專利名稱：抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體及構(gòu)建與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種嵌合抗體及其編碼基因。
背景技術(shù)：
堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種多功能的生長(zhǎng)因子，以多種亞型形式存在，現(xiàn)今研究的bFGF的生物學(xué)活性主要是針對(duì)Mr18000的亞型。bFGF的生物學(xué)效應(yīng)，除對(duì)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著的促增殖作用外，還參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展，特別對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移具有重要作用。此外，bFGF還可能參與了矽肺的纖維化過(guò)程，研究證實(shí)，在矽肺形成的過(guò)程中，肺內(nèi)的肥大細(xì)胞也可產(chǎn)生bFGF，而且bFGF陽(yáng)性肥大細(xì)胞的分布與細(xì)胞外基質(zhì)的沉積相匹配，即與纖維化的程度相關(guān)?？筨FGF單克隆抗體(mAb)還可抑制神經(jīng)發(fā)生及惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分裂和生長(zhǎng)，在腫瘤診斷上，用抗bFGFmAb檢測(cè)腫瘤患者血清或尿中bFGF的水平，輔助診斷腎、肺、腦、胃、膀胱、乳腺和胰腺等臟器的腫瘤；1997年Coppola G.用抗bFGFmAb對(duì)腫瘤進(jìn)行體內(nèi)診斷及治療的研究。發(fā)明人制備的抗rh-bFGF 1F11鼠mAb具有與rh-bFGF結(jié)合的活性和中和活性以及抑制bFGF刺激Balb/c3T3細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性；用家兔矽肺實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)兔源抗bFGF抗體可明顯抑制其矽肺病理的形成。由于mAb的鼠源性限制了其在體內(nèi)的治療，研制抗rh-bFGF人-鼠嵌合抗體，減少了抗bFGF抗體的鼠源性，為其體內(nèi)治療的抗體藥物奠定基礎(chǔ)。因此，抗rh-bFGF人-鼠嵌合抗體，既可成為腫瘤治療的抗體靶向藥物，又可作為預(yù)防矽肺形成的抗體藥物。
長(zhǎng)期以來(lái)，鼠源性mAb被廣泛地應(yīng)用于科研、臨床診斷和治療，但由于鼠源性mAb可引起人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)，從而限制其在臨床中的應(yīng)用。因此，進(jìn)行鼠源性mAb的人源化改造實(shí)屬必要。目前，實(shí)現(xiàn)鼠源性mAb的人源化的方法，主要通過(guò)基因工程技術(shù)制備嵌合抗體和改型抗體；通過(guò)噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)的強(qiáng)大篩選能力進(jìn)行鏈替換，雖可將鼠源抗體的L、H鏈徹底人源化，但國(guó)內(nèi)外眾多資料表明，前述的改型抗體及完全人源化抗體對(duì)于保留親本抗體的特異性及親和力的效果仍然極不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子嵌合抗體及其編碼基因。
本發(fā)明所述的一種抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體，包含(1)抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子(rh-bFGF)鼠源抗體的輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))和人IgG1C的L鏈恒定區(qū)(C區(qū))的L鏈；和(2)抗rh-bFGF鼠源抗體的重鏈(H鏈)V區(qū)和人IgG1C的H鏈C區(qū)的H鏈。
所述的L鏈V區(qū)含有如SEQ NO1列出的氨基酸序列。編碼所述的L鏈V區(qū)的氨基酸序列的DNA如下SEQ NO1VL基因M K L P V R LL V L M F W I P A S S S D1 ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG ATGTTCTGGA TTCCTGCTTC CAGCAGTGAT-----------------------------------------------------------------V L M T Q T PL S L P V S L G D Q A S I61GTTTTGATGA CCCAAACTCC ACTCTCCCTG CCTGTCAGTC TTGGAGATCA AGCCTCCATCS C R S S Q SI V H S N G N T Y L E W Y121TCTTGCAGAT CTAGTCAGAG CATTGTACAT AGTAATGGAA ACACCTATTT AGAATGGTACL Q K P G Q SP K L L I Y K V S N R F S181CTGCAGAAAC CAGGCCAGTC TCCAAAGCTC CTGATCTACA AAGTTTCCAA CCGATTTTCTG V P D R F SG S G S G T D F T L K I S241GGGGTCCCAG ACAGGTTCAG TGGCAGTGGA TCAGGGACAG ATTTCACACT CAAGATCAGCR V E A E D LG V Y Y C F Q G S H V P Y301AGAGTGGAGG CTGAGGATCT GGGAGTTTAT TACTGCTTTC AAGGTTCACA TGTTCCGTACT F G GG T KL E I K R A D A A P T V361 ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATA AAACGGGCTG ATGCTGCACC AACTGTAT所述的H鏈V區(qū)含有如SEQ NO2列出的氨基酸序列。編碼所述的H鏈V區(qū)的氨基酸序列的DNASEQ NO2VH基因M G C S W V M L F LV A T A T G V H S Q1 ATGGGATGCA GCTGGGTCAT GCTCTTTTTG GTAGCAACAG CAACAGGTGT CCACTCCCAG-----------------------------------------------------------------V Q L Q Q S G A E LV K P G A S V K L S61GTCCAACTGC AGCAGTCTGG GGCTGAACTG GTGAAGCCTG GGGCTTCAGT GAAGTTGTCCC K A S G Y T F T SY Y M Y W V K Q R P121TGCAAGGCTT CTGGCTACAC CTTCACCAGC TACTATATGT ACTGGGTGAA GCAGAGGCCTG Q G L E W I G E IN P S N G G T N F N181GGACAAGGCC TTGAGTGGAT TGGAGAGATT AATCCTAGCA ATGGTGGTAC TAACTTCAATE K F K S K A T L TV D K S S S T A Y M241 GAGAAGTTCA AGAGCAAGGC CACACTGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATGQ L S S L T S E D SA V Y Y C A S Q T A301CAGCTCAGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG CCAGACAGCTR A T W F A Y W G QG S L V T V S A A S361 CGGGCTACGT GGTTTGCTTA CTGGGGCCAA GGGAGTCTGG TCACTGTCTC TGCAGCCTCCT K G P421 ACCAAGGGCC CA
所列的SEQ NO1和SEQ NO2的序列表中，用點(diǎn)式下劃線標(biāo)記的序列是前導(dǎo)肽序列，用下劃線標(biāo)記的序列是框架區(qū)序列，斜體序列是高變區(qū)序列。
本發(fā)明應(yīng)用一套設(shè)計(jì)的引物從自主構(gòu)建并培養(yǎng)的抗rh-bFGF鼠mAb雜交瘤細(xì)胞株中克隆出了抗rh-bFGF抗體的輕鏈、重鏈的可變區(qū)基因。用生物軟件VNTI8.0分析序列的結(jié)果表明，VH基因與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中的鼠源VH基因進(jìn)行同源性比較具有較高的同源性，且保守區(qū)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中VH基因高度一致。VL基因與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)中的鼠源VL基因進(jìn)行同源性比較具有較高的同源性，且保守區(qū)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中VL基因高度一致，證實(shí)本發(fā)明人通過(guò)PCR技術(shù)從抗rh-bFGF鼠mAb雜交瘤細(xì)胞株中正確克隆出了抗rh-bFGF抗體的輕鏈、重鏈的可變區(qū)基因。
包含編碼SEQ NO1和SEQ NO2序列的DNA的表達(dá)載體，如pEF-dhfr1a或基因工程常用的其他表達(dá)載體。
所述的DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，如CHO-dhfr-細(xì)胞或基因工程常用的其他表達(dá)細(xì)胞。
嵌合抗體真核表達(dá)的關(guān)鍵在于其表達(dá)的產(chǎn)量。為了實(shí)現(xiàn)嵌合抗體在真核細(xì)胞中的高表達(dá)，本研究采用了CHO-dhfr-細(xì)胞和攜帶dhfr基因的載體表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是在不含有H(次黃嘌呤)、T(胸腺嘧啶)的選擇培養(yǎng)基中，只有轉(zhuǎn)化有攜帶dhfr基因的質(zhì)粒pEF-dhfr1a的細(xì)胞才能存活，可方便的篩選出穩(wěn)定表達(dá)外源基因的陽(yáng)性細(xì)胞克隆。隨后向培養(yǎng)液中加入并逐漸增加MTX，可逐漸增強(qiáng)dhfr及外源目的基因的表達(dá)，從而大大增加了嵌和抗體的產(chǎn)量。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體，包括以下步驟培養(yǎng)如前所述的宿主細(xì)胞，回收所表達(dá)的抗體。
本發(fā)明首次從抗rh-bFGF鼠mAb 1F11雜交瘤細(xì)胞株中克隆出VL和VH基因及人lgG1的C區(qū)基因，將V區(qū)基因和C區(qū)基因融合成完整的L鏈和H鏈基因，再與表達(dá)載體連接并轉(zhuǎn)化CHO-dhfr-細(xì)胞，最后在真核細(xì)胞中成功地表達(dá)了抗rh-bFGF的人-鼠嵌合抗體。
本發(fā)明的另一目的在于提供含如前所述的嵌合抗體為活性成分的藥物組合物。
所述的嵌合抗體可用于制備預(yù)防矽肺形成的抗體藥物和腫瘤血管抑制治療的抗體靶向藥物。
與現(xiàn)有的抗rh-bFG改型抗體及完全人源化抗體相比，本發(fā)明所述的嵌合抗體更能夠較為理想地保留親本抗體的特異性及親和力。因而，從臨床應(yīng)用的實(shí)際出發(fā)，嵌合抗體比改型抗體及完全人源化抗體更具有應(yīng)用價(jià)值。已有研究證明，本發(fā)明所述的嵌合抗體在臨床包括腫瘤等疾病的治療中已取得較好的效果。美國(guó)FDA近年批準(zhǔn)的抗體類生物制劑中，嵌合抗體占有較重要的位置。本發(fā)明所述的抗rh-bFGF人-鼠嵌合抗體可作為預(yù)防矽肺形成的抗體藥物和腫瘤血管抑制治療的抗體靶向藥物，本研究為其臨床應(yīng)用的研究奠定重要的基礎(chǔ)。進(jìn)一步的工作將通過(guò)MTX增加嵌合抗體的表達(dá)量，或通過(guò)弱化載體DHFR基因來(lái)提高嵌合抗體的表達(dá)量，篩選高表達(dá)的細(xì)胞株，進(jìn)行抗體功能和相關(guān)活性與穩(wěn)定性的研究。


圖1是mAb 1F11VL基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖中1是DL2000 Marker，2是Negative control(負(fù)對(duì)照)，3、5、7為Positiveresults(正結(jié)果)，4、6為Negative results(負(fù)結(jié)果)。
圖2是mAb 1F11VH基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；圖中17是DL2000 Marker，2、5、6、7為Positive results(正結(jié)果)，1、3、4及8-16為Negative results(負(fù)結(jié)果)。
圖3是重組質(zhì)粒pEF-dhfr1aL的酶切及PCR擴(kuò)增鑒定圖；圖中1為DL15000 marker，2為plasmid pEF-dhfr1aL，3為pEF-dhfr1aL/EcoRI，4為pEF-dhfr1aL/EcoRl+SaII，5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；6為DL2000 marker。
圖4是重組質(zhì)粒pEF-dhff1aH的酶切及PCR擴(kuò)增鑒定圖；圖中1為DL15000 marker，2為pEF-dhfr1a/EcoRI，3為質(zhì)粒pEF-dhfr1aH，4為pEF-dhfr1aH/EcoRI+NotI，5為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；6為DL2000 marker。
圖5是純化嵌合抗體的SDS-PAGE分析圖；圖中1為Protein marker，2為嵌合抗體的純化產(chǎn)物，3為IgG1。
具體實(shí)施例方式
本實(shí)施例所選用的分泌抗rh-bFGF鼠mAb 1F11雜交瘤細(xì)胞株為發(fā)明人所構(gòu)建并保存。CHO-dhfr-細(xì)胞、質(zhì)粒pMDHC、pMDLC及表達(dá)載體pEF-dhfr1a，均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所應(yīng)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。ExTaq DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。內(nèi)切酶購(gòu)自Promega公司。Trizol試劑盒，細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染試劑，購(gòu)自GibcoBRL公司。所用抗體均購(gòu)自Sigma公司。
本實(shí)施例中，VL代表L鏈V區(qū)，VH代表H鏈V區(qū)，CL代表L鏈C區(qū)，CH代表H鏈C區(qū)。
(一)引物的設(shè)計(jì)與合成擴(kuò)增VL基因上游引物L(fēng)L15′-GGGGCTAGCCACAATGGAGACAG ACACACTCCTGCTAT-3′；LL25′-GGGGCTAGCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3′；LL35′-GGGGCTAGCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA-3′；LL45′-GGGGCTAGCCACCATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT-3′；LL55′-GGGGCTAGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTTG-3′；劃線處NheI的酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增VL基因下游引物KC5′-TGGATGGT GGGAAGATGG-3′；JCK5′-GACAGATGGTGCAGCCACAGTCCGTTTTATTTCCAGCTTAGTC CC-3′；擴(kuò)增VH基因上游引物VHL15′-GGGGCTAGCCACCATGGRATGSAGCTGKGTMATS CTCTT-3′；VHL25′-GGGGCTAGCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3′；VHL35′-GGGGCTAGCCACCATGGCTGCCTTGGGGCTGCTGTTCT-3′；VHL45′-GGGGCTAGCCACCATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG-3′；劃線處NheI的酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增VH基因下游引物JCH15′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCATGGTCCC-3′；JCH25′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGCC-3′；JCH35′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAGACTCCC-3′；JCH45′-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTCCC-3′；擴(kuò)增人IgG1C區(qū)基因擴(kuò)增引物擴(kuò)增CL基因上游引物HuCK55′-ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC-3′；擴(kuò)增CL基因下游引物HuCK35′-GGGGTCGACCT ATTAACACTCTCCCCTGTTG-3′；劃線處為SaII酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增CH基因上游引物HuCH55′-GCCTC CACCAAGGGCCCATCGGTC-3′；擴(kuò)增CH基因因下游引物HuCH35′-GGGGCGGCCGCACTC ACCTGAGGAGACTGGTGAG-3′；劃線處為NotI酶切位點(diǎn)。
(二)mAb V區(qū)基因的克隆及序列測(cè)定從雜交瘤細(xì)胞1F11中提取總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，純化后的產(chǎn)物插入載體pMD-T中，分別取VH及VL基因的各2個(gè)克隆菌株送TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序。
(三)人IgG1C區(qū)基因的克隆及序列測(cè)定以質(zhì)粒pMDHC為模板，PCR擴(kuò)增CH基因，以質(zhì)粒pMDLC為模板，PCR擴(kuò)增CL基因，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化，純化后的產(chǎn)物插入載體pGEM-T中，分別取CH及CL基因的各2個(gè)克隆菌株送TaKaRa公司進(jìn)行測(cè)序。
(四)mAb 1F11 VL和VH基因的克隆和序列讀定用VL基因的5個(gè)上游引物和3個(gè)下游引物及VH基因的4個(gè)上游引物和4個(gè)下游引物，從雜交瘤細(xì)胞1F11的總RNA中，用RT-PCR分別擴(kuò)增出VL和VH基因片段，其中，VL的3個(gè)引物對(duì)LL1-KC、LL3-KC及LL5-KC，擴(kuò)增出400bp左右的基因片段，其瓊脂糖凝膠電泳分析如圖1所示；VH的4個(gè)引物對(duì)VHL1-JCH2、VHL1-JCH3、VHL1-JCH4及VHL2-JCH3，擴(kuò)增出420bp左右的基因片段，其瓊脂糖凝膠電泳分析如圖2所示。將PCR產(chǎn)物連接到載體pMD-T中，進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序后，經(jīng)與Kabat數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)比較及用生物軟件VNTl8.0分析，可確定只有LL5-KC引物擴(kuò)增出的418bp的VL基因片段和VHL1-JCH3引物擴(kuò)增出的432bp的VH基因片段是正確的，VL基因的序列為336bp，其前方有57bp的前導(dǎo)肽序列，Vκ屬于VKII家族；VH基因的序列為357bp，其前有57bp的前導(dǎo)肽序列，VH屬于VHIIB。
(五)人-鼠嵌合抗體表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建VL、CL與VH、CH基因經(jīng)過(guò)融合PCR，形成完整的嵌合輕鏈基因VLCL和完整的嵌合重鏈基因VHCH。將VLCL基因用NheI/Sa/I雙酶切后，克隆到XbaI/Sa/I雙酶切的表達(dá)載體pEF-dhfr1a上，構(gòu)建L鏈表達(dá)載體pEF-dhfr1aL，基因VHCH用NheI/NotI雙酶切后，連接到XbaI/NotI雙酶切的表達(dá)載體pEF-dhfr1a上，即可得到H鏈表達(dá)載體pEF-dhfr1aH。
L鏈表達(dá)載體pEF-dhfr1aL和H鏈表達(dá)載體pEF-dhfr1aH都以EF1-α為啟動(dòng)子，并有篩選基因dhfr(二氫葉酸還原酶)，在CHO-dhfr-細(xì)胞中，可通過(guò)撤去培養(yǎng)基中的次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)進(jìn)行選擇陽(yáng)性克隆，還可用MTX加壓篩選表達(dá)量高的單克隆細(xì)胞株。L鏈及H鏈表達(dá)質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物及酶切鑒定如圖3和圖4所示。
(六)CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和陽(yáng)性克隆的加壓篩選接種1×105個(gè)CHO-dhfr-細(xì)胞于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用含100mL/L透析胎牛血清、0.03mmol/L次黃嘌呤(H)、0.003mmol/L胸腺嘧啶脫氧核苷(T)及1×105U/L青鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基，于50mL/LCO2、37℃培養(yǎng)36h。采用Lipofect AMINETM2000試劑轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞先采用不含H、T的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行篩選，待克隆形成后，再逐次采用含1×10-8mol/L及1×10-7mol/L的MTX的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。
(七)表達(dá)產(chǎn)物的ELISA檢測(cè)以2mg/L羊抗人IgG Fc按每孔100μL的量包被酶標(biāo)板，依次加入轉(zhuǎn)化細(xì)胞的培養(yǎng)上清、羊抗人IgG Fc-HRP孵育，顯色后，讀取A490的值。對(duì)于陽(yáng)性克隆，再加HRP-羊抗人κC抗體孵育，顯色后，讀取A490的值。挑選雙陽(yáng)性反應(yīng)的克隆，以2mg/L的rh-bFGF包被酶標(biāo)板，每孔100μL。依次加入雙陽(yáng)性反應(yīng)克隆的細(xì)胞培養(yǎng)上清及羊抗人IgG Fc-HRP孵育，顯色后，讀取A490的值。
嵌合抗體基因的表達(dá)產(chǎn)物C區(qū)的ELISA檢測(cè)各取1μg L、H鏈嵌合抗體基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化CHO-dhfr-細(xì)胞。約10d后，可見克隆生長(zhǎng)，計(jì)數(shù)共約185個(gè)克隆。以2mg/L羊抗人IgG Fc抗體包被酶標(biāo)板，依次加入185個(gè)克隆的培養(yǎng)上清及羊抗人IgG Fc抗體-HRP，根據(jù)A490的值，得到表達(dá)H鏈的陽(yáng)性克隆為120個(gè)，其中高表達(dá)克隆為50個(gè)；再以2mg/L的羊抗人IgG Fc抗體包被酶標(biāo)板，依次加入H鏈高表達(dá)的50個(gè)克隆的培養(yǎng)上清及HRP-羊抗人κC抗體，根據(jù)A490的值，得到表達(dá)L、H鏈的陽(yáng)性克隆為32個(gè)，其中高表達(dá)的克隆為15個(gè)；在15個(gè)L、H鏈高表達(dá)的陽(yáng)性克隆中，有的克隆L鏈表達(dá)量遠(yuǎn)高于H鏈的表達(dá)量，而有的克隆恰相反，考慮到一個(gè)克隆中L、H鏈的表達(dá)量的匹配性，只得到5個(gè)較好的克隆株(I-67、I-348、I-786、VII-572、VII-863)，5個(gè)克隆中，在檢測(cè)表達(dá)的H鏈時(shí)，讀取的A490的值，分別為0.845、1.052、0.981、0.758及0.936，明顯高于陰性對(duì)照的A490值(0.068)；在檢測(cè)表達(dá)的L鏈時(shí)，讀取的A490的值，分別為1.120、1.357、1.268、0.926及1.184，也明顯高于陰性對(duì)照的A490值(0.072)，以上結(jié)果說(shuō)明，嵌合抗體的C區(qū)得到了表達(dá)，并且其C區(qū)是人源的。
嵌合抗體的活性檢測(cè)以2mg/L rh-bFGF包被酶標(biāo)板，加5株雜交瘤細(xì)胞(I-67、I-348、I-786、VII-572、VII-863)的混合培養(yǎng)上清，羊抗人IgGFc-HRP抗體為二抗(因?yàn)闄z測(cè)的一抗Fc部分為人源的)，以mAb1F11作為陽(yáng)性對(duì)照，羊抗鼠IgG-HRP抗體為二抗(因?yàn)闄z測(cè)的一抗為鼠源的)，顯色后，讀取A490的值。樣品孔、陽(yáng)性孔及陰性孔分別為0.312、0.378及0.065，結(jié)果表明表達(dá)的嵌合抗體與抗原有結(jié)合活性。
(八)嵌合抗體的純化收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)上清約100mL，用400g/L飽和硫酸銨溶液沉淀過(guò)夜，以12000g離心30min，棄上清，加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，并裝入透析袋中對(duì)0.1mol/L磷酸鹽溶液透析48h。以0.45μm的濾膜過(guò)濾后，超濾濃縮至10mL。并用Protein A親和層析柱，從2mL正常人血清中純化人源IgG1作為對(duì)照。
(九)嵌合抗體的SDS-PAGE分析分別取純化的嵌合抗體和對(duì)照樣品人源性IgG1后，進(jìn)行還原性SDS-PAGE，用考瑪斯亮藍(lán)R-250染色。
將陽(yáng)性細(xì)胞克隆用1×10-7mol/L的MTX的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后，改成無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)10d后，用400g/L的飽和硫酸銨溶液沉淀后，透析，再用超濾柱濃縮到10mL，進(jìn)行還原SDS-PAGE，分析結(jié)果如圖5所示，在還原SDS-PAGE后顯示兩條帶，1條Mr為50000(重鏈)，另1條Mr為29000(輕鏈)。
(十)序列表(用Patent-In Version 3.2生成)SEQUENCE LISTINGSEQNO1-DNA<110>暨南大學(xué)<120>抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體及構(gòu)建與用途<130>
<141>2004-03-08<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>418<212>DNA<213>小鼠
<400>1atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgtac 360acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgggctg atgctgcacc aactgtat 418SEQUENCE LISTINGSEQNO1-PRO<110>暨南大學(xué)<120>抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體及構(gòu)建與用途<130>
<141>2004-03-08<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>139<212>PRT<213>小鼠<400>1Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala1 5 10 15Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile35 40 45Val His Ser Asn Gly Asn Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro50 55 60Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser65 70 75 80Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 95Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys100 105 110Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu115 120 125Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val130 135SEQUENCE LISTINGSEQNO2-DNA<110>暨南大學(xué)<120>抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體及構(gòu)建與用途<130>
<141>2004-03-08<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>432<212>DNA<213>小鼠
<400>1atgggatgca gctgggtcat gctctttttg gtagcaacag caacaggtgt ccactcccag 60gtccaactgc agcagtctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactatatgt actgggtgaa gcagaggcct 180ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca atggtggtac taacttcaat 240gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300cagctcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag ccagacagct 360cgggctacgt ggtttgctta ctggggccaa gggagtctgg tcactgtctc tgcagcctcc 420accaagggcc ca432SEQUENCE LISTINGSEQNO2-PRO<110>暨南大學(xué)<120>抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體及構(gòu)建與用途<130>
<141>2004-03-08<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>144<212>PRT<213>小鼠<400>1Met Gly Cys Ser Trp Val Met Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly TyT Thr Phe35 40 45Thr Ser Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn65 70 75 80Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser85 90 95Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Ser Gln Thr Ala Arg Ala Thr Trp Phe Ala Tyr Trp115 120 125Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro130 135 140
權(quán)利要求
1.一種抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體，其特征在于包含(1)抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子(rh-bFGF)鼠源抗體的輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))和人IgG1C的L鏈恒定區(qū)(C區(qū))的L鏈；和(2)抗rh-bFGF鼠源抗體的重鏈(H鏈)V區(qū)和人IgG1C的H鏈C區(qū)的H鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗體，其特征在于所述的L鏈V區(qū)含有如SEQ NO1列出的氨基酸序列，SEQ NO1氨基酸序列如下M K L PV R LL V LM F W IP A SS S DV L M TQ T PL S LP V S LG D QA S IS C R SS Q SI V HS N G NT Y LE W YL Q K PG Q SP K LL I Y KV S NR F SG V P DR F SG S GS G T DF T LK I SR V E AE D LG V YY C F QG S HV P YT F G GG T KL E IK R A D A A PT V。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的嵌合抗體，其特征在于所述的H鏈V區(qū)含有如SEQ NO2列出的氨基酸序列，SEQ NO2氨基酸序列如下M G C SW V ML F LV A T AT G VH S QV Q L QQ S GA E LV K P GA S VK L SC K A SG Y TF T SY Y M YW V KQ R PG Q G LE W IG E IN P S NG G TN F NE K F KS K AT L TV D K SS S TA Y MQ L S SL T SE D SA V Y YC A SQ T AR A T WF A YW G QG S L VT V SA A ST K G P。
4.編碼如權(quán)利要求2所述的L鏈V區(qū)的氨基酸序列的DNA。
5.編碼如權(quán)利要求3所述的H鏈V區(qū)的氨基酸序列的DNA。
6.包含如權(quán)利要求4或5所述的DNA的表達(dá)載體。
7.用權(quán)利要求6所述的DNA載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.一種生產(chǎn)抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體的方法，其特征在于，包括以下步驟培養(yǎng)用包含如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，回收所表達(dá)的抗體。
9.含如權(quán)利要求1所述的嵌合抗體為活性成分的藥物組合物。
10.如權(quán)利要求1所述的嵌合抗體用于制備預(yù)防矽肺形成的抗體藥物和腫瘤血管抑制治療的抗體靶向藥物的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子嵌合抗體及其編碼基因。本發(fā)明所述的一種抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子的嵌合抗體，包含抗人重組堿性成纖維生長(zhǎng)因子(rh－bFGF)鼠源抗體的輕鏈(L鏈)可變區(qū)(V區(qū))和人IgG1C的L鏈恒定區(qū)(C區(qū))的L鏈；和抗rh－bFGF鼠源抗體的重鏈(H鏈)V區(qū)和人IgG1C的H鏈C區(qū)的H鏈。本發(fā)明所述的嵌合抗體可用于制備預(yù)防矽肺形成的抗體藥物和腫瘤血管抑制治療的抗體靶向藥物。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1560082SQ20041001558
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月8日
發(fā)明者向軍儉, 鄧寧, 李洪慶, 楊紅宇 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)