專利名稱：作藥物用的突變生長因子受體及其治療癌的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有治療性能的突變生長因子受體、至少含有一種突變生長因子受體的藥物，以及一種或多種此類突變受體治療癌的應(yīng)用。
細(xì)胞生長是一種取決于機(jī)體特殊需要的細(xì)致調(diào)節(jié)過程。在年幼機(jī)體中，細(xì)胞分裂率超過細(xì)胞死亡率，這就導(dǎo)致機(jī)體增長。在發(fā)育完全的機(jī)體中，細(xì)胞再生和細(xì)胞死亡達(dá)到平稀，形成“恒態(tài)”。但是，在一些少有的情況下，細(xì)胞繁殖失控，即使機(jī)體中并不特別需要較高數(shù)目的此類細(xì)胞，它們卻仍然開始生長并分裂。這種失控的細(xì)胞生長，是癌的起因。能夠引起失控細(xì)胞生長的因素，常常是化學(xué)上的因素，但也可以是物理方面的因素，例如放射性輻射。
目前，基本上有兩種治療癌的途徑。抑或經(jīng)外科手術(shù)從病患機(jī)體完全除去癌細(xì)胞，抑或設(shè)法使機(jī)體中變質(zhì)的細(xì)胞不造成危害，例如通過給藥或理療法如放射療法。
在化學(xué)療法中，常常使用藥物，這些藥物以某種形式影響DNS代謝，并使必然產(chǎn)生較高代謝效率的迅速生長細(xì)胞受損害，成為不分裂或僅緩慢分裂的細(xì)胞。然而，許多化療法的一個嚴(yán)重缺點(diǎn)是，所用的高效物質(zhì)特異性很小，使健康細(xì)胞在化療中也受損害。此外，高效物質(zhì)的這種很小特異性還要求，其定藥量每次都必須在殺死癌細(xì)胞的同時，盡可能少地?fù)p害健康細(xì)胞。這常常是做不到的，從而癌癥病人由于癌細(xì)胞不斷擴(kuò)散，致使維持生命所必需的各種機(jī)能因在后期缺失而死亡。
本發(fā)明的任務(wù)是，提供另一種具有寶貴治療性能的高效物質(zhì)，并提供一種含有該高效物質(zhì)的藥物，該高效物質(zhì)或藥物對治療癌癥特別有益。
按本發(fā)明，該任務(wù)用一種突變生長因子受體作藥物，和用至少含有一種突變生長因子受體的藥物來解決。
按照本發(fā)明，可以證明，突變生長因子受體具有寶貴的治療性能，它們尤其適用于治療癌癥。
生長因子受體，在人體癌細(xì)胞發(fā)生和繁殖中，起著決定性作用。生長因子受體參與正常細(xì)胞的生長控制。細(xì)胞分裂的真正信號是生長因子，它的形成取決于機(jī)體的需要。受體起著傳遞信號的作用;也即，它在細(xì)胞分裂活動中，在細(xì)胞內(nèi)部參與細(xì)胞外生長信號的轉(zhuǎn)換。就許多生長因子受體而言，它們在生長因子結(jié)合到細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域后，將磷酸鹽基轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)中酪氨酸基上的能力起著決定性作用。這些受體也稱作受體酪氨酸激酶。Yarden，Y.和Ullrich，A.在Rev.Biochem.1988，57，443-78中介紹了受體酪氨酸激酶的概況。在生長因子結(jié)合之后，這種生長因子受體的二聚化，在信號傳遞過程中是另一個重要過程。在具有酪氨酸激酶活性的生長因子受體的干預(yù)下，細(xì)胞外信號變成細(xì)胞內(nèi)信號的過程，可分解為下列5個階段1、生長因子(也稱作配位體)結(jié)合到受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上，誘發(fā)構(gòu)象變化;這導(dǎo)致2、構(gòu)象發(fā)生變化的受體進(jìn)行二聚化;
3、同時誘發(fā)胞漿結(jié)構(gòu)域的變構(gòu)性變化，以此又誘發(fā)激酶活力;
4、受體二聚體中，酪氨酸基發(fā)生轉(zhuǎn)磷酸作用，該作用又產(chǎn)生一種活化受體構(gòu)象，并使之穩(wěn)定;以及5、多肽底物發(fā)生磷酸化作用，并與細(xì)胞因子發(fā)生交互作用。
信號傳遞鏈的機(jī)能亢進(jìn)，導(dǎo)致相應(yīng)細(xì)胞的分裂活性過高，并在極端情況下蛻化為癌細(xì)胞。Ullrich，A.和Schlessinger，J.在Cell(1990)61，203-212中概要介紹了生長因子受體及其在信號從細(xì)胞外環(huán)境傳遞到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境時的作用，以及突變受體對癌細(xì)胞的形成可能產(chǎn)生的影響。
現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)突變受體與一種細(xì)胞的野生型受體共同表達(dá)時，上述5個階段的信號傳遞鏈可為突變生長因子受體所阻斷或抑制。因此，突變生長因子受體適宜用作藥物，可用它來治療同生長信號通過相應(yīng)受體加劇傳遞到細(xì)胞內(nèi)有關(guān)的癌癥。
優(yōu)選的受體突變種不再具有野生型受體的酪氨酸激活酶活力。在配位體形成后，這種突變種不能再使受體二聚體或多肽底物中的酪氨酸基發(fā)生磷酸化作用。因此，細(xì)胞外生長信號變成細(xì)胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)變被阻斷或部分抑制。
野生型受體中有一個點(diǎn)突變就能達(dá)到目的，因?yàn)楫?dāng)野生型受體經(jīng)此點(diǎn)突變已失去酪氨酸激酶活力時，它就不再具有作用能力。作為藥物，這樣一種點(diǎn)突變是優(yōu)選的。
此外，優(yōu)先選擇的是一種在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域有缺失的突變受體，該缺失使酪氨酸激酶喪失活力。
優(yōu)選的是，經(jīng)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)缺失所突變的受體，仍然還含有跨膜區(qū)。具有現(xiàn)存跨膜區(qū)的突變受體，能極為有效地抑制生長信號傳遞，并因而比無跨膜區(qū)的受體，例如由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域組成的突變種顯示出更好的治療作用。
尤其適合用作藥物的，是受體酪氨酸激酶的突變種，例如EGF受體、PDGF受體或NGF受體。
表皮生長因子(EGF)的突變受體，尤其特別適合。
在一種特別優(yōu)選的EGF受體突變種的情況下，野生型受體序列的氨基酸721位置上有一個點(diǎn)突變。在一種優(yōu)選的突變種中，721位置上的賴氨酸基由突變種的丙氨酸基代替。這種突變種，按照布達(dá)佩斯條約以編號DSM6678寄存在德國微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏有限公司(DSM)。在另外一種優(yōu)選的EGF受體突變種中，缺失野生型受體的533C-端部氨基酸。這種突變種以編號DMS6679寄存。
受體突變種可按照一般基因技術(shù)方法，由野生型受體制備，這些基因技術(shù)方法例如Sambrook，J.等在(1989)Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press)中已有描述。
本發(fā)明的藥物，至少含有一種上述突變生長因子受體和常用的佐藥與載體物質(zhì)。
特別優(yōu)選的，是一種含有包封在脂質(zhì)體中的一種或多種受體突變種的藥物。為了使脂質(zhì)體有選擇地到達(dá)靶組織，如果脂質(zhì)體在其膜中含有抗體，而且這些抗體能識別靶細(xì)胞的特定表位，并有選擇地結(jié)合到這些表位上，則是有利的。因此，受體突變種有選擇地到達(dá)靶組織，并在那里發(fā)揮其預(yù)期的作用。
此外，有一種藥物是優(yōu)選的，這種藥物含有一種或多種重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體形式的上述一種或多種受體。重組載體含有編碼上述一種或多種受體用的核酸片段。在給病人投藥后，逆轉(zhuǎn)錄病毒就感染靶細(xì)胞，并使受體突變種在其中進(jìn)行表達(dá)。給以包封在脂質(zhì)體中的高效物質(zhì)，是一種目前常用的投藥方式。
有一種特別優(yōu)選的藥物，它含有編碼EGF受體突變種的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pNTK-HER-K721A及/或pNTK-HERCD-533，它們分別以編號DSM6678和DSM6679寄存在DSM。
上述突變受體或含有這些突變受體的藥物，特別適用于治療癌癥。其中，可以特別有效地治療因生長因子受體功能亢進(jìn)所致的那些癌類。屬于這些癌類的，尤其是乳房癌、卵巢癌和肺癌。Slamon，D.J.等在Science(1987)，235，177-182和Science(1989)，244，707-712，以及Kern，J.A.等在Cancer Res.(1990)，50，5184-5191中已詳細(xì)論述了表面受體在這些癌癥中所起的作用。
不受某種特定理論的局限，人們可以認(rèn)為，所述的受體突變種之所以能在靶細(xì)胞中發(fā)揮其作用，是由于除野生型受體之外，突變種也被嵌入靶細(xì)胞膜中，受體突變種于是就使野生型受體的功能減退。
下面以EGF受體的突變種為模型來詳細(xì)闡述本發(fā)明。
Ullrich，A.等人在Nature(1984)，309，418-425中記述的表皮生長因子受體(EGF受體)，是具有酪氨酸激酶活力的170kD糖蛋白。Ullrich，A.和Schlessinger，J.在Cell(1990)，81，203-212中詳述了從結(jié)合配位體直到刺激激酶活力的分子級過程。正如Riedel，H.等在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1988)85，1477-1481中和Di Fiore，P.P.等人在Cell(1987)，51，1063-1070中所述，當(dāng)EGF在正常情況下引起成纖維細(xì)胞中的致有絲分裂反應(yīng)時，過度表達(dá)受體所致的EGF受體信號傳遞功能亢進(jìn)，導(dǎo)致了DIH 3T3小鼠細(xì)胞的配位體依賴性轉(zhuǎn)化。徹底的臨床檢查，支持了這種受體在各種癌如乳房癌、卵巢癌和肺癌的形成過程中的這種功能，這正如Slamon，D.J.等人在Science(1987)，235，177-182和Science(1989)，244，707-712，以及Kern，J.A.等人在Cancer Res.(1990)，50，5184-5191中所述。
現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)，不再具有酪氨酸激酶活力的EGF受體突變種，在表達(dá)EGF野生型受體的已轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞中所進(jìn)行的表達(dá)，能取消已轉(zhuǎn)化的表型。
材料和方法重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備Keller，G.等人在Nature，(1985)，318，149-154;Stewart，C.L.等人在EMBO J.，(1987)，6，383-388;von Ruden，T.和Wagner，E.F.在EMBO J.，(1988)，7，2749-2756中詳述了逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pN2、pNTK2及pNTK-HERC。pNTK-HER-k 721A通過克隆pNTK-HERc中CMVHER-k721A的一個BgL II片段來制備。借助如Sambrook，J.等人在Molecular cloning(Cold Spring Habour Laboratory Press，1989)中所述的一般克隆方法，通過Liven，E.等人在J.Biol.Chem.，260，12490-12491中所述方法，在pLSXNA 8的2kb大片段XBa I/Xho I的兩側(cè)上形成一個CLa I位點(diǎn)來制備pNTK-HERCD-533，接著用使CLaI裂解的pNTK2來連接2kb CLaI片段。通過將CVNHERXCD的一個ClaI片段克隆到pNTK2的CLaI位置上，來制備NTK-HERCD-566構(gòu)建體。該構(gòu)建體已以編號DSM6680寄存。生態(tài)營養(yǎng)性(ecotrope)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，用Markowitz D.在J.Virol.，(1988)62，1120-1124中所述的無輔助病毒生產(chǎn)系GP+E-86來制備。穩(wěn)定的GP+E-86生產(chǎn)系，借助于如Miller，A.D.和Buttimore，C.在Mol.Cell.Biol.，(1986)6，2895-2902中所述的一種改進(jìn)感染記錄法(Infektionsprotkoll1)來制備。低效價兩性營養(yǎng)性(amphotrophes)病毒，通過將逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染到無輔助病毒包裝細(xì)胞系PA317中來制備(對此，Miller，A.D.等人在Mol.Cell.Biol.，1985，5，431-437中已予說明)，并接著在G418(1mg/ML)中選擇生產(chǎn)系GP+E-86的克隆之后，用它來感染二次包裝細(xì)胞GP+E-86。通過用含有無細(xì)胞GP+E-86上消液的逆轉(zhuǎn)錄病毒稀釋系列感染NIH 3T3細(xì)胞，并測定對G418有抵抗力的集落數(shù)目，來測定病毒效價。Blashand，A.J.在Oncogene，(1990)5，1213-1221中論述了含有腫瘤生長因子α(TGFα)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒(ψ2TGFα)。
借助逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移基因在4μg/L聚凝胺(Aldrich)存在下，用釋放高效價NTK-HERc病毒(5×105G418R集落形成單位每mL)的GP+E-86細(xì)胞上清液，培養(yǎng)亞會合NIH 3T3細(xì)胞(105個細(xì)胞/6cm培養(yǎng)平板)4-12小時，接著在釋放高滴度N2、NTK-HERK 721A、NTK-HERCD-533病毒抑或NTK-HERCD-566病毒的GP+E-86細(xì)胞上清液中培養(yǎng)。如Bordignon，C.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，6748-6752中所述，通過多次感染來提高受體的表達(dá)水準(zhǔn)。在上述試驗(yàn)中，用1mL GP+E-86細(xì)胞稀釋上清液(1.25×105集落形成單位)感染一次，或用相同體積的未稀釋GP+E-86細(xì)胞上清液(5×105集落形成單位)感染1至4次，所述GP+E-86細(xì)胞釋放高滴度N2、NTK-HERK721A、NTK-HERCD-533病毒抑或NTK-HERCD-566病毒。
完整細(xì)胞中的受體磷酸化將如上所感染的細(xì)胞，在10cm碚養(yǎng)平板上培養(yǎng)到90%會合、洗滌，并在不含甲硫氨酸的DMEM(Gibco)中，添加含1%FCS的50μCi/mL35S-甲硫氨酸(Amersham)，培養(yǎng)16小時。用20ng/mL EGF(Amgen Corp.)刺激細(xì)胞10分鐘，并在4℃下，將細(xì)胞溶于0.5mL溶解緩沖液(50mM HEPES pH7.2、150mMNaCl、1.5mM MgCl、1mM EGTA、10%甘油(Glyerzin)、1%Triton X-100、1mM PMSF、10mg/mL抑肽酶、100μM正釩酸鈉)。在4℃下，將溶解產(chǎn)物在Eppendorf型離心分離機(jī)中以約12000g離心10分鐘。然后，將上清液用過量單克隆抗體108.1(Honegger，A.M.，Ullrich，A.及Schlessinger，J.在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1989)86，925-929中述及此)和蛋白A-瓊脂糖在4℃下培養(yǎng)4小時。免疫沉淀物用HNTG(20mM Hepes pH7.3、150mM NaCl、0.1% Triton X-100及10%甘油)洗滌兩遍。將片狀沉淀物再懸浮在試驗(yàn)緩沖液中，煮沸5分鐘，并用SDS-PAGE(7.5%)分析。以電泳法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上，接著用抗磷酪氨酸的單克隆小鼠抗體(5E2)(見Fendly，B.M.等人，1990，Cancer Research，50，1550-1558)培養(yǎng)。為驗(yàn)證起見，在ECL-底物-反應(yīng)(Amersham)之后，用聯(lián)接過氧化物酶的山羊抗小鼠抗體來培養(yǎng)硝化纖維素過濾器。在用柯達(dá)(Kodak)X-Omat底片檢測后，將硝化纖維素過濾器用含有0.2%Tween 20的PBS洗滌。接著，借助放射自顯影照相術(shù)來驗(yàn)證35S-甲硫氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。顯影帶密度用顯象密度測定法來確定。-胸苷摻入在用N2、NTK-HERK 721A、NTK-HERCD-533或者用NTK-HERCD-566進(jìn)行4次感染后，如所述用NTK-HERc輔助感染亞會合HIN 3T3細(xì)胞(105個細(xì)胞/6cm培養(yǎng)平板)。將該細(xì)胞均分到12孔科斯塔平板(costarplatten)上。達(dá)到會合后，使細(xì)胞單層在0.5mL DMEM，0.5% FCS中饑餓24小時，并在加入EGF18小時后，將該細(xì)胞用0.5μCi甲基-[3H]胸苷(Amersham)標(biāo)記4小時。將細(xì)胞用PBS洗滌兩遍，并接著在冰上用10%TCA沉淀1小時。用10%TCA洗滌沉淀物，并再溶于200μL 0.2N NaOH/0.2%SDS。中和溶解產(chǎn)物，并用閃爍計(jì)數(shù)法來定量測定所摻入的放射性。
轉(zhuǎn)化試驗(yàn)為了檢驗(yàn)NIH 3T3細(xì)胞在軟瓊脂中的集落形成能力，在用N2、NTK-HERK 721A、NTK-HERCD-533，抑或用NTK-HERCD-566感染4次后，用NTK-HERc感染會合后的NIH3T3細(xì)胞(105個細(xì)胞/6cm培養(yǎng)平板)。在能產(chǎn)生自分泌刺激的那些情況下，用ψ2TGFα病毒(5×104G418R集落形成單位每mL)感染細(xì)胞。在6cm培養(yǎng)平板上，將NIH 3T3細(xì)胞(105個)在3mL培養(yǎng)基中含有或不含有10ng/mL EGF的情況下，完全涂到由MEM組成并含有10%FCS及0.2%瓊脂(Gibco)的面層上。底層含有MEM、10%FCS及0.4%瓊脂。四星期后，點(diǎn)算可見集落。
為進(jìn)行空斑(Foci)形成試驗(yàn)，在用N2、NTK-HERK 721A、NTK-HERCD-533病毒，抑或用NTK-HERCD-566病毒感染四次后，用NTK-HERc(1×104G418R集落形成單位每mL)來輔助感染亞會合NIH 3T3細(xì)胞(105個細(xì)胞/6cm培養(yǎng)平板)。在有些實(shí)驗(yàn)中，用ψ2TGFα病毒(1×103G418R集落形成單位每mL)重復(fù)感染該細(xì)胞。感染后的細(xì)胞，在6cm培養(yǎng)平板上用含有4%FCS的DMEM，在有或沒有10ng/mL EGF存在下進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3天換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)平板用結(jié)晶紫染色，在第18天點(diǎn)算空斑。


圖1示意說明人的EGF野生型受體和突變EGF受體。圖中指出了富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CYS)、酪氨酸激酶(TK)結(jié)構(gòu)域及橫跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)的位置。突變種HERK 721A在712位上有一個點(diǎn)突變(以丙氨酸代替賴氨酸)，而HERCD-533和HERCD-566則分別載有533和566氨基酸的C端部缺失。Livneh，E.等人在J.Biol.Chem.，(1986)，260，12490-12497，以及Honegger，A.M.等人在Cell(1987)，51，199-209中詳述了這些突變種。
圖2A野生型EGF受體和突變EGF受體的酪氨酸磷酸化。將僅表達(dá)野生型受體，抑或同時共同表達(dá)野生型受體和突變受體的細(xì)胞，用[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記過夜，接著在有或沒有2ng/mL EGF存在下，培養(yǎng)10分鐘。將細(xì)胞溶解，并用抗EGF受體抗體(mAb108)使之沉淀，用SDS-PAGE加以分離，并用抗磷酸酪氨酸受體(5E2)進(jìn)行免疫學(xué)分析。
圖2(B)EGF受體在NIH 3T3細(xì)胞上的表達(dá)。將僅表達(dá)野生型受體，抑或同時共同表達(dá)野生型受體和突變受體的細(xì)胞，用[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記過夜，接在有或沒有20ng/mL EGF存在下培養(yǎng)10分鐘。將細(xì)胞溶解，并用抗EGF受體抗體(mAb108)沉淀，用SDS-PAGE進(jìn)行分離，并用抗磷酸酪氨酸受體(5E2)進(jìn)行免疫學(xué)檢測，其中進(jìn)行ECL底物反應(yīng)。用含0.2% Tween 20的PBS洗去ECL底物，并用自動射線照相術(shù)檢測[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記過的蛋白質(zhì)。
圖3模擬EGF的[3H]-胸苷插入。在僅表達(dá)野生型受體(虛線)，抑或共同表達(dá)野生型受體和突變受體的細(xì)胞中，例如A中為野生型EGF受體+K721A，B中為野生型EGF受體+CD-533，C中為野生型EGF受體+CD-566，在12孔科斯塔培養(yǎng)平板中培養(yǎng)到會合，并在含有0.5%FCS的EMEM中饑餓2天。添加10%FCS或不同濃度的EGF，并在添加EGF后18小時添加[3H]-胸苷(0.5μCi/孔)，歷時4小時，并測定其在DNS中的摻入。記錄致有絲分裂反應(yīng)，以揭示劑量與反應(yīng)之間的關(guān)系。所測值用基底胸苷摻入來校正，并將EGF的最大觀察反應(yīng)定為100%。所占的三角形標(biāo)示出最大胸苷插入的半值。
結(jié)果將僅表達(dá)野生型受體或共同表達(dá)野生型受體和突變受體的細(xì)胞，用[35S]-甲硫氨酸標(biāo)記，在有或沒有EGF存在下培養(yǎng)10分鐘，溶解，并用抗人體EGF受體的小鼠抗體(mAb108)免疫沉淀。樣品用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移到硝化纖維素過濾器中，并用磷酸酪氨酸特異性小鼠抗體5E2(圖2A)檢測酪氨酸磷酸化。存在于免疫沉淀物中的受體數(shù)量，用同一硝化纖維素過濾器進(jìn)行自動射線照相術(shù)來檢測(圖2B)。
如圖2A中的斑跡b和c所示，將EGF加入用含野生型EGF受體的病毒所感染的正常NIH 3T3細(xì)胞，誘導(dǎo)了170kDEGF受體顯影帶的強(qiáng)烈酪氨酸磷酸化。與未磷酸化的EGF受體相比，EGF受體在SDS-PAGE中的遷移速度因磷酸化而降低，正如由圖2B中的斑b和c所看到的那樣。野生型受體刺激EGF磷酸化的程度，就像通過NTK-HERCD-566病毒基因組編碼那樣，并不由于EGF受體的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的共同表達(dá)而降低，即使胞外結(jié)構(gòu)域的表達(dá)量比野生型受體過量4倍也然(圖2A，斑d至f;圖2B，斑d至f)。
相反，在一種類似的試驗(yàn)中，使用一種表達(dá)膜穩(wěn)定EGF受體缺失突變HERCD-533的受體(圖1)，對野生型EGF受體的EGF誘導(dǎo)磷酸化產(chǎn)生強(qiáng)烈劑量依賴性抑制作用(圖2A，斑g至i)，盡管170kD EGF受體蛋白質(zhì)含量保持不變(圖2B，斑g至i)。酪氨酸磷酸化顯影帶的強(qiáng)度分別從100%降至71%和30%。在此條件下，EGF受體顯示出同未磷酸化受體一樣的電泳特性(圖2B，斑i)，這與用mAb 5E2(圖2A，斑i)所檢測的其酪氨酸磷酸化的狀況相一致。
當(dāng)野生型受體與負(fù)激酶突變種HERK721A共同表達(dá)時，檢測到120kD顯影帶的酪氨酸磷酸化加劇(圖2A，斑k至m)。按照放射自顯影術(shù)密度測定分析，受體酪氨酸磷酸化信號強(qiáng)度從251%分別提高到337%和450%。因?yàn)橐吧褪荏w和負(fù)激酶突變種一樣大小，所以圖2B的斑k至m中，170kD信號的增強(qiáng)，表示兩種受體的磷酸化總和，在此種情況下，突變受體可被野生型受體轉(zhuǎn)磷酸化。
EGF誘導(dǎo)細(xì)胞分裂率的抑制如Riedel，H.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1988)85，1477-1481，以及Prgwes，R.等人在EMBO J.(1986)，2179-2190中所述，EGF能刺激表達(dá)EGF受體的NIH3T3成纖維細(xì)胞分裂。突變受體對EGF野生型受體所控制的細(xì)胞分裂產(chǎn)生的影響，借助于誘導(dǎo)DNA合成來測定。
這種DNA合成，在用NTK-HERc病毒和N2病毒對比組感染的細(xì)胞中，被選定為[3H]-胸苷摻入，而且此合成在2ng/mL EGF時刺激最大，在0.66ng/mL(圖3)時，為半最大刺激(ED50)。類似于早先如Honegger，A.M.等人在EMBO J.，(1988)7，3045-3052中和Riedel，H.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1988)85，1477-1481中所述的結(jié)果，較高的EGF濃度導(dǎo)致較低的[3H]-胸苷摻入量，如圖3所示。在用相應(yīng)的病毒感染4次后，EGF受體與HERCD-533和HERR721A的共同表達(dá)，使劑量依賴性曲線明顯地向高EGF濃度方向移動(圖3A和B)。這表明，與HERc/N2細(xì)胞相比，該細(xì)胞對生長因子已不大敏感。不論缺失突變種HERCD-533，還是點(diǎn)突變種HERK721A(圖1)，均對EGF野生型受體促成的細(xì)胞分裂信號顯示類似影響，并且使ED50成10倍地增加到6.6ng/mL EGF。與此相反，用NTK-HERCD-566病毒進(jìn)行的重復(fù)感染，對于用EGF刺激野生型的DNA合成，并沒有顯著影響(圖3C)。
EGF受體突變種的抗致癌活性眾所周知，EGF受體的重復(fù)表達(dá)，引起NIT 3T3細(xì)胞的EGF依賴性細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這正如Di Fiore，P.P.等人在Cell，(1987)51，1063-1070中，Velu，T.J.等人在Science，(1987)237，1408-1410中，以及Riecel，H.等人在Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，(1988)85，1477-1481中所述。為了檢驗(yàn)重復(fù)表達(dá)的EGF受體轉(zhuǎn)化潛力是否能被EGF受體突變種抑制，使EGF受體與受體突變種共同表達(dá)，并接著檢查其在軟瓊脂中形成集落，或在單層細(xì)胞培養(yǎng)中形成空斑的能力。通過向培養(yǎng)基添加EGF，抑或通過用帶有TGF-αDNA的病毒(ψ2TGFα)進(jìn)行感染，來達(dá)到對過度表達(dá)EGF受體的刺激，以便產(chǎn)生一種自分泌(Autocrin)活化系(表1示出4次試驗(yàn)的平均值)。
在用NTK-HERc病毒和N2對照組感染之后，NIH 3T3細(xì)胞在有10ng/mL EGF存在的軟瓊脂中形成約250個集落。在其它條件完全相同的情況下，通過用ψ2TGFα病毒協(xié)同感染，則形成148個集落(見表1)。然而，當(dāng)用EGF受體感染過的細(xì)胞以NTK-HER-K721A抑或NTK-HERCD-533病毒重復(fù)感染時，集落形成能力幾乎被完全壓抑。EGF受體與細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域HERCD-566的共同表達(dá)，在瓊脂層中以10ng/mL EGF刺激時，使集落形成能力約降低50%，而在用ψ2TGFα病毒感染后，以自分泌TGF刺激時，則約降低33%。
以類似方法測定NIH 3T3單層培養(yǎng)中NTK-HERc病毒的空斑形成潛力，在10ng/mL EGF存在時，每106個病毒形成920個空斑，抑或在用ψ2TGFα病毒協(xié)同感染后，每106個NTK-HERc病毒形成430個空斑。用NTK-HERK721A或NTK-HERCD-533病毒重復(fù)感染，在用EGF進(jìn)行刺激時，空斑數(shù)目約降低100%或90%，當(dāng)用ψ2TGFα病毒刺激時，空斑數(shù)目降低約75%或71%(表2)。
共同表達(dá)EGF野生型受體和HERCD-566的細(xì)胞，顯示同表達(dá)EGF受體并用對照病毒N2感染的細(xì)胞一樣的空斑數(shù)目。不僅在用EGF刺激時，而且在用ψ2TGFα病毒刺激時，都觀察到這種結(jié)果。
由上所述可見，EGF受體突變種不僅具有明確的抗增生潛力，而且也具有抗致癌的潛力，因此卓絕地適用于治療癌癥。
表1 軟瓊脂中集落的形成集落數(shù)目/106CFU感染+10ng/mL EGF+2TGFN2 0 0NTK-HERK721A 0 0NTK-HERCD-533 0 0NTK-HERCD-566 0 0NTK-HERc/N2 246 148NTK-HERc/NTK-HERK721A 8 2NTK-HERc/NTK-HERCD-533 6 4NTK-HERc/NTK-HERCD-566 128 1004周后點(diǎn)數(shù)集落。所示值為4次平行試驗(yàn)的平均值。CFU代表集落形成單位。
表2 NIH 3T3空斑形成空斑數(shù)目/106CFU細(xì)胞系+10ng/mL EGF+2TGFN2 0 0NTK-HERK721A 0 0NTK-HERCD-533 0 0NTK-HERCD-566 0 0NTK-HERc/N2 920 480NTK-HERc/NTK-HERK721A 40 18NTK-HERc/NTK-HERCD-533 90 14NTK-HERc/NTK-HERCD-566 910 50014-16天后點(diǎn)數(shù)空斑。所示值為4次平行試驗(yàn)的平均值。CFU代表集落形成單位。
權(quán)利要求
1.用作藥物的突變生長因子受體。
2.權(quán)利要求1所述的突變生長因子受體，其特征在于，它不再具有野生型受體的酪氨酸激酶活力。
3.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的突變受體，其特征在于，它是野生型受體的一個點(diǎn)突變種。
4.權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的突變受體，其特征在于，它在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中具有一個缺失。
5.權(quán)利要求1、2或4中任一項(xiàng)所述的突變受體，其特征在于，它缺失胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，但存在跨膜區(qū)。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的突變受體，其特征在于，它是一種突變的受體酪氨酸激酶。
7.權(quán)利要求6所述的突變受體，其特征在于，它是一種突變EGF受體。
8.權(quán)利要求7所述的突變受體，其特征在于，它在野生型受體序列的氨基酸位置721上有一個點(diǎn)突變。
9.權(quán)利要求8所述的突變受體，其特征在于，它在721位置上有一個丙氨酸基。
10.權(quán)利要求7所述的突變受體，其特征在于，野生型受體的533C-端部氨基酸缺失。
11.至少含有一種權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述突變生長因子受體和常用佐藥與載體物質(zhì)的藥物。
12.權(quán)利要求11所述的藥物，其特征在于，它含有一種或多種包封在脂質(zhì)體中的所述受體。
13.權(quán)利要求11或12所述的藥物，其特征在于，它含有一種或多種重組逆病毒載體形式的一種或多種所述受體，所述載體攜有編碼受體的核酸片段。
14.權(quán)利要求13所述的藥物，其特征在于，它含有逆病毒載體pNTK-HER-K721A及/或pNTK-HERCD-533，這兩種載體分別以編號DSM6678和DSM6679寄存在德國微生物保藏室。
15.權(quán)利要求11至14中至少一項(xiàng)所述、用于治療癌的藥物。
16.權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述突變受體用于治療癌的應(yīng)用。
17.權(quán)利要求16所述用于治療癌類的應(yīng)用，所述癌系由生長因子受體功能亢進(jìn)所致。
18.權(quán)利要求17所述用于治療乳房癌、卵巢癌和/或肺癌的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及適于作藥物的突變生長因子受體。這類突變生長因子受體對治療癌癥特別有益，尤其對治療生長因子受體在癌發(fā)生時功能亢進(jìn)起作用的那類癌。本發(fā)明公開了作為治癌特效藥的EGF受體突變種，其中野生型受體的酪氨酸激酶活力已為酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變或缺失所消除。
文檔編號C07K14/485GK1071586SQ9211139
公開日1993年5月5日 申請日期1992年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1991年9月5日
發(fā)明者A·烏爾里克, N·H·雷德曼 申請人:馬普科技促進(jìn)協(xié)會