專利名稱：：中和血管內(nèi)皮生長因子受體的人單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中和血管內(nèi)皮生長因子受體的人單克隆抗體及其用途，尤其涉及中和血管內(nèi)皮生長因子受體的人ScFv分子、以及含有該人ScFv分子的抑制血管生成的組合物和治療癌癥的組合物。
背景技術(shù)：
：血管生成是指通過內(nèi)皮細(xì)胞的生長、分化和移動由先存在的血管形成新血管，這不發(fā)生在健康成人中，除非因為某些特殊的原因，包括傷口愈合，月經(jīng)等。然而，已經(jīng)報道了在疾病(如腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、老年性黃斑退化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、銀屑病和慢性炎癥)中過度形成新血管(CamelietandJain,Nature，407249，2000)。因此，在采用血管生成抑制劑治療疾病尤其是腫瘤上進行了許多努力。參與血管生長的因子包括血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、上皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-b(TGFb)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等。其中，血管內(nèi)皮生長因子是直接參與內(nèi)皮細(xì)胞生長、分化和移動的內(nèi)皮細(xì)胞特異性因子，存在四種不同亞型(VEGF165、VEGF121、VEGF189和VEGF206)。四種亞型之中，VEGF165是除了胎盤外所有人組織中最豐富的亞型(Tisheretal.，J.Biol.Chem.，266=11947,1991)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)調(diào)控由內(nèi)皮前體(成血管細(xì)胞)原位分化而引起的新血管形成，VEGF在傷口愈合期間在胚胎組織(Breieretal.，Development(Camb),114521，1992)、巨噬細(xì)胞以及增生的上皮角蛋白細(xì)胞中表達(dá)(Brownetal.，J.Exp.Med.，1761375，1992)，并且VEGF可能是形成炎癥相關(guān)的組織水腫的原因(Ferraraetal.,Endocr.Rev.,13:18，1992)。原位雜交研究已證實，包括多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成血管細(xì)胞瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和AIDS相關(guān)的卡波希肉瘤在內(nèi)的大量人腫瘤系中存在VEGF的高表達(dá)(Plateetal.,Nature,359845,1992；Plateetal.,CancerRes.,53:5822,1993；Berkmanetal.,J.Clin.Invest.,91:153,1993；Nakamuraetal.，AIDSWeekly，13(1)，1992)。在缺氧誘導(dǎo)的血管生成中也觀察到高水平的VEGF(Shweikietal.，Nature,359:843，192)。VEGF的生物功能是通過高親和力的VEGF受體介導(dǎo)的，所述VEGF受體在胚胎形成(Millaueretal.,Cell,72=835,1993)和腫瘤形成期間在內(nèi)皮細(xì)胞中進行選擇性表達(dá)。VEGF受體(VEGFR)通常是III級受體型酪氨酸激酶，其特征在于在受體的氨基末端細(xì)胞外配體結(jié)合域具有幾個(通常是5或7個)免疫球蛋白樣環(huán)(Kaipainenetal.,J.Exp.Med.，178:2027，1993)。其他兩個區(qū)域包括一個跨膜區(qū)和一個通過插入可變長度的親水性內(nèi)激酶序列而阻斷的羧基末端細(xì)胞內(nèi)催化域，該羧基末端細(xì)胞內(nèi)催化域稱為激酶插入域(Termanetal.，Oncogene,6:1677，1991)。VEGF受體包括fms-樣酪氨酸激酶受體(Flt-1),或VEGFR-1(Shibuyaetal.,Oncogene,5519,1990；W092/14248；Termanetal.，Oncogene，6:1677，1991)，含激酶插入域的受體/胎兒肝激酶(KDR/Flk-1)，或VEGFR-2(Matthewsetal.，PNAS,889026,1991)，盡管其他受體如神經(jīng)纖毛蛋白(neuropilin)-l和神經(jīng)纖毛蛋白_2也可結(jié)合VEGF。其他酪氨酸激酶受體VEGFR-3(Flt_4)結(jié)合VEGF同系物VEGF-C和VEGF-D，且在淋巴管的生長中是很重要的。滲入神經(jīng)膠質(zhì)瘤的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)高水平的Flk-1(Plateetal.,Nature,359845，1992)。由人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤產(chǎn)生的VEGF特異性地正調(diào)節(jié)Flk-1水平(Plateetal.,CancerRes.，53:5822，1993)。與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GAEC)中高水平的Flk-1表達(dá)表明了在腫瘤形成期間可能誘導(dǎo)受體活性，因為在正常腦內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎檢測不到Flk-1轉(zhuǎn)錄物。這種正調(diào)節(jié)限于最接近腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞。在裸鼠中封閉VEGF活性和中和抗VEGF單克隆抗體(mAbs)可抑制人腫瘤異種移植物的生長(Kim,K.etal.，Nature,362:841_844，1993)，這表明了VEGF在腫瘤相關(guān)的血管生成中的直接作用。盡管在腫瘤細(xì)胞中VEGF配體被正調(diào)節(jié)，并且其受體在腫瘤滲入血管內(nèi)皮細(xì)胞中被正調(diào)節(jié)，但在與血管生成無關(guān)的正常細(xì)胞中VEGF配體和其受體的表達(dá)水平是很低的。因此，這種正常細(xì)胞會封閉VEGF和其受體之間的相互作用以抑制血管生成，從而抑制腫瘤生長。由滲入神經(jīng)膠質(zhì)瘤的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)高水平VEGFR-2，并由人成神經(jīng)膠質(zhì)瘤產(chǎn)生的VEGF對其進行特異性正調(diào)節(jié)(Plateetal.,Nature,359:845，1992；Plateetal.,CancerRes.,53=5822,1993)。在成神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞(GAEC)中VEGR-2的高水平表達(dá)表明了在腫瘤形成期間誘導(dǎo)了受體活性，因為在正常腦內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎檢測不到VEGFR-2轉(zhuǎn)錄物。因此，正積極地開展研究，關(guān)注于抑制在腫瘤生長位點表達(dá)的VEGF的活性，以抑制血管生成，從而抑制腫瘤生長。通常地，已經(jīng)發(fā)展了抑制癌細(xì)胞膜上的VEGF受體以阻止VEGF進入細(xì)胞的方法。產(chǎn)生VEGFR抗體的細(xì)胞系實例包括產(chǎn)生大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系(DC101；ATCCHB11534)、產(chǎn)生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb25的雜交瘤細(xì)胞系(M25,18A1；ATCCHB12152)、和產(chǎn)生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb73的雜交瘤細(xì)胞系[(M73，24;ATCCHB12153)、KM1730(FERMBP-5697;W098/22616；WO99/59636)、KM1731(FERMBP-5718)、KM1732(FERMBP-5698)、KM1748(FERMBP-5699)、KM1750(FERMBP-5700)]。已持續(xù)研發(fā)了針對VEGF受體的人源化抗體。迄今為止，這些針對VEGF受體的人源化抗體在體外表現(xiàn)出與VEGF的高度競爭性，但存在一個問題即它們中和細(xì)胞中VEGF受體的能力下降了且抗體在小鼠或大鼠中未表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性，以致未能進行動物試驗。因此，本發(fā)明人構(gòu)建了非免疫完全人抗體文庫，篩選了針對VEGF受體(KDR)的單鏈可變區(qū)片段(ScFv)抗體，并發(fā)現(xiàn)了抗體不僅在體外，而且在細(xì)胞內(nèi)和體內(nèi)也顯示出優(yōu)異的KDR中和效應(yīng)，甚至在小鼠和大鼠中表現(xiàn)出交叉反應(yīng)性，因此完成了本發(fā)明。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供完全的人單鏈可變區(qū)片段(singlechainvariablefragment,ScFv)抗體6A6_ScFv和6A6_IgG，其具有優(yōu)異的在細(xì)胞和體內(nèi)中和VEGF受體的能力。本發(fā)明的另一目的是提供完全的人單鏈可變區(qū)片段(ScFv)，其是6A6的輕鏈變體，該輕鏈變體相對于6A6-ScFv表現(xiàn)出更為優(yōu)異的中和VEGF受體的能力。本發(fā)明的另一目的是提供抑制血管生成的組合物，其含有具有中和VEGF受體能力的完全人ScFv或IgG。本發(fā)明的另一目的是提供治療癌癥的組合物，其含有具有中和VEGF受體能力的完全人ScFv或IgG。為實現(xiàn)上述目的，在一方面，本發(fā)明提供了一種單鏈可變區(qū)片段(ScFv)分子，其含有由SEQIDN0S:1-19的任一氨基酸序列所表示的輕鏈可變區(qū)并具有中和血管內(nèi)皮生長因子受體的功能。在本發(fā)明中，ScFv(單鏈可變區(qū)片段)分子和其構(gòu)建體優(yōu)選具有由SEQIDNO20的氨基酸序列所表示的重鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供了編碼所述ScFv(單鏈可變區(qū)片段)分子的DNA，含有所述DNA的載體，和轉(zhuǎn)化有所述載體的重組細(xì)胞。在本發(fā)明中，所述細(xì)胞優(yōu)選是細(xì)菌或動物細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制血管生成的組合物，其含有所述ScFv分子，并且本發(fā)明提供了治療癌癥的組合物，其含有所述ScFv分子。在另一方面，本發(fā)明提供了IgG，其含有由SEQIDN0S:1_19的任一氨基酸序列所表示的輕鏈可變區(qū)并具有中和血管內(nèi)皮生長因子受體的功能。在本發(fā)明中，所述IgG優(yōu)選具有由SEQIDNO20的氨基酸序列所表示的重鏈可變區(qū)。在另一方面，本發(fā)明提供了抑制血管生成的組合物，其含有所述IgG，并且本發(fā)明提供了治療癌癥的組合物，其含有所述IgG。將由以下具體描述和所附權(quán)利要求闡明本發(fā)明的其他特點和方面。圖1顯示了插入p⑶NA3-KDRD123tFcm載體的基因的氨基酸序列和功能。圖2顯示了本發(fā)明中用于表位定位(印Hopemapping)的KDR(ECD1_2)和KDR(ECD2-3)-Fc的示意圖。圖3顯示了本發(fā)明中純化的KDR(ECDl-3)-Fc的SDS-PAGE結(jié)果。圖4顯示了本發(fā)明中抗KDR噬菌體和抗KDR-SvFc的VEGF競爭試驗結(jié)果。圖5顯示了本發(fā)明中6A6ScFv噬菌體的核酸序列、氨基酸序列和⑶R序列。圖6顯示了純化的6A6ScFv的SDS-PAGE結(jié)果。圖7顯示了采用抗KDR-SvFc的VEGF競爭試驗結(jié)果。圖8顯示了本發(fā)明中抗KDR-SvFc的表位定位結(jié)果。圖9顯示了含有非可變區(qū)和6A6IgG重鏈區(qū)的載體pIGHD_6A6Hvy的酶切圖。圖10顯示了含有恒定區(qū)和IgG輕鏈區(qū)的載體pIgGLD_6A6Lgt的酶切圖。圖11顯示了純化的6A6IgG的SDS-PAGE結(jié)果。圖12顯示了采用抗KDR6A6IgG的VEGF競爭試驗結(jié)果。圖13顯示了抗KDR6A6IgG和VEGF族的競爭試驗結(jié)果。圖14顯示了本發(fā)明抗KDRIgG抗體與HUVEC細(xì)胞的結(jié)合親和力的FACS分析結(jié)果。圖15顯示了在HUVEC細(xì)胞中本發(fā)明抗KDRIgG抗體與VEGF165的競爭的FACS分析結(jié)果。圖16顯示了在K562細(xì)胞系(ATCCCCL-243)中KDR表達(dá)的蛋白印跡分析結(jié)果。圖17顯示了本發(fā)明抗KDRIgG抗體與K562細(xì)胞系的結(jié)合親和力。圖18顯示了在K562細(xì)胞系中本發(fā)明抗KDRIgG抗體與VEGF的競爭的FACS試驗結(jié)果。圖19顯示了本發(fā)明抗KDR抗體與Gleevec抗性細(xì)胞系的結(jié)合親和力的FACS分析結(jié)果。圖20顯示了本發(fā)明的抗KDRIgG抗體抑制細(xì)胞增殖的分析結(jié)果。圖21顯示了本發(fā)明抗KDR抗體對由VEGF誘導(dǎo)的KDR磷酸化和ERK磷酸化的抑制能力的蛋白印跡分析結(jié)果。圖22顯示了IgG型KDR抗體抑制VEGF移動內(nèi)皮細(xì)胞的能力。圖23顯示了IgG型KDR抗體抑制由VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的能力。圖24顯示了通過IgG型KDR抗體和細(xì)胞表面KDR之間的結(jié)合抑制VEGF-KDR內(nèi)化。圖25顯示了IgG型KDR抗體對由VEGF誘導(dǎo)的大鼠主動脈環(huán)化的抑制效應(yīng)。圖26顯示了IgG型KDR抗體對由VEGF誘導(dǎo)的血管生成的抑制效應(yīng)分析結(jié)果。圖27顯示了在結(jié)腸癌小鼠異種移植物模型中6A6抗體對HCT116細(xì)胞系中腫瘤生長的抑制效應(yīng)分析結(jié)果。圖28顯示了在結(jié)腸癌小鼠異種移植物模型中以6A6抗體治療后的腫瘤切片圖像。圖29顯示了在肺癌小鼠異種移植物模型中6A6抗體對A549細(xì)胞系中腫瘤生長的抑制效應(yīng)分析結(jié)果。圖30顯示了以碘放射性同位素對IgG型6A6抗體的標(biāo)記結(jié)果。圖31顯示了在慢性髓性白血病小鼠腫瘤模型中以碘123標(biāo)記的IgG型6A6抗體的彩圖。圖32是顯示輕鏈改組(lightchainshuffling)制備的示意圖。圖33顯示了通過輕鏈改組獲得的抗KDR抗體的VEGF競爭試驗結(jié)果。圖34顯示了通過輕鏈改組獲得的抗KDR抗體的VEGF競爭試驗結(jié)果。圖35顯示了通過輕鏈改組獲得的抗KDR抗體的VEGF競爭試驗結(jié)果。具體實施例方式在一方面，本發(fā)明涉及完全人ScFv(單鏈可變區(qū)片段)抗體A6A(TTAC-0001)-ScFv，其中和血管內(nèi)皮生長因子。按以下方式篩選6A6_ScFv。首先，構(gòu)建完全人抗體文庫，并構(gòu)建表達(dá)融合到Fc上的由KDR(VEGFR-2)胞外域1_3中的每個組成的融合蛋白的細(xì)胞系。采用純化的重組KDRD1-D3-FC融合蛋白從細(xì)胞系中的完全人抗體文庫中篩選中和KDR的抗KDR-ScFv抗體。以V5標(biāo)簽在細(xì)菌中表達(dá)并純化經(jīng)篩選的ScFv抗體，并在ScFv噬菌體顆粒狀態(tài)中進行人KDRD1-D3-FC結(jié)合試驗和VEGF競爭試驗。此外，進行BIAcore分析以測量ScFv抗體親和力，并獲得具有恒定維持親和力的6A6-ScFv且將其轉(zhuǎn)化成IgG形式。而且，在本發(fā)明中通過蛋白印跡法確認(rèn)了在初級培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞中6A6_ScFv抑制了血管生成信號因子ERK的磷酸化且這種抑制依賴于6A6-ScFv的濃度。在另一方面，本發(fā)明涉及中和血管內(nèi)皮生長因子受體的完全人抗體6A6_IgG。FACS分析揭示了與商業(yè)可供的IMC-1C11IgG嵌合抗體(Imclone,USA)相比，6A6-IgG牢固地結(jié)合到由活體HUVEC細(xì)胞(ATCC，USA)在表面表達(dá)的內(nèi)源人KDR上，甚至還在以競爭性結(jié)合人VEGF165處理細(xì)胞的時候，與商業(yè)可供的IMC-1C11IgG嵌合抗體相比，6A6-IgG能更有效地中和HUVEC細(xì)胞表面表達(dá)的KDR。這表明了ELISA中的VEGF競爭試驗結(jié)果不同于在相似水平下6A6_IgG和IMC-1C11IgG嵌合抗體中和KDR獲得的結(jié)果。即，體外試驗結(jié)果和體內(nèi)試驗結(jié)果會互有區(qū)別，且根據(jù)體外試驗結(jié)果篩選高度有效的抗體是有局限性的。此外，在本發(fā)明中，可以觀察到與IMC-1C11IgG相比，6A6_IgG抗體更牢固地結(jié)合到由人急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562(ATCC，USA)表達(dá)的KDR上。而且，在本發(fā)明中，通過蛋白印跡法確認(rèn)了在初級培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞中6A6_IgG抑制了血管生成信號因子ERK的磷酸化且這種抑制以6A6-IgG濃度依賴方式而增強。此外，在本發(fā)明中，可以觀察到本發(fā)明的6A6_IgG抑制了HUVEC細(xì)胞的趨化性向存在VEGF的環(huán)境的移動且6A6-IgG也抑制了HUVEC細(xì)胞的微管形成，其直接作用于血管生成。而且，在本發(fā)明中，為了確認(rèn)6A6_IgG對HUVEC細(xì)胞VEGF的抑制效應(yīng)是因為6A6-IgG阻斷了VEGF受體進入HUVEC細(xì)胞，在采用以FITC標(biāo)記的KDR抗體的試驗中以共焦顯微鏡進行觀察。結(jié)果觀察到當(dāng)以6A6-IgG處理細(xì)胞時VEGF受體(KDR)不能進入細(xì)胞中。此外，通過在體外大鼠主動脈環(huán)試驗，發(fā)現(xiàn)了以6A6_IgG處理大鼠主動脈環(huán)，不會出現(xiàn)血管萌生。而且，通過將基質(zhì)膠皮下注射到小鼠中的基質(zhì)膠塞入試驗分析了血管生成。結(jié)果在以VEGF處理的組中，在塞入物中觀察到血管生成，但在以VEGF和6A6_IgG處理的組中，未觀察到血管形成，這表明了6A6-IgG在體內(nèi)具有血管生成抑制效應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明涉及通過輕鏈改組以突變6A6_ScFv輕鏈序列而獲得的變體。通過輕鏈改組，獲得了18個6A6_ScFv輕鏈變體，且輕鏈改組通過以下方式進行。(1)為了防止在生物淘篩期間6A6被再次選中，以在6A6的⑶R3上具有識別位點的限制性酶Spel處理6A6輕鏈改組文庫中的DNA。在DNA被轉(zhuǎn)染到ETB細(xì)胞中之后，構(gòu)建亞文庫，以ELISA進行KDR親和力和VEGF競爭試驗以選擇具有優(yōu)異KDR中和能力的克隆子。(2)在生物淘篩的洗滌步驟中，使抗體克隆子與可溶性KDR競爭以選擇具有優(yōu)異KDR中和能力的克隆子。(3)在生物淘篩的使噬菌體結(jié)合到抗原KDR上的步驟中，還加入IMC-1121BIgG(ImClone,USA)以選擇KDR中和能力強于或類似于1121BIgG的克隆子。在另一方面，本發(fā)明涉及抑制血管生成的組合物和治療癌癥的組合物，其含有所述的ScFv或IgG。本文所用的術(shù)語“血管生成”包括腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、老年性黃斑退化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、銀屑病和慢性炎癥中涉及的血管形成，但本發(fā)明的范圍不限于此。在本發(fā)明中，所述癌癥包括但不限于結(jié)腸癌，胰腺癌，直腸癌，結(jié)直腸癌，前列腺癌，腎癌，黑色素瘤，轉(zhuǎn)移至骨骼的前列腺癌，卵巢癌和血癌。本發(fā)明的組合物可通過任何適宜特定分子的途徑給藥。本發(fā)明組合物可通過任何適宜方式直接地(例如，局部地，如通過注射、皮下注射或局部給藥至組織部位)或全身地(例如，胃腸外或口服)提供給包括人在內(nèi)的動物。若通過胃腸外提供本發(fā)明組合物，例如通過靜脈內(nèi)、皮下、眼、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、口腔內(nèi)、直腸、陰道、眼眶內(nèi)、大腦內(nèi)、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、心室內(nèi)、腱鞘內(nèi)、腦池內(nèi)、囊內(nèi)、鼻內(nèi)給藥或通過氣溶膠給藥，組合物優(yōu)選含有部分水性或生理相容流體懸浮液或溶液。從而，載體或輔料是生理可接受的以便除將所需藥劑遞送給受試者之外，溶液不會另外負(fù)面影響受試者的電解質(zhì)和/或容積平衡。用于藥劑的水性介質(zhì)可包括常規(guī)生理鹽水。為了治療，可將本發(fā)明的ScFv或IgG蛋白以足以預(yù)防、抑制或減緩腫瘤發(fā)展(例如腫瘤的生長、侵入、轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā))的量給藥至癌癥患者。足以實現(xiàn)該效果的量被定義為“藥效治療劑量”。能有效發(fā)揮該用途的量將取決于疾病的嚴(yán)重性和患者自身免疫系統(tǒng)的概況。本發(fā)明所述蛋白的劑量優(yōu)選為0.01-100mg/kg，更優(yōu)選為0.1-lOmg/m2。然而，最佳劑量將取決于要治療的疾病和副作用的存在，其可通過常規(guī)實驗進行測定?？贵w的給藥可通過周期的彈丸注射，或通過從外部源(例如從靜脈內(nèi)袋)或內(nèi)部源(例如從生物可降解的植入物)持續(xù)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥。而且，本發(fā)明的抗體蛋白也可與許多不同生物活性分子一起給藥至預(yù)期接受者。然而，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)實驗確定融合蛋白和其他分子的最佳組合，給藥模式，劑量。本發(fā)明所述的組合物可和其他與相關(guān)疾病有關(guān)的治療劑組合使用。當(dāng)以VEGF受體抗體與放療、化療、其他受體拮抗劑或其組合結(jié)合來治療包括人腫瘤在內(nèi)的腫瘤時，存在協(xié)同作用。換言之，在與化療劑、放療、或附加受體拮抗劑或其組合結(jié)合時通過VEGF受體拮抗劑抑制腫瘤生長可被增強至超過預(yù)期。例如相對于以VEGF受體拮抗劑和化療劑、放療或附加受體拮抗劑治療所預(yù)期的累加效應(yīng)，通過組合治療能更強地抑制腫瘤生長，從而體現(xiàn)出協(xié)同作用。優(yōu)選地，通過癌癥的消除證實協(xié)同作用，其中該消除是不能由VEGF受體拮抗劑和化療劑、放療或附加受體拮抗劑的組合治療所預(yù)期的。在開始化療或放射治療的之前、期間或之后給藥VEGF受體拮抗劑以及它們的任意組合，即開始化療和/或放射治療的之前和期間，之前和之后，期間和之后，或之前、期間和之后。例如，當(dāng)VEGF受體拮抗劑是抗體時，該抗體通常在開始放射治療和/或化療之前的1-30天之間，優(yōu)選3-20天之間，更優(yōu)選5-12天之間被給藥。VEGF受體抗體在一個實施方式中，VEGF受體抗體特異性地結(jié)合到VEGF受體的胞外域的表位上。VEGF受體的胞外域是配體結(jié)合域。該配體結(jié)合域可在受體的任一端發(fā)現(xiàn)，但通常在氨基末端發(fā)現(xiàn)。VEGF受體的一些實例包括蛋白酪氨酸激酶受體，其在文獻中被稱為Flt-1(VEGFR-1)、KDR和Flk_l(VEGFR-2)。除非本文另外指出或另有明確說明，本說明書將遵循VEGF受體的常規(guī)文獻命名法。KDR將被稱為分子量MW為180kD的人形式VEGF受體(Termanetal.，Oncogene,6:1677，1991)。Flk-1(VEGFR-2)將被稱為KDR的鼠同系物(Matthewsetal.，PNAS，88:9026，1991)。Flt-1(VEGFR-1)被稱為與KDR/Flk-1受體不同但相關(guān)的一種形式的VEGF受體(Shibuyaetal.，Oncogene,5:519，1990)。其他VEGF受體包括可與標(biāo)記VEGF交聯(lián)的VEGF受體，或可與KDR共免疫沉淀的VEGF受體。這些VEGF受體的一些已知形式具有大約170kD、150kD、130_135kD、120_125kD和85kD的分子重量(Quinnetal.，PNAS,90:7533，1993；Scheretal.，J.Biol.Chem.，2715761,1996)。VEGF受體通常與細(xì)胞結(jié)合，例如內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF受體也可與非內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，例如腫瘤細(xì)胞?？蛇x地，VEGF受體可游離于細(xì)胞，優(yōu)選以可溶形式。本發(fā)明的拮抗劑中和VEGF受體。在本說明書中，中和(neutralizing)受體是指鈍化受體固有的激酶活性以轉(zhuǎn)導(dǎo)信號。VEGF受體中和的可信試驗是受體磷酸化的抑制。本發(fā)明不受VEGF受體中和的任何特定機制限制。由一種拮抗劑引發(fā)的機制不一定與另一拮抗劑引發(fā)的相同。一些可能的機制包括防止VEGF配體與VEGF受體胞外結(jié)合域的結(jié)合，和防止受體的二聚化或低聚化。但不排除其他機制。在本發(fā)明的上下文中，VEGF受體(或VEGFR)抗體抑制受體VEGFR亞族的活化。抑制受體VEGFR亞族的活化是指VEGFR活化的任何下降。即，防止活化不需要完全終止VEGFR的活化。而且，在本發(fā)明中定義的VEGFR活化的抑制是指通過VEGFR抗體和VEGFR的相互作用抑制VEGFR。聯(lián)合(association)是指VEGFR和能抑制受體酪氨酸激酶活性的VEGFR抗體之間的充分物理或化學(xué)作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員會識別這種化學(xué)作用的實例，本領(lǐng)域已知的包括聯(lián)合或結(jié)合，且包括共價結(jié)合、離子結(jié)合、氫鍵結(jié)合等。因此，本發(fā)明的VEGFR拮抗劑抑制受體的酪氨酸激酶活性，其防止受體的自磷酸化和參與VEGFR信號途徑的多種其他蛋白的磷酸化。參與調(diào)控脈管形成和血管生成的這種途徑包括以下任一者磷脂酶Cy(PLCy)途徑、或磷脂酰3’激酶(PI3-K)/Akt和分裂素活化蛋白激酶(MAPK)途徑(Larriveeetal.，Int.JMed.，5447,2000)。受體的VEGFR亞族的特征在于在胞外域中存在七個免疫球蛋白樣環(huán)，單個跨膜域，以及在胞內(nèi)區(qū)中的裂解酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域(III級受體酪氨酸激酶)。存在幾種已知的受體VEGFR亞族成員，其實例包括VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。通常認(rèn)為KDR(VEGFR_2)是引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖、移動、分化，引起脈管形成，增加血管滲透性，和保持血管完整性的主要VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。VEGFR-1擁有弱得多的激酶活性，且在受到VEGF刺激時不能發(fā)生有絲分裂反應(yīng)，盡管其與VEGF的結(jié)合的親和力比KDR(VEGFR-2)高大約10倍。VEGFR-1也參與VEGF和胎盤生長因子(P1GF)誘導(dǎo)的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞移動以及組織因子的產(chǎn)生。如上述的VEGFR的情況，增加的VEGFR活化可能起因于更高水平的配體、VEGFR基因擴增、引起正調(diào)節(jié)受體信號的受體或突變體的轉(zhuǎn)錄增加。在本發(fā)明的一個實施方式中，VEGFR抗體抑制VEGFR與其配體的結(jié)合。配體與VEGH外部胞外域的結(jié)合刺激受體的二聚化、VEGFR的自磷酸化、受體內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的活化、和參與調(diào)控脈管形成和血管生成的多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的啟動。VEGFR的配體包括VEGF及其同系物P1GF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E。例如，P1GF是一種二聚化分泌因子且僅與VEGFR-1結(jié)合，其由絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層、合體細(xì)胞滋養(yǎng)層和絨毛外滋養(yǎng)層大量產(chǎn)生并且與VEGF具有密切的氨基酸同源性。在人類中存在三種亞型P1GF-1、P1GF_2和P1GF-3。對缺乏P1GF的小鼠的研究證實該生長因子本身不參與血管生成，而是在病理狀態(tài)下特異性地調(diào)控VEGF的血管生成和通透性效應(yīng)。此外，由于存在未在其他VEGF族成員中發(fā)現(xiàn)的N和C端延長，VEGF-D與VEGF-C密切相關(guān)。在成人組織中，VEGF-DmRNA在心、肺、骨骼肌、結(jié)腸和小腸中最豐富。分析VEGF-D受體特異性揭示了VEGF-D是VEGFR-2(Flkl)和VEGFR-3(Flt4)的配體并能活化這些受體；但是，VEGF-D不能結(jié)合到VEGFR-1。此外，VEGF-D是內(nèi)皮細(xì)胞的促分裂劑。9在本發(fā)明的另一實施方式中，VEGFR抗體特異性地結(jié)合VEGFR。應(yīng)該認(rèn)識的是，VEGFR抗體可在外部結(jié)合到VEGFR的胞外部分，其可以或不可以抑制配體的結(jié)合，或進入酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，本發(fā)明的VEGFR拮抗劑是VEGFR特異性的抗體或其功能等效物，在以下將更為詳細(xì)地描述其細(xì)節(jié)。在一個優(yōu)選實施方式中，VEGF受體抗體與KDR特異性結(jié)合。尤其優(yōu)選的是抗原結(jié)合蛋白，該抗原結(jié)合蛋白結(jié)合到KDR胞外域并通過其配體VEGF和P1GF中的一個或兩個阻斷結(jié)合、和/或中和VEGF誘導(dǎo)或P1GF誘導(dǎo)的KDR活化。也存在多種產(chǎn)生VEGFR-2抗體的雜交瘤。例如，產(chǎn)生大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體(DC101)的雜交瘤細(xì)胞系保藏為ATCCHB11534；產(chǎn)生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb25的雜交瘤細(xì)胞系(M25.18A1)保藏為ATCCHB12152；產(chǎn)生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb73的雜交瘤細(xì)胞系(M73.24)保藏為ATCCHB12153。此外，存在多種產(chǎn)生抗VEGFR-1抗體的雜交瘤，包括但不限于在W098/22616、W099/59636、AU5066698B2和CA2328893中公開的雜交瘤KM1730(保藏為FERMBP-5697)、KM1731(保藏為FERMBP-5718)，KM1732(保藏為FERMBP-5698)、KM1748(保藏為FERMBP-5699)、KM1750(保藏為FERMBP-5700)。本領(lǐng)域中已知多種其他VEGFR拮抗劑。VEGFR拮抗劑的一些實例如US5，185,438、5，621，090、5，283，354、5，270，458、5，367，057、5，548，065、5，747，651、5，912，133、6，677，434,6，960，446,5，840，301,5，861，499,6，365，157,5，955，311,6，365，157,6，811，779、以及W02001/66063所述。US5，861，301、Termanetal.，Oncogene，6:1677，199UW094/10202和WO95/21865公開了VEGFR拮抗劑，特別是抗VEGFR-2抗體。此外，抗VEGFR-2抗體如US.6，177，401和5，712，395所公開的。US5，981，569公開了為有機分子的VEGFR拮抗劑。此外，已知針對KDR(VEGFR-2)和VEGFR-1的雙特異性抗體(BsAbs)，其具有兩種不同抗原結(jié)合特異性或位點。而且，Hennequinetal.，J.Med.Chem.,42=5369,1999公開了特定的喹唑啉、喹啉和噌啉可作為有效的VEGF受體拮抗劑(Annieetal.,J.Acqu.ImmuneDefic.Syn.andHum.Retrovirol.,17:A41,1998)。而且，本領(lǐng)域已知檢測VEGFR抗體的試驗。本發(fā)明的VEGFR抗體抑制VEGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及磷酸化作用。因此，磷酸化試驗可用于檢測本發(fā)明的VEGFR抗{本o^Paneketal.,J.Pharmacol.Exp.Thera.,2831433,1997andBatleyetal.,LifeSci.,62=143,1998中描述了一些酪氨酸激酶活性的試驗。此外，可利用特異性檢測VEGFR表達(dá)的方法。抗體可通過本領(lǐng)域已知的方法(Kohler和Milstein，Nature,256:495，1975；Campbell,MonoclonalAntibodyTechnology,TheProductionandCharacterizationofRodentandHumanHybridomas；Burdonetal.,Eds.,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,Vol.13,ElsevierSciencePublishers,Amsterdam,1985；Huseetal.，Science，246:1275，1989)制備本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可以是單克隆或多克隆抗體或任何其他適宜形式的抗體，例如抗體的片段或衍生物、單鏈可變區(qū)片段(ScFv)或抗體的合成同系物，條件是所述抗體具有與完整抗體相同的結(jié)合特性或具有與完整抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特征。除非文中另有指示或明確指出，本文所用的抗體結(jié)構(gòu)域、區(qū)域和片段遵循本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)定義(Abbasetal.,CellularandMolecularlmmunology,ff.B.SaundersCompany,Philadelphia,PA,1991)。優(yōu)選地,本發(fā)明的抗體是單克隆抗體?？贵w片段可通過裂解完整抗體或通過表達(dá)編碼片段的DNA而制備?？贵w片段可通過公開文獻中描述的方法制備(Lamoyietal.,J.Immunol.Methods,56=235,1983；Parham，J.Immunol.，131:2895，1983)。這種片段可包含F(xiàn)ab片段和F(ab')2片段中的一個或兩個。這種片段也可包含單鏈可變區(qū)片段抗體(即ScFv)、雙抗體或其他抗體片段。在W093/21319，EP239,400,W089/09622，EP338，745和EP332，424中公開了制備這些功能等效物的方法。單鏈可變區(qū)片段(scFv)是與輕鏈可變區(qū)(一種短肽連接物)連接的抗體重鏈可變區(qū)組成的多肽。從而，scFv包含整個抗體結(jié)合位點。可在細(xì)菌或在真核細(xì)胞中制備這些鏈。本發(fā)明的單鏈抗體的典型實例是6A6-ScFv(TTAC-0001)。6A6_ScFv表現(xiàn)為阻斷VEGF-KDR(VEGF-VEGFR-2)相互作用并抑制VEGF刺激的受體磷酸化。這種6A6_ScFv可與HUVEC細(xì)胞和K562細(xì)胞中的可溶性KDR(VEGFR_2)和細(xì)胞表面表達(dá)的KDR(VEGFR_2)結(jié)合。6A6-ScFv具有SEQIDNO35的輕鏈序列和SEQIDNO36的重鏈序列。6A6_ScFv抗體是完全的人抗體并可由Fab',F(ab')2、二價ScFv、二價重組ScFv或人IgG抗體構(gòu)成。優(yōu)選地，盡管抗體片段含有整個抗體的所有六個互補決定區(qū)(⑶Rs)，但是包含比所有這些區(qū)域更少的如三，四或五個⑶Rs的片段也具有功能。如果抗體片段太短而不具備免疫原性，可將其與載體分子偶聯(lián)。一些適宜的載體分子包括匙孔血藍(lán)蛋白和牛血清白蛋白?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法進行偶聯(lián)。本發(fā)明的抗體也包括通過直接突變、親和力成熟的方法、噬菌體展示或鏈改組而改善其結(jié)合特性的抗體。通過突變CDRs和篩選具有所需特性的抗原結(jié)合位點，可修飾或改善親和力和特異性(Yangetal.，J.Mol.Biol.，254:392，1995)。以多種方式突變CDRs。一種方法是任意排布單個殘基或殘基組合以使在一組同一抗原結(jié)合位點中在特定位點發(fā)現(xiàn)所有二十種氨基酸?？蛇x地，通過錯配PCR方法在CDR殘基范圍內(nèi)誘導(dǎo)突變(Hawkinsetal.,J.Mol.Biol.,226=889,1992)0含有重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的噬菌體展示載體在E.coli突變株中繁殖(Lowetal.，J.Mol.Biol.，250:359，1996)。這些產(chǎn)生突變的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法的例示?？贵w特別是單克隆抗體可由本領(lǐng)域已知的方法制備。制備抗體的實例包括但不限于在雜交瘤中產(chǎn)生和用編碼受體拮抗劑的DNA轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞。在許多公開文獻中描述了這些方法(KohlerandMilstein,Nature,256:495，1975；Campbellin"MonoclonalAntibodyTechnology,TheProductionandChracterizationofRodentandHumanHybridomas"inBurdonetal,Eds.，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,Vol.13,ElservierSciencePublishers,Amsterdam,1985；Huseetal.，Science,246:1275，1989)?？贵w等效物也可通過本領(lǐng)域已知的方法制備。例如，可由完整抗體酶促制備抗體片段。優(yōu)選地，抗體等效物是由編碼這些等效物的DNA制備的。編碼抗體片段的DNA可以通過刪除除了所需的編碼抗體全長的DNA部分之外的所有部分而制備。編碼嵌合抗體的DNA可通過重組基本上或?qū)ｉT地來自于相應(yīng)的人抗體區(qū)域的編碼人恒定區(qū)域的DNA和基本上或?qū)ｉT地來自于除人之外的哺乳動物的可變區(qū)序列的編碼可變區(qū)的DNA而制備。編碼人源化抗體的DNA可通過重組基本上或?qū)ｉT地來自于相應(yīng)的人抗體區(qū)域的編碼除了互補決定區(qū)(CDRs)之外的恒定區(qū)和可變區(qū)的DNA和基本上或?qū)ｉT地來自于除人之外哺乳動物的編碼⑶Rs的DNA而制備。編碼抗體片段的DNA分子的適宜來源包括表達(dá)全長抗體的細(xì)胞，例如雜交細(xì)胞瘤。片段可作為抗體等效物而使用，或可如上述重組到等效物之中。在本節(jié)描述的DNA刪除和重組可通過已知方法進行，例如在本節(jié)名為“FunctionalEquivalentsofAntibodies”的公開專利申請中描述的那些和/或例如以下描述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化載體和表達(dá)本發(fā)明抗體的宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，例如C0S-7細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞和淋巴源的細(xì)胞系(例如淋巴瘤、骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞)?？蛇x擇利用其他真核宿主例如酵母。例如，小鼠胎兒肝基質(zhì)細(xì)胞系2018結(jié)合APtag-Flk1和APtag-Flk-2的融合蛋白，即含有VEGFR-2和Flk_2(ATCC,Manassas,VA,CRL10907)的配體，人胎兒脾細(xì)胞系Fsp62891含有Flk-2配體(ATCCCRL10935)，人基質(zhì)胎兒胸腺細(xì)胞系F.thy62891含有VEGFR-2配體(ATCCCRL10936)。本文所用的術(shù)語“載體”是指任何含有將被引入宿主細(xì)胞并且將被重組和整合到宿主細(xì)胞組中的合適核酸序列、或含有作為附加體自主復(fù)制的合適核酸序列的核酸。這種載體包括線性核酸，質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，RNA載體，病毒載體等等。病毒載體的實例包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒。本文所用的術(shù)語“基因表達(dá)”或“靶蛋白表達(dá)”應(yīng)理解成表示DNA序列的轉(zhuǎn)錄、mRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯和Fc融合蛋白產(chǎn)物的分泌。在本發(fā)明中，適宜的宿主細(xì)胞可以被DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并可用于表達(dá)和/或分泌靶蛋白。優(yōu)選用于本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括永生雜交瘤細(xì)胞、NS/0骨髓瘤細(xì)胞、293細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CH0)細(xì)胞、HELA細(xì)胞和COS細(xì)胞。通過本領(lǐng)域已知的方法在含有可同化碳源(碳水化合物例如葡萄糖或乳糖)、氮源(氨基酸、肽、蛋白或其降解產(chǎn)物，例如酮、銨鹽等)和無機鹽(鈉、鉀、鎂和鈣的硫酸鹽、磷酸鹽和/或碳酸鹽)的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。培養(yǎng)基額外含有例如促生長物質(zhì)，例如微量元素，如鐵、鋅、錳等。若希望在酵母中表達(dá)基因構(gòu)建體，適宜用于酵母的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7±的trpl(Stinchcombetal.，Nature,28239,1979；Kingsmanetal.，Gene,7:141，1979)。trpl基因為缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株提供了選擇標(biāo)記，例如ATCC44076或PEP4-1(Jones，Genetics，8512，1977)。trpl在酵母宿主細(xì)胞基因組中存在損壞然后提供了在缺乏色氨酸下通過生長來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似地，通過已知帶有Leu2基因的質(zhì)粒補充Leu2缺陷酵母株?？蛇x地，編碼受體拮抗劑的DNA可被克隆到來自病毒(例如腺病毒，腺病毒伴隨病毒，皰疹病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒)的載體中。基因表達(dá)通過可誘導(dǎo)或不可誘導(dǎo)調(diào)控序列來控制。簡言之，選擇了含有表達(dá)所需DNA(例如抗體，抗體等效物或VEGF受體的核酸分子)的細(xì)胞的適宜來源。通過標(biāo)準(zhǔn)程序由適宜來源制備總RNA?？俁NA直接用于cDNA合成。在例如以上所述的那些分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)手冊中提供了分離RNA和合成cDNA的標(biāo)準(zhǔn)方法。可通過已知方法擴增cDNA。例如，cDNA可作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴增模版(Saikietal.，Science,239:487，1988；US4，683，195)。用于PCR擴增的低聚核苷酸引物來源于要擴增的已知序列。通過本領(lǐng)域已知的方法合成所述低聚核苷酸(Caruthers，Science,230:281，1985)。將上游和下游低聚核苷酸的混合物用于PCR擴增中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序優(yōu)化每個特定引物對的條件。例如通過電泳具有正確大小的cDNA并對照引物之間的序列來分析PCR產(chǎn)物?？蛇x地，編碼區(qū)域可擴增兩個或多個重疊片段。該重疊片段被設(shè)計成包含允許由這些片段裝配成完整cDNA的限制性酶切位點。為了分離完整的VEGF受體蛋白編碼區(qū)域，例如上游PCR低聚單克隆抗體與5’端的序列是互補的，并優(yōu)選地包含ATG啟動密碼子和至少5-10個核苷酸的啟動密碼子上游。下游PCR低聚核苷酸引物與所需DNA序列的3’端序列是互補的。所需DNA序列優(yōu)選編碼VEGF受體的完整的胞外部分，并且任選地編碼所有或部分跨膜區(qū)域和/或所有或部分細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，包括終止密碼子。要擴增的NDA(例如編碼抗體、抗體等效物或VEGF受體的DNA)也可以在多種克隆載體中在多種宿主細(xì)胞中進行復(fù)制。宿主細(xì)胞可以是原核的或真核的。拼接了DNA的載體可含有染色體、非染色體和合成DNA序列片段。一些適宜的原核克隆載體包括來自于E.coli的質(zhì)粒，例如colEl、pCRI、pBR322、pMB9、pKSM和RP4。原核載體也包括噬菌體DNA的衍生物例如M13和其他絲狀單鏈DNA噬菌體。優(yōu)選用于克隆編碼VEGF受體的核酸的載體是桿狀病毒載體。含有要表達(dá)DNA的載體被轉(zhuǎn)染到適宜的宿主細(xì)胞中。宿主細(xì)胞被保持在適宜的培養(yǎng)基中，并置于細(xì)胞和載體復(fù)制的條件下。可從細(xì)胞回收載體。可從載體中回收要表達(dá)的DNA。要表達(dá)的DNA(如編碼抗體、抗體等效物或受體的DNA)可被插入到適宜的表達(dá)載體中并在適宜的原核或真核宿主細(xì)胞中進行表達(dá)。例如，插入宿主細(xì)胞的DNA可編碼VEGF受體的整個胞外部分，或VEGF受體的胞外部分的可溶性片段。由DNA編碼的VEGF受體的胞外部分可任選地在5’和/或3’端添加上附加氨基酸序列。附加氨基酸序列可添加在VEGF受體胞外區(qū)(例如前導(dǎo)序列)、VEGF受體的跨膜區(qū)和/或胞內(nèi)區(qū)。附加氨基酸序列也可以是天然VEGF受體所未添加的序列。優(yōu)選的，這種附加氨基酸序列發(fā)揮特定作用，以改善表達(dá)水平、分泌、可溶性或免疫原性。用于在細(xì)菌特別是E.coli中表達(dá)蛋白的載體是已知的(DieckmarmandTzagoloff,J.Biol.Chem.，2601513，1985)。這些載體含有編碼鄰氨基苯甲酸合成酶(TrpE)的DNA序列且之后在其羧基端有聚合接頭。其他的表達(dá)載體系統(tǒng)是基于β_半乳糖苷酶(ρΕΧ)、λPL、麥芽糖結(jié)合蛋白(pMAL)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(pGST)(Gene,67:31，1988；PeptideResearch,3:167，1990)。用于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的適宜載體也是已知的。這種載體包括公知的SV-40衍生物、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生DNA序列和來自于功能性哺乳動物載體組合的改組載體，例如以上描述的那些，以及功能性質(zhì)粒和噬菌體DNA。用于真核細(xì)胞表達(dá)的附加載體是本領(lǐng)域已知的(Southern，P.J.andBerg,P.，J.Mol.App1.Genet.，1327,1982；Subramanietal,Mol.Cell.Biol.，1854,1981；KaufinannandSharp,J.Mol.Biol.,159601,1982；KaufinannandSharp,Mol.Cell.Biol.，1982；Scahilletal.，PNAS，80:4654，1983；UrlaubandChasin,PNAS，77:4216，1980)。本發(fā)明可用的表達(dá)載體包含至少一個被操作連接到要表達(dá)的DNA序列或片段上的表達(dá)控制序列?？刂菩蛄斜徊迦胼d體中以控制和調(diào)控克隆DNA序列的表達(dá)。可用的表達(dá)控制序列實例包括=Iac體系，trp體系，tac體系，trc體系，噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區(qū)，和fd包被蛋白的控制區(qū)，酵母的糖酵解啟動子(例如3-膦酸甘油酸酯激酶的啟動子)，酵母酸性磷酸酶的啟動子(例如Pho5)，酵母α配對因子的啟動子，來自于多瘤、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和猿猴病毒的啟動子(例如SV40的早期和晚期啟動子)，以及已知控制原核或真細(xì)胞及其病毒的基因表達(dá)的其他序列。含有控制信號和要表達(dá)的DNA(例如編碼抗體、抗體等效物或VEGF受體的DNA)的載體被插入到用于表達(dá)的宿主細(xì)胞中。一些可用的表達(dá)宿主細(xì)胞包括公知的原核和真核細(xì)胞。一些適宜的原核宿主包括例如E.coli，例如，E.coliSG-936、Ε.coliHB101、E.coliW3110、E.coliX1776、Ε.coliX2282、Ε.coliDHI、和E.coliMRCI；假單胞菌(Pseudomonas)；桿菌(Bacillus),如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；禾口鏈霉菌(Str印tomyces)。適宜的真核細(xì)胞包括酵母和其他真菌、昆蟲、動物細(xì)胞(例如COS細(xì)胞和CHO細(xì)胞)、以及組織培養(yǎng)的人類細(xì)胞和植物細(xì)胞。然后維持在適宜培養(yǎng)基的宿主細(xì)胞中進行表達(dá)，要表達(dá)的多肽或肽(例如抗體、抗體等效物或VEGF受體)可通過本領(lǐng)域已知的方法從培養(yǎng)基中分離和純化。如果多肽或肽未被分泌到培養(yǎng)基中，可在分離純化之前裂解宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明的抗體可通過以可溶性受體免疫哺乳動物而制備?？扇苄允荏w本身可作為免疫原，或被附加到載體蛋白或其他目標(biāo)如微球即瓊脂糖微球上。在哺乳動物產(chǎn)生抗體之后，分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞的混合物例如脾細(xì)胞。通過從混合物中分離單個產(chǎn)生抗體的細(xì)胞并將這些細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞例如骨髓瘤細(xì)胞融合使其永生來制備單克隆抗體。制得的雜交瘤被保存在培養(yǎng)液中，并表達(dá)單克隆抗體，單克隆抗體可從培養(yǎng)基中收集獲得。還可由結(jié)合到表達(dá)特定感興趣受體的細(xì)胞的表面的受體制備抗體。受體結(jié)合的細(xì)胞可以是天然表達(dá)受體的細(xì)胞，例如VEGF的血管內(nèi)皮細(xì)胞。可選地，受體結(jié)合的細(xì)胞可以是被編碼受體的DNA所轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，例如3T3細(xì)胞，其被VEGFR所轉(zhuǎn)染。受體可用作免疫原以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。受體肽可從天然來源獲取，例如從表達(dá)受體的細(xì)胞中獲取。例如，VEGF受體肽可從血管內(nèi)皮細(xì)胞中獲取?？蛇x地，采用商業(yè)可供機械可制備合成的受體肽。在一個實施方式中，VEGF受體氨基酸序列可由公開文獻提供(Shibuyaetal.,Oncogene,5:519,1990；PCT/US92/01300；Termanetal.,Oncogene,61677，1991；Matthewsetal.，PNAS，889026,1991)?？蛇x地，將編碼受體的DNA例如cDNA或其片段進行克隆和表達(dá)，并回收制得的多肽從而以其作為免疫原以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。例如，為了制備抗體所針對的VEGF受體，可采用例如以下所述的那些標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將編碼本發(fā)明VEGF受體或其部分特別是其胞外部分的核酸分子插入到用于在宿主細(xì)胞表達(dá)的已知載體中。這些核酸分子的適宜來源包括表達(dá)VEGF受體的細(xì)胞，即血管內(nèi)皮細(xì)胞?？稍谌我獠溉閯游镏兄苽淇贵w；除人之外的適宜哺乳動物包括例如兔，大鼠，小鼠，馬，山羊或靈長類。小鼠被頻繁用于制備單克隆抗體。抗體可以是以下免疫球蛋白類別中的一種成員IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及它們的亞型，并優(yōu)選是IgGl抗體。本發(fā)明的抗體和其功能等效物可以是免疫球蛋白類別的任意成員或其組合。VEGF受體的VEGF活化的中和可在體外或體內(nèi)在內(nèi)皮或非內(nèi)皮細(xì)胞的樣品例如腫瘤細(xì)胞中實施VEGF受體活化的中和。在表達(dá)VEGF受體的細(xì)胞樣品中VEGF受體的VEGF活的化中和包括以本發(fā)明的抗體接觸細(xì)胞。在細(xì)胞樣品中添加VEGF之前同時或之后，細(xì)胞在體外接觸抗體。在體內(nèi)，通過給藥至哺乳動物將本發(fā)明的抗體與VEGF受體接觸。給藥至哺乳動物的方法包括例如口服，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，或肌肉內(nèi)給藥。這種體內(nèi)中和方法可用于抑制已知哺乳動物的血管生成。血管生成抑制是一種有效的治療方法，例如用于防止或抑制與病理狀態(tài)如腫瘤生長相關(guān)的血管生成。因此，本發(fā)明的抗體是抗血管生成和抗腫瘤的免疫治療劑。本發(fā)明所用的術(shù)語“哺乳動物”是指任意哺乳動物。哺乳動物的一些實例包括寵物動物，例如狗和貓；農(nóng)場動物，例如豬、牛、綿羊和山羊；實驗室動物，例如小鼠和大鼠；靈長類，例如猴、猿和黑猩猩；和人。在一些非內(nèi)皮細(xì)胞例如腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)VEGF受體，這表明在這些細(xì)胞中存在非預(yù)期的自分泌和/或旁分泌環(huán)。本發(fā)明的拮抗劑例如抗體可用于中和這些細(xì)胞中的VEGF受體活性，從而阻斷自分泌和/或旁分泌環(huán)，并抑制腫瘤生長。抑制血管生成和抑制病理狀態(tài)例如在哺乳動物中的腫瘤生長的方法包括給藥有效量的任意本發(fā)明拮抗劑(例如抗體，包括任意的功能等效物)至哺乳動物全身或直接至哺乳動物內(nèi)的腫瘤。所述哺乳動物優(yōu)選為人。這種方法可有效地治療患有實體腫瘤(優(yōu)選高度脈管腫瘤)和非實體腫瘤的受試者。抑制或減少腫瘤生長包括防止或抑制腫瘤的發(fā)展，包括癌性和非癌性腫瘤。腫瘤的發(fā)展包括侵入，轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)和腫瘤大小的增長。抑制或減少腫瘤生長也包括腫瘤的破除。通過本發(fā)明的方法可治療所有類型的腫瘤。腫瘤可以是實體或非實體的?？赏ㄟ^本發(fā)明拮抗劑治療的實體腫瘤的一些實例包括癌，肉瘤，胚細(xì)胞瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤。這些腫瘤的一些實例包括表皮樣腫瘤，鱗片狀腫瘤(例如頭頸腫瘤)，結(jié)直腸腫瘤，前列腺腫瘤，乳腺腫瘤，肺腫瘤(包括小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺腫瘤)，胰腺腫瘤，甲狀腺腫瘤，卵巢腫瘤，和肝腫瘤。其他實例包括=Kapos肉瘤、CNS瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、毛細(xì)血管成血管細(xì)胞瘤、腦膜瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤、黑色素瘤、胃腸道和腎的癌和肉瘤、橫紋肌肉瘤、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(優(yōu)選多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)和平滑肌細(xì)胞瘤。本發(fā)明的拮抗劑有效的血管化皮膚癌的實例包括鱗片狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌和可通過壓制惡性角蛋白形成細(xì)胞例如人惡性角蛋白形成細(xì)胞生長而治療的皮膚癌。非實體腫瘤的一些實例包括白血病、多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些實例包括急性粒細(xì)胞白血病(AML)，慢性粒細(xì)胞白血病(CML)，急性淋巴白血病(ALL)，慢性淋巴白血病(CLL)，紅細(xì)胞白血病或單核細(xì)胞性白血病。淋巴瘤的一些實例包括與霍奇金病和非霍奇金病相關(guān)的淋巴瘤。防止或抑制血管生成也可用于治療特征為過度血管生成的病癥，例如新生血管性青光眼，包括增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變在內(nèi)的增殖性視網(wǎng)膜病，關(guān)節(jié)炎，黃斑變性，血管瘤，面部血管纖維瘤，和銀屑病。采用本發(fā)明的抗體以分離和純化VEGF受體采用常規(guī)方法例如親和層析法(Deanetal.，AffinityChromatographyAPracticalApproach,IRLPress，Arlington，VA，1985)，可利用本發(fā)明的拮抗劑分離和純化VEGF受體。本領(lǐng)域公知的其他方法包括以涂有抗體的磁珠進行的磁性分離，以附著在固體基質(zhì)上的抗體進行的“淘篩”，和流式細(xì)胞計數(shù)法(FACS)。VEGF受體的來源通常是表達(dá)VEGF受體的脈管細(xì)胞，特別是脈管內(nèi)皮細(xì)胞。脈管內(nèi)皮細(xì)胞的適宜來源是血管，例如臍帶血細(xì)胞，特別是人臍帶血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。VEGF受體可用作制備其他物質(zhì)的起始物質(zhì)，例如用于制備能識別并結(jié)合到VEGF受體上或VEGF表達(dá)細(xì)胞表面的其他抗原上的附加單克隆和多克隆抗體的抗原。采用本發(fā)明的抗體以分離和純化KDR陽性腫瘤細(xì)胞采用常規(guī)方法例如親和層析法(Deanetal.，AffinityChromatographyAPracticalApproach,IRLPress，Arlington，VA，1985)，可利用本發(fā)明的抗體分離和純化Flk-IKDR(VEGFR-2)陽性腫瘤細(xì)胞，即表達(dá)KDR的腫瘤細(xì)胞。本領(lǐng)域公知的其他方法包括以涂有抗體的磁珠進行的磁性分離，偶聯(lián)在抗體上的細(xì)胞毒素劑(例如互補物)，以附著在固體基質(zhì)上的抗體進行的“淘篩”，和流式細(xì)胞計數(shù)法(FACS)。監(jiān)測體外或體內(nèi)VEGF和VEGF受體水平采用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)試驗和方法，利用本發(fā)明的抗體可在生物樣品中監(jiān)測體外或體內(nèi)VEGF或VEGF受體的水平。生物樣品的一些實例包括體液，例如血液。標(biāo)準(zhǔn)試驗包括例如標(biāo)記抗體和實施標(biāo)準(zhǔn)免疫試驗，例如本領(lǐng)域公知的放射免疫試驗。執(zhí)行本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)如文獻所述(Sambrooketal.，‘‘MolecularCloning,“第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1987；Ausubeletal,(Eds)"CurrentProtocolsinMolecularBiology,"GreenPublishingAssociates/ffiley-Interscience,NewYork,1990)。給藥為了治療，可將本發(fā)明受體抗體以足以防止、抑制或減緩腫瘤發(fā)展(例如腫瘤的生長、侵入、轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā))的劑量給藥至患有腫瘤的患者。足以實現(xiàn)該目的的劑量被定義為有效治療劑量。能有效發(fā)揮該用途的量將取決于疾病的嚴(yán)重性和患者自身免疫系統(tǒng)的概況。也會依據(jù)疾病狀態(tài)和患者體質(zhì)改變給藥方案，通常從單次丸劑劑量或持續(xù)輸注至每天多次給藥(例如每4-6小時)，或如治療醫(yī)生和患者狀態(tài)所指示的。然而應(yīng)該注意的是本發(fā)明不限于任何特定劑量。本發(fā)明可用于治療任何適宜腫瘤，包括例如乳腺，心，肺，小腸，結(jié)腸，脾，腎，膀胱，頭頸，卵巢，前列腺，腦，胰腺，皮膚，骨骼，骨髓，血液，胸腺，子宮，睪丸，宮頸或肝的腫瘤。優(yōu)選地，在腫瘤是結(jié)腸腫瘤或腫瘤是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)時采用本發(fā)明方法。而且，本發(fā)明的腫瘤優(yōu)選具有VEGFR的異常表達(dá)或信號。在許多不同人類癌癥中觀察到增強的VEGFR信號。由滲入神經(jīng)膠質(zhì)瘤的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)高水平VEGFR-2(Plateetal.，Nature,359:845，1992)。由人成神經(jīng)膠質(zhì)瘤產(chǎn)生的VEGF特異性地正調(diào)節(jié)VEGFR-2水平(Plateetal.，CancerRes.,53:5822，1993)。與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GAEC)中高水平的VEGFR-2表達(dá)表明了在腫瘤形成期間可能誘導(dǎo)受體活性，因為在正常腦內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎檢測不到VEGFR-2轉(zhuǎn)錄物。這種正調(diào)節(jié)限于最接近腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明可用于抑制或減緩腫瘤生長。抑制或減緩腫瘤生長表示防止、抑制或減緩腫瘤的發(fā)展，例如腫瘤的生長、侵入、轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā)。此外，本發(fā)明也可用于治療血管生成病狀，例如動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、黃斑變性和銀屑病。鑒別具有本發(fā)明對癥的病癥的患者完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力和知識范圍之內(nèi)。本發(fā)明中，任何適宜方法或途徑可用于給藥VEGFR抗體，例如口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)給藥。拮抗劑的給藥劑量取決于許多因素，包括例如抗體類型、要治療腫瘤的類型和嚴(yán)重性、以及抗體給藥途徑。然而應(yīng)該強調(diào)的是本發(fā)明不限于任何特定的給藥方法或途徑。在一個可選實施方式中，VEGFR拮抗劑可與一種或多種抗腫瘤藥組合給藥(US6，217，866)?？刹捎萌魏芜m宜的抗腫瘤藥例如化療劑或放療?；焺┑膶嵗ǖ幌抻陧樸f，鏈霉菌(doxorubicin)，紫杉醇，伊立替康(CPT-Il)，托波替康或其組合。當(dāng)抗腫瘤藥是放療時，放射源可以是在待治療患者的體外(外放射治療-EBRT)或體內(nèi)(近距離放射治療-BT)。抗腫瘤藥的給藥劑量取決于許多因素，包括例如藥劑類型、要治療腫瘤的類型和嚴(yán)重性、以及藥劑的給藥途徑。然而應(yīng)該強調(diào)的是本發(fā)明不限于任何特定劑量。在一個附加的可選實施方式中，本發(fā)明的VEGFR抗體可與一種或多種適宜的佐劑例如細(xì)胞因子(例如IL-10和IL-13)或其他免疫刺激劑組合給藥。參見例如Larriveeetal.,supra.,然而應(yīng)該認(rèn)識到以有效治療方式僅給藥VEGFR拮抗劑就足以防止、抑制或減緩腫瘤的發(fā)展。此外，VEGFR抗體可作為配體偶聯(lián)物給藥，其特異性地結(jié)合到受體上并遞送毒性致命的有效載荷，之后配體_毒素被內(nèi)化。為了開發(fā)過表達(dá)EGFR或VEGFR的腫瘤細(xì)胞的特異性毒劑并最小化非特異性毒性，設(shè)計了毒素和受體之間的偶聯(lián)物。例如，由EGF和假單胞菌內(nèi)毒素(PE)組成的偶聯(lián)物在體外表現(xiàn)出對表達(dá)EGFR的HeLa細(xì)胞的毒性。包括硫利噠嗪和腺病毒在內(nèi)的多種藥劑可增強細(xì)胞對偶聯(lián)物的吸收，以及增加偶聯(lián)物的細(xì)胞毒性。應(yīng)理解的是，為預(yù)防和治療目的用在哺乳動物中的本發(fā)明的VEGFR抗體可以以額外含有藥物可接受載體的組合物形式給藥。適宜的藥物可接受載體包括例如水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽溶液、右旋糖、甘油、乙醇等以及它們的組合中的一種或多種。藥物可接受載體還可含有少量的輔助物質(zhì)例如潤濕或乳化劑、防腐劑或緩沖劑，其增加了儲存期或結(jié)合蛋白的有效性。如本領(lǐng)域公知，可制劑化成用來注射的組合物以便提供在給藥至哺乳動物之后有效成分的快速、持續(xù)或延遲釋放。本發(fā)明的VEGFR抗體可以是多種形式。包括例如固體、半固體和液體劑型，例如片齊、丸劑、粉末、液態(tài)溶液、分散液或懸浮液、脂質(zhì)體、栓劑、可注射溶液和可注入的溶液。優(yōu)選形式取決于預(yù)期的給藥模式和治療用途?？砂此幬镱I(lǐng)域公知的方式制備這種抗體。在組合物制備中，活性成分將通常與載體混合、或被載體稀釋和/或被吸附在載體內(nèi)，其可以是例如膠囊、囊劑、紙或其他容器的形式。當(dāng)載體作為稀釋劑時，其可以是固體、半固體或液態(tài)物質(zhì)，其充當(dāng)有效成分的媒介、賦形劑或介質(zhì)。從而，組合物的形式可以是片劑，錠劑，囊劑，扁囊劑，酏劑，懸浮液，氣霧劑(作為固體或液體介質(zhì))，含有例如高達(dá)10%重量的活性化合物的軟膏，軟膠囊和硬膠囊，栓劑，注射液，懸浮液，無菌包裝粉末，以及局部貼劑。放射與VEGF受體拮抗劑組合使用的放射源可以在待治療患者的體外或體內(nèi)。當(dāng)放射源在患者體外，該治療被稱為外放射治療(EBRT)。當(dāng)放射源在患者體內(nèi)時，該治療稱為近距離放射治療(BT)。采用為此制造的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備例如AECL遠(yuǎn)距離鈷治療機(Theratron)和瓦里安醫(yī)用直線加速器(VarianClinac)，按照公知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)給藥射線。射線的劑量取決于本領(lǐng)域公知的許多因素。這些因素包括要治療的器官、在射線途徑中可能無意間受到負(fù)面影響的健康器官、患者對放射治療的耐受性、以及需要治療的機體面積。劑量通常在I-IOOGy之間，更具體在2-80Gy之間。已報道的一些劑量包括對脊髓的35Gy，對腎的15Gy，對肝的20Gy，和對前列腺的65-80Gy。然后應(yīng)該強調(diào)的是本發(fā)明不限于任何特定劑量。由治療醫(yī)生根據(jù)給定情況下的特定因素包括以上提及的因素確定劑量。體外射線源和進入患者的點之間的距離可以是表示殺死靶細(xì)胞和最小化副作用之間達(dá)到的可接受平衡的任何距離。通常地，體外射線源至進入患者的點之間為70cm-100cmo近距離放射治療通常將射線源置入患者內(nèi)。通常地，射線源置于離待治療組織大約0-3cm。已知的技術(shù)包括間質(zhì)、腔內(nèi)和表面近距離放射治療。放射性粒源(radioactiveseed)可被永久地或暫時地植入。已用于永久植入的一些典型放射性原子包括碘-125和氡。已用于暫時植入的一些典型放射性原子包括鐳、銫-137和銥-192。已用于近距離放射治療的一些其他放射性原子包括镅-241和金-198。近距離放射治療中的射線劑量可同于以上所述外放射治療的。除了以上述提及的決定外放射治療劑量的因素之外，還要考慮所用放射性原子的特性以確定近距離放射治療的劑量?；熁焺┌ㄋ心苡行б种颇[瘤生長的化合物。可通過多種方式完成化療劑的給藥，包括通過腸胃外和腸內(nèi)途徑的全身給藥。在一個實施方式中，VEGF受體拮抗劑和化療劑以單獨分子被給藥。在另一實施方式中，例如通過偶聯(lián)將VEGF受體拮抗劑附加到化療劑上?；焺┑膶嵗ㄍ榛瘎?，例如氮芥、乙烯亞胺化合物和烷基磺酸鹽；抗代謝物，例如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如長春花生物堿和鬼白毒素衍生物；細(xì)胞毒性抗生素；破壞或干擾DNA表達(dá)的化合物。此外，化療劑包括本文所述的抗體、生物分子和小分子?；焺┗蚧煹奶囟▽嵗樸f、達(dá)卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、鏈脲菌素、環(huán)磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNE)、多柔比星(阿霉素)、柔紅霉素(daunorubicin)、丙卡巴胼(procarbazine)、絲裂霉素、阿糖胞苷(cytarabine)、依托泊苷(etoposide)、甲氨ifΠφ(methotrexate)>5-M^BtPS(5-fluorouraci1)>(vinblastine)>-lx#ifM(vincristine)、博來霉素(bleomycin)、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(泰素帝)、阿地白介%(aldesleukin)、^#酉先月安_(asparaginase)、白消安(busulfan)、+白(carboplatin)、克拉屈濱(cladribine)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、氟脲苷(floxuridine)、氟達(dá)拉濱(fludarabine)、羥基脲、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、干擾素α、亮丙瑞林(Ieuprolide)、甲地孕酮(megestrol)、美法侖(melphalan)、巰嘌呤(mercaptopurine)、普利霉素(plicamycin)、米托坦(mitotane)、培門冬酶(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、哌泊溴烷(pipobroman)、普利霉素(plicamycin)、鏈脲菌素、他莫昔芬(tamoxifen)、替尼泊苷(teniposide)、高內(nèi)酯(testolactone)、硫鳥嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)、長春瑞濱(vinorelbine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、泰素(taxol)、以及它們的組合。本發(fā)明還包括用于抑制腫瘤生長的試劑盒，該試劑盒含有有效治療劑量的EGFR拮抗劑和有效治療劑量的VEGFR拮抗劑。本發(fā)明的試劑盒的EGFR或VEGFR拮抗劑可以是任何適宜的拮抗劑，其實例如上所述。優(yōu)選地，試劑盒的EGFR拮抗劑含有EGFR特異性的抗體或其功能等效物?？蛇x地，且優(yōu)選地，試劑盒的EGFR拮抗劑含有EGFR特異性的小分子。試劑盒的VEGFR拮抗劑含有VEGFR特異性的抗體或其功能等效物?？蛇x地，試劑盒的VEGFR拮抗劑優(yōu)選含有VEGFR特異性的小分子。此外，本發(fā)明的試劑盒還可含有抗腫瘤藥。本文描述了本發(fā)明的合適抗腫瘤藥的實例。本發(fā)明的試劑盒還可含有佐劑，其實例已如上所述。因此，本發(fā)明的受體抗體可在體內(nèi)和體外用于研究、診斷、預(yù)防或治療方法中，其是本領(lǐng)域公知的。當(dāng)然，可以理解和預(yù)期的是本領(lǐng)域技術(shù)人員可對本文公開的發(fā)明原理進行改變，這種修改應(yīng)被包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實施例下文中將更具體地描述本發(fā)明。然而，應(yīng)該理解的是這些實施例的目的僅在于示例性而不應(yīng)解釋成限制本發(fā)明的范圍。實施例1分泌KDR-Fc的細(xì)胞系的構(gòu)建從人胎盤cDNA文庫(Clonetech，USA)中擴增與KDR基因(GenBank的登錄號AF063658)的胞外域(ECDs)1_3對應(yīng)的基因。采用分別具有BamHI和NheI消化位點的引物KDRIF(SEQIDNO21)和KDR3R(SEQIDNO22)進行擴增。SEQIDNO215'-CGCGGATCCATGGAGAGCAA-3‘SEQIDNO225'-CCGCTAGCTTTTTCATGGACCCTGACA-3‘為制備KDR(ECD1-3)-Fc嵌合蛋白，以BamHI和NheI消化由將BACE-Fc蛋白基因插入pcDNA3載體(Invitrogen，USA)中而構(gòu)成的pcDNA3-BACE_Fc載體(韓國專利公開文本10-2005-0032177)，然后連接到以相同限制性內(nèi)切酶消化的PCR片段上。采用引物ThFc-F(SEQIDNO23)和MycFc-R(SEQIDNO:24)通過PCR擴增Fc結(jié)構(gòu)域以使其具有凝血酶消化位點和myc標(biāo)簽，采用NheI和XhoI位點將擴增片段與載體連接，從而構(gòu)建pcDNA3-KDRD123tFcm。SEQIDNO235'-CCGCTAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCGACAAAACTCAC-3‘SEQIDNO245'-GGCTCGAGTCACAGGTCTTCCTCAGAGATCAGCTTCTGCTCTTACCCGGAGAC-3‘pcDNA3-KDRD123tFcm由編碼含有人KDR的分泌信號序列和胞外域的氨基酸殘基1-327的堿基序列、編碼凝血酶識別位點(SSGLVPRGS)的堿基序列、編碼對應(yīng)人免疫球蛋白G(hlgG)的Fc結(jié)構(gòu)域的227個氨基酸的堿基序列和編碼myc標(biāo)簽的堿基序列(EQKLISEEDL)構(gòu)成(圖1)。為了抗體的表位定位，制備了KDR(ECDl-2)_Fc(氨基酸殘基1-222)和KDR(ECD2-3)-Fc(氨基酸殘基1-327(Δ24-116))。為了克隆KDR(ECD1-2)，采用弓|物KDRIF(5，-CGCGGATCCATGGAGAGCAA,SEQIDNO25)和引物KDR12R(5，_CTAGCTAGCCCTATACCCTACAACGACA_3，，SEQIDNO26)通過PCR對制得的序列進行擴增，然后將PCR擴增片段插入到以BamHI和NheI消化的pcDNA3_KDRD123tFcm中，從而制得pcDNA3_KDRD12tFcm。為克隆KDR(ECD2-3)，通過重疊PCR來擴增引物KDRIF和引物KDR23SR(SEQIDNO26)的PCR片段以及引物KDR23SF(SEQIDNO27)和引物KDR23R(SEQIDNO28)的PCR片段。采用BamHI和NheI位點將制得的PCR片段插入pcDNA3_KDRD123tFcm中，從而制得pcDNA3-KDRD23tFcm(圖2)。SEQIDNO265'-ACATAACCCACAGAGGCGGCCCGGGTCTCCA-3‘SEQIDNO:27:5'-GACCCGGGCCGCCTCTGTGGGTTATGTTCAAGATTACAGA-3'SEQIDNO285'-CTAGCTAGCTTTTTCATGGACCCTGACA-3‘為制備KDR(ECD)-Fc嵌合蛋白，將以上制得的pcDNA3_KDRD123tFcm載體轉(zhuǎn)染到CH0-DG44細(xì)胞中(Aprogen，Korea)，在含有10%dFBS(Gibco,USA)和500μg/mlG418(Geneticin；Sigma,USA)的α-MEM(GibCo，USA)中培養(yǎng)該細(xì)胞。為優(yōu)化KDR(ECD)-Fc嵌合蛋白的表達(dá)，在存在MTX(甲氨蝶呤，Sigma)的CH0-SFM2培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)該細(xì)胞，同時增加MTX的濃度。結(jié)果，確定蛋白在700nMMTX中有最佳表達(dá)。采用蛋白A親和層析(蛋白A-瓊脂糖，GEHealthcare)和體積排阻色譜(HiloadSuperdex200，GEHealthcare)對制備的蛋白進行純化并將其儲存在含有150mMNaCl的IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)。圖3顯示了按照上述方法純化的KDR(E⑶1_3)-Fc的SDS-PAGE結(jié)果。^MM2MirMm^(魏)單鏈抗體(ScFv)卩策If體展示采用TRI試劑(Sigma)從五個健康骨髓供者身上獲取總RNA，基于總RNA，采用mRNA純化試劑盒(OligotexmRNA制備試劑盒，Qiagen，USA)純化mRNA。采用RT-PCR體系(ThermoScriptRT-PCR體系，Gibco_BRL，USA)處理mRNA以獲取cDNA。為獲得VH基因，采用表1所示的引物擴增V基因片段和DJ片段，采用在5’端和3’端具有SfiI限制性酶切位點的引物(SEQIDNOS29-61)通過二次PCR對每個擴增DNA片段進行擴增。表1用于擴增VH和DJ基因片段的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>其中，R表示A或G;S表示C或G為獲得VL基因，采用每個用于\基因擴增的引物(表2)和用于K基因擴增的引物(表3)進行一次PCR，并采用在5’端和3’端具有BstXI消化位點的引物(入:SEQIDNOS.76-81；和k:SEQIDNOS.106-108)將每個擴增片段進行二次PCR。表2擴增入基因片段的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>其中，K表示G或T;R表示A或G;Y表示T或C;W表示A或T表3擴增k基因片段的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>其中，H表示A、C或T表示A或T為將VH基因片段和VL基因片段導(dǎo)入噬菌粒載體中，采用pAKlOO載體(Krebber，A.etal.，J.Immunol.Method.，201:35，1997)。為導(dǎo)入VL基因片段，采用快變位點特異性突變試劑盒(Stratagene，USA)突變pAKlOO載體的lac阻遏基因(lacl)中存在的三個BstXI結(jié)構(gòu)域(236、365和488)。采用修飾的pAKlOO載體，為制備用于構(gòu)建ScFv文庫的骨干載體，將采用H05引物(SEQIDN029)和H230引物(SEQIDNO49)擴增的重鏈V基因和采用CDR3-3引物(SEQIDNO54)和JH-U1引物(SEQIDNO57)擴增的DJ基因片段，以H48SfiI(SEQIDNO58)/H47Sfil(SEQIDNO61)進行二次PCR，并以Sfil消化制得的重鏈可變區(qū)且將其連接到以相同酶消化的修飾PAK100載體中。為導(dǎo)入輕鏈和連接體，采用引物(正向:SEQIDNO109；和反向:SEQIDNO110)擴增重鏈區(qū)，采用每個引物(正向SEQIDNO111；和反向:SEQIDNO112)擴增人4-1BB抗體(LB506)(韓國專利公開文本2000-0034847)。采用Xbal/EcoRI將擴增片段插入具有導(dǎo)入的重鏈可變域的修飾pAKlOO載體，從而制得抗體文庫骨干載體。SEQIDNO1095'-CGAATTTCTAGATAACGA-3‘SEQIDNO1105‘-CCTCCGCCACTACCTCCTCCTCCGAGGCCCCCGAGGCCTGA-3‘SEQIDNO1115'-GGTAGTGGCGGAGGAGGCTCCGGTGGATCCAGCGGTGTGGGTTCCGATATTGTG-3‘SEQIDNO1125’-CTCGAATTCCCACGAGGCTGGCTCCTCCACGTTTGATTTC-3’為導(dǎo)入輕鏈可變區(qū)，以BstXI消化每個擴增的輕鏈(k，入)可變區(qū)并將其插入抗體文庫骨干載體中。以Sfil限制性內(nèi)切酶消化制得的質(zhì)粒并將其連接到之前以Sfil消化的重鏈可變區(qū)擴增PCR片段上。連接質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到ElectroTen-Blue感受態(tài)細(xì)胞中(Stratagene,USA)。結(jié)果，從集落中收集了具有約1011多樣性的ScFv噬菌體文庫。實施例3牛物淘篩將實施例2中構(gòu)建的文庫原液培養(yǎng)至對數(shù)生長期并以M13K07輔助噬菌體(GEhealthcare,USA)進行復(fù)壯。在2xYT培養(yǎng)基中(2xYT/C/K；含有34ug/ml氯霉素和70ug/ml卡那霉素并添加了ImMIPTG)30°C下將制得的文庫擴增過夜。以20%PEG6000/2.5MNaCl沉淀噬菌體原液并重懸在PBS中。將重懸的噬菌體原液在含有500yg/ml人Fc蛋白的2%脫脂乳/PBS溶液中37°C溫育1小時以去除表現(xiàn)出抗人Fc的噬菌體。作為抗原的KDR(人VEGFR-2)是含有KDR胞外域的IgG_樣結(jié)構(gòu)域1、2和3的KDR(ECDl-3)-Fc。培養(yǎng)實施例1制備的KDR(ECD1_3)-Fc穩(wěn)定細(xì)胞系，并從培養(yǎng)細(xì)胞系中純化KDR(ECDl-3)-Fc。首先以2%脫脂乳/PBS將涂有KDR(ECDl-3)_Fc(10iig/ml)的Maxisorp星號離心管(NuncDenmark)在室溫下封閉2小時，然后以5.4X1012pfu的噬菌體原液在室溫下孵育1小時。以PBST(含0.1%Tween20的PBS)將離心管洗滌10次，再以PBS洗滌10次。在室溫下以1ml的100mM新鮮三乙胺溶液將結(jié)合噬菌體洗脫10分鐘。將洗脫好的噬菌體與10ml對數(shù)中期XL1-藍(lán)細(xì)胞保留在一起，然后振蕩培養(yǎng)30分鐘。然后，將感染的XL1-藍(lán)細(xì)胞在含有葡萄糖的2xYT/C平板上30°C培養(yǎng)過夜。在一次淘篩之后，通過將KDR(ECDl-3)-Fc涂在96孔板(Nunc，USA)以替代Maxisorp離心管進行二次和三次淘篩程序。實施三次淘篩之后，通過VEGF競爭試驗分析獲得的噬菌體的KDR中和能力。對于VEGF競爭試驗，將以200ng的VEGF165(R&Dsystem)涂覆過夜的微板與2%脫脂乳/PBS在37°C反應(yīng)2小時。以PBS洗滌微板，然后將由10ngKDR(ECD1_3)-Fc與不同量噬菌體在室溫下反應(yīng)1小時獲得的混合物置于板的每個孔中并使其在室溫下反應(yīng)2小時。以PBS清洗反應(yīng)溶液，使其與兔抗KDR抗體(Reliatech，Germany)在37°C反應(yīng)1小時，與HRP(辣根過氧化物酶)偶聯(lián)的羊抗兔抗體(Abcam，UK)在37°C反應(yīng)1小時。反應(yīng)完成之后，以TMB溶液(Sigma)顯色每個孔，然后測量在450nm處的吸光值(圖4)。結(jié)果，觀察到6A6、6H1、6G1和6C1都能抑制VEGF和KDR的結(jié)合，其中，6A6和6H1顯示出最高的中和VEGF能力。此外，6A6和6H1表現(xiàn)出具有類似于實施例4獲得的改造1C11(下文稱為1C11)噬菌體的結(jié)合親和力。6A6(TTAC-0001)ScFv的DNA序列、氨基酸序列和⑶R序列如圖5所示。此外，6A6(TTAC_0001)ScFv的堿基序列和氨基酸序列表示為重鏈CDR1(SEQIDN0:113*SEQIDNO:114)、重鏈CDR2(SEQIDNO:115和SEQIDNO:116)、重鏈CDR3(SEQIDNO:117禾口SEQIDNO:118)、輕鏈CDR1(SEQIDNO:119禾口SEQIDNO:120)、輕鏈CDR2(SEQIDN0:121禾口SEQIDNO:122)、輕鏈CDR3(SEQIDN0:123禾口SEQIDN0:124)，重鏈可變區(qū)(SEQIDNO125和SEQIDNO20)、輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO126和SEQIDNOl)、IgG重鏈區(qū)(SEQIDNO:127禾口SEQIDNO:128)、和IgG輕鏈區(qū)(SEQIDNO:129禾口SEQIDNO130)。實施例4改造IMC-1121(rIMC~1121)和IMC-1C11(rlMC-lCll)噬菌體載體的構(gòu)建為獲得可用作陽性對照組的IMC-1C11ScFv(PCT/US2001/10504)和IMC-1121ScFv(PCT/US2002/006762)噬菌體顆粒(Imclone)，將每個抗體的ScFv區(qū)克隆到pAK載體中。對于IMC-1C11，采用從小鼠naAve抗體文庫(LGLifeSciences)中獲取的pTA-d9_07克隆(LGLifeSciences)作為模板克隆輕鏈可變基因。采用表4所示的LR和LF引物擴增克隆，以BstXI消化擴增的輕鏈可變基因并將其連接到以BstXI預(yù)處理的文庫骨干載體上。采用表4所示的引物以pTA-A5N2-10克隆(LGLifeSciences)作為模板通過PCR擴增重鏈可變基因。采用每個引物對HF1-RI(A)、HF2-HR2(B)、HF3-HR3(C)和HF4-HR4(D)進行每個PCR反應(yīng)之后，采用A_B(HF1-HR2引物組)和C_D(HF3-HR4引物對)通過重疊PCR擴增每個擴增片段，然后采用A-B-C-D(HF1-HR4引物對)通過重疊PCR進行擴增。然后以Sfil處理每個擴增片段并將其連接到以Sfil處理的含有1C11輕鏈基因的文庫骨干載體上。表4顯示了噬菌體載體(pAK-rlcll)的PelB信號序列和琥珀(TGA)密碼子的DNA序列。表4:LR和LF引物<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>為獲得IMC-1121，以6G1作為模板克隆輕鏈可變區(qū)。采用引物對LF-KRl(A)、LF1-LR2(B)、LF2-LR3(C)和LF3-LR4(D)通過PCR擴增6G1模板，采用A-B(LF-LR2引物組)和C-D(LF2-LR引物對)通過重疊PCR進行擴增，然后采用A_B_C_D(LF-LR引物對)通過重疊PCR進行擴增。以BstXI處理獲得的PCR片段并將其插入文庫骨干載體中(改造IMC-1121；下文稱為IMC-1121)。此處所用引物如表5所示。對于重鏈可變區(qū)，將從人naAvescFv文庫(實施例2)中獲得的克隆序列中具有最接近IMC-1121的序列的YGKL-136克隆作為模板。采用每個引物對HF-HRl(A)、HF1-HR2(B)和HF2-HR(C)通過PCR擴增YGKL-136克隆，然后進行A+B和C重疊PCR(HF_HR引物對)。以SfiI處理制備的PCR片段并將其連接到含輕鏈的文庫骨干載體中。表5用于克隆輕鏈可變區(qū)的LF和HF引物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula>GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCYGKL-136CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATT144重鏈(模板)CACCTTCAGTAGCTATAGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTAGTAGTAGTTACATACACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTCACAGATGCTTTTGATATCTGGGGCCCCGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTATTTAGGCTGGTATCAGCAGAAACCA6G1輕鏈GGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAATTTGCAAACAGGGGTCCCGCCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATC145(模板)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>實施例5可溶件ScFv的制備和純化為制備可溶性6A6ScFv,以EcoRI和XbaI消化具有pelB序列和ScFv序列的PAK-6A6以獲得具有pelB序列和ScFv序列的片段。采用相同的限制性內(nèi)切酶將片段插入pET21b載體中(NoVagen，USA)。為了給插入具有pelB序列和ScFv序列的片段的載體添加myc標(biāo)簽，采用引物(mycFor，SEQIDNO160；和mycRev，SEQIDNO161)通過PCR擴增作為模板的插入了PelB序列和ScFv序列的pET21b載體，并采用EcoRJ和XboI將該PCR片段連接到具有pelB序列和ScFv序列的載體中，從而構(gòu)建pET21b-KDR6A6。SEQIDNO1605'-GAGCCAGCCTCGTGGAATTCGAACAAAAA-3‘SEQIDNO:1615'-TGCTCGAGATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTGAATTCCACGAGGCT-3'對于動力學(xué)測量，按以下方式在myc標(biāo)簽下游的XboI位點插入V5標(biāo)簽序列(GKPIPNPLLGLDST)。采用引物(V5-正向，SEQIDNO:162；和V5-反向，SEQIDNO163)通過PCR擴增制得的序列，所述引物擴增pET21b-KDR6A6的EcoRI和含V5標(biāo)簽序列的XboI消化位點，以EcoRI和XboI消化擴增的片段并將其連接在以相同限制性內(nèi)切酶消化的pET21b-KDR6A6,從而構(gòu)建pETV-KDR6A6。將構(gòu)建的pETV-KDR6A6轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中。SEQIDNO1625'-CCAGCCTCGTGGAATTCGAAC-3‘SEQIDNO:163:5'-CCGCTCGAGGGTGGAGTCCAGACCTAATAGAGGGTTTGGGATCGGCTTTCCATTCAGATCCTCTTCTGA-3'培養(yǎng)被pETV-KDR6A6轉(zhuǎn)化的E.coliBL21(DE3)細(xì)胞以表達(dá)可溶性ScFv蛋白并離心，采用含有20%蔗糖和200iig/ml溶菌酶和蛋白酶抑制劑混合物(Roche，Swiss)的50mMTris(pH8.0)溶液從細(xì)胞中收集胞質(zhì)部分。采用Ni_NTI親和層析(Hispr印，GEHealthcare,USA)和離子交換色譜(Q-瓊脂糖，SP-瓊脂糖，GEHealthcare,USA)純化獲得的部分，從而獲得ScFv蛋白。對于6A6，采用含有20mM咪唑、0.4MNaCl和lxPBS的溶液平衡Hispr印柱，在柱內(nèi)裝填胞質(zhì)部分并以300mM含咪唑的溶液(300mM咪唑，0.4MNaCl/lxPBS)洗脫。將洗脫的蛋白在50mM咪唑(pH6.7)溶液進行透析，然后以陽離子交換色譜洗脫同時將NaCl的濃度增至0.5M。濃縮洗脫的蛋白(Centripr印YM10，Milipore，USA)，然后透析并儲存在PBS溶液中。圖6顯示了純化的6A6ScFv的SDS-PAGE結(jié)果。實施例6以VEGF的VEGF競爭試騎為了檢測分離的ScFv能否抑制KDR和VEGF的結(jié)合，實施了競爭試驗。為此，將20ng的VEGF165涂在96孔微孔板室溫過夜，然后使其與2%脫脂乳/PBS在37V反應(yīng)2小時。反應(yīng)完成之后，以PBS洗滌板，然后將由lOOng的Fc消化KDR(ECDl-3)與不同量ScFv在室溫下反應(yīng)1小時獲得的混合物置于微孔板中并在室溫下反應(yīng)2小時。反應(yīng)完成之后，以PBS洗滌板，然后往其中添加抗KDR小鼠抗體(5ug/ml,Reliatech，Germany)并在37°C反應(yīng)1小時。然后，往其中添加15000稀釋的HRP偶聯(lián)羊抗小鼠抗體(Abcam，UK)并反應(yīng)1小時，然后添加TMB溶液進行反應(yīng)。接著，測量每個板孔中細(xì)胞在450nm和650nm處的吸光值。圖7顯示了以實施例5中純化的抗KDR-ScFv的VEGF競爭試驗結(jié)果。如圖7所示，可以看出僅6A6-ScFv表現(xiàn)出中和KDR的有效能力。實施例7抗KDRScFv抗體的表位定位為了檢測哪些抗KDRScFv抗體結(jié)合到KJDR胞外域1_3中的哪個結(jié)構(gòu)域中，將按照實施例1方法制備的3ug/ml每種KDR(ECDl-2)、KDR(ECD2_3)和KDR(ECD1-3)-Fc涂在96孔板上并在37°C反應(yīng)2小時。反應(yīng)完成之后，以PBS洗滌板，然后將未涂KDR蛋白的板部分以2%脫脂乳/PBS封閉。接著，再以PBS洗滌板，然后往其中添加330nM抗KDRScFv抗體并在37°C下反應(yīng)1小時30分鐘。反應(yīng)完成之后，再以PBS洗滌板，然后往其中添加1500稀釋的HRP偶聯(lián)兔抗6x組氨酸抗體(Abcam，UK)并在37°C下反應(yīng)1小時。然后，以TMB溶液將每個孔中的細(xì)胞顯色并測定450nm處的吸光值。結(jié)果，可以觀察到6A6以與IMC-1121相同的方式結(jié)合到KDR的胞外域3上(圖8)。但是，6G1和6C1更牢固地結(jié)合到結(jié)構(gòu)域1上，盡管吸光值很低。實施例8:IrG的表達(dá)和純化為表達(dá)完整形式的IgG，制備了各含有完整恒定區(qū)的重鏈和輕鏈表達(dá)載體。對于重鏈表達(dá)載體，以Sfil處理具有人4-lbb的重鏈骨干的plgGHD載體(Aprogen，Korea)，然后將其與以Sfil處理pAK-ScFv重鏈可變區(qū)所獲得的片段連接，從而構(gòu)建表達(dá)載體pIgGHD-6A6Hvy，其含有完整的恒定區(qū)和重鏈區(qū)(圖9)。對于輕鏈表達(dá)載體，以BstXI處理具有人4-lbb的輕鏈骨干的plgGLD載體(Aprogen，Korea)，然后將其與以BstXI處理pAK-ScFv輕鏈可變區(qū)所獲得的片段連接，從而構(gòu)建表達(dá)載體pIgGLD-6A6Lgt，其含有完整的恒定區(qū)和輕鏈區(qū)(圖10)。對于IMC-1C11和1121，按如上所述的相同方式構(gòu)建IgG表達(dá)載體。對于IgG的表達(dá)，將相同量的重鏈表達(dá)載體(6A6克隆的pIgGHD-6A6Hvy)和輕鏈表達(dá)載體(6A6克隆的pIgGLD-6A6Lgt)共轉(zhuǎn)染至CHODG44細(xì)胞(Aprogen，Korea)。在含有10%dFBS和500iig/mlG418的a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，然后選擇具有最高蛋白表達(dá)水平的克隆，同時往其中添加10nM-700nM濃度范圍的MTX。對于抗體的表達(dá)，在含有700nMMTX的CH0-SF2培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)細(xì)胞，并收集培養(yǎng)物。按照供應(yīng)商的方案采用蛋白A柱(GEHealthcare,USA)通過親和層析從組合上清液中純化6A6-IgG。將上清液倒入以含有20mM磷酸鈉(pH7.0)和100mMNaCl的溶液平衡的蛋白A柱中并以含有20mM磷酸(pH7.0)UmMEDTA和500mMNaCl的溶液清洗。然后，以含有l(wèi)OOmMNaCl的0.1M甘氨酸-HC1(pH3.3)溶液洗脫蛋白。以1MTris中和洗脫的蛋白。按11比例將洗脫蛋白與5mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)混合，然后倒入以含有50mMNaCl的5mM磷酸鈉(pH6.0)平衡的預(yù)裝SP-瓊脂糖柱(GEHealthcare)中。以含有50mMNaCl的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗脫結(jié)合到柱上的蛋白并將其倒入以洗脫緩沖液平衡的預(yù)裝Q-瓊脂糖柱(GEHealthcare)中，收集未結(jié)合的蛋白。以30KdVivaspin20(Sartorius)濃縮收集的蛋白并以PBS透析。圖11顯示了按上述方法純化的6A6IgG蛋白的SDS-PAGE結(jié)果。實施例9以不同VEGFs的抗KDRIgG競爭試騎按采用VEGF165的實施例6進行的KDRScFv的VEGF競爭試驗相同的方式進行以VEGF的抗KDRIgG競爭試驗。結(jié)果，在抗IgGs之中，6A6IgG表現(xiàn)出最高的中和KDR的能力，類似于以ScFv進行的競爭試驗結(jié)果，這表明了KDR中和能力類似于在氨基酸序列基礎(chǔ)上改造的IMC-1121抗KDRIgG(圖12)。此外，為了檢測6A6IgG與同型和除VEGF165之外的VEGF族的結(jié)合和競爭，將各200ng的VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E涂在96孔板，然后按與實施例6相同的方法進行競爭試驗。結(jié)果，6A6IgG通過與屬于VEGF-A的VEGF121、VEGF165和VEGF-E的結(jié)合顯示了VEGF中和能力，且它不與VEGF-C和VEGF-D結(jié)合(圖13)。實施例10抗KDRScFv和I甙結(jié)合親和力的分析以BIAcore(GEHealthcare)測量了抗體與KDR(VEGFR-2)的結(jié)合親和力。對于ScFv，按照供應(yīng)商的手冊將KDR(ECDl-3)-Fc固定到CM5芯片(GEHealthcare，Sweden)上，對于V5-標(biāo)簽ScFv，將V5抗體(Abchem，UK)固定到芯片上。將V5-標(biāo)簽ScFv結(jié)合到固定有V5抗體的CM5芯片上，然后使無Fc的KDR(E⑶1-3)作用于芯片表面，從而獲得感應(yīng)圖。對于IgG，如在沒有V5的ScFv情況下，將KDR(ECDl-3)-Fc固定到CM5芯片上，然后以不同量的抗體作用于芯片表面，從而獲得感應(yīng)圖。根據(jù)每個濃度獲得的感應(yīng)圖，測定動力學(xué)常數(shù)kon和k。ff，從動力學(xué)常數(shù)k。ff/k。n的比值計算Kd(表6)。結(jié)果，證實在不同ScFvs中，對KDR具有高親和結(jié)合力的ScFv是6A6。此外，當(dāng)6A6被轉(zhuǎn)化成IgG的形式時，其Kd值大約比IMC-1121的低2倍。這表明了相對于IMC-1121，6A6IgG更牢固地結(jié)合到KDR上。表6抗KDRScFv的Kd(M)值，IgG<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>*N/A(不適用)實施例11利用FACS分析在HUVEC細(xì)胞中分析抗KDR_IgG的KDR中和能力將原始培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)以誘導(dǎo)KDR的過度表達(dá)，然后收集細(xì)胞，以PBS洗滌三次。將洗滌的細(xì)胞與6A6或IMC-lCllIgG(10iig/ml)在4°C反應(yīng)1小時，然后與FITC標(biāo)記的兔抗人IgG抗體(Abchem，UK)反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)完成之后，洗滌細(xì)胞并以流式細(xì)胞計數(shù)儀(FACS；型號EPICS9，CoulterCorp.，USA)進行分析。結(jié)果，如圖14所示，IMC-1C11和6A6在相同水平識別HUVEC細(xì)胞的KDR。此外，為了檢測對VEGF的競爭抑制能力，將HUVEC細(xì)胞在無血清狀態(tài)下過夜培養(yǎng)以誘導(dǎo)KDR的表達(dá)，然后收集細(xì)胞并以PBS洗滌三次。將清洗的細(xì)胞與20ng/ml的VEGF在室溫下反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)完成之后，將細(xì)胞與6A6-IgG和IMC-1C11IgG在4°C反應(yīng)1小時，然后與FITC標(biāo)記的兔抗人IgG抗體在4V反應(yīng)30分鐘。結(jié)果如圖15所示，觀察到兩種抗體都表現(xiàn)出與VEGF165結(jié)合的信號，這表明6A6-IgG競爭性結(jié)合VEGF。此外，在VEGF競爭試驗中，6A6-IgG和IMC-1C11IgG表現(xiàn)出相同水平的KDR中和能力，但是在實際的活體細(xì)胞中6A6-IgG的KDR中和能力大約是IMC-1C11IgG的2倍。實施例12在K562細(xì)胞中抗KDR_IgG的KDR中和能力的分析為了在除了HUVEC細(xì)胞之外的KDR表達(dá)細(xì)胞系中檢測抗體的KDR結(jié)合親和力，在白血病細(xì)胞系K562(ATCCCCL-243)中分析了KDR的表達(dá)。圖16顯示了在K562(ATCCCCL-243)細(xì)胞中KDR表達(dá)的蛋白印跡分析結(jié)果。如圖16所示，不管是否存在血清，K562和HUVEC細(xì)胞都表達(dá)KDR。因此，按與實施例11對HUVEC細(xì)胞相同方式處理K562細(xì)胞(ATCCCCL-243)并通過FACS進行分析以檢測KDR-IgG是否能與K562細(xì)胞結(jié)合。結(jié)果，如圖17所示，不同于HUVEC細(xì)胞，6A6_IgG僅在顯著水平能與K562細(xì)胞結(jié)合。通過VEGF競爭的FACS試驗結(jié)果如圖18所示。如圖18所示，不同于HUVEC細(xì)胞，K562細(xì)胞在陽性細(xì)胞比率上未表現(xiàn)出大變化。盡管不清楚原因，但是考慮是因為6A6抗體牢固地結(jié)合在K562細(xì)胞表面表達(dá)的KDR上或利用VEGF/KDR(VEGFR-2)的自分泌環(huán)機制來調(diào)控細(xì)胞的生長，因而如果外部處理VEGF，可誘導(dǎo)K562細(xì)胞中的KDR表達(dá)，使得相對于外部處理VEGF之前在細(xì)胞表面表達(dá)增加量的KDR蛋白，且6A6-IgG信號增強。此外，如圖19所示，可看出6A6_IgG能結(jié)合到Gleevec-抗性的K562細(xì)胞(TheCatholicUniversityofKorea)的KDR上。實施例13:6A6抗體抑制HUVEC細(xì)胞增殖的分析采用WST-1試劑(Roche，Swiss)分析抗KDR-IgG對HUVEC細(xì)胞增殖的抑制。將HUVEC細(xì)胞按2xl04細(xì)胞/孔的濃度分散在涂有明膠的24孔培養(yǎng)板的孔中并培養(yǎng)18小時。然后，將細(xì)胞在無血清M199培養(yǎng)基(Sigma-aldrich，USA)中進一步培養(yǎng)4小時，然后往其中添加20ng/mlVEGF和不同濃度6A6。然后，按照供應(yīng)商手冊將WST-1試劑加入其中，1小時和4小時之后，測量細(xì)胞在450nm和690nm處的吸光值(圖20)。結(jié)果，當(dāng)以VEGF處理HUVEC細(xì)胞時，其增殖增加了三倍，而當(dāng)將6A6抗體添加到HUVEC細(xì)胞中時，細(xì)胞的增殖以濃度依賴方式被降低。實施例14:6A6抗體對KDR抑制和ERK磷酸化的影響的分析將充分生長的HUVEC細(xì)胞在含1%FBS的M199培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時，然后以不同濃度的VEGF和6A6、IMC-1121和6C1抗體處理10分鐘。然后，以1ml裂解緩沖液(20mMTris-HCl,pH8.0,2mMEDTA,137mMNaCl,ImMNa3V04,ImMPMSF，10%甘油，1%TritonX-100)裂解細(xì)胞并離心，且以1Pg/ml抗KDR/Flk-1抗體(SantacruzBiotechnology,USA)4°C處理上清液3小時。處理的上清液與蛋白A瓊脂糖微粒(Sigma-aldrich，USA)溫育1小時，將免疫沉淀的蛋白在SDS-PAGE上進行電泳，然后以蛋白印跡進行分析(圖21的A)。結(jié)果，觀察到當(dāng)以VEGF處理細(xì)胞時，KDR的磷酸化如預(yù)期地增加，但以6A6或IMC-1121處理細(xì)胞時，由VEGF引起的KDR的磷酸化被抑制。此外，6C1抗體對VEGF的中和沒有影響。根據(jù)如上所述的方法，進行了試驗以檢測已知接收KDR信號的激酶ERK的磷酸化是否被抑制。結(jié)果，確認(rèn)6A6和IMC-1121會抑制ERK磷酸化，但如預(yù)期地6C1基本不抑制ERK的磷酸化(圖21的B)。實施例15抗KDR-6A6IrG對由VEGF誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞趨化性的抑制效應(yīng)的分析為了檢測6A6-IgG對由VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞遷移的抑制效應(yīng)，采用了具有6.5mm直徑的聚碳酸酯過濾器(8yM孔徑)的培養(yǎng)小室(transwell)(Corningcostar,USA)。以10yg的明膠涂覆過濾器的下層表面，并將新鮮的M199培養(yǎng)基(含1%FBS)和VEGF置于過濾器的下層孔中。按lxl06/ml的濃度以M199培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)稀釋HUVEC細(xì)胞，并往其中添加不同濃度的抗KDR抗體且在室溫下反應(yīng)30分鐘。將100yl的反應(yīng)液置于上層孔中并在37°C反應(yīng)4小時。然后，將細(xì)胞以蘇木精和伊紅染色。以棉球去除未遷移的細(xì)胞，而以顯微鏡觀察遷移至下層孔的細(xì)胞以測量遷移細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果，觀察到由VEGF誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞的遷移被6A6抑制。實施例16抗KDR-6A6IrG對由VEGF誘導(dǎo)的微管形成的抑制效應(yīng)的分析為了檢測6A6抗體是否抑制由VEGF誘導(dǎo)的HUVEC微管形成，將250u1生長因子減少的基質(zhì)膠(CollaborativeBiomedicalProducts,USA)置于16mm直徑的組織培養(yǎng)板的孔中并在37°C聚合30分鐘。將HUVEC細(xì)胞懸浮在M199培養(yǎng)液中(含1%FBS)，并混合不同量的抗體使其與細(xì)胞反應(yīng)。30分鐘之后，將細(xì)胞以2xl05細(xì)胞/孔的濃度涂在基質(zhì)膠上，并往其中加入lOng/ml的VEGF，將細(xì)胞培養(yǎng)20小時。以顯微鏡觀察培養(yǎng)的細(xì)胞，以Image-Proplus(Mediacybernetics,USA)進行顯象。結(jié)果，觀察到6A6IgG抑制了由VEGF誘導(dǎo)的HUVEC微管形成(圖23)。實施例17由6A6與細(xì)胞表面KDR的結(jié)合抑制VEGF-KDR的內(nèi)化將2xl04細(xì)胞/孔濃度的HUVEC細(xì)胞置于涂有明膠的蓋玻片上，24小時之后，將細(xì)胞以M199培養(yǎng)基洗滌兩次并在M199培養(yǎng)基(含F(xiàn)BS)中培育6小時。將HUVEC細(xì)胞與不同濃度的抗體反應(yīng)30分鐘并與lOng/mlVEGF反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)完成之后，以甲醇或20%甲醛將細(xì)胞固定和滲透10分鐘并以PBS洗滌。然后以0.TritonX-100和2%BSA/PBS將細(xì)胞封閉30分鐘，并將細(xì)胞與小鼠KDR抗體反應(yīng)1小時，然后與FITC標(biāo)記的抗小鼠抗體在室溫下反應(yīng)45分鐘。以SloFade(MolecularProbe)包埋蓋玻片并以共焦顯微鏡(Zeiss，Germany)在488nm(激發(fā)波長)下進行觀察。結(jié)果，圖24顯示，觀察到6A6抗體抑制了KDR向細(xì)胞的滲透，而6G1基本不抑制KDR向細(xì)胞的滲透。實施例18杭KDR-IgG對血管牛成的抑制效應(yīng)的離體分析為了檢測6A6-IgG是否抑制由VEGF誘導(dǎo)的主動脈環(huán)血管萌發(fā)，進行了主動脈環(huán)試驗。首先，從6周齡的大鼠(SpragueDawley)中分離動脈，然后切成約0.5mm的大小。將切好的動脈置于涂有120u1基質(zhì)膠的48孔板中并以50u1基質(zhì)膠覆蓋。將VEGF(10ng/ml)和6A6-IgG、6Cl-IgG和1121-IgG與人內(nèi)皮無血清培養(yǎng)基(Invitrogen)各混合至終體積200iil，將混合物置于板孔中。6天之后，固定細(xì)胞并以Diff_Quick(BaxterDiagnostics)染色。按0(最低陽性)至5(最高陽性)的分?jǐn)?shù)對數(shù)據(jù)進行評級，且進行了6次獨立試驗。圖25的A顯示了血管萌發(fā)的圖像，而圖25的B顯示了血管萌發(fā)分?jǐn)?shù)的統(tǒng)計結(jié)果。6A6抗體抑制了由VEGF誘導(dǎo)的血管萌發(fā)，但6C1抗體未顯示出抑制能力。除了6A6抑制由VEGF誘導(dǎo)的血管生成的簡單事實之外，上述的離體大鼠主動脈環(huán)試驗結(jié)果具有非常重要的意義。即，結(jié)果揭示了6A6可與Flk-1結(jié)合以中和大鼠中表達(dá)的人KDR同系物Flk-1，盡管其是為中和人KDR的目的而制備。換言之，可以看出6A6抗體在人和大鼠之間具有交叉反應(yīng)性。實施例19:6A6對抑制體內(nèi)由VEGF誘導(dǎo)的血管生成的影響(體內(nèi)小鼠基質(zhì)膠塞入試驗)大鼠主動脈環(huán)試驗之后，進行了小鼠基質(zhì)膠塞入試驗以檢測人KDR中和抗體6A6能否抑制小鼠體內(nèi)由VEGF誘導(dǎo)的血管生成。為此，將0.6ml含有200iig抗體、lOOngVEGF和10單位肝磷脂的基質(zhì)膠皮下注射到6-8周齡的小鼠中。7天之后，通過手術(shù)將基質(zhì)膠塞入物取出，并對其進行照相(圖26的A)。然后，在OCT(最佳切割溫度)化合物的存在下在液氮中將塞入物快速冷凍并切成8-12um的厚度。以4%中性緩沖多聚甲醛將切好的塞入物固定，以抗CD31抗體測量微血管的密度(圖26的B)。觀察到6A6抗體可在小鼠體內(nèi)抑制由VEGF誘導(dǎo)的血管形成。類同于大鼠離體實驗，再次證實6A6抗體可中和小鼠KDR同系物Flk-1并在人和小鼠之間具有交叉反應(yīng)性。在治療抗體中，未公開過在人和小鼠之間具有交叉反應(yīng)性的KDR抗體。若采用種交叉反應(yīng)性的6A6抗體，可采用小鼠或大鼠確認(rèn)抗體的體內(nèi)作用。20=6A6抗體在結(jié)腸癌中言云力4勿It型中的抗痛效應(yīng)采用已知相對于N0D/SCID小鼠具有更容易接受人癌細(xì)胞的優(yōu)勢的刪除了T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的N0D/SCIDIL-2R裸鼠(雌性，11周齡，重25g，TheJacksonLaboratories,USA)分析了6A6抗體在結(jié)腸癌異種移植動物模型中的抗癌效應(yīng)。對于人癌細(xì)胞，采用了稱為HCT116(ATCC，USA)的人結(jié)腸癌細(xì)胞，在第0天按2xl05細(xì)胞(無血清DMEM)/10y1的濃度將細(xì)胞皮下注射到小鼠左側(cè)來實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的注射。從第1天(在注射腫瘤細(xì)胞的第0天起24小時)，每周三次將6A6抗體靜脈注射到小鼠中。將小鼠分成三組，每組由5個動物組成。組1是注射PBS組(對照組)，組2是注射100μg/ea(=4mg/kg)6A6抗體，而組3是注射200μg/ea(=8mg/kg)6A6抗體。以26天的間隔根據(jù)以下等式測量小鼠中出現(xiàn)的腫瘤大小腫瘤體積=l/2x(長χ面積χ高)在第30天，將小鼠處死，并測量腫瘤重量。結(jié)果觀察到相對于注射PBS的對照組，在以6A6抗體給藥的組內(nèi)腫瘤大小依據(jù)劑量減小(圖27和圖28)。實施徹丨21:6A6杭體在肺癌異種移棺云M勿1草型中的杭癌效應(yīng)以7xl07細(xì)胞的濃度將人肺癌A549細(xì)胞(ATCC，USA)皮下注射到裸鼠中(JapanSL,Japan)以形成腫瘤。注射癌細(xì)胞10天之后，肉眼已經(jīng)可觀察到腫瘤，然后每周三次將6A6抗體腹膜內(nèi)注射到小鼠中。將小鼠分成三組，每組由5個動物組成。組1是注射PBS組(對照組)，組2注射lmg/kg6A6抗體，而組3注射lmg/kgof阿伐他汀(Genentech，USA)。結(jié)果如圖29所看到的，相對于注射PBS的對照組，在注射6A6抗體的組和注射阿伐他汀的陽性對照組中腫瘤的生長被抑制了。實施例22放射件碘標(biāo)記的6A6抗體在體內(nèi)的腫瘤靶向采用抗體和CML(慢性髓性白血病)K562細(xì)胞的結(jié)合親和力分析了6Α6抗體的腫瘤靶向作用。采用碘珠方法以放射性碘-125標(biāo)記抗體，以用碘標(biāo)記超過90%的抗體(圖30的Α)，制備了純度超過98%的以放射性碘標(biāo)記的抗KDR(6Α6)抗體(圖30的B)。將Κ562細(xì)胞皮下注射到Balb/c裸鼠中以制備CML腫瘤模型，在注射K562細(xì)胞之后的21-28天當(dāng)腫瘤大小達(dá)到Icm時，將碘-125標(biāo)記的抗體(100μg)注射到K562腫瘤模型裸鼠的尾靜脈中。注射抗體2小時和24小時之后，獲得了體內(nèi)形成腫瘤的動物的γ造影圖像。觀察到在2小時和24小時抗體導(dǎo)入腫瘤表現(xiàn)出相似的模式，24小時之后本底放射能下降。觀察到抗體定位于腫瘤，這表明了K562腫瘤表達(dá)了KDR。從而，由于抗體本身通過定位的治療效應(yīng)，以及由于放射性同位素輻射的β射線引起的治療效應(yīng)，該抗體可能用作一種放射免疫治療劑(圖31)。實施例23采用輕鏈改組的6Α6-Ι戒的親和力成熟為了鑒別親和力高于6Α6的抗體，按實施例2的操作，采用限制性內(nèi)切酶SfiI從完整人抗體文庫DNA中移除重鏈。在移除重鏈的位點插入以SfiI限制性內(nèi)切酶處理的ΡΑΚ-6Α6的重鏈。將制得的DNA轉(zhuǎn)化到ETB(ElectroTenblue)細(xì)胞中(Stratagene，USA)，并將細(xì)胞在SOB培養(yǎng)基上培養(yǎng)1小時。然后，將細(xì)胞涂布在2xYT(Cm)平板上，第二天收集菌落并儲存在_70°C。結(jié)果，構(gòu)建了具有4xl06多樣性的6A6輕鏈改組文庫(圖32)。為了檢測是否成功構(gòu)建輕鏈改組文庫，隨機挑選48個克隆，分析其輕鏈序列。結(jié)果，在48個克隆的輕鏈序列中不存在重疊。按與實施例3相同的方式通過噬菌體展示的生物淘篩程序從文庫中篩選具有高于6A6的結(jié)合親和力的克隆。通過以下程序最終獲得了18個候選者。(1)為了防止在生物淘篩程序中再選到6A6，以在6A6的⑶R3上具有識別位點的限制性內(nèi)切酶SpeI處理6A6輕鏈改組文庫的DNA。DNA被轉(zhuǎn)化到ETB細(xì)胞之后，基于培養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建子文庫，在ELISA中分析了子文庫的KDR親和力。在由第四輪淘篩獲得的候選者之中，按與實施例5相同的方式選擇了94個候選者并進行KDR結(jié)合試驗。在表現(xiàn)出陽性反應(yīng)的候選者之中，隨機挑選四個候選者，測定其DNA序列。此外，采用各自的噬菌體對候選者進行VEGF競爭(圖33)。結(jié)果，選擇了具有類似等于陽性對照組6A6的KDR中和能力的4SD5、4SC3和4SC5。(2)在生物淘篩的清洗步驟中，通過與可溶性KDR的競爭選擇了KE3、KE6、2KG8、3KE11、3KF11、3KG3和K3F1。此處所采用的生物淘篩程序如下。以4mlKDR(5yg/ml)涂覆Maxisorp星號離心管(Nunc,Denmark)并以2%脫月旨乳/PBS在37°C封閉2小時。然后，將500μ1懸浮在2%脫脂乳中的6Α6輕鏈改組文庫噬菌體與KDR結(jié)合，然后在0.PBS-T(Tween20)中反應(yīng)1小時。然后，以0.1%PBST將離心管洗滌10次并以PBS緩沖液洗滌10次。然后，添加4ml可溶性KDR(25μg/ml/PBS)并使其結(jié)合30分鐘，以IOOmM三乙胺處理離心管以洗脫噬菌體。洗脫的噬菌體以500μIlMTris-Cl(ρΗ7.5)中和并將其轉(zhuǎn)化到Ε.coliXLl-Blue細(xì)胞50分鐘，然后培養(yǎng)細(xì)胞。將在三個淘篩步驟中選擇的抗體在ScFv-噬菌體顆粒狀態(tài)下進行VEGF競爭試驗。在第一次淘篩中獲得的四個候選抗體之中，選擇了相對于其他候選抗體具有高VEGF競爭力的KE3和KE6，排除了KC7和KQll(圖34的A)。在第二次淘篩中獲得的三個候選抗體之中，排除了VEGE競爭力低的2KE5，而選擇了具有類似于6A6的VEGF競爭力的剩余2KG4和2KG8。2KG4表現(xiàn)出與后面選擇的抗體3KG3相同的序列，從而其被3KG3所取代(圖34的B)。在第三次淘篩中獲得的五個候選抗體之中，排除了具有低競爭力的3KG2和3KF7，僅選擇了3KE11、3KF11和3KG3(圖34的C)。類似地，選擇了通過第三次淘篩獲得的K3F1，K3F1相對于6A6K3F1表現(xiàn)出相當(dāng)高的VEGF競爭力(圖34的D)。(3)在生物淘篩程序的噬菌體和抗原KDR結(jié)合的步驟中，也添加了實施例8中獲得的IMC-1121IgG，結(jié)果，選擇了IE4、3IG11、3IG12、3IE1、3IH2、I2F2、I3A12和I3F2克隆。此處所采用的生物淘篩程序如下。以4mlKDR(5yg/ml)涂覆Maxisorp星號離心管(Nunc,Denmark)并以2%脫月旨乳/PBS在37°C封閉2小時。然后，將500μ1懸浮在含21μg/mlIMC_1121IgG(0.14μΜ)的2%脫脂乳中的6Α6輕鏈改組文庫噬菌體在其中結(jié)合1小時，然后在0.PBST中反應(yīng)1小時。然后，以0.1%PBST將離心管洗滌10次并以PBS緩沖液洗滌10次。然后，在離心管中添加4ml可溶性KDR(25μg/ml/PBS)并使其結(jié)合30分鐘，以IOOmM三乙胺進行處理以洗脫噬菌體。洗脫的噬菌體以500μ1IMTris-Cl(ρΗ7.5)中和，然后將其轉(zhuǎn)化到Ε.coliXLl-Blue細(xì)胞50分鐘，然后培養(yǎng)細(xì)胞。將在三個淘篩步驟中選擇的抗體在ScFv-噬菌體顆粒狀態(tài)下進行VEGF競爭試驗。在第一次淘篩中獲得的三個候選抗體之中，僅選擇了具有類似于6A6的VEGF競爭力的IE4(圖35的A)。分析了IE4的DNA序列，結(jié)果，在IE4有28個氨基酸不同于6A6。此外，6A6具有108個輕鏈氨基酸，而IE4具有107個氨基酸，這表明了在6A6的CDR3中被刪除了一個氨基酸。圖35的B顯示了通過第三次淘篩獲得的三個候選抗體的VEGF競爭試驗結(jié)果。在DNA測序中，3IG8具有完全不同于6A6的輕鏈序列，在FACS結(jié)果中，3IG8不與活體細(xì)胞結(jié)合，表明了其不轉(zhuǎn)化成IgG的形式。選擇了3IG11、3IG12、3IE1和3IH2，并排除了3IA7，因為其在輕鏈序列中有一個終止密碼子。圖35的C顯示了通過第二次淘篩和第三次淘篩獲得的候選抗體的VEGF競爭試驗結(jié)果。選擇了全部的3IA12、I3F2和I2F2。18個被選克隆的輕鏈DNA序列如SEQIDNO164至SEQIDNO181所示，由DNA序列推斷的氨基酸序列如SEQIDNO:2至SEQIDNO19所示。表7顯示了相對于6A6輕鏈氨基酸(TTAC-0001)被取代的區(qū)域。此外，克隆被重命名為“TTAC-0002至TTAC-0019”(表8)。表7:18個被選克隆的突變位點<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表8開發(fā)的抗體的新名稱<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>開發(fā)的抗體的名稱新名稱開發(fā)的抗體的名稱新名稱SD5TTAC-0005I2F2TTAC-OO152KG8TTAC-0006I3A12TTAC-OO163KE11TTAC-0007I3F2TTAC-OO173KF11TTAC-00084SC3TTAC-OO183KG3TTAC-00094SC5TTAC-OO193IG11TTAC-OO10產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性如上具體所述的，本發(fā)明提供了完全人抗體，其具有優(yōu)異的中和體內(nèi)細(xì)胞中VEGF受體的能力，并且提供了含有所述抗體的抑制血管生成的組合物和治療癌癥的組合物。相對于商業(yè)可供的針對血管內(nèi)皮生長因子受體的抗體，本發(fā)明的6A6抗體在活體細(xì)胞中表現(xiàn)出優(yōu)異的中和能力，并不僅在人而且在小鼠和大鼠中也表現(xiàn)出中和血管內(nèi)皮生長因子受體的能力。因而，6A6抗體可用于抗癌研究并在癌癥治療中高度有效。盡管參照特定特征具體描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然會認(rèn)識到這樣的說明僅是優(yōu)選的實施方式而不會限定本發(fā)明的范圍。從而本發(fā)明的實際范圍將由所附的權(quán)利要求和其等效物所確定。權(quán)利要求一種單鏈可變區(qū)片段分子，該單鏈可變區(qū)片段分子含有由SEQIDNOS1-19的任一氨基酸序列所表示的輕鏈可變區(qū)，并且具有中和血管內(nèi)皮生長因子受體的功能。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈可變區(qū)片段分子，該單鏈可變區(qū)片段分子具有由SEQIDNO20的氨基酸序列所表示的重鏈可變區(qū)。3.一種編碼權(quán)利要求1或2所述的單鏈可變區(qū)片段分子的DNA。4.一種含有權(quán)利要求3所述的DNA的載體。5.重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求4所述的載體。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組細(xì)胞，其中該細(xì)胞是細(xì)菌或動物細(xì)胞。7.一種抑制血管生成的組合物，該組合物含有權(quán)利要求1或2所述的單鏈可變區(qū)片段分子。8.一種治療癌癥的組合物，該組合物含有權(quán)利要求1或2所述的單鏈可變區(qū)片段分子。9.一種IgG，該IgG含有由SEQIDN0S1-19的任一氨基酸序列所表示的輕鏈可變區(qū)，并且具有中和血管內(nèi)皮生長因子受體的功能。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的IgG，該IgG具有由SEQIDNO20的氨基酸序列所表示的重鏈可變區(qū)。11.一種抑制血管生成的組合物，該組合物含有權(quán)利要求9或10所述的IgG。12.—種治療癌癥的組合物，該組合物含有權(quán)利要求9或10所述的IgG。全文摘要本發(fā)明涉及中和血管內(nèi)皮生長因子受體的人單克隆抗體及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及中和血管內(nèi)皮生長因子受體的人ScFv分子、以及含有該人ScFv分子的抑制血管生成的組合物和治療癌癥的組合物。相對于商業(yè)可供的針對血管內(nèi)皮生長因子受體的抗體，所公開的中和血管內(nèi)皮生長因子受體的單克隆抗體在活體細(xì)胞中表現(xiàn)出優(yōu)異的中和能力，并不僅在人而且在小鼠和大鼠中也表現(xiàn)出中和血管內(nèi)皮生長因子受體的能力。因而，單克隆抗體可用于抗癌研究并在癌癥治療中高度有效。文檔編號C07K16/00GK101802003SQ200780053244公開日2010年8月11日申請日期2007年6月26日優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日發(fā)明者全在元,姜貞恩,尹採玉,張賢淑,樸美熙,樸英宇,權(quán)英根,李東憲,李東燮,李俊哲,李元燮,柳珍山,柳賢美,沈相烈,片寶貞,羅根配,薛衫淑,趙頭賢,金世美,金圣祐,金渡倫,金藍(lán)珠,金貴和,高尚錫申請人:韓國生命工學(xué)研究院