in vivo試驗顯 示相同的藥物敏感性、毒性反應。即，必須可在細胞培養(yǎng)容器的表面， 構建具有規(guī)則性地排列的細胞間的網絡。此處，細胞間的網絡是指細 胞彼此結合而進行相互作用的狀態(tài)，細胞聚集形成細胞塊的形態(tài)或細 胞結合成網孔狀的形態(tài)。另外，因用于細胞培養(yǎng)試驗的細胞培養(yǎng)抹極 其昂貴，因而細胞的生存率和增殖速度的提高受到期待。
上述細胞培養(yǎng)試驗是在相同條件下，改變進行評價的藥物等的 量、濃度等而對其效果進行測定的。因此細胞培養(yǎng)容器的材質、形狀 等也必須相同。作為該細胞培養(yǎng)容器， 一般可使用塑料制培養(yǎng)皿、玻 璃制培養(yǎng)皿、固定于容器內的玻璃板、孔板等。孔板中有6孔、12孔、 48孑L、 96孔的各板或培養(yǎng)皿。對它們而言， 一般板整體的大小幾乎 相同，孔數(shù)越多，則l孔的尺寸越小。該l孔相當于l培養(yǎng)皿。另外 由于最近趨于微量化的趨勢，因而也開始使用更小口徑且包含多個培 養(yǎng)皿的384孔板。這些培養(yǎng)皿的底面為平坦的平板狀，該底面用作培 養(yǎng)面。
但是，在組織細胞的培養(yǎng)中，使用以往的細胞培養(yǎng)容器時，細胞 薄薄地延展而成為無方向性的形態(tài)。并且由于隨機地配置于細胞培養(yǎng) 容器的表面，故細胞間的網絡復雜地交錯形成。因此存在無法再現(xiàn)生 物體內的細胞功能的問題。作為解決上述問題、立體地培養(yǎng)細胞的方法，公開有利用數(shù)百微
米級大小的細胞培養(yǎng)腔室(chamber)來培養(yǎng)細胞的方法(參照專利文 獻1)、利用具備細胞配置部和流路的微圖案來培養(yǎng)細胞的方法(參照 專利文獻2)等。
專利文獻1:日本特開2004-154027號公報
專利文獻2:日本特開2006-191809號公報

發(fā)明內容
專利文獻1和2均設有用于間隔化培養(yǎng)細胞用空間的凸部，但專 利文獻1中，因凸部上面的寬度為細胞的2~3倍左右，故細胞粘附 于其上面，因此存在在上述培養(yǎng)空間內無法有效地構建細胞間的網絡 的問題。而專利文獻2中，雖然凸部的寬度比細胞小，但因凸部的高 度低，故細胞會越過，故存在在上述培養(yǎng)空間內，無法有效地構建細 胞間的網絡的問題。
本發(fā)明為解決此類問題而設，其目的在于提供可在培養(yǎng)空間內有 效地構建細胞間的網絡的細胞培養(yǎng)容器和細胞培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的細胞培養(yǎng)容器為在表面具有多個微容器的細胞培養(yǎng)容 器，其特征在于，形成有間隔相鄰的前述微容器間的凸部，使細胞不 粘附于前述凸部的上面。凸部為多階梯結構，可使細胞不粘附于各階 梯的上面。另夕卜，凸部上面的短邊寬度為0.5~ 15jam,前述凸部的高 度優(yōu)選為前述短邊寬度的3倍以上，前述凸部的高度優(yōu)選為30 ~ 300 ia m。
另外，以前述微容器水平面為基準面的前述側壁的高度方向的上 部50%以上處，水平面與該側壁的各側面所成的角度優(yōu)選為80° ~ 90° 。
另外，微容器的底面面積優(yōu)選為6.25 x i0-4mm2~ 0.563mm2。并 且，培養(yǎng)細胞為肝細胞時，底面的長徑優(yōu)選為短徑的1~1.5倍。而在 對細胞的遷移性進行評價時，底面的長徑優(yōu)選為短徑的1.5-50倍。
進而，前述微容器與至少1個相鄰的微容器連通，為此之開口部 的底面寬度優(yōu)選為1 ]um 25jum。
另外，在設置有前述微容器的區(qū)域進行表面處理，通過前述表面 處理形成的層合膜為2層以上，優(yōu)選至少l層為無機膜，至少l層為有機膜。進一步優(yōu)選該區(qū)域為透明。
本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)方法，是在前述細胞培養(yǎng)容器中，在設置 于細胞培養(yǎng)容器中的前述微容器中，注入細胞并培養(yǎng)前述細胞的方 法。前述細胞優(yōu)選為肝細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、牙髓細胞、軟骨 細月包、干細胞、神經細胞、心肌細胞中的任一種。
根據(jù)本發(fā)明，可提供可在培養(yǎng)空間內有效地構建細胞間的網絡的 細胞培養(yǎng)容器和細胞培養(yǎng)方法。


表示實施方式所述的細胞培養(yǎng)容器的構成的平面圖。表示實施方式所述的細胞培養(yǎng)容器的構成的截面圖。 [圖3]表示實施方式所述的細胞培養(yǎng)容器的構成的平面圖。 [圖4]表示實施方式所述的細胞培養(yǎng)容器的構成的截面圖。 [圖5]表示實施方式所述的細胞培養(yǎng)容器的構成的平面圖。 [圖6]表示實施方式所述的細胞培養(yǎng)容器的構成的截面圖。
圖像。； 穴 、、 ， 、 、"實施例1所述的細胞培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)細胞的光學顯微鏡 圖像。比較例1所述的細胞培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)細胞的光學顯微鏡 圖像。比較例1所述的細胞培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)細胞的光學顯微鏡 圖像。表示;施方^所述的細胞培養(yǎng)容器的構成的截面圖。 [圖13]實施例2所述的細胞培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)細胞的光學顯微鏡 圖像。
符號說明
10細胞培養(yǎng)容器
11微容器
12側壁
121第1側壁122第2側壁 13開口部
具體實施例方式
本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)容器中形成有凹凸圖案，即多個微容器， 即培養(yǎng)空間。通過使分隔該微容器的側壁(凸部)的寬度和高度最適化， 可以將細胞僅培養(yǎng)于微容器內，并有效地構建細胞間的網絡。
被側壁所包圍的微容器的尺寸必須是用于培養(yǎng)細胞的最適范圍。 如果微容器的底面面積過大，則和在平板上的培養(yǎng)相同，細胞薄薄地 延展、無法形成立體結構。而如果微容器的底面面積過小，則變得無
容納一個或多個的范圍。多個細胞集結形成細胞塊時，優(yōu)選為可容;內 該細胞塊的范圍。
另外，微容器的側壁也必須是用于培養(yǎng)細胞的最適范圍。如果側
壁的寬度過寬，則細胞粘附于側壁的上面，不適于培養(yǎng)。如果側壁的 寬度過窄，則不易制作。如果側壁的高度過低，則細胞越過側壁，不 適于培養(yǎng)。如果側壁的高度過高，則不易制作且物質不易擴散、培養(yǎng) 環(huán)境惡化。
進而，通過在側壁設置開口部，形成連通多個微容器的結構，可 有效地對細胞供給氧或營養(yǎng)成分并除去來自細胞的排泄物。應予說 明，通過對應于培養(yǎng)的細胞種類，適當?shù)卦O定側壁的高度、微容器尺 寸、開口部的寬度，也可適用于各種培養(yǎng)系。
以下，對本發(fā)明的實施方式進行說明。但本發(fā)明并不受限于以下 的實施方式。而且，以下記載和圖被適當?shù)暮喡砸郧宄剡M行說明。
使用圖1、 2對實施方式所述的細胞培養(yǎng)容器的構成進行說明。 圖1是表示本實施方式所述的細胞培養(yǎng)容器的構成的平面圖，圖2是 圖1的II-II截面圖。如圖l所示，細胞培養(yǎng)容器10具備微容器11、 側壁12、開口部13。在細胞培養(yǎng)容器10的培養(yǎng)面上，多個側壁12 形成為網孔狀，被該側壁12所圍住四面的空間成為微容器11。并且 在矩形形狀的各微容器11的四邊所形成的側壁12的各邊的中央部， 形成有開口部13。
圖1中顯示了微容器11的底面寬度a、用于分隔微容器11的側壁12的寬度b、高度C、用于使相鄰的微容器11互相連通的開口部
13的寬度d。其中，要求0.5ym<b《15Mm,且c/b》3。如果側壁 12的寬度b超過15nm，則細胞粘附于側壁的上面，不適于培養(yǎng)。而 如果側壁12的寬度b小于0.5|um，則不易制作。如果側壁的高度過 低，則細胞越過側壁，不適于培養(yǎng)。如果側壁12的高度c小于側壁 12的寬度b的2倍，則培養(yǎng)于微容器ll中的細胞越過而向相鄰的微 容器11移動。另外，側壁12的高度c優(yōu)選為30|im~ 300nm的范 圍內。具體而言，形成當量直徑100jum的細胞塊時，側壁12的高度 c優(yōu)選為50|um~ 150|am。此處，如果側壁的高度c過高，則不易制 作且物質不易擴散、培養(yǎng)環(huán)境惡化。側壁12也可為多階梯形狀。
微容器11的底面形狀并無特別限制，除正方形、圓形、多角形 之外，還可采用各種形狀。該底面面積優(yōu)選為6.25 x l(T4mm2 ~ 0.563mm2。具體而言，再現(xiàn)生物體內的肝功能的細月包i咅養(yǎng)中，該底面 面積優(yōu)選為0.01mm2~0.1mm2。此時，底面的長徑優(yōu)選為短徑的1~ 1.5倍。且優(yōu)選為等方的形狀，如果為正方形例如形成當量直徑100 jum的細胞塊時， 一邊的長度優(yōu)選為100jum 300 y m。
另外，為再現(xiàn)生物體內的神經網絡而進行神經細胞的排列的培養(yǎng) 中，可采用具有長方形或開口部的微容器。例如，微容器短邊寬度優(yōu) 選為20Mm,長邊的長度優(yōu)選為lOOiam以上。即，底面的長徑優(yōu)選 為短徑的5倍以上。
為調查生物體內的細胞功能而進行細胞的遷移性評價時，可采用 長方形的形狀。例如微容器短邊寬度為15 iam,長邊的長度優(yōu)選為 22.5 ~ 750 ju m。即，底面的長徑優(yōu)選為短徑的1.5~50^咅。
微容器11的水平面和側壁12所成的角度，必須為細胞無法越過 的角度，故自側面的上部50%以上處優(yōu)選為80° ~90° ,特別優(yōu)選 為85° ~ 90° 。
用于將相鄰的微容器11互相連通的開口部13的寬度d，優(yōu)選為 培養(yǎng)細胞無法從最初播種的微容器11移動至相鄰的微容器11的程 度。例如，如果培養(yǎng)細胞的當量直徑為20 M m，則優(yōu)選為5 15jum。 此外，如圖11、 12所示的凹凸圖案形狀那樣，開口部13可以不為樣么 容器ll的中央，而為角落部分(矩形的角的部分)。此處，圖11是表 示本實施方式所述的其它細胞培養(yǎng)容器的構成的平面圖，圖12是圖
8ll的XI-XI截面圖。應予說明，開口部13并不是必須的，如圖3圖 和圖4所示那樣，微容器11的四周也可被側壁12所完全包圍。此處，
4是圖3的IV-IV截面圖。
另外，如圖5和圖6所示那樣，圓形狀的微容器11被第1側壁 121所完全包圍，進而第1側壁121上可形成第2側壁122。即，由 第1側壁121和第2側壁122而形成多階梯的側壁(凸部)12。此處，
6是圖5的vi:i截:圖。、、 r '"、'''
作為制作本發(fā)明的細胞培養(yǎng)容器上的凹凸圖案的方法，并無特別 限定，可舉出例如使用模具的轉印成型、三維光刻、精密機械切削、 濕式蝕刻、干式蝕刻、激光加工、放電加工等方法。優(yōu)選考慮細胞培 養(yǎng)容器的用途、所要求的加工密度、成本等而適當?shù)剡x擇其制造方法。
作為使用模具的轉印成型方法的具體例，可舉出以金屬結構體為 模具、通過樹脂成型來形成凹凸圖案的方法。該方法可以以高轉印率 將金屬結構體的形狀再現(xiàn)于樹脂的凹凸圖案上，另外，由于可通過使 用常用的樹脂材料來降低材料成本，故優(yōu)選。此類使用金屬結構體的 模具的方法成本低，在可滿足高尺寸精度方面優(yōu)異。
作為上述金屬結構體的制法，可舉出例如對采用光微影制作的 抗蝕圖案或采用三維光刻制作的樹脂圖案的鍍敷處理、精密機械切 削、濕式蝕刻、干式蝕刻、激光加工、放電加工等?？梢钥紤]用途、 所要求的加工精度、成本等而進行適當選擇。
作為使用上述制得的金屬結構體為模具、將凹凸圖案成型于樹脂 的方法，可舉出例如噴射成型、加壓成型、單體鑄塑成型、溶劑鑄塑 成型、熱壓花成型、基于擠壓成型的輥轉印等方法。從生產率和模具 轉印性的觀點出發(fā)，優(yōu)選采用噴射成型。
作為構成本發(fā)明的細胞培養(yǎng)容器的材料，只要是具有自支持性者 則無特別限定，可舉出例如合成樹脂、有機硅、玻璃等。從成本面或 基于顯微鏡觀察的細胞能見度的觀點出發(fā)，優(yōu)選以透明的合成樹脂為 材料。作為透明的合成樹脂，可舉出例如聚曱基丙烯酸曱酯、曱基丙 烯酸曱酯-苯乙烯共聚物等丙烯酸系樹脂、聚苯乙烯等苯乙烯系樹脂、 環(huán)烯烴等烯烴系樹脂、聚對苯二曱酸乙二醇酯、聚乳酸等酯系樹脂、聚二曱基硅氧烷等有機硅系樹脂、聚碳酸酯樹脂等。在不影響透明性 的范圍內，此類樹脂中也可含有著色劑、擴散劑、增稠劑等各種添加劑。
對于本發(fā)明的細胞培養(yǎng)容器，可以以提升容器表面的親水性、生 物體適合性、細胞親和性等為目的，在凹凸圖案表面?zhèn)冗M行表面處理， 也可設置改良層和/或涂覆層。作為設置前述改良層的方法，只要是不
喪失自支持性的方法或不發(fā)生10 ym以上的極端的表面粗糙的方法 即可，并無特別的限制，例如藥品處理、溶劑處理、導入表面接枝聚 合所致的接枝聚合物等的化學處理、電暈放電、臭氧處理、等離子處 理等物理處理等方法。而設置涂覆層的方法并無特別限制，可舉出例 如濺射、蒸鍍等干式涂覆、無機材料涂覆、聚合物涂覆等濕式涂覆等 方法。在凹凸圖案上，為了在不混入氣泡的情形下注入培養(yǎng)液，期望 附予親水性，作為形成均勻的親水性膜的方法，優(yōu)選采用無機蒸鍍。
另外，考慮細胞親和性時，更優(yōu)選涂覆例如膠原、纖維結合素等 細胞親和性蛋白質。為均勻地涂覆膠原水溶液等，優(yōu)選形成前述親水 性膜之后再進行涂覆。通常，在細胞培養(yǎng)中，期待模仿生物體內環(huán)境 而在細胞外基質表面的培養(yǎng)，因此，如前述般設置均勻的親水性無機 膜后，特別優(yōu)選設置包含適于培養(yǎng)細胞的細胞外基質的有機膜。
本發(fā)明的細胞培養(yǎng)方法，只于培養(yǎng)細胞的微容器置入細胞，為在 其空間內體現(xiàn)類似生物體內的形態(tài)或功能，必須播種適當?shù)募毎麛?shù)， 細胞播種密度優(yōu)選為1.0 x 104~ 1.0 x 106細胞/(^12。例如微容器為正方 形、且一邊為200 Mm時，優(yōu)選為5.0x 104~5.0x 1()5細胞/cm2?；?這樣的條件，可得直徑達30 200)am的細月包塊。
實施例
發(fā)明并不受這些實施例限定。 〈肝細胞的制備〉
用于培養(yǎng)的初代大鼠肝細胞如下制備。將靜脈留置針插入6周齡
的Wistar系大鼠的門脈，通入含EDTA的溶液并進行脫血液后，灌流 膠原酶溶液。之后，將經過膠原酶溶液處理的肝臟放入培養(yǎng)液，以移 液器進行吹洗使細胞分散。洗凈細胞懸浮液3次，除去細胞以外的細 胞，將分離的細胞用于培養(yǎng)?！磁囵B(yǎng)方法〉
用于培養(yǎng)的培養(yǎng)液如下制備。
于DMEM/F12培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清、ljug/ml胰島素、 1 x io-7M地塞米松(dexamethasone)、 10mM煙酰胺、2mM的L-谷氨 酰胺、50jum的(3-巰基乙醇、5mM的HEPES、 59)ig/ml青霉素、100 ]ug/ml鏈霉素、25ng/ml的HGF、 20ng/ml的EGF。
以l.Ox 1()S細胞/cm2的濃度，將肝細胞播種于凹凸圖案基材上， 于5%C02、 37。C的條件下，培養(yǎng)規(guī)定的時間。使用相同組成的新鮮培 養(yǎng)基0.5mL,每1日至2日進行培養(yǎng)基更換。
通過光微影制作圖3所示凹凸圖案形狀的、a=100jum、 b=10jum、 c=50 n m的圖案，進行鎳電解鍍敷，得到具有對應的凹凸形狀的模具。 使用該模具通過熱壓花成型，于聚苯乙烯上進行圖案轉印，制作前述 尺寸的樹脂基材。通過真空蒸鍍，于該樹脂基材表面形成100nm二氧 化硅膜，進行Y射線滅菌，制得凹凸圖案基材。將肝細胞培養(yǎng)于該凹 凸基材上。
通過光微影制作圖3所示凹凸圖案形狀的、a=100jum、 b=20 M m、 c=50 ia m的圖案，進行鎳電解鍍敷，得到具有對應的凹凸形狀的模具。 使用該模具通過熱壓花成型，于聚苯乙烯上進行圖案轉印，制作前迷 尺寸的樹脂基材。通過真空蒸鍍，于該樹脂基材表面形成100nm二氧 化硅膜，進行Y射線滅菌，制得凹凸圖案基材。將肝細胞培養(yǎng)于該凹 凸基材上。
以實例1的條件進行細胞播種，培養(yǎng)4小時后的光學顯微鏡相片 示于圖7，培養(yǎng)4天后的光學顯微鏡相片示于圖8。細胞不粘附于間 隔培養(yǎng)空間的凸部上面，可以只培養(yǎng)于原本的培養(yǎng)空間的凹部。因此， 可在培養(yǎng)空間內構建細胞間的網絡，可表現(xiàn)相近于生物體的功能。
以比較例1的條件進行細胞播種，培養(yǎng)4小時后的光學顯微鏡相 片示于圖9，培養(yǎng)4天后的光學顯微鏡相片示于圖10。細胞粘附于間 隔培養(yǎng)空間的凸部上面而進行培養(yǎng)。并且，無法明確地間隔相鄰的培 養(yǎng)空間，且無法只于培養(yǎng)空間內培養(yǎng)細胞。因此，無法在培養(yǎng)空間內 構建細胞間的網絡，無法表現(xiàn)相近于生物體的功能。[實施例2]
通過光微影制作如圖11、 12所示凹凸圖案形狀的、a-80nm、b-15 Mm、 c^50iam的圖案，進行鎳電解鍍敷，制得具有對應的凹凸形狀 的模具。使用該模具通過熱壓花成型，于聚苯乙烯上進行圖案轉印， 制作前述尺寸的樹脂基材。通過真空蒸鍍，于該樹脂基材表面形成 lOOmn二氧化硅膜，進行Y射線滅菌，制得凹凸圖案基材。將肝細胞 培養(yǎng)于該凹凸基材上。
以實施例2的條件進行細胞播種，培養(yǎng)4小時后的光學顯微鏡相 片示于圖13。細胞不粘附于間隔培養(yǎng)空間的凸部上面，可以只培養(yǎng)于 原本的培養(yǎng)空間的凹部。因此，可在培養(yǎng)空間內構建細胞間的網絡， 可表現(xiàn)相近于生物體的功能。
權利要求
1.細胞培養(yǎng)容器，其是在表面具有多個微容器的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于，形成有間隔相鄰的前述微容器間的凸部，且使細胞不粘附于前述凸部的上面。
2. 權利要求1所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于，前述凸部為多 階梯結構，且使細胞不粘附于各階梯的上面。
3. 權利要求1或2所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于，前述凸部 上表面的短邊寬度為0.5 ~ 15 Mm,前述凸部的高度為前述短邊寬度的 3倍以上。
4. 權利要求3所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于，前述凸部的高 度為30 ~ 300 ja m。
5. 權利要求1~4中任一項所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于， 以前述微容器的底面為基準面的前述凸部的高度方向的上部50%以 上處，前述底面和前述凸部各側面所成的角度為80° -90° 。
6. 權利要求1~5中任一項所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于， 前述孩i容器的底面面積為6.25 x 10-4mm2~ 0.563mm2。
7. 權利要求1~6中任一項所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于， 前述微容器的底面的長徑為短徑的1~1.5倍。
8. 權利要求1~6中任一項所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于， 前述微容器的底面的長徑為短徑的1.5~50倍，評價細胞的遷移性。
9. 權利要求1~8中任一項所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于， 前述微容器與至少1個相鄰的微容器連通。
10. 權利要求9所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于，用于將前述 微容器與至少1個相鄰的微容器連通的開口部的寬度為1~25mhi。
11. 權利要求1 ~ 10中任一項所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于， 在設置前述微圖案的區(qū)域進行表面處理。
12. 權利要求11所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于，通過前述表 面處理而形成的層合膜為2層以上，至少l層為無機膜，至少l層為 有機膜。
13. 權利要求1 ~ 12中任一項所述的細胞培養(yǎng)容器，其特征在于， 設置前述微圖案的區(qū)域為透明。
14. 細胞培養(yǎng)方法，該方法包括在設置于權利要求1~13中任一項所述的細胞培養(yǎng)容器中的前述微容器中，注入細胞并培養(yǎng)前述細 胞。
15.權利要求14所述的細胞培養(yǎng)方法，其特征在于，前述細胞為肝細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、牙髓細胞、軟骨細胞、干細胞、神經 細胞、心肌細胞中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明提供可在培養(yǎng)空間內有效地構建細胞間的網絡的細胞培養(yǎng)容器和細胞培養(yǎng)方法。本發(fā)明所述的細胞培養(yǎng)容器10是在表面具有多個微容器11的細胞培養(yǎng)容器10，其特征在于，形成有間隔相鄰的微容器11間的凸部(側壁12)，其使細胞不粘附于凸部的上面。由此，細胞只培養(yǎng)于微容器11內，細胞間的網絡被有效地構建。
文檔編號C12N5/071GK101679933SQ200880020619
公開日2010年3月24日 申請日期2008年6月16日 優(yōu)先權日2007年6月18日
發(fā)明者小坂知子, 田崎剛, 福田始弘 申請人:可樂麗股份有限公司