專利名稱：：用于調(diào)節(jié)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin9型(pcsk9)的分子和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗原結(jié)合分子、被此類分子結(jié)合的表位和使用所述分子的方法。
背景技術(shù)：
：前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)/kexin9型(PCSK9)(也稱為神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶l(neuralapoptosis-regulatedconvertase1)或NARC-1)是絲氨酸蛋白酶的蛋白酶K分泌型枯草桿菌蛋白酶樣亞家族的成員(Naureckiene等人，2003Arc.Biochem.Biophys.420:55-67)。人PCSK9是主要在腎、肝和腸中表達(dá)的分泌性蛋白。其具有三個(gè)結(jié)構(gòu)域抑制性前結(jié)構(gòu)域(pro-domain)(氛基酸1-152;包括在氨基酸1J0上的信號序列)、絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(氨基酸153-448)和長度為210個(gè)殘基的C端結(jié)構(gòu)域(氨基酸449-692)——其富含半胱氨酸殘基。PCSK9以酶原的形式合成，所述酶原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生前結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域之間的自催化斷裂。斷裂后前結(jié)構(gòu)域保持與成熟蛋白質(zhì)結(jié)合，復(fù)合物被分泌。所述富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域可起著與其他Furin/Kexin/枯草桿菌蛋白酶-樣絲氨酸蛋白酶的P-(加工)結(jié)構(gòu)域類似的作用，所述作用似乎是4皮激活的蛋白酶的折疊和調(diào)控所必需的。PCSK9中的突變與血漿中的低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)的異常水平相關(guān)(Horton等人，2006Trends.Biochem.Sci.32(2):71-77)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及PCSK9的表位、PCSK9結(jié)合分子，以及使用此類分子的方法。PCSK9結(jié)合分子與PCSK9相互作用并且調(diào)控PCSK9的功能。14PCSK9結(jié)合分子可用于增加LDL-受體(LDL-R)水平并且減少膽固醇水平。在多個(gè)方面，本發(fā)明提供了調(diào)控(例如抑制)PCSK9的一個(gè)或多個(gè)生物學(xué)功能的PCSK9結(jié)合分子。例如，PCSK9結(jié)合分子可抑制PCSK9的蛋白水解活性(例如，PCSK9前結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)水解)和/或PCSK9與PCSK9受體之間的相互作用(例如，PCSK9對LDL-R的結(jié)合)。PCSK9以轉(zhuǎn)錄后方式下調(diào)LDL-R。因此，抑制PCSK9將導(dǎo)致增加的LDL-R水平。體內(nèi)LDL-R水平的增加允許LDL-R介導(dǎo)的LDL-c攝取的增加。因此，干擾PCSK9對LDLR的調(diào)控的結(jié)合分子將最終減少循環(huán)LDL-c的水平。PCSK9結(jié)合分子包括例如結(jié)合PCSK9(例如，在PCSK9的特定結(jié)構(gòu)域或表位，例如催化結(jié)構(gòu)域或富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi))的抗體和包含此類抗體的抗原結(jié)合部分的多肽。PCSK9結(jié)合分子還包括其中結(jié)合部分不是從抗體衍生的分子，例如，PCSK9結(jié)合分子可以衍生自具有免疫球蛋白樣折疊的多肽，其抗原結(jié)合部分通過隨機(jī)化、選擇和親和力成熟的方式進(jìn)行工程改造而結(jié)合PCSK9。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含結(jié)合(例如，特異性結(jié)合)PCSK9的抗體的抗原結(jié)合部分的PCSK9結(jié)合分子，其中該抗原結(jié)合部分結(jié)合人PCSK9的催化結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:l)內(nèi)的表位，所ii^位存在于下列序列的一個(gè)序列內(nèi)或與之重疊(例如包含其全部或部分或由其全部或部分組成)(a)SEQIDNO:l的氨基酸166-177(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位YRADEYQPPDGG(SEQIDNO:4));(b)SEQIDNO:l的氨基酸187-202(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位TSIQSDHREIEGRVMV(SEQIDNO:5));(c)SEQIDNO:l的氨基酸206-219(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位ENVPEEDGTRFHRQ(SEQIDNO:6));(d)SEQIDNO:l的氨基酸231-246(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位AGVVSGRDAGVAKGAS(SEQIDNO:7));(e)SEQIDNO:l的氨基酸277-283(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位VQPVGPL(SEQIDNO:8));(f)SEQIDNO:l的氨基酸336-349(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位15VGATNAQDQPVTLG(SEQID隱9));(g)SEQID餘l的氨基酸368-383(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位IIGASSDCSTCFVSQS(SEQIDNO:10));或(h)SEQIDNO:l的^J^酸426-439(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位EAWFPEDQRVLTPN(SEQIDNO:ll))。例如，抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:1的氨基酸166-171、169-174或172-177內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的^J^酸187-193、191-196、194-199或197-202內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的#^酸206-211、209-214、212-217、215-219內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸231-237、235-240、238-243、241-246內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸277-282或279-283內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸336-341、339-343、341-346或344-349內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸368-374、372-377、375-380或378-383內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的^J^酸426-431、429-434、432-437或435-439內(nèi)的表位。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含結(jié)合(例如，特異性結(jié)合)PCSK9的抗體的抗原結(jié)合部分的分離的PCSK9結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合部分結(jié)合人PCSK9的富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位，所a位存在于下列序列的一個(gè)序列內(nèi)或與之重疊(a)SEQIDNO:1的氨基酸443-500;(b)氨基酸557-5卯；或(e)氨基酸636-678。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合人PCSK9的表位，該表^f立存在于下列序列的一個(gè)序列內(nèi)或與之重疊(a)SEQIDNO:l的氨基酸443-458(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位ALPPSTHGAGWQLFCR(SEQIDNO:12));(b)SEQIDNO:l的氨基酸459-476(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位TVWSAHSGPTRMATAIAR(SEQIDNO:13));(c)SEQIDNO:l的氨基酸486-500(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位:CSSFSRSGKRRGERM(SEQIDNO:14));(d)SEQIDNO:l的氨基酸557-573(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位:HVLTGCSSHWEVEDLGT(SEQIDNO:15));(e)SEQIDNO:l的^J^酸577-590(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位PVLRPRGQPNQCVG(SEQIDNO:16));(f)SEQIDNO:l的氨基酸636-645(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位SALPGTSHVL(SEQIDNO:17));(g)SEQIDNO:l的氨基酸659-677(即，下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位:RDVSTTGSTSEEAVTAVAI(SEQIDNO:18))。例如，抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸443-449、447-452、450-455、453-458內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的^J^酸459-465、463-468、466-471、469-474或472-476內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的^J^酸486-491、489-494、492-497或495-500內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸557-563、561-566、564-569、567-572或569-573內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的^J^酸577-582、580-585、583-588或586-590內(nèi)的表位;抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸636-643或640-645內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸659-665、663-668、665-670、668-673或671-677內(nèi)的表位。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含結(jié)合(例如，特異性結(jié)合)PCSK9的抗體的抗原結(jié)合部分的分離的PCSK9結(jié)合分子，其中所述抗原結(jié)合部分結(jié)合人PCSK9的前結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位，所i^位存在于SEQIDNO:l的^J^酸89-134內(nèi)或與之重疊。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合人PCSK9的表位，所述表位存在于下列序列的一個(gè)序列內(nèi)或與之重疊(a)SEQIDNO:l的氨基酸89-101(即，存在于下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位SQSERTARRLQAQ(SEQIDNO:2));或(b)SEQIDNO:l的氨基酸106-134(即，存在于下列序列內(nèi)的或與之重疊的表位GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA(SEQIDNO:3))。例如，抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸123-131內(nèi)的表位。例如，抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:l的氨基酸89-94、92-97或95-101內(nèi)的表位；抗原結(jié)合部分結(jié)合SEQIDNO:1的^tJ^酸106-111、109-114、112-117、115-120、118-123、121-126、124-129或127-134內(nèi)的表位。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合人PCSK9的前結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位，所述表位存在于SEQIDNO:l的M酸101-107(氨基酸QAARRGY)內(nèi)或與之重疊。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合人PCSK9的前結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位，所述表位存在于SEQIDNO:l的氨基酸123-132(氨基酸LVKMSGDLLE)內(nèi)或與之重疊。這些氨基酸落在PCSK9的前結(jié)構(gòu)域的氨基酸106-134(SEQIDNO:3;GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDIXELA)內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分特異性在SEQIDNO:l的氨基酸101-132內(nèi)結(jié)合PCSK9(即，結(jié)合SEQIDNO:2內(nèi)的表位、SEQIDNO:3內(nèi)的表位或與SEQIDNOs:2和3重疊的表位，即，包含來自SEQIDNO:2和來自SEQIDNO:3的至少一個(gè)氛基酸的表位)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分在SEQIDNO:l的氨基酸101-132內(nèi)特異性結(jié)合PCSK9并且包含至少一個(gè)來自SEQIDNO:2的氨基酸(例如，谷氨酰胺)和至少一個(gè)來自SEQIDNO:3的氨基酸(例如，甘氨酸和/或酪氨酸)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分特異性結(jié)合PCSK9，結(jié)合在SEQIDNO:l的氨基酸101-132內(nèi)并且包含至少一個(gè)來自SEQIDNO:2的^i^酸(例如，谷氨酰胺)和至少一個(gè)來自SEQIDNO:3的氨基酸(例如，甘氨酸和/或酪氨酸)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分在如下表位處特異性結(jié)合PCSK9,所述表位與至少一個(gè)來自SEQIDNO:2的氛基酸(例如，谷氨酰胺)和至少一個(gè)來自SEQIDNO:3的氛基酸(例如，甘氨酸和/或酪氨酸)重疊。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及與任何一個(gè)上述PCSK9結(jié)合分子交叉竟?fàn)幗Y(jié)合的分離的PCSK9結(jié)合分子。因此，此類交叉竟?fàn)幮越Y(jié)合分子可以例如通過結(jié)合空間上緊鄰的表位來干擾(例如，抗體或包含抗體的抗原結(jié)合18部分的其他PCSK9結(jié)合分子)對SEQIDNO:l的氨基酸101-107或123-132的結(jié)合。在多個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子(例如，結(jié)合催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的或前結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位的PCSK9結(jié)合分子)與非人靈長類動(dòng)物(例如，食蟹猴或恒河猴)的PCSK9交叉反應(yīng)。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分與嚙齒類動(dòng)物物種的PCSK9(例如，小鼠PCSK9、大鼠PCSK9)交叉反應(yīng)。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分結(jié)合線性表位。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位。在一個(gè)實(shí)例中，抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位，所述非線性表位包含下列線性表位之每一個(gè)的至少一個(gè)部分或由其組成:(a)SEQIDNO:l的氨基酸89-101;和(b)SEQIDNO:l的氨基酸106-134。在另一個(gè)實(shí)例中，抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位，所述非線性表位包含下列線性表位之每一個(gè)的至少一個(gè)部分或由其組成(a)SEQIDNO:l的氨基酸166-177;和(b)SEQIDNO:l的氨基酸443-458。在另一個(gè)實(shí)例中，抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位，所述非線性表位包含下列線性表位中的2個(gè)或3個(gè)表位的各至少一個(gè)部分或由其組成(a)SEQIDNO:l的氨基酸187-202;(b)SEQIDNO:l的氨基酸231-246;和(c)SEQIDNO:1的氨基酸368-383。在另一個(gè)實(shí)例中，抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位，所述非線性表位包含下列線性表位之每一個(gè)的至少一個(gè)部分或由其組成(a)SEQIDNO:l的氨基酸206-219;和(b)SEQIDNO:l的氨基酸227-283。在另一個(gè)實(shí)例中，抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位，所述非線性表位包含下列線性表位之每一個(gè)的至少一個(gè)部分或由其組成(a)SEQIDNO:l的#^酸336-349;和(b)SEQIDNO:l的氨基酸426-439。在另一個(gè)實(shí)例中，抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位，所述非線性表位包含下列線性表位中的2個(gè)或3個(gè)表位的各至少一個(gè)部分或由其組成(a)SEQIDNO:l的氨基酸459-476;(b)SEQIDNO:l的氨基酸486-500;和(c)SEQIDNO:l的氨基酸557-573。在另一個(gè)實(shí)例中，抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位，所述非線性表位包含下列線性表位中的2個(gè)或3個(gè)表位的各至少一個(gè)部分或由其組成(a)SEQIDNO:l的氨基酸577-590;(b)SEQIDNO:l的^&酸636-645;和(c)SEQIDNO:l的氛基酸659-677。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分結(jié)合非線性表位(例如，構(gòu)象表位)，所述表位包含(a)SEQIDNO:l的氨基酸101-107和(b)SEQIDNO:l的氨基酸123-132的全部或部分。在多個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子的結(jié)合功效與在PCSK9的特定結(jié)構(gòu)域或表位內(nèi)的結(jié)合位置相關(guān)。在多個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子的抗原結(jié)合部分以等于或小于10nM、1nM、0.5nM、0.25nM或0.1nM的解離常數(shù)(K。)結(jié)合PCSK9。在多個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子的抗原結(jié)合部分以等于或小于0.3nM的K。結(jié)合非人靈長類動(dòng)物(例如，食蟹猴或黑猩猩)的PCSK9。在多個(gè)實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分以等于或小于0.5nM的K。結(jié)合小鼠PCSK9。抗體可以是嵌合(例如，人源化)抗體或人抗體，或humaneered抗體。在一個(gè)實(shí)施歲案中，抗原結(jié)合部分是人抗體的抗原結(jié)合部分?？乖Y(jié)合#分可以是單克隆抗體或多克隆抗體的抗原結(jié)合部分。PCSK9結(jié)合分子包括例如抗體的Fab片段、Fab，片段、F(ab，)2或Fv片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子是人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子包括單鏈Fv。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子包括雙抗體(diabody)(例如，單鏈雙抗體或具有兩條多肽鏈的雙抗體)。在一些實(shí)施方案中，抗體的抗原結(jié)合部分來源于一種下列同種型的抗體IgGl、IgG2，、IgG3或IgG4。在一些實(shí)施方案中，抗體的抗原結(jié)合部分來源于1gA或IgE同種型的抗體。PCSK9結(jié)合分子(例如，結(jié)合催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的、富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域內(nèi)的或前結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位的PCSK9結(jié)合分子)可展示一種或多種生物學(xué)活性。在多個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子抑制PCSK9對PCSK9配體的結(jié)合。20在一些實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子在pH7-8抑制對PCSK配體的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子在低于pH7的pH(例如，在pH5-7)抑制結(jié)合。例如，與對照相比較(例如，與在PCSK9結(jié)合分子不存在的情況下的結(jié)合相比較)，PCSK9結(jié)合分子對PCSK9與PCSK9配體的結(jié)合造成至少5%、10%、15%、5%或50%的抑制。例如，PCSK9結(jié)合分子可抑制PCSK9對低密度脂蛋白受體(LDL-R)的結(jié)合(例如，PCSK9結(jié)合分子在pH7或更低的pH,例如pH5-7，抑制PCSK9對LDL-R的結(jié)合)。PCSK9前結(jié)構(gòu)域可以與成熟PCSK9多肽斷裂，并保持與成熟PCSK9多肽的非共價(jià)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子與PCSK9前結(jié)構(gòu)域竟?fàn)帉Υ呋Y(jié)構(gòu)域或富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的結(jié)合(或反過來)，和抑制PCSK9的生物學(xué)活性。在一些實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子抑制PCSK9的蛋白水解活性(例如，PCSK9前結(jié)構(gòu)域的蛋白水解，或其它PCSK9底物的蛋白水解)。例如，與對照相比(例如，與在PCSK9結(jié)合分子不存在的情況下的活性相比)，PCSK9結(jié)合分子對PCSK9的蛋白水解活性造成至少5%、10%、15%、25%或50%的抑制。在一些實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子抑制細(xì)胞例如肝細(xì)胞上LDL-R的PCSK9依賴性減少(例如，LDL-R的PCSK9依賴性降解)。例如，與對照相比(例如，與在PCSK9結(jié)合分子不存在的情況下的LDL-R減少相比)，PCSK9結(jié)合分子對LDL-R的PCSK9依賴性減少造成5。/。、10%、15%、25%或50%的抑制。在這些實(shí)施方案中，LDL-R水平的增加指示PCSK9結(jié)合分子對LDL-R的PCSK9-依賴性減少造成抑制。在某些實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合分子，當(dāng)與細(xì)胞例如肝細(xì)胞在PCSK9存在的條件下接觸時(shí)，與在PCSK9結(jié)合分子不存在的情況下肝細(xì)胞對LDL-c的才聶取相比，增加肝細(xì)胞對LDL-c的攝取。例如，與對照相比較(例如，與在PCSK9結(jié)合分子不存在的情況下的結(jié)合相比較)，PCSK9結(jié)合分子4吏LDL-c的才聶取增加至少5%、10%、15°/。、25%或50%。PCSK9結(jié)合分子可在LDL-c存在的情況下結(jié)合PCSK9和/或其可在血清存在的情況下(例如，在至少1°/。、5%、10%、25%、50%的血清存在的情況下)結(jié)合PCSK9。本發(fā)明還涉及非抗體PCSK9結(jié)合分子。非抗體PCSK9結(jié)合分子包含PCSK9結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域具有來源于非抗體多肽例如下列多肽之一的免疫球蛋白樣(Ig-樣)折疊的氨基酸序列生腱蛋白(tenascin)、N-鈣粘著蛋白、E-鈣粘著蛋白、ICAM、肌聯(lián)蛋白、GCSF-受體、細(xì)胞因子受體、糖普酶抑制劑、抗生素色蛋白(antibioticchromoprotein)、髓鞘膜粘附分子(myelinmembraneadhesionmolecule)P0、CD8、CD4、CD2、I類MHC、T-細(xì)胞抗原受體、CD1、VCAM-1的C2和I-set結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白結(jié)合蛋白C的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白結(jié)合蛋白H的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、端蛋白(telokin)的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、NCAM、顫搐蛋白(twitchin)、神經(jīng)膠質(zhì)蛋白、生長激素受體、促紅細(xì)胞生成素受體、催乳素受體、干擾素-y受體、P-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、P-葡糖醛酸糖苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、T-細(xì)胞抗原受體、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)、組織因子結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞色素F、綠色熒光蛋白、GroEL或奇甜蛋白(thaumatin)。一般地，與免疫球蛋白樣折疊的^JL酸序列相比較，PCSK9結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列被改變，以致PCSK9結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合PCSK9(即，其中免疫球蛋白樣折疊不特異性結(jié)合PCSK9)。在多個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合結(jié)構(gòu)域的M酸序列與纖連蛋白、細(xì)胞因子受體或鈣粘著蛋白的免疫球蛋白樣折疊的氨基,列至少60%同一(例如，至少65%、75%、80%、85%或90%同一)。在多個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9結(jié)合結(jié)構(gòu)域的^J^酸序列與一個(gè)下列多肽的免疫球蛋白樣折疊的氨基酸序列至少60%、65%、75%、80%、85%或90%同一生腱蛋白、N-鈣粘著蛋白、E-鈣粘著蛋白、ICAM、肌聯(lián)蛋白、GCSF-受體、細(xì)胞因子受體、糖苷酶抑制劑、抗生素色蛋白、髓鞘膜粘附分子P0、CD8、CD4、CD2、I類MHC、T-細(xì)胞抗原受體、CD1、VCAM曙1的C2和I-set結(jié)構(gòu)域、M^蛋白結(jié)合蛋白C的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、肌球蛋白結(jié)合蛋白H的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、端蛋白的I-set免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、NCAM、顫搐蛋白、神經(jīng)M蛋白、生長激素受體、促紅細(xì)胞生成素受體、催乳素受體、干擾素-y受體、p-半乳糖苷酶/葡糖醛酸糖苷酶、P-葡糖醛酸糖苷酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、T-細(xì)胞抗原受體、超氧化物歧化酶、組織因子結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞色素F、綠色熒光蛋白、GroEL或奇甜蛋白。在多個(gè)實(shí)施方案中，PCSK9以等于或低于10nM(例如，1nM、0.5nM、0.1nM)的Kd結(jié)合PCSK9。在一些實(shí)施方案中，Ig-樣折疊是纖連蛋白的Ig-樣折疊，例如纖連蛋白III型的Ig樣折疊(例如，纖連蛋白III的組件(module)10的Ig-樣折疊)。本發(fā)明還提供了相應(yīng)于PCSK9的抗原表位的肽。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及肽，所述肽由與下列M酸序列之一具有至少卯％同一性的^,列組成YRADEYQPPDGG(SEQIDNO:4);TSIQSDHREIEGRVMV(SEQIDNO:5);ENVPEEDGTRFHRQ(SEQIDNO:6);AGWSGRDAGVAKGAS(SEQIDNO:7);VQPVGPL(SEQIDNO:8);VGATNAQDQPVTLG(SEQIDNO:9);IIGASSDCSTCFVSQS(SEQIDNO:10);EAWFPEDQRVLTPN(SEQIDNO:11);ALPPSTHGAGWQLFCR(SEQIDNO:12);TVWSAHSGPTRMATAIAR(SEQIDNO:13);CSSFSRSGKRRGERM(SEQIDNO:14);HVLTGCSSHWEVEDLGT(SEQIDNO:15);PVLRPRGQPNQCVG(SEQIDNO:16);SALPGTSHVL(SEQIDNO:17);RDVSTTGSTSEEAVTAVAI(SEQIDNO:18);SQSERTARRLQAQ(SEQIDNO:2);或GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA(SEQIDNO:3)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了組合物，當(dāng)對動(dòng)物施用所迷組合物時(shí)，其引發(fā)特異性結(jié)合PCSK9的抗體。所述組合物包括例如下列肽之一YRADEYQPPDGG(SEQIDNO:4);TSIQSDHREIEGRVMV(SEQIDNO:5);ENVPEEDGTRFHRQ(SEQIDNO:6);AGWSGRDAGVAKGAS(SEQIDNO:7);VQPVGPL(SEQIDNO:8);VGATNAQDQPVTLG(SEQIDNO:9);IIGASSDCSTCFVSQS(SEQIDNO:10);EAWFPEDQRVLTPN(SEQIDNO:ll);ALPPSTHGAGWQLFCR(SEQIDNO:12);TVWSAHSGPTRMATAIAR(SEQIDNO:13);CSSFSRSGKRRGERM(SEQIDNO:14);HVLTGCSSHWEVEDLGT(SEQIDNO:15);PVLRPRGQPNQCVG(SEQIDNO:16);SALPGTSHVL(SEQIDNO:17);RDVSTTGSTSEEAVTAVAI(SEQIDNO:18);SQSERTARRLQAQ(SEQIDNO:2);GYLTKILHVFHGLLPGFLVKMSGDLLELA(SEQIDNO:3);它們的具有少于5個(gè)氨基酸變化的肽；或它們的片段(例如，包含5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)氨基酸的片段)。可以修飾肽，例如，將肽偶聯(lián)至載體蛋白，以增加抗原性。本發(fā)明還涉及包含本文中描述的PCSK9結(jié)合分子的藥物組合物。所述藥物組合物包含例如PCSK9結(jié)合分子和藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還涉及使用本文中描述的PCSK9結(jié)合分子的方法。例如，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及增加細(xì)胞例如肝細(xì)胞上LDL-R水平的方法。所述方法包括將肝細(xì)胞與PCSK9結(jié)合分子(例如，包含特異性結(jié)合PCSK9的抗體的抗原結(jié)合部分的PCSK9結(jié)合分子)接觸，從而減少PCSK9對LDL-R的下調(diào)并且增加肝細(xì)胞上的LDL-R水平。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及增加細(xì)胞例如肝細(xì)胞攝取LDL-c的方法。所述方法包括將肝細(xì)胞與PCSK9結(jié)合分子(例如，包含特異性結(jié)合PCSK9的抗體的抗原結(jié)合部分的PCSK9結(jié)合分子)接觸，從而減少PCSK9對LDL-R的下調(diào)并且增加肝細(xì)胞對LDL-c的攝取。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及在受試者中調(diào)節(jié)PCSK9活性的方法。該方法包括對受試者施用調(diào)節(jié)PCSK9的生物學(xué)活性的PCSK9結(jié)合分子(例如，包含特異性結(jié)合PCSK9的抗體的抗原結(jié)合部分的PCSK9結(jié)合分子)。PCSK9結(jié)合分子展示一個(gè)或多個(gè)下列活性(a)抑制PCSK9對LDL-R的結(jié)合；(b)抑制PCSK9的蛋白水解活性；(c)抑制肝細(xì)胞上LDL-R的PCSK9依賴性減少；和(d)抑制肝細(xì)胞中LDL-R的PCSK9依賴性降解。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及減少受試者的血漿膽固醇的方法。方法包括以有效地減少受試者的血漿膽固醇的量對受試者施用包含本文中描述的PCSK9結(jié)合分子的藥物組合物。所述量可以是有效減少LDL-c的量。受試者的血漿LDL-c濃度與施用組合物之前的血漿LDL-c相比，可減少至少5%(例如，血漿LDL-c的濃度減少至少10%、15%或20%)。在一些實(shí)施方案中，受試者還可以正在接受使用第二降膽固醇藥，例如他汀類藥(statin)，的治療。在多個(gè)實(shí)施方案中，受試者具有脂質(zhì)異常(例如，高脂血癥、I型、II型、III型、IV型或V型高脂血癥、繼發(fā)性高甘油三酯血癥(secondaryhypertriglyceridemia)、高膽固醇血癥(hypercholesterolemia)、黃瘤癥(xanthomatosis)、膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥)或有發(fā)生脂質(zhì)異常的危險(xiǎn)。例如，受試者患有高膽固醇血癥或有發(fā)生高膽固醇血癥的危險(xiǎn)；受試者患有或有危險(xiǎn)患有動(dòng)脈粥樣硬化；受試者患有或有危險(xiǎn)患有心血管病癥。在一些實(shí)施方案中，受試者不耐受他汀類藥(例如，當(dāng)服用他汀類藥物時(shí)，受試者出現(xiàn)副作用)，和/或受試者抵抗他汀類藥治療(例如，他汀類藥治療不引起受試者的膽固醇降低)。在一些實(shí)施方案中，在施用組合物之前，受試者的總血漿膽固醇水平是200mg/dl或更高。在一些實(shí)施方案中，在施用組合物之前，受試者血漿LDL-c水平是160mg/dl或更高。在一些實(shí)施方案中，靜脈內(nèi)施用組合物。在一些實(shí)施方案中，PSCK9結(jié)合分子可用于制備治療與高膽固醇水平相關(guān)的疾病的藥物。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的詳細(xì)內(nèi)容示于附圖和下面的描述中。通過描述和附圖以及通過權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征、目的和有利方面是明顯的。附圖簡述圖1是人PCSK9的示意圖，其標(biāo)示了信號肽、前結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和C末端(富含半胱氨酸)結(jié)構(gòu)域在線性序列中的位置。圖2描述了人PCSK9的三維結(jié)構(gòu)模型。數(shù)字標(biāo)示表2中所列的表位的位置。圖3描述了Hl-Fab結(jié)合hPCSK9的Biacore結(jié)合親和力研究的結(jié)果。傳感圖(sensog鬧)(鋸齒形黑線)是Hl陽Fab在0.78、1.56、3.12、6.25和12.5nM濃度的結(jié)合曲線。1:1全局?jǐn)M合(平滑黑線)給出了下列結(jié)合參數(shù):Kd=3.41x103(l/s)、Ka=3.23x105(1麵)以及KD=1.05和108(M)。圖4A-C舉例說明Hl-Fab可以(4A)破壞hPCSK9/LDL-R的相互作用，導(dǎo)致(4B)增加的表面LDL-R水平和(4C)增加HepG2細(xì)胞對LDL的攝取。圖5A-C描述了自動(dòng)化氘交換質(zhì)譜(DXMS)系統(tǒng)的流體連接示意圖。分別在圖5A、5B和5C中示例了用于實(shí)驗(yàn)的上樣/在線蛋白水解階段、脫鹽階段和分離階段的閥門位置。圖6示意性地描述了互補(bǔ)氫/氖(H/D)交換實(shí)驗(yàn)(即，保護(hù)、對照和在D20中(In-D20)的實(shí)驗(yàn))和預(yù)期的結(jié)果。圖7A-B針對在hPCSK9和hPCSK9:Hl-Fab復(fù)合物上進(jìn)行的(A)保護(hù)實(shí)驗(yàn)和(B)In-D20實(shí)驗(yàn)，描述了作為hPCSK9殘基號的函數(shù)的觀察到的氖化變化。圖8描述了hPCSK9的動(dòng)畫晶體結(jié)構(gòu)，其中兩個(gè)氬基酸區(qū)段(即，氨基酸殘基101-107(QAARRGY)和123-132(LVKMSGDLLE))被預(yù)測形成非線性表位。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了結(jié)合PCSK9的分子("PCSK9結(jié)合分子")，特別是結(jié)合人PCSK9并且調(diào)節(jié)其功能的人抗體和其部分。本文中還提供了PCSK9的表位和結(jié)合這些表位的試劑。人PCSK9(hPCSK9)全長序列見于Genbank⑧目錄號GI:119627065，gb|EAX06660.1，并且在表1中顯示為SEQIDNO:1。編碼hPCSK9的26mRNA序列見于目錄號GI:31317306，NM—174936。表l.人PCSK9氨基齡列LQ(SEQIDNO:1)信號肽、前結(jié)構(gòu)域、催化結(jié)構(gòu)域和C端富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域在SEQIDNO:l線性序列中的位置示于圖1中。人PCSK9在N533上被N-糖基化。其在Y53上和在催化(蛋白酶)結(jié)構(gòu)域中被硫酸化。hPCSK9在人血漿中的濃度范圍是50至600ng/ml(Lagace等人，2006J.Clin.Inv.116(11):2995-3005)。hPCSK9中的某些突變與升高的或降低的LDL-c血漿水平相關(guān)。(Horton等人，2006Trends.Biochem.Sci.32(2):71-77)。下列突變與升高的LDL-c相關(guān)S127R、F216L、D374Y、N425S和R496W。下列突變與降低的LDL-c相關(guān)R46L、AR97、G106R、Y142X、L253F、A443T和C679X。預(yù)測的黑猩猩PCSK9氨基酸序列見于Genbanl^目錄號GI:1145567卯,XP—001154126;和目錄號GI:114556788，XP—513430。小鼠PCSK9的^Jl酸序列見于目錄號GI:23956352，NP—705793。大鼠PCSK9^酸序列見于目錄號GI:77020250，NP—954862。hPCSK9的氨基酸序列與黑猩猩PCSK9具有98.7%同一性，與大鼠PCSK9具有79.5%同一性，與小鼠PCSK9具有78.9%同一性。hPCSK9的抗原性表位的氨基酸序列和它們在SEQIDNO:l的hPCSK9序列內(nèi)的位置列于表2中。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>pro-前結(jié)構(gòu)域,cat-催化結(jié)構(gòu)域，crd=富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域圖2是hPCSK9的三維結(jié)構(gòu)模型。下列線性表位組在三維模型中是鄰近的前結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域l(SEQIDNO2和SEQIDNO3);催化結(jié)構(gòu)域和催化/富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域2(SEQIDNO4和SEQIDNO12);催化結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域3(SEQIDNOS、SEQIDNO7和SEQIDNO10);催化結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域4(SEQIDNO6和SEQIDNO8);催化結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域5(SEQIDNO9和SEQIDNO11);富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域6(SEQIDNO:13、SEQIDNO;14和SEQIDNO:15);和富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域中的區(qū)域7(SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18)。這些表位組中的氨基酸殘基形成非線性表位。本文中使用的術(shù)語"抗體，，是指完整抗體或其抗原結(jié)合片段(即，"抗原結(jié)合部分")或單鏈(即，輕鏈或重鏈)。完整抗體是包含通過二疏鍵互連的至少2個(gè)重(H)鏈和輕(L)鏈的糖蛋白。各重鏈由重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1、CH2和CH3組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VO和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL組成。VH和Vt區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分成稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，其與稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域相間分布。各VH和VL由按照下列從氨基端至羧基端的順序排列的3個(gè)CDR和4個(gè)FR組成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括各種免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq))的結(jié)合。本文中使用的術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"是指完整抗體的一個(gè)或多個(gè)片段，所迷片段保持特異性結(jié)合給定的抗原(例如，hPCSK9)的能力?？贵w的抗原結(jié)合功能可通過完整抗體的片段來實(shí)現(xiàn)。涵蓋在術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中的結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab片段一一由Vl、Vh、Cl和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價(jià)片段；F(ab)2片段一一包含在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個(gè)Fab片段(通常一個(gè)來自重鏈且一個(gè)來自輕鏈)的二價(jià)片段；由Vh和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；由抗體單臂的Vl^和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)片段(Ward等人，1989Nature341:544-546);和分離的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域Vl和VH可以由分開的基因編碼，但也可以使用重組方法通過人工肽接頭將它們連接起來使得它們能夠形成為單個(gè)蛋白質(zhì)鏈，在該單鏈中Vl和VH區(qū)域配對形成單價(jià)分子(稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如，Bird等人，1988Science242:423-426;和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。此類單鏈抗體可以包含抗體的一個(gè)或多個(gè)"抗原結(jié)合部分"。這些抗體片段可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)來獲得，并且可以以和完整抗體相同的方式篩選有用的片段。還可將抗原結(jié)合部分摻入單結(jié)構(gòu)域抗體、maxibody、微型抗體(minibody)、胞內(nèi)抗體(intrabody)、雙抗體(diabody)、三抗體(triabody)、四抗體(tetrabody)、v-NAR和雙-scFv(參見，例如，Hollinger和Hudson,2005，NatureBiotechnology,23，9，1126-1136)?？蓪⒖贵w的抗原結(jié)合部分移植入基于多肽例如III型纖連蛋白(Fn3)的支架(參見美國專利6,703,199，其描述了纖連蛋白多肽單抗體(monobody))。可將抗原結(jié)合部分摻入包含一對串聯(lián)Fv區(qū)段(Vh-CH1-Vh-CH1)的羊鏈分子，所述單鏈分子可以與互補(bǔ)輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等人，1995ProteinEng.8(10):1057-1062;和美國專利5,641,870)。本文中使用的"分離的PCSK9結(jié)合分子"是指這樣的結(jié)合分子，其基本上不含對于非PCSK9抗原具有抗原特異性的分子，例如，特異性結(jié)合hPCSK9的分離的抗體基本上不含有特異性結(jié)合非hPCSK9抗原的抗體。然而，特異性結(jié)合hPCSK9的分離的結(jié)合分子可與其他抗原例如來自其他物種的PCSK9分子具有交叉反應(yīng)性。如果結(jié)合分子基本上不含有細(xì)胞物質(zhì)，那么其是"純化的"。本文中使用的術(shù)語"單克隆抗體組合物"是指具有單一分子組成的抗體分子制備物。單克隆抗體組合物展示對于特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。本文中使用的術(shù)語"人抗體"旨在包括具有其中構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均來源于人源序列的可變區(qū)的抗體。此外，如果抗體包含恒定區(qū)，則恒定區(qū)也來源于這樣的人序列，例如，人胚系序列或人胚系序列的突變形式。本發(fā)明的人抗體可包括非由人序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機(jī)或定點(diǎn)誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變)。然而，本文中使用的術(shù)語"人抗體"無意包括下述抗體，在所迷抗體中來源于另一種哺乳動(dòng)物種例如小鼠的胚系的CDR序列已被移植至人構(gòu)架序列上。術(shù)語"人單克隆抗體，，是指展示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有其中的構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均來源于人序列的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，人單克隆抗體由雜交瘤產(chǎn)生，所述雜交瘤包括從轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物(例如，具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠)獲得的、與永生化細(xì)胞融合的B細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語"重組人抗體，，包括通過重組方式制備的、表達(dá)的、產(chǎn)生的或分離的任何人抗體，例如^^A免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物(例如，小鼠)或由其制備的雜交瘤分離的抗體；從經(jīng)轉(zhuǎn)化表達(dá)人抗體的宿主細(xì)胞，例如從轉(zhuǎn)染瘤(transfectoma)，分離的抗體；從重組的組合人抗體文庫分離的抗體；和通過涉及將人免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接成另一DNA序列的任何其他方法，制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。此類重組人抗體具有構(gòu)架區(qū)和CDR區(qū)均來源于人胚系免疫球蛋白序列的可變區(qū)。然而，在某些實(shí)施方案中，可將此類重組人抗體進(jìn)行體外誘變(或，當(dāng)4吏用人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，體內(nèi)體細(xì)萬包i秀變)，從而重纟且抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列雖然來源于人胚系Vh和Vl序列并與其相關(guān)，卻可以是不在人的人抗體胚系庫(germlinerepertoire)中天然存在的序列。如本文中所使用的，"同種型，，指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(例如，IgM、IgE、IgG例如IgGl或IgG4)。短語"識(shí)別抗原的抗體"和"抗原特異性抗體"在本文中可與術(shù)語"特異性結(jié)合抗原的抗體"互換使用。如本文中使用的，"特異性結(jié)合PCSK9"的PCSK9結(jié)合分子(例如，抗體或其抗原結(jié)合部分)意指以1x10—7M或更小的Kd結(jié)合PCSK9的PCSK9結(jié)合分子。"與抗原交叉反應(yīng)"的PCSK9結(jié)合分子(例如，抗體)意指以lx10'6M或更小的Kd結(jié)合抗原的PCSK9結(jié)合分子。"不與給定抗原交叉反應(yīng)"的PCSK9結(jié)合分子(例如，抗體)意指對給定抗原的結(jié)合不能被檢測到的或以1x10-5M或更大的Ku結(jié)合給定抗原的PCSK9結(jié)合分子。在某些實(shí)施方案中，不與抗原交叉反應(yīng)的此類結(jié)合分子在標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測定試驗(yàn)中基本上不展示可檢測的對此類蛋白質(zhì)的結(jié)合。如本文中使用的，術(shù)語"高親和力"，當(dāng)指IgG抗體時(shí)，表示抗體對于靶抗原具有10—9M或更小的KD。如本文中使用的，術(shù)語"在特定氨基殘基內(nèi)的或與之重疊的表位，，是指包含這些殘基的全部或部分、或由這些殘基的全部或部分組成、或與這些殘基的全部或部分重疊的表位。術(shù)語"表位"或"抗原決定簇"是抗原上與本發(fā)明的PCSK9結(jié)合分子特異性結(jié)合的位點(diǎn)。表位可從連續(xù)氨基酸或從通過蛋白質(zhì)的三級折疊而靠在一起的非連續(xù)氨基酸形成。從連續(xù)氨基酸形成的表位通常在暴露于變性溶31劑時(shí)仍然得到保持，而通過三級折疊形成的表位在用變性溶劑處理時(shí)通常會(huì)喪失。表位通常以獨(dú)特的空間構(gòu)象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)氨基酸。確定表位的空間構(gòu)象的方法包括本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)和本文中描述的技術(shù)，例如X射線衍射晶體學(xué)和2-維核磁共振(參見，例如，EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66巻，G.E.Morris,Ed.(1996))。本發(fā)明還包括與本文中描述的PCSK9結(jié)合分子結(jié)合(即，識(shí)別)相同表位的PCSK9結(jié)合分子。結(jié)合相同表位的PCSK9結(jié)合分子可通過它們與參照PCSK9結(jié)合分子以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著方式交叉竟?fàn)幇锌乖?即，竟?fàn)幮砸种茖Π铱乖慕Y(jié)合)的能力來鑒定。例如，如果PCSK9結(jié)合分子結(jié)合相同的或結(jié)構(gòu)上相似的表位(例如，重疊表位)或空間上緊鄰的表位(所W位，當(dāng)被結(jié)合時(shí)，引起抗體之間的空間位阻)時(shí)，竟?fàn)幮砸种瓶砂l(fā)生。竟?fàn)幮砸种瓶墒褂贸Ｒ?guī)測定法來測定，在所述測定中，受試PCSK9結(jié)合分子抑制參照PCSK9結(jié)合分子對共同抗原的特異性結(jié)合。許多類型的竟?fàn)幮越Y(jié)合測定法是已知的，例如固相直接或間接放射免疫測定法(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定法(EIA)、夾心竟?fàn)帨y定法(參見Stahli等人，MethodsinEnzymology9:242(1983));固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人，J.Immunol.137:3614(1986));固相直接標(biāo)記測定法、固相直接標(biāo)記夾心測定法(參見Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryMa畫l，ColdSpringHarborPress(1988));使用1-125標(biāo)記的固相直接標(biāo)記RIA(參見Morel等人，Mol.Immunol.25(1):7(1988));固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology176:546(1990));和直接標(biāo)記RIA(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32:77(19卯))。通常，未標(biāo)記的受試PCSK9結(jié)合分子和已標(biāo)記的參照PCSK9結(jié)合分子。竟?fàn)幮砸种瓶赏ㄟ^測定在受試PCSK9結(jié)合分子存在的情況下結(jié)合至固相表面或細(xì)胞上的標(biāo)記物量來確定。通常，使受試PCSK9結(jié)合分子過量存在。通常，當(dāng)竟?fàn)幮訮CSK9結(jié)合分子過量存在時(shí)，其可以對參照PCSK9結(jié)合分子與共同抗原的特異性結(jié)合造成至少50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更多的抑制。其他技術(shù)包括例如表位作圖法，例如，可以提供表位的原子分辨的抗原PCSK9結(jié)合分子復(fù)合物晶體X射線分析。其他方法可以監(jiān)測PCSK9結(jié)合分子對抗原片段或抗原的突變變異的結(jié)合，其中由于抗原序列內(nèi)的氨基酸殘基改變而引起的結(jié)合喪失通常被認(rèn)為指示著表位組分。此外，還可以使用用于表位作圖的計(jì)算組合法。此類方法依賴于目的PCSK9結(jié)合分子從組合噬菌體展示肽文庫中親和分離特定短肽的能力。之后，所述肽可以被用作線索以確定相應(yīng)于用于篩選肽文庫的PCSK9結(jié)合分子的表位。關(guān)于表位作圖，也已開發(fā)出已經(jīng)被證實(shí)可以對不連續(xù)的構(gòu)象表位作圖的計(jì)算機(jī)算法。如本文中使用的，術(shù)語"受試者"包括任何人或非人動(dòng)物。術(shù)語"非人動(dòng)物，，包括所有非人脊推動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物，例如非人靈長類動(dòng)物、嚙齒類動(dòng)物、兔子、綿羊、狗、貓、馬、牛、鳥、兩棲動(dòng)物、爬行類動(dòng)物等。如果核苷酸序列已被改變以使用在生產(chǎn)性細(xì)胞或生物體(通常為真核細(xì)胞，例如酵母例如畢赤酵母的細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)或人細(xì)胞)中優(yōu)選的密碼子編碼氨基酸序列，則該核苦酸序列被稱作"優(yōu)化的"。可以對優(yōu)化的核苷酸序列進(jìn)行工程改造以與原初的起始核苦酸序列(也稱為"親本"序列)編碼相同或幾乎相同的氨基酸序列。如本文中使用的，術(shù)語"humaneered抗體"是指結(jié)合相同表位但序列不同的抗體。示例性技術(shù)包括通過Kalobios的humaneering技術(shù)產(chǎn)生的humaneered抗體，其中抗原結(jié)合區(qū)的序列通過例如突變而非由保守氨基酸置換來產(chǎn)生(參見例如，WO2004/072266，WO2005/069970)。在以下部分中更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的多個(gè)方面估量分子結(jié)合不同物種的PCSK9以及PCSK9的特定表位的能力的標(biāo)準(zhǔn)測定法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，包括例如ELISA和western印跡法。確定PCSK9結(jié)合分子是否結(jié)合PCSK9的特定表位可使用肽表位竟?fàn)幮詼y定法。例如，將PCSK9結(jié)合分子與相應(yīng)于目的PCSK9表位的肽在飽和肽濃度一起孵育。可以例如通過Biacore⑧分析，檢測預(yù)孵育的PCSK9結(jié)合分子對固定的PCSK9的結(jié)合。如果與肽的預(yù)孵育導(dǎo)致PCSK9結(jié)合被抑制，則表明PCSK9結(jié)合分子結(jié)合該肽表位(參見，例如，美國專利發(fā)明者D·L·約韋,D·米克哈伊洛夫,T·弗萊明申請人:諾瓦提斯公司