專利名稱：用于確定對血管內(nèi)皮生長因子受體2調(diào)節(jié)劑的敏感性的生物標(biāo)志物和方法
用于確定對血管內(nèi)皮生長因子受體2調(diào)節(jié)劑 的敏感性的生物標(biāo)志物和方法本申請根據(jù)美國法典第35編第119條(e)要求享有2007年4月13曰提 交的美國臨時(shí)申請序列號60/911,547的權(quán)益。本申請?jiān)⑷朐撋暾埖娜拷虒?dǎo)。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及藥物基因組學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，涉及用于在患者 中監(jiān)測應(yīng)答或確定敏感性的的方法和程序，以鑒定個(gè)體化的遺傳概貌 (genetic profile),這將有助于疾病和病癥的治療。發(fā)明背景癌癥是一種在組織臨床學(xué)上具有高度異質(zhì)性的疾病。盡管人們已經(jīng)將 常規(guī)的組織學(xué)和臨床特征與預(yù)后關(guān)聯(lián)起來，但是相同的腫瘤表觀預(yù)后類型 在其對治療的反應(yīng)性和患:者的結(jié)果生存率上存在很大變化。需要新的預(yù)后性和預(yù)測性標(biāo)志物(其有助于針對每位患者提供個(gè)體化的 療法)來在臨床上準(zhǔn)確預(yù)測患者對治療(諸如小分子或生物分子藥物)的應(yīng) 答。這個(gè)問題可以通過鑒定能夠更好地預(yù)測患者對治療的敏感性的新參數(shù) 來解決。患者樣品的分類是癌癥診斷和治療的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過將患者 對治療的應(yīng)答與分子和遺傳標(biāo)志物關(guān)聯(lián)起來，可以為非應(yīng)答性患者提供新 的開發(fā)治療方法的機(jī)會(huì)，或者可以因?yàn)槟撤N治療的功效的可信度更高而突 出其相對于其它治療選項(xiàng)的適用性。此外，對有可能對藥品、藥物或聯(lián)合 療法產(chǎn)生良好應(yīng)答的患者的預(yù)選能夠減少臨床研究需要的患者數(shù)量或加快 完成臨床開發(fā)方案所需的時(shí)間(M. Cockett et al., Current Opinion in Biotechnology, 11:602-609 (2000》。確定哪些患者對抗血管發(fā)生療法(諸如VEGFR-2調(diào)節(jié)劑)有應(yīng)答或預(yù)測 患者的藥物敏感性的能力是特別有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樗幬飸?yīng)答不僅反映了靶 細(xì)胞內(nèi)在的特性，而且反映了宿主的代謝特性。利用遺傳信息預(yù)測或監(jiān)測藥物應(yīng)答的努力主要集中于具有廣泛作用的個(gè)別基因，諸如多藥抗性基因mdrl和mrpl (P. Sonneveld， J. Intern. Med.， 247:521-534 (2000》。隨著大規(guī)模表征基因mRNA表達(dá)模式的微陣列技術(shù)的發(fā)展，人們已有 可能系統(tǒng)地尋找分子標(biāo)志物和將癌癥分類為迥異的亞群，而這些亞群在傳 統(tǒng)的組織病理學(xué)方法下是不明顯的(J. Khan et al.， Cancer Res.， 58:5009-5013 (1998); A.A. Alizadeh et al" Nature, 403:503-511 (2000); M. Bittner et al.， Nature, 406:536-540 (2000); J. Khan et al" Nature Medicine, 7(6):673-679 (2001); and T.R. Golub et al" Science, 286:531-537 (1999); U. Alon et al" P.N.A.S. USA, 96:6745-6750 (1999))。這類技術(shù)和分子工具為在任意指定時(shí) 間監(jiān)測細(xì)胞群內(nèi)大量轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平提供了可能(參見，例如，Schena et al.: Science, 270:467-470 (1995); Lockhart et al" Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Blanchard et al., Nature Biotechnology, 14:1649 (1996); Ashby等的美國專利號5,569,588)。最近的研究顯示，由人腫瘤的微陣列分析產(chǎn)生的基因表達(dá)信息可以預(yù) 測臨床結(jié)果(L丄van，t Veer et al., Nature, 415:530-536 (2002); M. Shipp et al.， Nature Medicine, 8(1 ):68-74 (2002); G. Glinsky et al.， J. Clin. Invest" 113(6):913-923 (2004))。這些發(fā)現(xiàn)為更好地預(yù)測和監(jiān)測個(gè)體腫瘤對療法的應(yīng) 答，從而極大地改進(jìn)癌癥治療提供了希望。PCT申請?zhí)朠CT/US2006/034201提供了可用于鑒定對包含施用 VEGFR-2調(diào)節(jié)劑的癌癥療法會(huì)產(chǎn)生治療應(yīng)答的哺乳動(dòng)物的生物標(biāo)志物。需要新的和替代性的確定藥物敏感性或監(jiān)測患者應(yīng)答的方法和程序來 為個(gè)體化診斷的開發(fā)提供條件。個(gè)體化診斷對于基于患者的分子水平應(yīng)答 的疾病和病癥治療而言是必需的。發(fā)明概述本發(fā)明還提供用于確定患者對一種或多種二元VEGFR-2 (血管內(nèi)皮生 長因子受體2)/FGFRl (成纖維細(xì)胞生長因子受體l)調(diào)節(jié)劑的敏感性，或在 分子水平監(jiān)測對上述調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答的方法和步驟。本發(fā)明還提供在進(jìn)行治 療之前確定或預(yù)測需要治療疾病狀況(諸如癌癥)的個(gè)體是否會(huì)對治療產(chǎn)生 應(yīng)答的方法，其中所述治巧包括施用一種或多種二元VEGFR-2/FGFR1調(diào)節(jié) 劑(dual VEGFR-2/FGFR1 modulators)。 所述一種或多種二元VEGFR_2/FGFR1調(diào)節(jié)劑可以是小分子，單克隆抗體，反義分子或它們的等 同物，RNAi分子或者它們的等同物，等等。
本發(fā)明還提供用于確定患者對一種或多種血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR-2)調(diào)節(jié)劑的敏感性或在分子水平上監(jiān)測對所述調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答的方 法和程序。本發(fā)明還提供在進(jìn)行治療之前確定或預(yù)測需要治療疾病狀況(諸 如癌癥)的個(gè)體是否會(huì)對治療產(chǎn)生應(yīng)答的方法，其中所述治療包括施用 一種 或多種VEGFR-2調(diào)節(jié)劑。所述一種或多種VEGFR-2調(diào)節(jié)劑是可以選自， 例如，以下各項(xiàng)的化合物 一種或多種VEGFR-2特異性配體， 一種或多種 小分子VEGFR-2抑制劑，或一種或多種VEGFR-2結(jié)合性單克隆抗體。 本發(fā)明提供用于確定患者對一種或多種FGFR-1調(diào)節(jié)劑的敏感性或在分子 水平上監(jiān)測對所述調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答的方法和程序。本發(fā)明還提供在進(jìn)行治療 之前確定或預(yù)測需要治療疾病狀況(諸如癌癥)的個(gè)體是否會(huì)對治療產(chǎn)生應(yīng) 答的方法，其中所述治療包括施用一種或多種FGFR-1調(diào)節(jié)劑。所述一種或 多種FGFR-1調(diào)節(jié)劑可以是，例如，選自以下各項(xiàng)的化合物 一種或多種 FGFR-1特異性配體， 一種或多種小分子FGFR-1抑制劑，或一種或多種 FGFR-1結(jié)合性單克隆抗體。
一方面，本發(fā)明提供 一 種預(yù)測哺乳動(dòng)物對包括施用調(diào)節(jié)劑的癌癥治療 方法產(chǎn)生治療應(yīng)答的可能性的方法，其中所述方法包括(a)測量哺乳動(dòng)物 中的FGF2水平；(b)將哺乳動(dòng)物暴露于選自下組的所述調(diào)節(jié)劑二元 VEGFR-2/FGFR-l調(diào)節(jié)劑，VEGFR-2調(diào)節(jié)劑和FGFR-1調(diào)節(jié)劑；(c)在步驟 (b)的暴露后，測量哺乳動(dòng)物中的FGF2水平，其中與步驟(a)中測量到的FGF2 水平相比，步驟(c)中FGF2水平的增加指示哺乳動(dòng)物將對所述癌癥療法產(chǎn)生 治療應(yīng)答的可能性增加。
另一方面，生物標(biāo)志物可以包括FGF2以及一種或多種其他生物標(biāo)志 物，諸如，F(xiàn)GF1, VEGFR-2或IV型膠原。
本領(lǐng)域技術(shù)人員利用已知的技術(shù)，可以容易地確定足以指示哺乳動(dòng)物 是否將會(huì)對癌癥療法產(chǎn)生治療應(yīng)答的生物標(biāo)志物水平差異?？梢詾樯飿?biāo) 志物水平的增加或降低建立關(guān)聯(lián)，以確定所述差異是否足以鑒定出將產(chǎn)生
治療應(yīng)答的哺乳動(dòng)物。對于足夠的生物標(biāo)志物水平差異而言，在一個(gè)方面， 可以在確定哺乳動(dòng)物是否將對治療產(chǎn)生治療應(yīng)答之前預(yù)先加以確定。在一 個(gè)方面，生物標(biāo)志物水平的差異是mRNA水平的差異(例如，通過RT-PCR或微陣列來加以測量)，諸如表達(dá)水平的至少約兩倍的差異，至少約三倍的
差異，或至少約四倍的差異，或更高。在另一個(gè)方面，通過質(zhì)譜法或FISH 或IHC在蛋白水平上確定生物標(biāo)志物的差異。在又一個(gè)方面，生物標(biāo)志物 水平的差異是指Anova分析中p值〈0.05。在另又一個(gè)方面，所述差異是在 ELISA分析法中測定的。
如本文使用的，所謂產(chǎn)生治療應(yīng)答，是指癌癥的減輕或去除。這表示 患癌個(gè)體的預(yù)期壽命將延長，或癌癥的一種或多種癥狀將減輕或改善。該 術(shù)語涵蓋癌性細(xì)胞生長的減弱或肺瘤體積的減小。哺乳動(dòng)物是否產(chǎn)生治療 應(yīng)答可以通過本領(lǐng)域公知的許多方法測量，諸如PET成像。
哺乳動(dòng)物可以是，例如，人，大鼠，小鼠，狗，兔，豬，綿羊，牛， 馬，貓，靈長類動(dòng)物，或猴。
本發(fā)明的方法可以是例如體外方法，其中測量哺乳動(dòng)物的至少一種生 物標(biāo)志物水平的步驟包括從哺乳動(dòng)物采取生物樣品，然后測量該生物樣品 中所述生物標(biāo)志物的水平。生物樣品可以包括，例如,血清，新鮮的全血， 外周血單個(gè)核細(xì)胞，冷凍的全血，新鮮血漿，冷凍血漿，尿液，唾液，皮 膚，毛嚢，骨髓或腫瘤組織中的至少一種。
至少一種生物標(biāo)志物的水平可以是，例如，生物標(biāo)志物的蛋白和/或 mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平。
在另 一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測哺乳動(dòng)物對包含施用調(diào)節(jié)劑的癌癥 療法產(chǎn)生治療應(yīng)答的可纟k性的方法，其中所述方法包括(a)將哺乳動(dòng)物暴 露于所述調(diào)節(jié)劑(b)在步驟(a)的暴露后，測量該哺乳動(dòng)物的FGF2水平， 其中與未暴露于所述調(diào)節(jié)劑的哺乳動(dòng)物的生物標(biāo)志物的水平相比，步驟(b) 中所測FGF2水平的增加提示哺乳動(dòng)物將對所述癌癥療法產(chǎn)生治療應(yīng)答的 可能性增加，其中所述調(diào)節(jié)劑選自下組二元VEGFR-2/FGFR-l調(diào)節(jié)劑， VEGFR-2調(diào)節(jié)劑和FGFR-1調(diào)節(jié)劑。
另一方面，本發(fā)明提供一種確定化合物是否抑制哺乳動(dòng)物的VEGFR-2 活性的方法，包括(a)將哺乳動(dòng)物暴露于所述化合物；和(b)在步驟(a)的暴 露后，檢測哺乳動(dòng)物的FGF2水平，其中與未暴露于所述化合物的哺乳動(dòng) 物的FGF2水平相比，步驟(b)中所測FGF2水平的差異指示所述化合物抑制 哺乳動(dòng)物的VEGFR-2活性。
另一方面，本發(fā)明提供一種確定化合物是否抑制哺乳動(dòng)物的VEGFR-2活性的方法，包括(a)將哺乳動(dòng)物暴露于所述化合物；和(b)在步驟(a)的暴 露后，測量哺乳動(dòng)物的膠原IV水平，其中與未暴露于所述化合物的哺乳動(dòng) 物的膠原IV水平相比，步驟(b)中所測得的膠原IV水平的差異指示所述化 合物抑制哺乳動(dòng)物的VEGFR-2活性
另一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)測癌癥患者是否正在接受有效劑量的包 含施用VEGFR-2調(diào)節(jié)劑的癌癥治療的方法，包括以下步驟(a)測量來自所 述患者樣品的膠原IV的水平；和(b)將所述樣品的膠原IV水平與標(biāo)準(zhǔn)比較， 其中所述樣品的膠原IV水平相對于所述標(biāo)準(zhǔn)減少指示患者正在接受治療上 有效的劑量的所述癌癥治療的可能性增加，而所述樣品的膠原IV水平相對 于所述標(biāo)準(zhǔn)增加或不變指示所述患者正在接受治療上有效的劑量的所述癌 癥治療的可能性降低。所述癌癥治療可以是本文所列的任意一項(xiàng)治療，可 以包括，例如，VEGFR-2調(diào)節(jié)劑的施用，或二元VEGFR-2/FGF調(diào)節(jié)劑的 施用。在所述患者被預(yù)測沒有接受有效劑量的所述癌癥治療的情況下，可 能有理由以更高的劑量或給藥頻率，單獨(dú)地或與其它治療聯(lián)合地施用所述 治療。
在又一方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物是否已暴露于(has been exposed to)抑制VEGFR-2活性的化合物的方法，所述方法包括(a)將哺乳 動(dòng)物暴露于所述化合物；和(b)在步驟(a)的暴露后，檢測哺乳動(dòng)物的FGF2 水平，其中與未暴露于所述化合物的哺乳動(dòng)物的FGF2水平相比，步驟(b) 中所測FGF2水平的差異指示哺乳動(dòng)物已經(jīng)暴露于抑制VEGFR-2活性的化 合物。
在又一方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物是否已暴露于(has been exposed to)抑制VEGFR-2活性的化合物的方法，所述方法包括(a)將哺乳 動(dòng)物暴露于所述化合物；和(b)在步驟(a)的暴露后，測量哺乳動(dòng)物的膠原IV 水平，其中與未暴露于所述化合物的哺乳動(dòng)物的膠原IV水平相比，步驟(b) 中所測得的膠原IV水平的差異指示哺乳動(dòng)物已經(jīng)暴露于抑制VEGFR-2活 性的化合物。
在又一方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物是否正在對抑制VEGFR-2 活性的化合物產(chǎn)生應(yīng)答的方法，所述方法包括(a)將哺乳動(dòng)物暴露于所述 化合物；和(b)在步驟(a)的暴露后，檢測哺乳動(dòng)物的FGF2水平，其中與未 暴露于所述化合物的哺乳動(dòng)物的FGF2水平相比，步驟(b)中所測FGF2水平的差異指示哺乳動(dòng)物正在對抑制VEGFR-2活性的化合物產(chǎn)生應(yīng)答。
在又一方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物是否正在對抑制VEGFR-2 活性的化合物的產(chǎn)生應(yīng)答的方法，所述方法包括(a)將哺乳動(dòng)物暴露于所 述化合物；和(b)在步驟(a)的暴露后，測量哺乳動(dòng)物的膠原IV水平，其中與 未暴露于所述化合物的哺乳動(dòng)物的膠原IV水平相比，步驟(b)中所測膠原IV 水平的差異指示哺乳動(dòng)物正在對抑制VEGFR-2活性的化合物產(chǎn)生應(yīng)答。
在又一方面，本發(fā)明提供一種確定化合物是否抑制哺乳動(dòng)物的FGFR-1 活性的方法，所述方法包括(a)將哺乳動(dòng)物暴露于所述化合物；和(b)在步 驟(a)的暴露后，測量哺乳動(dòng)物的FGF2水平，其中與未暴露于所述化合物 的哺乳動(dòng)物的FGF2水平相比，步驟(b)中所測FGF2水平的差異指示所述化 合物抑制哺乳動(dòng)物的FGFR-1活性。
在又一方面，本發(fā)明提供一種確定化合物是否抑制哺乳動(dòng)物的FGFR-1 活性的方法，包括(a)將哺乳動(dòng)物暴露于所述化合物；和(b)在步驟(a)的暴 露后，測量哺乳動(dòng)物的膠原IV,其中與未暴露于所述化合物的哺乳動(dòng)物的 膠原IV水平相比，步驟(b)中所測得的膠原IV水平的差異指示所述化合物 抑制哺乳動(dòng)物的FGFR-1活性。
在另又一方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物是否已暴露于(has been exposedto)抑制FGFR-1活性的4t合物的方法，所述方法包4舌(a)將哺乳動(dòng) 物暴露于所述化合物；和(b)在步驟(a)的暴露后，測量哺乳動(dòng)物的FGF2水 平，其中與未暴露于所述化合物的哺乳動(dòng)物的FGF2水平相比，步驟(b)中 所測得的FGF2水平的差異指示哺乳動(dòng)物已經(jīng)暴露于抑制FGFR-1活性的化 合物。
在另又一方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物是否已暴露于抑制 FGFR-1活性的化合物的方法，所述方法包括(a)將哺乳動(dòng)物暴露于所述化 合物；和(b)在步驟(a)的暴露后，測量哺乳動(dòng)物的膠原IV水平，其中與未暴 露于所述化合物的哺乳動(dòng)物的膠原IV水平相比，步驟(b)中所測得的膠原IV 水平的差異指示哺乳動(dòng)物已暴露于抑制FGFR-1活性的化合物。
在又一方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物是否正在對抑制FGFR-1活 性的化合物的產(chǎn)生應(yīng)答的方法，所述方法包括(a)將哺乳動(dòng)物暴露于所述 化合物；和(b)在步驟(a)的暴露后，測量哺乳動(dòng)物的FGF2水平，其中與未 暴露于所述化合物的哺乳動(dòng)物的FGF2水平相比，步驟(b)中所測FGF2水平的差異指示哺乳動(dòng)物正在對抑制FGFR-1活性的化合物產(chǎn)生應(yīng)答。
在又一方面，本發(fā)明提供一種確定哺乳動(dòng)物是否正在對抑制FGFR-1活 性的化合物的產(chǎn)生應(yīng)答的方法，包括(a)將哺乳動(dòng)物暴露于所述化合物； 和(b)在步驟(a)的暴露后，測量哺乳動(dòng)物的膠原IV水平，其中與未暴露于所 述化合物的哺乳動(dòng)物的膠原IV水平相比，步驟(b)中所測膠原IV水平的差 異指示哺乳動(dòng)物正在對抑制FGFR-1活性的化合物產(chǎn)生應(yīng)答。
如本文使用的，"產(chǎn)生應(yīng)答"涵蓋哺乳動(dòng)物中藉由生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)應(yīng) 答、以及臨床應(yīng)答(比如癥狀的改善，治療效果，或不良事件)作出的應(yīng) 答。
本發(fā)明還提供分離的FGF2生物標(biāo)志物，分離的FGF1生物標(biāo)志物，分 離的VEGFR-2生物標(biāo)志物，和分離的IV型膠原生物標(biāo)志物。本發(fā)明的生 物標(biāo)志物包括全長FGF2、 FGF1 、 VEGFR-2和IV型膠原的核苷酸和氨基酸 序列，及其片段和變體。
本發(fā)明還提供包括本發(fā)明兩種或更多種生物標(biāo)志物的生物標(biāo)志物系列。
本發(fā)明還提供用于確定或預(yù)測患者對包括一種或多種VEGFR-2調(diào)節(jié) 劑、 一種或多種FGFR-1調(diào)節(jié)劑或一種或多種二元VEGFR-2/FGFR-l調(diào)節(jié)
劑的治療是否敏感或耐藥的試劑盒。所述患者可能患有癌癥或腫瘤，例如， 結(jié)腸癌癥或腫瘤。
在一方面，試劑盒包括合適的容器，所述容器包括用于測試來自患者 組織標(biāo)本或患者樣品的細(xì)胞的一種或多種本發(fā)明的專用微陣列、 一種或多 種VEGFR-2調(diào)節(jié)劑、 一種或多種FGFR-1調(diào)節(jié)劑或一種或多種二元 VEGFR-2 / FGFR-1調(diào)節(jié)劑，和使用說明書。試劑盒還可以包括用于在mRNA 或蛋白水平上監(jiān)測生物標(biāo)志物系列之表達(dá)的試劑或材料。
在另一方面，本發(fā)明提供包括兩種或更多種生物標(biāo)志物的試劑盒。
在又一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括用于測量選自FGF2、 FGF1、 VEGFR-2和IV型膠原中的至少一種物質(zhì)之存在的抗體和核酸中的 至少一種。在一個(gè)方面，所述試劑盒還包括用于確定哺乳動(dòng)物是否將對癌 癥療法產(chǎn)生治療應(yīng)答的說明書，所述癌癥療法包括施用抑制VEGFR-2活性、 FGFR-1活性或二元VEGFR-2/FGFR-1活性的化合物。
本發(fā)明還提供用于確定患者將對利用一種或多種VEGFR-2調(diào)節(jié)劑、一種或多種FGFR-1調(diào)節(jié)劑或一種或多種二元VEGFR-2/FGFR-l調(diào)節(jié)劑的治 療敏感或是耐藥的篩選分析法。
本發(fā)明還提供一種監(jiān)測對患有疾病的患者的治療的方法，其中所述疾 病通過包括施用 一種或多種VEGFR-2調(diào)節(jié)劑， 一種或多種FGFR-1調(diào)節(jié)劑， 或一種或多種二元VEGFR-2 / FGFR-1調(diào)節(jié)劑的方法進(jìn)行治療。
本發(fā)明還提供在分子水平基于患者應(yīng)答治療疾病和病癥必需的個(gè)體化 遺傳概貌。
本發(fā)明還提供包括一種或多種生物標(biāo)志物的專用微陣列，例如寡核香 酸微陣列或cDNA微陣列，所述生物標(biāo)志物具有與針對一種或多種 VEGFR-2調(diào)節(jié)劑， 一種或多種FGFR-1調(diào)節(jié)劑，或一種或多種二元VEGFR-2 / FGFR-1調(diào)節(jié)劑的敏感性或耐藥性相關(guān)聯(lián)的表達(dá)模式。
本發(fā)明還提供針對 一種或多種本發(fā)明的生物標(biāo)志物的抗體，包括多克 隆或單克隆抗體。
當(dāng)閱讀本發(fā)明的詳細(xì)說明并結(jié)合附圖后將更好的理解本發(fā)明。
附圖簡述
本專利的文件包含至少一幅彩色的附圖。根據(jù)要求并支付必要費(fèi)用后， 專利與商標(biāo)局將提供包括彩圖的本專利的拷貝。

圖1 (圖1A-1C)顯示IV型膠原的IHC結(jié)果。 圖2 (圖2A-2B)顯示VEGFR-2的IHC結(jié)果。 圖3 (圖3A-3C)顯示FGF1的IHC結(jié)果。 圖4 (圖4A-4D)顯示FGF2的IHC結(jié)果。
圖5顯示應(yīng)答者和非應(yīng)答者中腫瘤從基線起的百分比變化對FGF2染色 的箱線圖。
圖6顯示Kaplan-Meier曲線，其顯示隨時(shí)間的無進(jìn)展生存。
圖7所示結(jié)果顯示brivanib調(diào)節(jié)FGF2生長因子基因表達(dá)水平而貝伐 單抗(bevacizumab)不調(diào)節(jié)，盡管brivanib和貝伐單抗均調(diào)節(jié)VEGF基因表達(dá) 水平。顯示的結(jié)果獲自AFFYMETRIX⑧人陣列。
圖8所示結(jié)果顯示在體外brivanib抑制FGF2誘導(dǎo)下的腫瘤細(xì)胞系生 長的IC50值比舒尼替尼(sunitinib)低得多。
圖9顯示brivanib敏感性和brivanib耐藥性胂瘤細(xì)胞系中FGFR1、
12FGF2、 VEGFR2和VEGF的mRNA表達(dá)水平。
圖10所示結(jié)果顯示當(dāng)用FGF2刺激增殖時(shí)brivanib直接抑制結(jié)腸癌 細(xì)胞生長。
圖11所示結(jié)果顯示當(dāng)用FGF2刺激增殖時(shí)brivanib直接抑制卵巢癌 和胰腺癌細(xì)胞系生長。
圖12所示結(jié)果顯示與貝伐單抗和舒尼替尼相比，brivanib抑制被 FGF2而不是被VEGF刺激的GEO腫瘤細(xì)胞生長。
圖13顯示利用Western印跡所示的brivanib對FGFR1 、 VEGFR2 、 ERK 和AKT的磷酸化的影響。
圖14顯示對響應(yīng)于FGF2刺激的67種途徑的表達(dá)分析。如其所示，只 有FGF途徑被顯著地誘導(dǎo)。
圖15顯示用1 |am brivanib或l|iim舒尼替尼處理后，響應(yīng)于FGF2刺激 的FGF途徑的表達(dá)分析。如其所示，僅在只有brivanib而非舒尼替尼存在 的條件下FGF2誘導(dǎo)的表達(dá)被消除。
發(fā)明詳述
許多臨床前研究已經(jīng)證明VEGF通過其同源受體(VEGFR跨膜蛋白酪 氨酸激酶家族)在驅(qū)動(dòng)血管生成過程中起著重要作用。尤其值得注意的是， VEGFR-2信號傳導(dǎo)途徑是腫瘤血管發(fā)生的主要驅(qū)動(dòng)者已經(jīng)得到實(shí)驗(yàn)的支 持。VEGFR-2信號途徑是在以AVASTIN (貝伐單抗)的批準(zhǔn)為基礎(chǔ)的癌癥 治療中的一個(gè)經(jīng)臨床驗(yàn)證的途徑，貝伐單抗通過阻止VEGF配體結(jié)合而間 接地抑制該信號途徑。Brivanib已經(jīng)顯示可強(qiáng)力抑制VEGFR-2，并可抑制 FGFR-1和FGFR-2——后者是構(gòu)成血管生成途徑的基礎(chǔ)的另 一蛋白酪氨酸 激酶受體家族，受FGF生長因子的調(diào)節(jié)。人們認(rèn)為brivanib通過抑制多種 重要的血管發(fā)生途徑(VEGF和FGF),在GEO結(jié)腸癌模型中顯示比貝伐單 抗更大的對抑制腫瘤生長能力的影響。
該項(xiàng)生物標(biāo)志物研究已經(jīng)鑒定出了 一組在分子水平上反映抗血管發(fā)生 和抗肺瘤活性的生物標(biāo)志物，brivanib對它們的影響比貝伐單抗更大。這些 生物標(biāo)志物受影響的程度與該體內(nèi)腫瘤模型中觀察到的功效高低密切相 關(guān)。這些生物標(biāo)志物在確定癌癥患者的最佳抗血管發(fā)生療法方面具有重要 的臨床意義。在藥物候選物的臨床開發(fā)中，鑒定出能夠使人們快速、容易地讀取功 效、藥物暴露量或臨床應(yīng)答的生物標(biāo)志物日益重要。本發(fā)明的各實(shí)施方案 包括測量分泌蛋白或血漿生物標(biāo)志物(代表一類生物標(biāo)志物)的水平的變化。 在一個(gè)方面，使用一種易得的材料來源一一血漿樣品作為標(biāo)志物分析的替
代組織(surrogate tissue)。
本發(fā)明提供應(yīng)答特定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)(respond to the modulation of a specific signal transduction pathway)并且也與VEGFR-2調(diào)節(jié)劑敏感性或耐 藥性相關(guān)的生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物可以用于預(yù)測和監(jiān)測針對一種或 多種VEGFR-2調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答。在一個(gè)方面，本發(fā)明的生物標(biāo)志物選自FGF2、 FGFl、 VEGFR-2和IV型膠原，包括多核苷酸和多肽序列。在另一個(gè)方面， 本發(fā)明的生物標(biāo)志物是由于遺傳密碼的筒并性而編碼序列表提供的多肽序 列的核苷酸序列。
所述生物標(biāo)志物可以作為分子工具用來預(yù)測和監(jiān)測針對影響VEGFR-2 活性或VEGFR-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的VEGFR-2調(diào)節(jié)劑的應(yīng)答。
本文使用的"約"當(dāng)涉及測量值諸如數(shù)量、持續(xù)時(shí)間等等時(shí)，其旨在 涵蓋從給定值起± 20%或± 10%的變化，更優(yōu)選± 5%，更優(yōu)選± 1%，和進(jìn) 一步更優(yōu)選的±0.1%,只要這種變化適于實(shí)施本文公開的方法。
測量本文所述任一指定標(biāo)志物水平的方法可以利用本領(lǐng)域公知的方法 來實(shí)施，這樣的方法包括，但不限于PCR; RT-PCR; FISH; IHC;免疫 檢測法；免疫沉淀；Western印跡；ELISA;放射免疫分析；PET成像；HPLC; 表面等離子體共振，和分光光度學(xué)；和質(zhì)譜法，等等。
本發(fā)明的生物標(biāo)志物可以利用本領(lǐng)域已知的任意免疫特異性結(jié)合方法
非竟?fàn)幮苑治鱿到y(tǒng)Western印跡，放射免疫分析，ELISA (酶聯(lián)免疫吸附 測定)，"夾心，，免疫分析，免疫沉淀分析，沉淀素反應(yīng)，凝膠擴(kuò)散沉淀 素反應(yīng)，免疫擴(kuò)散測定，凝集測定，補(bǔ)體固定測定，免疫放射測定，熒光 免疫測定，蛋白A免疫測定，略舉數(shù)例。這類分析法是本領(lǐng)域常規(guī)和公知 的(參見,例濁口， Ausubel et al.， eds.， Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)，其在此完整引入作為參考)。示 例性的免疫測定法在下文簡單描述(但不是意圖構(gòu)成限制)。
免疫沉淀方案通常包括在裂解緩沖液(諸如添加了蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制劑(例如，EDTA, PMSF，抑肽酶，釩酸鈉)的RIPA緩沖液(1% NP-40 或TritonX-100， 1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS, 0.15MNaCl， 0.01 M磷酸鈉 pH7.2， 1。/。TRASYLOL⑧))中裂解細(xì)胞群體，向所述細(xì)胞裂解物中添加感興 趣的抗體(即，針對本發(fā)明的生物標(biāo)志物的抗體)，在4'C溫育一段時(shí)間(例如， 1-4小時(shí))，向所述細(xì)胞裂解物添加蛋白A SEPHAROSE⑧和/或蛋白G SEPHAROSE⑧珠子，在4。C溫育約1小時(shí)或更長時(shí)間，用裂解緩沖液清洗 珠子并將珠子重懸于SDS/樣品緩沖液。感興趣的抗體免疫沉淀特定抗原的 能力可以通過例如western印跡分析來力。以評價(jià)。本領(lǐng)域才支術(shù)人員知道可以 調(diào)節(jié)哪些參數(shù)以增加抗體與抗原的結(jié)合和降低背景(例如，用SEPHAROSE 珠子來對細(xì)胞裂解物進(jìn)行預(yù)澄清)。關(guān)于免疫沉淀方案的進(jìn)一步討論可參見， 例^口， Ausubel等人編,Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 10.16.1 (1994)。
Western印跡分析通常包括制備蛋白樣品，聚丙烯酰胺凝膠(例如， 8%-20%SDS-PAGE，取決于抗原的分子量)中蛋白樣品的電泳，將所述蛋白 樣品從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到膜諸如硝酸纖維素、PVDF或尼龍膜上，在封 閉溶液(例如，含3。/。BSA或脫脂奶的PBS)中封閉膜，用清洗緩沖液(例如， PBS-Tween 20)清洗膜，用封閉緩沖液稀釋的一抗(感興趣的抗體)封閉膜， 用清洗緩沖液清洗膜，用封閉緩沖液稀釋的偶聯(lián)了酶底物(例如，辣根過氧 化物酶或堿性磷酸酶)或放射性分子(例如，32P或1251)的二抗(其識別一抗， 例如，抗人抗體)封閉膜，用清洗緩沖液清洗膜，和測量抗原的存在。本領(lǐng) 域技術(shù)人員了解那些參數(shù)可以加以改變來增加檢測到的信號并減低背景噪 聲。關(guān)于western印跡規(guī)程的進(jìn)一步討論參見，例如，Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1， John Wiley & Sons, Inc., New York, 10.8.1 (1994)。
ELISA包括制備抗原，用所述抗原包被96孔微量滴定板的孔，向孔中 加入偶聯(lián)有可檢測的化合物如酶底物(例如，辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶) 的感興趣抗體并溫育一段時(shí)間，和測量所述抗原的存在。在ELISA中感興 趣的抗體不一定要偶聯(lián)可測量的化合物；而可以向孔中加入偶聯(lián)有可測量 化合物的二抗(其識別感興趣的抗體)。此外，可以不用抗原包被孔，而用抗 體包被孔。在這種情況下，可以在將感興趣的抗原添加到包被的孔之后， 添加偶聯(lián)有可測量的化合物的二抗。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解哪些參數(shù)可以加
15以改變來增加測量到的信號，以及本領(lǐng)域已知的ELISA其他變化。關(guān)于 ELISA的進(jìn)一步討論參見，例如，Ausubel等人編，Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1， John Wiley & Sons, Inc., New York, 11.2.1 (1994)。
或者，可以利用串聯(lián)質(zhì)譜、或與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的一維或多維高效液相 層析鑒定生物標(biāo)志物多肽的相對量。該方法考慮了以下事實(shí)即對于利用 與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的一維或多維高效液相層析分離的、身份已知的蛋白而言， 其片段的數(shù)目的增加與該蛋白在樣品中存在的水平直接相關(guān)。這種方法是 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，在許多出版物中有描述，例如，2-D Proteome Analysis Protocols, A丄Link, ed., Humana Press (1999), ISBN: 0896035247; Mass Spectrometry of Proteins and Peptides, J.R. Chapman, ed., Humana Press (2000)， ISBN: 089603609X。
本文使用的術(shù)語"調(diào)節(jié)"或"調(diào)節(jié)劑"是指特定活性的數(shù)量、質(zhì)量或 作用的增加或降低，或樣品中測量到的DNA、 RNA或蛋白水平的增加或降 低。
VEGFR-2調(diào)節(jié)劑
本文使用的術(shù)語"VEGFR-2調(diào)節(jié)劑"旨在表示一種化合物或藥物，它 們是直接或間接調(diào)節(jié)VEGFR-2活性或VEGFR-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的生物分子 或小分子。因此，本文使用的化合物或藥物旨在包括小分子和生物分子。 直接調(diào)節(jié)或間接調(diào)節(jié)包括VEGFR-2活性或VEGFR-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化 或抑制。在一個(gè)方面，抑制是指對VEGFR-2與VEGFR-2配體(諸如，例如， VEGF)之結(jié)合的抑制。在另一個(gè)方面，抑制是指VEGFR-2激酶活性的抑制。
VEGFR-2調(diào)節(jié)劑包括，例如，VEGFR-2特異性配體，小分子VEGFR-2 抑制劑，和VEGFR-2單克隆抗體。在一個(gè)方面，VEGFR-2調(diào)節(jié)劑抑制 VEGFR-2活性和/或抑制VEGFR-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在另 一個(gè)方面，VEGFR-2 調(diào)節(jié)劑是抑制VEGFR-2活性和/或抑制VEGFR-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的VEGFR-2 單克隆抗體。
VEGFR-2調(diào)節(jié)劑包括生物分子或小分子。
VEGFR-2調(diào)節(jié)劑還包括反義和RNAi分子。
生物分子包括所有分子量大于450的脂類以及單糖、氨基酸及核苷酸 的聚合物。因此，生物分子包括，例如，寡糖和多糖；寡肽，多肽，肽，和蛋白；以及寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷酸和多核香酸包括，例如，DNA 和RNA。
生物分子還包括如上所述的任一分子的衍生物。例如，生物分子的衍 生物包括寡肽、多肽、肽和蛋白的脂類和糖基化衍生物。
生物分子的衍生物還包括寡糖和多糖的脂類衍生物，例如脂多糖。最 典型地，生物分子是抗體，或抗體的功能等同物。抗體的功能等同物具有 與所述抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特性，并抑制表達(dá)VEGFR-2的細(xì)胞的生長。這類功 能等同物包括，例如，嵌合、人源化和單鏈抗體及其片段。
抗體的功能等同物還包括具有與所述抗體的可變或高變區(qū)氨基酸序列 基本上相同的氨基酸序列的多肽。與另一序列基本上相同，但通過一個(gè)或 多個(gè)取代、添加和/或缺失而與該另 一序列不同的氨基酸序列視為等同的序 列。優(yōu)選的，蛋白中被取代、添加或缺失的氨基酸數(shù)低于序列中氨基酸殘 基數(shù)目的50%，更優(yōu)選低于25%，進(jìn)一步更優(yōu)選低于10%。
抗體的功能等同物優(yōu)選的是嵌合或人源化抗體。嵌合抗體包括非人抗 體的可變區(qū)和人抗體的恒定區(qū)。人源化抗體包括非人抗體的高變區(qū)(CDR)。 人源化抗體中除了高變區(qū)以外的可變區(qū)(例如，框架可變區(qū))和恒定區(qū)是屬于 人抗體的。
非人抗體的合適的可變區(qū)和高變區(qū)可以來源于由任何在體內(nèi)生成單克 隆抗體的非人哺乳動(dòng)物所產(chǎn)生的抗體。除了人之外的哺乳動(dòng)物的合適實(shí)例 包括，例如，兔，大鼠，小鼠，馬，山羊，或靈長類動(dòng)物。
功能等同物還包括具有與完整抗體相同或相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特性的抗體片 段。抗體的合適片段包括任何這樣的片段，其包含足夠的高變(即，互補(bǔ)決 定)區(qū)部分，使其能夠特異地并以足夠親和力與VEGFR-2酪氨酸激酶結(jié)合從 而抑制表達(dá)這類受體的細(xì)胞的生長。
這類片段可以，例如，包含F(xiàn)ab片段或F(ab')2片段中的之一或二者。 優(yōu)選的，抗體片段包含完整抗體的所有6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，盡管具有不足全 部的互補(bǔ)決定區(qū)(諸如3、 4或5個(gè)CDR)的功能性片段也包括在抗體片段之 內(nèi)。
在一個(gè)方面，所述片段是單鏈抗體，或Fv片段。單鏈抗體是這樣的多 區(qū)。因此，F(xiàn)v片段包括完整的抗體聯(lián)合位點(diǎn)(antibody combining site)。這些鏈可以在細(xì)菌或真核細(xì)胞中產(chǎn)生。
抗體和功能等同物可以是任一類免疫球蛋白的成員，諸如IgG， IgM， IgA, IgD，或IgE,及其亞類。
在一個(gè)方面，所述抗體是IgGl亞類的成員。功能等同物也可以是任一 上述類型和亞類組合的等同物。
在一個(gè)方面，VEGFR-2抗體是CDP-791 (UCB)。在另一個(gè)方面， VEGFR-2抗體是IMC-112lb (ImClone Systems)。在又一個(gè)方面，VEGFR-2 調(diào)節(jié)齊寸是AVE-005 (VEGF trap, Regeneron Pharmaceuticals)。
除上述討論到的生物分子之外，本發(fā)明中有用的VEGFR-2調(diào)節(jié)劑也可 以是小分子。任意不是生物分子的分子在本文中均被認(rèn)為是小分子。小分 子的一些實(shí)例包括有機(jī)化合物、有機(jī)金屬化合物、有機(jī)和有機(jī)金屬化合物 的鹽、糖、氨基酸、和核苷酸。小分子還包括這樣的分子如果不是由于 它們的分子量未超過450的話，它們本應(yīng)^C看作生物分子。因此，小分子 可以是分子量為450或更低的脂類，寡糖，寡肽，和寡核苷酸及它們的衍 生物。
需要強(qiáng)調(diào)的是，小分子的分子量可以是任意的。它們被稱作小分子僅 僅是因?yàn)樗鼈兊姆肿恿客ǔ５陀?50。小分子包括在自然界發(fā)現(xiàn)的化合物以 及合成化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，VEGFR-2調(diào)節(jié)劑是抑制表達(dá)VEGFR-2 的肺瘤細(xì)胞生長的小分子。在另一實(shí)施方案中，VEGFR-2調(diào)節(jié)劑是抑制表 達(dá)VEGFR-2的耐藥性腫瘤細(xì)胞的生長的小分子。
文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了許多可用于抑制VEGFR-2的小分子。 在一個(gè)方面，VEGFR-2調(diào)節(jié)劑是brivanib， 25]-2-氨基丙酸 (2-[4-(4-氟-2-曱基-lH-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,l-f][l,2，4]三嗪-6-基 氧基]-l-曱基乙基)酯，具有如下結(jié)構(gòu)(化合物I):<formula>formula see original document page 18</formula>
在另一個(gè)方面，VEGFR-2調(diào)節(jié)劑選自美國專利號6,869,952 (援引并入本文)中描述的化合物。在又一個(gè)方面，VEGFR-2調(diào)節(jié)劑選自PCT
發(fā)明者吉瑟斯·P·帕拉達(dá), 蘇珊·M·加爾布雷思 申請人:百時(shí)美施貴寶公司