嵌合抗原受體及其基因和重組表達(dá)載體、工程化her1靶向性的nkt細(xì)胞及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤生物制品領(lǐng)域，具體地，涉及過繼免疫治療中的一種嵌合抗原受 體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重組表達(dá)載體、工程化肥R1祀向性的NKT細(xì)胞 (CARHER1-NKT細(xì)胞）及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] EGFR(epithelialgrowthfactorreceptor,表皮生長因子受體）即肥R1,是原癌 基因c-erbBl的表達(dá)產(chǎn)物，屬于人類表皮生長因子受體（肥時(shí)家族，其本身具有酪氨酶激酶 活性，一旦與表皮生長因子巧G巧組合可啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)的有關(guān)基因，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增 殖。肥R1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)肥R1表達(dá)于大多數(shù)肺癌患者，表達(dá)水平達(dá)到 80%，其表達(dá)水平與肺癌疾病的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)。盡管最近肺癌的治療已經(jīng)獲得一定的進(jìn) 展，但是仍然未提高患者的生存率，因此亟需探討新的療法來克服送一困擾。
[0003]目前，在治療進(jìn)展期肥R1陽性肺癌患者時(shí)，肥R1酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinaseinhibitors,TKIs)已經(jīng)處于臨床研究階段，但是，臨床結(jié)果表明，僅部分肺癌患者 采用肥R1酪氨酸激酶抑制劑治療有效，并且患者最終會(huì)產(chǎn)生一定的耐藥性，從而影響藥物 的療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中采用肥R1酪氨酸激酶抑制劑治 療進(jìn)展期HER1陽性肺癌患者時(shí)引起的耐藥性的缺陷，提供一種嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重組表達(dá)載體、工程化肥R1祀向性的NKT細(xì)胞 (CAR肥R1-NKT細(xì)胞）及其應(yīng)用，嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的ΝΚΤ細(xì)胞 在治療進(jìn)展期肥R1陽性肺癌時(shí)，能夠有效避免采用肥R1酪氨酸激酶抑制劑時(shí)引起的耐藥 性，對(duì)肺癌細(xì)胞具有一定的特異祀向殺傷活性。
[0005] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中意外發(fā)現(xiàn)，采用嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的ΝΚΤ細(xì)胞治療進(jìn)展期肥R1陽性肺癌時(shí)，能夠有效避免采 用肥R1酪氨酸激酶抑制劑時(shí)引起的耐藥性，對(duì)肺癌細(xì)胞具有一定的特異祀向殺傷活性。
[0006]因此，為了實(shí)現(xiàn)上述目的，第一方面，本發(fā)明提供了一種嵌合抗原受體，所述嵌合 抗原受體為肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由肥RlScFv、CD8的較鏈區(qū)化inge區(qū)）和跨膜區(qū)、 CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。
[0007] 第二方面，本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0008] 第Η方面，本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。
[0009] 第四方面，本發(fā)明提供了一種工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ細(xì)胞，所述ΝΚΤ細(xì)胞是上 述嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的ΝΚΤ細(xì)胞。
[0010] 第五方面，本發(fā)明提供了上述工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ細(xì)胞在制備用于治療腫瘤 的制劑中的應(yīng)用。
[0011] 在治療進(jìn)展期肥R1陽性肺癌時(shí)，本發(fā)明的嵌合抗原受體 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NKT細(xì)胞，即工程化肥R1祀向性的NKT細(xì)胞能夠特異 性結(jié)合肥R1抗原，明顯延長免疫細(xì)胞在患者體內(nèi)的存活時(shí)間，增強(qiáng)免疫細(xì)胞祀向識(shí)別肺癌 細(xì)胞表面HER1抗原的能力，加強(qiáng)對(duì)肺癌細(xì)胞的特異殺傷活性，而且確實(shí)能夠有效避免采用 肥R1酪氨酸激酶抑制劑時(shí)引起的耐藥性。本發(fā)明的工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ細(xì)胞為治療 進(jìn)展期肥R1陽性肺癌提供了一種新的選擇，具有良好的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景。
[0012] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予W詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0013]圖1為流式細(xì)胞術(shù)對(duì)分離培養(yǎng)的ΝΚΤ細(xì)胞表型分析的結(jié)果。
[0014] 圖2為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性內(nèi)切酶Mlul/ Sail雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[001引 圖3為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性內(nèi)切 酶BamHI/Sall雙酶切片段的電泳鑒定圖。
[0016] 圖4為本發(fā)明的慢病毒表達(dá)載體pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的結(jié)構(gòu)示意 圖，其中，逆時(shí)針序列為正向基因片度，順時(shí)針為反向基因片段。
[0017] 圖5為流式細(xì)胞術(shù)檢測含有嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒濃 縮液對(duì)ΝΚΤ細(xì)胞的感染效率。
[0018] 圖6為流式細(xì)胞術(shù)檢測嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的ΝΚΤ細(xì) 胞（CARHER1-NKT細(xì)胞）表型鑒定的結(jié)果。
[0019] 圖7為本發(fā)明的CARHER1-NKT細(xì)胞對(duì)人肺癌細(xì)胞殺傷作用的細(xì)胞毒性分析圖。
[0020] 圖8為本發(fā)明的CAR肥R1-NKT細(xì)胞對(duì)進(jìn)展期肥R1陽性肺癌患者治療過程中，患者 病灶部位肥R1陽性肺癌細(xì)胞數(shù)目的變化。
[002。 圖9為本發(fā)明的CAR肥R1-NKT細(xì)胞對(duì)進(jìn)展期肥R1陽性肺癌患者治療過程中，患者 病灶部位影像圖變化。
【具體實(shí)施方式】
[0022] W下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0023] 本發(fā)明提供了 一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體為 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由肥RlScFv、CD8的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu) 域和〔03ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成。優(yōu)選情況下，嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1 所示。
[0024] 本發(fā)明提供了編碼上述嵌合抗原受體的基因。優(yōu)選情況下，編碼上述嵌合抗原受 體的基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0025] 本發(fā)明提供了含有上述基因的重組表達(dá)載體。優(yōu)選情況下，重組表達(dá)載體為慢病 毒表達(dá)載體。對(duì)于慢病毒表達(dá)載體沒有特別的限定，只要能夠與輔助載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞 如293T包裝細(xì)胞，獲得病毒濃縮液及嵌合抗原受體肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修飾的NTK 細(xì)胞即可，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體為pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ。
[0026] 對(duì)于慢病毒表達(dá)載體ρΚΡΤ-ΗΕΚ15οΡν-〔08-〔0137-〔03ζ的制備方法沒有特 別的限定，可W為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的各種方法，優(yōu)選情況下，慢病毒表達(dá)載體 pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制備方法包括W下步驟：
[0027] (1)從ΝΚΤ細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的胞 內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和〔03ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域，并克隆至載體pWPT-GFP中，構(gòu)建得到 PWPT-CD8-CD137-CD3ζ；
[002引 似合成編碼大鼠生長激素信號(hào)膚和肥RlScFv的核巧酸序 列，并克隆至PWPT-CD8-CD137-CD3 ζ中，經(jīng)測序驗(yàn)證后得到序列正確的pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[002引步驟（1)中，對(duì)于從ΝΚΤ細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增CD8的hinge區(qū)和跨膜區(qū)、CD137的 胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域和CD3ζ的胞內(nèi)信號(hào)結(jié)構(gòu)域的方法沒有特別的限定，可W為本領(lǐng)域常用的 各種方法，例如可W為RT-PCR法。其中，ΝΚΤ細(xì)胞可W通過分離人靜脈血中的單個(gè)核細(xì)胞， 然后進(jìn)行培養(yǎng)獲得。
[0030] 具體地，得到PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的方法可W包括；提取ΝΚΤ細(xì)胞的總RNA， 逆轉(zhuǎn)錄獲得ΝΚΤ細(xì)胞cDNA，W得到的ΝΚΤ細(xì)胞cDNA為模板，利用引物Ρ1(SEQIDNO. 11)和 P2(SEQIDNO. 12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得CD8基因的hinge區(qū)和跨膜區(qū)（SE