專利名稱：血管內(nèi)皮生長因子受體1^＋細(xì)胞在治療和監(jiān)測癌癥以及在篩選化療藥中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血管內(nèi)皮生長因子受體r細(xì)胞在治療和監(jiān) 測癌癥以及在篩選化療藥中的用途。
背景技術(shù)：
癌癥在美國是僅次于心臟病發(fā)作的第二大死因。在開 發(fā)治療這類破壞性疾病的新療法中已經(jīng)取得了重大進(jìn)步。這些進(jìn)步 大部分歸功于對正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖的更多了解。 正常細(xì)胞的增殖是通過生長因子受體各自的配體高度 控制生長因子受體活化的結(jié)果。這類受體的實(shí)例是生長因子受體酪 氨酸激酶。 癌細(xì)胞的增殖是正常細(xì)胞的DNA突變或腫瘤抑制基因 功能喪失的結(jié)果。這些遺傳變化產(chǎn)生許多新的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，例如過 量表達(dá)的腫瘤相關(guān)生長因子或趨化因子或受體，這可刺激其它細(xì)胞(例 如內(nèi)皮細(xì)胞)的增殖，并在腫瘤內(nèi)形成新血管以供其繼續(xù)生長并促進(jìn) 腫瘤轉(zhuǎn)移。在非腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的能支持腫瘤生長、并且在某些
環(huán)境下本身就在腫瘤細(xì)胞表面的某些生長因子受體的實(shí)例包括血管
內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、胰 島素樣生長因子受體(IGFR)、神經(jīng)生長因子受體(NGFR)和成纖維細(xì) 胞生長因子受體(FGF)。 在胚胎發(fā)育期間，造血細(xì)胞和早期內(nèi)皮細(xì)胞(成血管細(xì) 胞)起源于共同的前體細(xì)胞，稱為成血成血管細(xì)胞(hemagioblast)。因 為它們具有共同的細(xì)胞來源，所以造血細(xì)胞和血管細(xì)胞共享一些信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 一個這樣的途徑是VEGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。VEGF受體 (VEGFR)包括VEGFR1 (也稱為FLT-1,由Shibuya M.等人測序 (Shibuya M,等，(9wcoge"e 5:519-524 (1990))和VEGFR2 (也稱為KDR 或FLK-l,參見Terman等，6:1677-1683 (1991);并由 Matthews W.等人測序(Matthews W.等，尸rac. Jcaof. 88:9026-9030 (1991》。除非上下文中另有說明或有明確表示，否則本說明書 將會遵循VEGF受體的習(xí)慣命名法。KDR是指VEGFR2的人形式。 FLK-1是指VEGFR2的鼠同系物。FLT-1與KDR/FLK-1受體不同， 但與之相關(guān)。 VEGFR能結(jié)合VEGFR1和VEGFR2,對內(nèi)皮細(xì)胞和造 血細(xì)胞發(fā)揮增殖和遷移效應(yīng)。過去認(rèn)為VEGRF2只由內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。 然而，近來發(fā)現(xiàn)VEGFR2也存在于多能造血干細(xì)胞亞群上(Ziegler等, Sc/e"ce 285 (5433):1553-8 (1999))。若干研究已經(jīng)表明，某些白血病 細(xì)胞也表達(dá)VEGFR1和VEGFR2 (Fiedler等，S/ood 89(6):1870-5 (1997》。 介導(dǎo)VEGF的不同生物學(xué)效應(yīng)的兩種主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)酪 氨酸激酶受體是VEGFR2和VEGFR1。盡管VEGFR1與VEGF的結(jié) 合親和性非常高，Kd值為10-70pM (Klagsbmn等，GrawA Factor 7(3):259-70 (1996)),但是大多數(shù)研究表明，VEGFR2是傳 送用于內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞信號的關(guān)鍵性受體(Ortega等， /
尸a^oZ 151(5):1215-24 (1997))。 VEGFR1看來對血管重塑更加重要。 在通過同源重組破壞鼠胚胎干細(xì)胞的VEGFR2基因和VEGFR1基因 的研究中，已經(jīng)確定VEGF受體在調(diào)節(jié)血管發(fā)生和血管生成中的相 對重要性。VEGFR2缺陷型小鼠是在血管發(fā)生、血管生成和血細(xì)胞 生成中具有重大缺陷的小鼠(Shalaby等，A^m" 376(6535):62-6 (1995))。相比之下，VEGFR1敲除小鼠發(fā)育異常血管通道，表明該 受體在調(diào)節(jié)細(xì)胞相互作用和血管穩(wěn)定方面的作用(Fong等，A^wre 376(6535):66-70 (1995》。 通過破壞VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制血管生成，導(dǎo)致對 實(shí)體瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制。例如，在鼠模型中，中和抗鼠VEGFR2 的單克隆抗體(MoAb)，抑制腫瘤侵襲(Skobe等，Ato 3(11):1222-7 (1997)和Prewett等，C匿w i ^ 59(20):5209-18 (1999》。此外，在 VEGFR2顯性失活的小鼠中，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生長受到抑制(Millauer 等，367(6463):576-9 (1994))。這類對肺瘤生長的抑制，歸功于 對血管生成的抑制，有效限制了對腫瘤的血液供應(yīng)。 白血病起源于其成熟和分化的不同時期的造血干細(xì) 胞。目前已經(jīng)清楚地知道，急性白血病起源于具有自我更新能力的 未成熟的造血干細(xì)胞，而某些攻擊性較弱的白血病(例如慢性白血病) 則似乎起源于更成熟的定型造血祖細(xì)胞。 —些研究表明，VEGF幾乎總是由所有已確定的白血病 細(xì)胞系以及新分離的人類白血病細(xì)胞系(包括已充分研究的HL-60白 血病細(xì)胞系)表達(dá)(Fiedler等，祝ood 89(6):1870-5 (1997), Bellamy等, C朋cer化s 59(3):728-33 (1999》。利用RT-PCR, —些研究已經(jīng)表明， VEGFR-2和VEGFR-1僅由某些人類白血病表達(dá)(Fiedler等，說ood 89(6):1870國5 (1997), Bellamy等，C離er腦59(3):728-33 (1999》。然 而，這些研究都沒有說明，VEGF表達(dá)是否與任何平行表面 VEGFR2/VEGFR1表達(dá)或功能性反應(yīng)相關(guān)。骨髓(BM)衍生細(xì)胞(BMDC)可促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化(Coussens
等,"MMP-9 Supplied by Bone Marrow-derived Cells Contributes to Skin Carcinogenesis (骨髓衍生細(xì)胞所供應(yīng)的MMP-9能促進(jìn)皮膚癌的發(fā) 生)"Ce〃 103:481-490 (2000》、肺瘤血管形成(Lyden等，"Impaired
Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨fi書亍生的內(nèi)
皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的募集減少能阻斷腫瘤血管生成和生長),"A^. A/W. 7:1194-1201 (200l)和Autiero等，"Placental Growth Factor and its
Receptor, Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1: Novel Targets for Stimulation of Ischemic Tissue Revascularization and Inhibition of Angiogenic and Inflammatory Disorders (胎盤生長因子及其受體，血管
內(nèi)皮生長因子受體-l:刺激缺血組織的血管再形成并抑制血管生成及 炎性疾病的新把標(biāo)),"Jowma/o/772raw6./faewoW. 1:1356-1370(2003)) 和腫瘤細(xì)胞遷移(Neson等，"Lymphocyte-facilitated Tumor Cell Adhesion to Endothelial Cells: the Role of High Affinity Leukocyte Integrins (淋巴細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞粘附內(nèi)皮細(xì)胞高親和力白細(xì)胞整 聯(lián)蛋白的作用),"35:50-55 (2003))。先前已經(jīng)鑒定了表達(dá)血 管內(nèi)皮生長因子受體1 (VEGFR1)的造血祖細(xì)胞(HPC)群體，其干細(xì) 胞駐留在BM的特異性生態(tài)位依賴區(qū)內(nèi)。在新血管生成過程中，這 種小于0.01%總BM細(xì)胞的正常小群體增殖并與BM衍生的VEGFR2+ 內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)—起被動員到外周循環(huán)中，這兩種細(xì)胞都是原發(fā)性 腫瘤血管形成和生長必不可少的(Lyden等，"Impaired Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨髓4汙生的內(nèi)皮細(xì)月包和造血 祖細(xì)胞的募集減少能阻斷腫瘤血管生成和生長),"Ato. A/". 7:1194-1201 (2001)和Hattori等，"Placental Growth Factor Reconstitutes Hematopoiesis by Recruiting VEGFR1(+) Stem Cells from Bone-marrow Microenvironment (胎盤生長因子通過從骨髓」徵環(huán)境募集VEGFRl(+) 干細(xì)胞而重建血細(xì)胞生成),"A^. Med 8:841-9 (2002))。這些骨髓單 核細(xì)胞來源的VEGFRl+細(xì)胞定位于腫瘤床的血管周圍部位，為新形
成血管起到支持和穩(wěn)定的作用(Lyden等，"Impaired Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨髓衍生的內(nèi)皮細(xì)胞和造血
祖細(xì)胞的募集減少能阻斷腫瘤血管生成和生長),"A^. A/eof. 7:1194-1201 (2001))。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞和其它腫瘤相關(guān)細(xì)胞能增強(qiáng)原發(fā)性 肺瘤生長并促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散，但是它們對腫瘤轉(zhuǎn)移的精確作用目前尚 不清楚(Pollard, " Tumor-educated Macrophages Promote Tumor Progression and Metastasis (腫瘤馴化巨喧細(xì)月包促進(jìn)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn) 移),"iV饑i^v. Ca"cer. 4:71-78 (2004)和Himtsuka等，"MMP9 Induction by Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 is Involved in Lung-specific Metastasis (血管內(nèi)皮生長因子受體-1的MMP9誘導(dǎo)，參與肺 特異性肺瘤轉(zhuǎn)移)，"C朋cer 0〃. 2:289-300 (2002))。 本發(fā)明涉及利用這些現(xiàn)象監(jiān)測和治療癌癥和腫瘤轉(zhuǎn)移。
發(fā)明概述 本發(fā)明涉及抑制癌癥患者遠(yuǎn)離腫瘤原先形成部位的部 位腫瘤形成的方法。該方法包括在有效抑制癌癥患者遠(yuǎn)離胂瘤原 先形成部位的部位肺瘤形成的條件下，給予癌癥患者血管內(nèi)皮生長
因子受體r骨髓衍生細(xì)胞抑制劑。 本發(fā)明的另 一 方面涉及預(yù)防癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的方 法。該方法包括在有效抑制癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，給予癌
癥患者血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞抑制劑。 本發(fā)明的另一方面涉及用于抑制癌癥患者腫瘤形成或 預(yù)防癌癥患者肺瘤轉(zhuǎn)移的候選化合物的鑒定方法。該方法包括提供
試驗化合物，并將試驗化合物與血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生 細(xì)胞一起孵育。鑒定能結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞 的試驗化合物，作為用于抑制癌癥患者腫瘤形成或預(yù)防癌癥患者胂 瘤轉(zhuǎn)移的候選化合物。
本發(fā)明的另 一 方面涉及監(jiān)測癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的方
法。該方法包括評價患者樣品的血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生 細(xì)胞水平，并將血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的水平與血 管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞先前的水平進(jìn)行比較，其中血 管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞水平增加，就表明未來會有腫 瘤轉(zhuǎn)移。 本發(fā)明的另 一 方面涉及抑制患者的遠(yuǎn)離肺瘤原先形成 部位的部位纖連蛋白表達(dá)的方法。該方法包括在有效抑制患者的 遠(yuǎn)離腫瘤原先形成部位的部位纖連蛋白表達(dá)的條件下，給予患者血 管內(nèi)皮生長因子受體l+骨髓衍生細(xì)胞抑制劑。目前，對完全切除或部分切除實(shí)體瘤并進(jìn)行輔助化療
后又發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的患者進(jìn)行確定，是非常困難的。在任何指定腫 瘤轉(zhuǎn)移頻發(fā)部位(例如結(jié)腸癌患者的肝臟、骨肉瘤患者的肺部、乳癌
患者的淋巴結(jié))測定VEGFRl+骨髓衍生細(xì)胞的體系，可有助于預(yù)測患 者是否需要針對這些VEGFRr骨髓衍生簇的額外輔助治療以及更常 規(guī)療法，例如在切除后用化療提前治療，而不是等待出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù) 發(fā)之后才開始治療。這些細(xì)胞簇作為表達(dá)VEGFR1或VLA的循環(huán)或 動員細(xì)胞在血流中也可以被示蹤。另外，有可能在將來可以標(biāo)記這 些VEGFRl+造血祖細(xì)胞，這樣可以通過造影研究以跟蹤對治療的反 應(yīng)或評價未來的轉(zhuǎn)移危險性。它可用于改變最小殘余疾病的分期和 監(jiān)測方法。這樣的標(biāo)記和潛在治療策略將證明對原發(fā)性腫瘤患者以 及那些患者的照顧是非常有用的?？梢灶A(yù)知的是，該策略也可用于 患有缺血性疾病和炎性疾病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎性腸病)的患者。 胂瘤擴(kuò)散之前，這些VEGFRl+骨髓衍生細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部 位的存在，導(dǎo)致形成利于導(dǎo)入VEGFR2+內(nèi)皮細(xì)胞和胂瘤細(xì)胞的微環(huán) 境，這提供證據(jù)表明這些細(xì)胞產(chǎn)生新趨化因子或生長因子，這可 解釋這些特性。新蛋白質(zhì)/基因的分離/鑒定包括VEGFRl+細(xì)胞和轉(zhuǎn)移
前生態(tài)位引起腫瘤細(xì)胞遷移和粘附的增加，這將為預(yù)防腫瘤擴(kuò)散提 供重要靶標(biāo)。
附圖簡述

圖1A-E顯示骨髓衍生細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移前生態(tài)位。在圖1A 中，在輻射后和LLC細(xì)胞植入前，在肺部罕見(3-gal+骨髓細(xì)胞(左圖， n=6)。到第14天，(3-gal+骨髓衍生簇出現(xiàn)在肺實(shí)質(zhì)中(左中圖和箭頭 區(qū)域的放大插圖；11=25)并在第23天與微小轉(zhuǎn)移聯(lián)合(右圖，箭頭)并 且在總體轉(zhuǎn)移中(右圖，插圖；n=12)。也顯示了與終末細(xì)支氣管和支 氣管靜脈間基質(zhì)(常見的轉(zhuǎn)移部位)聯(lián)合的簇(右中圖)。B是終末細(xì)支 氣管，V是支氣管靜脈。圖1B顯示在輻射后和DsRed-標(biāo)記的B16 細(xì)胞植入前的肺部GFP+骨髓(左圖；n=6)。在第14天，可見GFP+ BMDC 沒有DsRed+腫瘤細(xì)胞(左中圖和插圖；n=12)。從第18天開始，少量 單個DsRed+ B16細(xì)胞粘附到GFP+骨髓簇上(右中圖)，到第23天， DsRed+腫瘤細(xì)胞在簇部位增殖(右圖；n=8)。 DAPI染色顯示細(xì)胞核。 圖1C是曲線圖，表示肺部骨髓衍生的GFP+ BMDC和DsRed+ B16 細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)(11=30)，以及第14天(左圖)和第18天(右圖) 的兩幅流向圖。圖ID顯示與僅接受培養(yǎng)基的動物相比(左圖； P<0.01),用B16條件培養(yǎng)基時GFP+ BMDC的動員，然后在粘附24 小時后通過尾靜脈注射DsRed標(biāo)記的肺瘤細(xì)胞(右圖，箭頭)。插圖表 示4天后簇中增殖的腫瘤細(xì)胞(右圖插圖；n=6)。圖IE顯示具有皮內(nèi) LLC或B16腫瘤的動物中，每100X物鏡視野中簇的數(shù)量(1^12)。右 下角的比例尺適用于圖1A(左，左中，右中，80mm;左中插圖，8mm; 右圖，20mm;右插圖，47mm),適用于圖IB (左，左中，80mm; 左中插圖，8mm;右中，右，40mm)，適用于圖lD(40mm;右插圖， 20mm)。轉(zhuǎn)移前簇包括VEGFRl+造血祖細(xì)胞。圖1F-I顯示轉(zhuǎn)移前簇 包括VEGFR1造血祖細(xì)胞。圖1F顯示在輻射過的肺中，在肺瘤植入 之前的VEGFR1染色(左圖和插圖；n=10),以及在LLC細(xì)胞植入后
14天顯示肺部的簇(右圖，箭頭；r^l8,每100X物鏡視野中3.9 ±0.2% 細(xì)胞帶有VEGFR1染色，P<0.05)。圖1G和H顯示帶有第14天LLC 腫瘤的動物肺部的雙重免疫熒光。VEGFRl+和GFP+骨髓細(xì)胞(左圖)、 VEGFRl+和CD133+ (右圖)見圖1G。 VEGFRl+和CD117+見圖1H。 圖II顯示在生命的第40天和腫瘤發(fā)生之前，c-Myc轉(zhuǎn)基因淋巴結(jié)中 的VEGFRl+簇(中圖和插圖顯示VEGFRl+細(xì)胞)，相比之下，野生型 同窩出生幼仔淋巴結(jié)沒有轉(zhuǎn)基因(左圖)，在第120天，c-Myc轉(zhuǎn)基因 結(jié)具有淋巴瘤(右圖)。在右圖的插圖中，箭頭指淋巴瘤周圍圍繞的 VEGFRl+蔟(n-6)。右下角的比例尺適用于圖IE (80mm;左插圖， 40mm)、圖1G(20mm)、圖1H (20mm)和圖II (80mm;插圖，8mm)。
圖2A-B顯示對骨髓細(xì)胞歸巢的抑制可預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移。 圖2A顯示在LLC植入后第24天，VEGFRr-選擇的骨髓(Rl-pos)允 許微小轉(zhuǎn)移(箭頭，中圖)，但能預(yù)防血管形成良好的大轉(zhuǎn)移，正如在 野生型中所見(左圖)。插圖顯示CD31 (內(nèi)皮標(biāo)記)表達(dá)。VEGFRl+細(xì) 胞的骨髓耗盡(非Rl)消除簇和轉(zhuǎn)移(右圖)(經(jīng)ANOVA, PO.Ol)。該 表顯示每100X物鏡視野下簇和^L小轉(zhuǎn)移的數(shù)量。*表示轉(zhuǎn)移填充在 肺部。(Rl-pos， n=4;非Rl, n=4;野生型，n=6;非Rl加上野生 型，n=4)。圖2B顯示在帶有LLC腫瘤的小鼠中用抗VEGFRl抗體(抗 Rl)和抗VEGFR2抗體(抗R2)進(jìn)行治療，能阻止簇和腫瘤轉(zhuǎn)移(經(jīng) ANOVA, PO.01;對于所有組，n=5)。野生型肺部中的箭頭指大的 LLC轉(zhuǎn)移?？筊2中的箭頭指簇，插圖顯示簇內(nèi)微小轉(zhuǎn)移。T，腫瘤 細(xì)胞。該表顯示肺部每100X物鏡視野下簇和LLC微小轉(zhuǎn)移的數(shù)量。 *表示轉(zhuǎn)移填充在組織中。右下角的比例尺適用于圖2A (20mm;野 生型插圖，26mm; Rl-pos插圖，32mm)和圖2B (40mm;抗R2插圖， 20mm)。 圖3A-F顯示VLA4/纖連蛋白途徑介導(dǎo)簇的形成。圖 3A-C顯示野生型小鼠在腫瘤移植后第14天出現(xiàn)能表達(dá)VLA-4 (插 圖，VEGFRl和VLA-4)、 MMP9和Id3的簇(插圖，VEGFRl和Id3)。
圖3D顯示給予VEGFR1+GFP+ BMDC的帶有LLC腫瘤的Id3敲除(KO) 小鼠的肺部組織(經(jīng)ANOVA, PO.01; n=6)。箭頭指上插圖區(qū)域。箭 頭(下插圖)顯示用GFP+VEGFRl+細(xì)胞的轉(zhuǎn)移部位。圖3E顯示野生型 肺部的基線纖連蛋白表達(dá)(11=6)(左圖)。在第3天，轉(zhuǎn)移前肺部的支 氣管周圍基質(zhì)纖連蛋白增加(中圖，箭頭)，在第14天達(dá)到最大表達(dá)(右 圖)。插圖，PDGRFoc表達(dá)表明駐留的成纖維細(xì)胞釋放纖連蛋白。圖3F 顯示定量RT-PCR,表明與野生型相比，帶有LLC腫瘤小鼠肺部的 纖連蛋白表達(dá)增加(經(jīng)ANOVA, *P<0.05; n=6)，而且?guī)в蠦16黑素 瘤動物肺部也有類似的早期趨勢。右上角的比例尺適用于圖3A-C (40mm;插圖，8mm)、圖3D (80mm;右上插圖，20mm;右下插圖 80mm)和圖3E(40mm;插圖，20mm)。 圖4A-E顯示LLC轉(zhuǎn)移改道向非典型部位。圖4A-B顯 示與野生型并用LCM-治療小鼠相比，通過定量RT-PCR分析，在給 予MCM的小鼠中可見輸卵管(圖4A)和腸(圖4B)內(nèi)纖連蛋白表達(dá)增 加。與野生型相比，對于輸卵管，第3-5天，經(jīng)ANOVA， *P<0.05， 第7-9天，**P<0.001;而與野生型相比，對于腸道，第7畫9天，*P<0.001 (n=6)。圖4C顯示條件培養(yǎng)基中VEGF和P1GF水平的ELISA測定(一 式三份)(當(dāng)與L-LCM相比，經(jīng)ANOVA， *P<0.05,而當(dāng)與培養(yǎng)基單 用相比，**P<0.01)。圖4D顯示transwell遷移測定(一式三份)，證明 VEGFRl+細(xì)胞向LCM和MCM的遷移增加(經(jīng)ANOVA, **P<0.001)。 圖4E顯示用MCM處理，使LLC的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散改道B16黑素瘤轉(zhuǎn)移 部位，例如脾(左圖)、腎(左中圖)、腸(右中圖)和輸卵管(右圖)。箭頭 指轉(zhuǎn)移邊界區(qū)，見插圖(11=6)。 T, LLC腫瘤細(xì)胞。右下角的比例尺 適用于圖4E (200mm;插圖，20mm)。 圖5A-E顯示腫瘤和VEGFR2+細(xì)胞在VEGFR1+HPC之 后到達(dá)。圖5A顯示第8、 14、 18和23天的流式細(xì)胞術(shù)分析，表明 肺部GFP+ BMDC群體和DsRed B16黑素瘤腫瘤細(xì)胞(n-30)。圖5B 顯示VEGFR1和CD34 (中圖)、VEGFR1和這些造血標(biāo)記共表達(dá)的頻
率(右圖)。圖5C顯示在第12、 14、 18和27天通過流式細(xì)胞術(shù)對肺 部CD117+祖細(xì)胞和熒光GFP+-LLC腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分析，表明這些細(xì) 胞的存在先于腫瘤細(xì)胞到達(dá)。圖5D顯示骨髓衍生的VEGFR2+循環(huán) 內(nèi)皮祖細(xì)胞在VEGFRl+造血祖細(xì)胞之后到達(dá)轉(zhuǎn)移前生態(tài)位。VEGFR1 與VEGFR2的雙重免疫熒光(左圖)。VEGFR1和CD31/PECAM (中圖) (箭頭指內(nèi)皮細(xì)胞)。VEGFR2+細(xì)胞和GFP的雙重免疫熒光，表明已 建立和生長的轉(zhuǎn)移生態(tài)位內(nèi)的這些細(xì)胞起源于骨髓(右圖)。圖5E是 曲線圖，表明VEGFR-2+細(xì)胞到達(dá)轉(zhuǎn)移生態(tài)位的時間，其與帶有16 天和24天胂瘤的動物肺部組織中可見的肺瘤細(xì)胞的到達(dá)是一致的(細(xì) 胞/蔟/100x視野)(n-6)。比例尺20pm (圖5B);左，左中20拜，右 10ium(圖5D)。 圖6A-F顯示轉(zhuǎn)移前人體組織中VEGFR1的表達(dá)。在患 有乳癌(11=15)、肺癌(11=15)和胃腸癌(11=3)的個體中，在惡性和非惡性 組織中，細(xì)胞簇用VEGFR1染色。圖6A顯示具有乳腺癌轉(zhuǎn)移證據(jù) 的淋巴結(jié)(箭頭指肺瘤)，而圖6B顯示同一患者沒有惡性腫瘤的淋巴 結(jié)。圖6C顯示原發(fā)性肺腺癌，而圖6D顯示沒有腫瘤的鄰近"正常" 肺(箭頭指VEGFRl+細(xì)胞)。無腫瘤個體的淋巴結(jié)(圖6B插圖；11=6)和 肺組織(圖6D插圖；11=3)中未見VEGFRl+蔟。也顯示胃食管連接的 原發(fā)性腺鱗狀上皮癌(圖6E)和無癌肝淋巴結(jié)(圖6F)。圖6E-F中的插 圖顯示VEGFR1和c-Kit的共免疫熒光。右下角的比例尺適用于所有 圖(40mm; 4#圖，40mm)。 圖7A-C顯示腫瘤在其趨化因子特性和纖連蛋白表達(dá)模 式方面是不同的。圖7A顯示，與培養(yǎng)基對照相比(左圖和中圖插圖) (n=12)，用LLC條件培養(yǎng)基(LCM)治療的WT小鼠誘導(dǎo)肝(左圖)和肺 (中圖)的纖連蛋白表達(dá)。LCM支持肺部P-gar BM簇(右圖，TB二終末 細(xì)支氣管，BV:支氣管靜脈)(n=6)。圖7B顯示與培養(yǎng)基對照的腸中 纖連蛋白表達(dá)相比(中圖插圖)(n=12),用MCM處理的小鼠顯示出在 肝(左圖)和腸(中圖)以及腎、睪丸和肺中纖連蛋白表達(dá)增加。帶有(3-gar
BM并用MCM處理的WT小鼠，表現(xiàn)出局限于富含纖連蛋白區(qū)域的 鄰近簇形成。(右圖)(n=6)。圖6C顯示對于得自14天腫瘤的動物的 LLC和B16黑素瘤來說，腫瘤衍生血漿中VEGF和P1GF的ELISA 水平(一式三份，與WT血漿相比，對于腫瘤衍生血漿，經(jīng)單側(cè) ANOVA, *p<0.05)。圖7A-B的比例尺為左圖和中圖40|um,插圖 35.2|um，右圖20prn。 圖8A-D顯示骨髓衍生的VEGFRl+細(xì)胞吸引腫瘤細(xì)胞。 圖8A顯示VEGFRl+細(xì)胞分離自BM,并與B16肺瘤細(xì)胞共培養(yǎng)， 形成聚集和增殖，用抗VEGFRl抗體(中圖)或抗VLA-4抗體(右圖) 進(jìn)4亍治療，可消除該效應(yīng)。圖8B顯示transwell遷移測定，證明B16 胂瘤細(xì)胞向VEGFRl+選擇群體的遷移增力o(—式三份，與非Rl和培 養(yǎng)基相比，對于Rl ，p<0.001%)。圖8C顯示低和高放大倍數(shù)的VEGFR1+ 細(xì)胞簇的SDF-1 (CXCL12)免疫熒光染色。SDF-la和VEGFR1的共 免疫熒光，對于SDF-la表達(dá)，VEGFRl+細(xì)胞簇染色陽性。圖8D顯 示LLC和B16腫瘤細(xì)胞表達(dá)CXCR4。比例尺對于圖8A, 50拜， 插圖120|Lim,對于圖8C，左圖和右圖40拜，中圖8拜，對于圖8D, 20|tim。 圖9顯示Id3敲除小鼠缺乏HPC動員，而Id3缺陷型 小鼠的CDllb+ VEGFRl+造血祖細(xì)胞動員增加。 圖10顯示VEGFR1抗體抑制B16腫瘤轉(zhuǎn)移。在用抗 VEGFR1和/或VEGFR2的中和抗體處理的小鼠中可見B16腫瘤(右 圖)。WT脾臟中的實(shí)心箭頭指有活性的黑素瘤，也見于插圖，而空 心箭頭指壞死和黑素顆粒?？筊l (抗VEGFR1)中的箭頭指脾臟中典 型的生發(fā)中心。抗Rl+抗R2組的插圖代表動物肺部分離的轉(zhuǎn)移瘤。 比例尺為20|iim:插圖WT脾811m，抗Rl+抗R2 66|iun。 圖11A-D顯示對VLA-4和MMP-9的抑制能抑制腫瘤 轉(zhuǎn)移。B16黑素瘤誘導(dǎo)肺部纖連蛋白表達(dá)。圖像顯示LLC植入后14 天，用抗VLA-4抗體治療的WT小鼠的肺組織((3-gal用伊紅復(fù)染，
n=8,經(jīng)學(xué)生氏t檢驗，p<0.01)(圖IIA)和MMP9V-小鼠的肺組織 (VEGFR1 DAB,用蘇木精復(fù)染，n=6)(圖IIB)。給予VLA-4抗體的 WT小鼠或MMP-9缺陷型小鼠的p-gal和VEGFR1細(xì)胞簇形成減少， 見圖IIC的下圖，定量測定的簇或轉(zhuǎn)移/100x視野(經(jīng)學(xué)生氏t檢驗， pO.Ol)。圖11D顯示B16黑素瘤肺瘤植入后第3和14天的肺組織 的纖連蛋白表達(dá)。第14天的箭頭指簇部位的纖連蛋白表達(dá)。比例尺 為80fim(圖IIA)和左圖、中圖40jxm,右圖8|um (圖IID)。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及抑制癌癥患者遠(yuǎn)離肺瘤原先形成部位的部 位腫瘤形成的方法。該方法包括在有效抑制癌癥患者遠(yuǎn)離腫瘤原 先形成部位的部位腫瘤形成的條件下，給予癌癥患者血管內(nèi)皮生長
因子受體r骨髓衍生細(xì)胞抑制劑。該抑制劑也可用于預(yù)防原發(fā)腫瘤
部位的腫瘤復(fù)發(fā)。 該方法的給藥步驟是在刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r 骨髓衍生細(xì)胞動員的相應(yīng)時間周期內(nèi)進(jìn)行的。由于化療、應(yīng)激、手
術(shù)、癌癥患者的骨髓重建(bone marrow recovery)、炎癥、輻射或生長 因子，可發(fā)生這樣的刺激。在刺激生長因子(例如粒細(xì)胞集落刺激因 子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子和紅細(xì)胞生成素)中，可以刺激造 血細(xì)胞被動員進(jìn)入血流中并促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。
在實(shí)施本發(fā)明時，選擇血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓
衍生細(xì)胞抑制劑，以結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞。
選擇血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞抑制劑， 以預(yù)防或減少血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的形成。合適 的抑制劑可以是血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞特異性生物
分子或者抑制RNA或DNA的小分子。 生物分子包括所有脂質(zhì)和分子量大于450的單糖、氨 基酸和核苷酸的聚合物。因此，生物分子包括例如寡糖和多糖、寡
肽、多肽、肽和蛋白質(zhì)；以及寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷酸和多 核苷酸包括例如DNA和RNA。 生物分子還包括任何上述分子的衍生物。例如，生物 分子的衍生物包括脂質(zhì)以及寡肽、多肽、肽和蛋白質(zhì)的糖基化衍生 物。生物分子的衍生物還包括寡糖和多糖的脂質(zhì)衍生物，例如脂多 糖。 最典型的生物分子是血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍 生細(xì)胞特異性抗體或所述抗體的功能性等價物。這樣的功能性等價 物包括例如嵌合抗體、人源化抗體和單鏈抗體及其片段。 抗體的功能性等價物優(yōu)選為嵌合抗體或人源化抗體。 嵌合抗體包含非人類抗體的可變區(qū)和人類抗體的恒定區(qū)。人源化抗 體包含非人類抗體的超變區(qū)(CDR)。人源化抗體的可變區(qū)(不是超變 區(qū))，例如構(gòu)架可變區(qū)，以及恒定區(qū)，都是人類抗體的。 為了本申請的目的，非人類抗體的合適可變區(qū)和超變 區(qū)可來自任何非人類哺乳動物產(chǎn)生的抗體，其中制備了單克隆抗體。 哺乳動物(而不是人類)的合適實(shí)例包括例如兔、大鼠、小鼠、馬、山 羊或靈長類動物。優(yōu)選小鼠。 功能性等價物還包括結(jié)合特性與完整抗體相同或相當(dāng) 的抗體片段。 這樣的片段可以例如含有F(ab')2片段中的一個或兩個 Fab片段。優(yōu)選的抗體片段含有完整抗體的全部6個互補(bǔ)決定區(qū)，盡 管也包括功能性片段，含有少于所有這樣的區(qū)域，例如包含3、 4或 5個CDR。優(yōu)選的片段是單鏈抗體或Fv片段。單鏈抗體是多肽， 其至少包含抗體重鏈可變區(qū)及與其相連的抗體輕鏈可變區(qū)，含有或 不含相互連接的接頭。因此，F(xiàn)v片段包含完整抗體結(jié)合位點(diǎn)?？稍?細(xì)菌或真核細(xì)胞中產(chǎn)生這些鏈?？贵w和功能性等價物可以是任何類別的免疫球蛋白成
員，例如IgG、 IgM、 IgA、 IgD或IgE及其亞類成員。優(yōu)選的抗體是 IgGl亞類成員。功能性等價物也可以是任何以上類別或亞類的組合。
本發(fā)明的抗體能夠結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓 衍生細(xì)胞，并能起到抑制其活性的作用。通過抑制血管內(nèi)皮生長因
子受體r骨髓衍生細(xì)胞的功能，這類抗體可具有治療潛力，尤其是
在癌癥治療中。 本發(fā)明的抗體能結(jié)合VLA-4 (ot4(31)整聯(lián)蛋白，抑制這 些骨髓衍生簇的形成。通過抑制VEGFRl+和VLA-4+骨髓衍生細(xì)胞的 功能，這類抗體可具有治療潛力，尤其是在癌癥治療中。 本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。 單克隆抗體可通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)來制備。概 括地講，該方法包括首先用目標(biāo)抗原在體內(nèi)或體外免疫哺乳動物(例 如小鼠)，再從其脾臟獲取免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)。然后，將分泌抗體 的淋巴細(xì)胞與能在細(xì)胞培養(yǎng)物中無限增殖的(小鼠)骨髓瘤細(xì)胞或轉(zhuǎn)化 細(xì)胞融合，由此產(chǎn)生無限增殖的、分泌免疫球蛋白的細(xì)胞系。培養(yǎng) 所得融合細(xì)胞即雜交瘤，篩選所得集落，用于制備所需單克隆抗體。 克隆能產(chǎn)生這類抗體的集落，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)以產(chǎn)生大量抗體。 有關(guān)融合這類細(xì)胞的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐方法的描述參見Kohler等, M^re 256:495 (1975),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。 通過用血管內(nèi)皮生長因子受體r體內(nèi)免疫動物(例如小 鼠)，免疫哺乳動物淋巴細(xì)胞。如有必要，間隔數(shù)周重復(fù)進(jìn)行這樣的 免疫，以得到足夠效價的抗體。在最后一次抗原加強(qiáng)免疫之后，處 死動物，取出脾細(xì)胞。 采用標(biāo)準(zhǔn)和公知的技術(shù)，可以與在細(xì)胞培養(yǎng)時能無限 增殖的哺乳動物骨髓瘤細(xì)胞或其它融合伙伴進(jìn)行融合，所述技術(shù)例 如通過使用聚乙二醇("PEG")或其它融合劑(Milstein等，￡wr丄 /ww柳o/. 6:M1 (l976)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。選擇 這種無限增殖細(xì)胞系(優(yōu)選鼠，但也可來自其它哺乳動物細(xì)胞，包括
但不限于大鼠和人)，所述細(xì)胞系缺乏利用某些營養(yǎng)物質(zhì)的酶，能夠 快速生長，并具有良好融合性能。許多這樣的細(xì)胞系是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的，其它細(xì)胞系也有常規(guī)描述。多克隆抗體的制備方法也是眾所周知的。通常，可通
過將血管內(nèi)皮生長因子受體r皮下給予新西蘭白兔(其事先已經(jīng)采血
以獲取免疫前血清)，產(chǎn)生這類抗體。在6個不同部位注射抗原，每 個部位總體積為lOOpl。各注射材料含有合成表面活性劑佐劑泊洛沙 姆多聚醇(pluronic polyol),或經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后含有蛋 白質(zhì)或多肽的研磨過的丙烯酰胺凝膠。第一次注射后2周給兔子放 血，然后每6周定期用相同抗原加強(qiáng)免疫3次。每次加強(qiáng)免疫后10 天，采集血清樣品。然后，通過親和色i普，使用相應(yīng)抗原捕獲抗體， 從血清中回收多克隆抗體。最終，用150mg/Kg IV戊巴比妥麻醉兔 子。產(chǎn)生多克隆抗體的上述方法和其它方法都公開于Harlow等(主編), 爿w"6oWw爿丄aZ)0rato7 A/朋wa/ (1988),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合 到本文中。 原本是人抗體的抗體可由轉(zhuǎn)基因哺乳動物、尤其是轉(zhuǎn) 基因小鼠產(chǎn)生，所述動物經(jīng)基因修飾以產(chǎn)生人抗體。嵌合抗體和人 源化抗體的制備方法也是本領(lǐng)域已知的。例如，嵌合抗體的制備方 法可參見美國專利第4,816,397和4,816,567號，所述文獻(xiàn)通過引用 全部結(jié)合到本文中。人源化抗體的制備方法參見美國專利第5,225,539 號，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。 抗體人源化的優(yōu)選方法稱為CDR移植法。在CDR移 植中，將直接參與抗原結(jié)合的小鼠抗體區(qū)(即CDR互補(bǔ)決定區(qū))移植 到人可變區(qū)上，產(chǎn)生"重構(gòu)人"可變區(qū)。這類完全人源化的可變區(qū) 再拼接到人恒定區(qū)上，產(chǎn)生完整的"完全人源化"抗體。 為了產(chǎn)生與抗原結(jié)合良好的完全人源化的抗體，最好 是仔細(xì)設(shè)計重構(gòu)的人可變區(qū)。應(yīng)該仔細(xì)選擇用于移植CDR的人可變 區(qū)，通常在人可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)(FR)內(nèi)關(guān)鍵位置上有必要改變幾個氨基酸。 例如，重構(gòu)的人可變區(qū)在所選人輕鏈可變區(qū)FR內(nèi)可包 含至多10個氨基酸改變，在所選人重鏈可變區(qū)FR內(nèi)可包含至多12 個氨基酸改變。將編碼這些重構(gòu)的人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的DNA 序列與編碼人重鏈和輕鏈恒定區(qū)基因的DNA序列(分別優(yōu)選yl和k) 連接起來。再在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)重構(gòu)的人源化抗體，將其對其 耙標(biāo)的親和力與相應(yīng)鼠抗體和嵌合抗體進(jìn)行比較。 選擇人源化抗體中有待取代的殘基并進(jìn)行取代的方法 是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如Co等，M rt^e 351:501-502 (1992); Queen等，尸rac. A^/.爿cad "&4 86:10029-1003 (1989)和Rodrigues 等，/"A C朋cw,增刊7:45-50 (1992),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合 到本文中。225種抗EGFR單克隆抗體的人源化和重構(gòu)方法參見WO 96/40210，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。該方法可用于針對
其它蛋白質(zhì)的抗體的人源化和重構(gòu)。 單鏈抗體的制備方法也是本領(lǐng)域眾所周知的。 一些實(shí) 例包括以下文獻(xiàn)中描述的例子歐洲專利申請第502 812號和Wels 等，, Ca"cw 60:137-144 (1995)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本 文中。單鏈抗體也可通過篩選噬菌體展示文庫而制備。 產(chǎn)生上述功能性等價物的其它方法公開于WO 93/21319、歐洲專利申請第239 400號、WO 89/09622、歐洲專利申 請第338 745號、美國專利第5,658,570號、美國專利第5,693,780號 和歐洲專利申請第332 424號，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文 中。在本發(fā)明方法的實(shí)踐中，可通過口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、 腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下或鼻內(nèi)給予患者抑制劑而進(jìn)行給藥步驟。本 發(fā)明的抑制劑可單獨(dú)給予或與合適的藥用載體一起給予，可以呈固 體或液體形式，例如片劑、膠嚢劑、粉劑、溶液劑、混懸劑或乳劑。本發(fā)明的抑制劑可口服給予，例如與惰性稀釋劑或與
可吸收的可食用載體一起給予，或者可將其包入硬殼或軟殼膠嚢中， 或者可將其壓制成片劑，或者可將其直接混入食物中。對于口服治 療性給予，本發(fā)明的抑制劑可以與賦形劑混合，以片劑、膠嚢劑、
酏劑、混懸劑、糖漿劑等形式使用。這類組合物和制劑應(yīng)含有至少0.1%
的本發(fā)明抑制劑。這些組合物中抑制劑的比例當(dāng)然可以不同，通常
介于約2%至約60%的單位重量。這類治療用組合物中本發(fā)明抑制劑 的用量使得能達(dá)到合適劑量。 片劑、膠嚢劑等也可含有粘合劑，例如西黃蓍膠、阿 拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸鉤；崩解劑，例如玉 米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；和甜味劑， 例如蔗糖、乳糖或糖精。當(dāng)單位劑型是膠嚢劑時，除了以上類型的 材料之外，它還可含有液體載體，例如脂肪油。 各種其它材料可以包衣或改良劑量單位的物理形式的 方式存在。例如片劑可以用蟲膠、糖或這兩者來包衣。糖漿劑中除 了活性成分之外，還可含有蔗糖(作為甜味劑)、對羥基苯曱酸曱酯和 對羥基苯曱酸丙酯(作為防腐劑)、染料和矯味劑(例如櫻桃味或橘子 味)。 本發(fā)明的抑制劑也可通過胃腸外給予?？梢杂门c表面 活性劑(例如羥丙基纖維素)適當(dāng)混合的水來制備抑制劑的溶液劑或混 懸劑。也可以用甘油、液體聚乙二醇及其混合物的油溶液來制備分 散劑。說明性的油是石油、動物油、植物油或合成來源的油，例如， 花生油、大豆油或礦物油。 一般而言，水、鹽水、含水葡萄糖和相 關(guān)糖溶液和二醇類(例如丙二醇或聚乙二醇)都是優(yōu)選的液體載體，尤 其是用于注射液。在通常的貯藏和使用條件下，這些制劑含有防腐 劑，以防止^f效生物生長。 適于注射用的藥物形式包括無菌水溶液劑或分散劑以 及臨用時制備成無菌注射用溶液劑或分散劑的無菌粉針劑。在所有 情況下，其形式必須是無菌的，而且其流動性必須易于注射。它在
生產(chǎn)和貯存條件下必須穩(wěn)定，必須防止細(xì)菌和真菌等^t生物的污染 作用。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例 如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)、其合適的混合物和植物油。 本發(fā)明的抑制劑也可以氣溶膠的形式直接給予呼吸 道。對于氣溶膠而言，溶液劑或混懸劑中的本發(fā)明抑制劑可與合適 的拋射劑以及常規(guī)輔料一起包裝在加壓的氣溶膠容器中，所述拋射 劑例如烴類拋射劑，例如丙烷、丁烷或異丁烷。本發(fā)明的抑制劑也 可以以非加壓形式給予，例如噴霧器或霧化器。 本發(fā)明可用于治療各種癌癥。本文所用的治療癌癥特 別是指將治療藥給予經(jīng)診斷患有癌癥的患者(即已確診患有癌癥的患 者)，以抑制癌組織中惡性細(xì)胞的進(jìn)一步生長或擴(kuò)散，和/或引起惡性 細(xì)胞的死亡。具體地講，乳癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌和皮膚癌 以及許多兒科癌癥都適于用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療。癌癥治療也包 括治療患有癌變前病癥的患者，以阻止癌變前病癥的發(fā)展或引起消 退。癌變前病癥包括增生、發(fā)育異常和化生。 本發(fā)明的治療藥可單獨(dú)使用或與其它癌癥療法(例如化 療藥、輻射或其組合)聯(lián)用。 化療藥的實(shí)例包括烷化劑(例如氮芥、吖丙啶化合物和 磺酸烷基酯)；抗代謝藥(例如葉酸、。票呤或嘧啶類拮抗劑)；有絲分 裂抑制劑(例如長春花屬生物堿和鬼臼毒素衍生物，以及細(xì)胞毒性抗 生素)；以及破壞或干擾DNA表達(dá)的化合物。
化療藥或化療的具體實(shí)例包括順鉑、達(dá)卡巴溱(DTIC)、 放線菌素D、氮芥、鏈佐星、環(huán)磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司 汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、柔紅霉素、丙卡巴肼、絲裂霉素、 阿糖胞苷、依托泊苷、曱氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、長春堿、長春新堿、 博來霉素、紫杉醇(商品名泰素(taxol))、多西他賽(商品名泰索帝 (Taxotere))、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉑、克拉曲濱、 達(dá)卡巴溱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、干擾素a、亮
丙立德、magastrol、美法侖、巰基嘌呤、奧沙利鉑(oxaloplatin)、普 卡霉素、米托坦、培門冬酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普卡霉素、鏈 佐星、他莫昔芬、替尼泊苷、睪內(nèi)酯、硫鳥嘌呤、塞替派、烏拉莫 司汀、長春瑞濱、苯丁酸氮芥、紫杉醇和它們的組合。 本發(fā)明的抑制劑也可與放療聯(lián)用。放射源可以來自待 治療患者外部或內(nèi)部。當(dāng)來源是患者外部，該療法就稱為外部束放 射療法(EBRT)。當(dāng)來源是患者內(nèi)部，該療法就稱為近距離放射治療 (brachytherapy, BT)。 按照眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和供該目的而生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)設(shè) 備(例如AECL Theratron和Varian Clinac)給予放療。輻射劑量取決于 本領(lǐng)域眾所周知的諸多因素。這些因素包括待治療的器官、在輻射 途徑中可能因疏忽而受到不利影響的健康器官、患者對放射療法的 耐受性和需要治療的身體部位。劑量通常介于l-100Gy,更特別介于 2-80Gy。已經(jīng)報道的一些劑量包括35Gy (對于脊髓)、15Gy (對于腎 臟)、20Gy (對于肝臟)和65-80Gy (對于前列腺)。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的
是，本發(fā)明不限于任何具體劑量。劑量將由主治醫(yī)師根據(jù)既定情況 下的具體因素(包括上述因素)來確定。 外部放射源和患者進(jìn)入點(diǎn)之間的距離可以是代表殺傷 靶細(xì)胞與最小副作用之間可接受的平衡的任何距離。通常外部放射 源與患者進(jìn)入點(diǎn)之間的距離介于70-100cm。 通常在患者體內(nèi)放置放射源，進(jìn)行近距離放射治療。 通常放射源放置在離待治療組織約0-3cm遠(yuǎn)處。已知技術(shù)包括間質(zhì)、 空腔和表面近距離放射治療。放射性種子形小管可以永久性或暫時 性植入。已用于永久性植入的一些典型的放射性原子包括碘-125和 氡。已用于暫時性植入的一些典型的放射性原子包括鐳、銫-137和 銥-192。已經(jīng)用于近距離放射治療的一些放射性原子包括镅-241和金 -198。用于近距離放射治療的輻射劑量可以與上述外部束放
射治療所用的劑量相同。確定外部束放射治療的因素除了上述因素 之外，還要考慮放射性原子的性質(zhì)，以確定近距離放射治療劑量。 本發(fā)明具體優(yōu)選的實(shí)施方案包括其與輔助治療方案聯(lián) 合使用。具體地講，這包括化療以及在手術(shù)之前和/或手術(shù)之后、以 及在整個常規(guī)輔助化療療程期間使用其它抗VEGFR1和/或VLA-4的
單克隆抗體，或者用基本化療(沒有輔助)療程(沒有手術(shù))。另外，本 發(fā)明也可用于在基本手術(shù)之后、對沒有接受其它治療的患者進(jìn)行治 療(即這些患者進(jìn)行了基本的完全切除，沒有證據(jù)表明殘余疾病或一 段時間過后才會出現(xiàn)的疾病)，以預(yù)防轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。此外，本發(fā)明可用 作診斷工具，并確定患者是否處于轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的最高危險中。 本發(fā)明的另 一方面涉及預(yù)防癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的方 法。該方法包括在有效預(yù)防癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，給予癌
癥患者血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞抑制劑。本發(fā)明的該
方面包括使用與如上所述的基本相同的治療藥和治療方式。為了實(shí)施本發(fā)明的該方面，抑制劑預(yù)防或減少血管內(nèi)
皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞的形成或增殖。這類抑制劑也可預(yù)
防所述細(xì)胞遷移或腫瘤在其它部位的形成或增殖。本發(fā)明的另 一 方面涉及用于抑制癌癥患者腫瘤形成或
預(yù)防癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的候選化合物的鑒定方法。該方法包括提供
試驗化合物，將試驗化合物與血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì) 胞一起孵育。鑒定能結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的 試驗化合物，作為用于抑制癌癥患者腫瘤形成或預(yù)防癌癥患者腫瘤 轉(zhuǎn)移的候選化合物。本發(fā)明的另 一 方面涉及監(jiān)測癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的方
法。該方法包括評價患者樣品的血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生 細(xì)胞水平，并將血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的所測水平 與血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的其它水平進(jìn)行比較。這 樣的其它水平可以是患者先前的水平，其中如果血管內(nèi)皮生長因子
受體r骨髓衍生細(xì)胞水平增加，則表明未來會有胂瘤轉(zhuǎn)移。或者， 其它水平可以是標(biāo)準(zhǔn)或正常水平，其中所測水平高于正?；驑?biāo)準(zhǔn)時， 則表明有腫瘤轉(zhuǎn)移。 為了實(shí)施本發(fā)明的該方面，患者樣品可以是組織樣品 或血液樣品。尤其希望通過給予治療藥，并根據(jù)血管內(nèi)皮生長因子
受體r骨髓衍生細(xì)胞的現(xiàn)有水平與血管內(nèi)皮生長因子受體i+骨髓衍 生細(xì)胞的先驗水平進(jìn)行比較的步驟，來實(shí)施本發(fā)明的該方面。這樣 的給藥包括如上所述的輔助治療方案?；蛘撸委熕幙梢允腔熕?， 根據(jù)血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的現(xiàn)有水平與血管內(nèi)皮 生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的先驗水平進(jìn)行比較，來選擇所述化 療藥的規(guī)格。 該方法可以在體外或體內(nèi)實(shí)施。對于本發(fā)明的體內(nèi)方 面，評價和比較步驟包括對癌癥患者的某一部位進(jìn)行造影。采用對 血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞具有特異性的標(biāo)記物或標(biāo)記 的血管內(nèi)皮生長因子受體l+骨髓衍生細(xì)胞，將其中任一種導(dǎo)入癌癥 患者體內(nèi)，可以完成該方法。 本發(fā)明的又 一 方面涉及抑制患者的遠(yuǎn)離腫瘤原先形成 部位的部位纖連蛋白表達(dá)的方法。該方法包括在有效抑制患者的 遠(yuǎn)離腫瘤原先形成部位的部位纖連蛋白表達(dá)的條件下，給予患者血 管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞抑制劑。本發(fā)明的該方面包括 使用與如上所述的基本相同的治療藥和治療方式。
實(shí)施例
實(shí)施例1 -骨髓bm移植 對野生型C57B1/6小鼠進(jìn)行致死性輻射(950拉德)，然 后移植1 x 106 (5-半乳糖苷酶+或GFP+ BM細(xì)胞(Rosa-26小鼠)(Lyden 等,"Impaired Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and
Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨髓衍生的內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的募集減少能阻斷腫瘤血管生成 和生長),"A^.MW. 7:1194-1201 (2001)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合 到本文中)。4周后，給小鼠皮內(nèi)注射2x106 LLC (ATCC)或B-16細(xì) 胞(ATCC)。
實(shí)施例2-P-半乳糖苷酶染色 組織和股骨在4。/o低聚曱醛(PFA)中固定4小時。樣品
在X-gal溶液中在37。C染色36小時，參見Tam等，"The Allocation of
Epiblast Cells to the Embryonic Heart and other Mesodermal Lineages: The Role of Ingression and Tissue Movement during Gastrulation (上胚
層細(xì)胞定位于胚心和其它中胚層譜系原腸胚形成期間內(nèi)移和組織 運(yùn)動的作用),"Dev卻畫t 124:1631-1642 (1999)，所述文獻(xiàn)通過引 用全部結(jié)合到本文中。X-gal染色的腫瘤和BM按照以下文獻(xiàn)所述進(jìn) 行包埋Lyden等,"Impaired Recruitment of Bone-marrow-derived Endothelial and Hematopoietic Precursor Cells Blocks Tumor Angiogenesis and Growth (骨髓衍生的內(nèi)皮細(xì)胞和造血祖細(xì)胞的募集 減少能阻斷肺瘤血管生成和生長),"M^.MW. 7:1194-1201 (2001),所 述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
實(shí)施例3 -熒光腫瘤轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前24小時，接種B16和LLC細(xì)胞(2 x 105)。然 后沉淀細(xì)胞并重懸于含有DsRed報道基因或GFP基因的慢病毒載體 上清液的無血清培養(yǎng)基中。如前所述，效價為l-2x 10s感染顆粒/ml 的濃縮病毒構(gòu)建體用于感染2xlOS細(xì)胞/lml (感染復(fù)數(shù)為50)。進(jìn)行 流式細(xì)胞術(shù)分析，證實(shí)熒光強(qiáng)度。給C57B1/6小鼠接種2xl06 LLC/GFP+或B16/DsRed+細(xì)胞。
實(shí)施例4-免疫組織化學(xué) 按照先前所述的文獻(xiàn)，固定組織并包埋在OCT中或石 蠟塊中Lyden等，"Idl and Id3 are Required for Neurogenesis, Angiogenesis and Vascularization of Tumor Xenografts (Idl和Id3是月中 瘤異種移植物神經(jīng)發(fā)生、血管發(fā)生和血管形成所必需的),"A^wm. 401:670-677 (1999),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。對于所 有抗原來說，可使用以下抗體VEGFRl (Flt-1,克隆mF-l, ImClone Systems, New York, New York和Flt-1克隆C-17, Santa Cruz Biotechnology)、 CD31 (PEC扁，SC-1506, Santa Cruz Biotechnology), VEGFR2 (Flk-l/KDR, dclOl, ImClone Systems), MMP-9 (D19557, Oncogene)、 Id3 (C-20， Santa Cruz Biotechnology),纖連蛋白(TV國l, Chemicon)、 CDllb (CBRMl/5, eBioScience)、 CD34 (RAM34, BD Pharmigen)、 ckit (ACK2， eBioScience) 、 PDGFRa (CD49d, VL-4, PS—2, Southern Biotech)、 aV (Chemicon)、 CD133 (13A4, eBioScience)、 a4 (CD49d, VLA-4, PS—2, Southern Biotech) 、 a5 (CD49e, 5H10畫27)、 a6 (CD49f, GoH3， BD Pharmingen)、(M (9EG7， BD Pharmingen)、p2 (M18/2, BD Pharmingen)、 (34 (Santa Cruz Biotechnology) 、 (37 (M293, BD Pharmingen)、 SDF畫1 (79018.111， R+D systems)、 CXCR4 (2B11, BD Pharmingen)。
實(shí)施例5-雙重免疫熒光 在OCT中將組織切片，然后用丙酮固定。用0.1% BSA/PBS洗滌，非特異性抗體用抗生物素蛋白和生物素(Vector Laboratories)封閉。將第一基本抗體(如上所述)在4'C孵育過夜。種屬 特異性生物素化笫二抗體(Vectastain ABC Kit, Vector)在室溫下孵育 30分鐘。然后將得克薩斯紅抗生物素蛋白D或熒光素抗生物素蛋白 D (Vector)孵育30分鐘。對笫二基本抗體重復(fù)該步驟。將切片浸入含 有DAPI的熒光封固介質(zhì)(Vectashield, Vector)中，如上所述進(jìn)行觀察。 實(shí)施例6-選擇性骨髓移植 在第0、 4和8天，Rosa-26小鼠接受腺病毒-VEGF^ (AdVEGF) (Avecilla 等，"Chemokine-mediated Interaction of Hematopoietic Progenitors with the Bone Marrow Vascular Niche is Required for Thrombopoiesis (趨化因子介導(dǎo)的造血祖細(xì)胞與骨髓血管 生態(tài)位的相互作用，是血小板生成所必需的),"A^. 10:64-71 (2004)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。在第12天，分離BM 并用生物素化鼠VEGFR1抗體和抗生物素磁珠(Miltenyi Biotec)進(jìn)行 標(biāo)記，用MACS (Miltenyi Biotec)分離。在3個連續(xù)步驟后， VEGFR1+BM的純度為95%。負(fù)選擇群體代表非Rl細(xì)胞(Hattori等， "Placental Growth Factor Reconstitutes Hematopoiesis by Recruiting VEGFRl(+) Stem Cells from Bone-marrow Microenvironment (月臺盤生長 因子通過從骨髓孩史環(huán)境募集VEGFRl(+)干細(xì)胞而重建血細(xì)胞生成)," Ato. Afed 8:841-9 (2002),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。如 上所述，對WT小鼠進(jìn)行輻射并移植選擇性BM。每3天一次經(jīng)靜脈 內(nèi)注射105細(xì)胞，給Id3 KO (Idl7+Id3一)小鼠移植選擇性Id3活性 VEGFR1+BM,共23天。對照動物接受VEGFRl+細(xì)胞，沒有腫瘤。
實(shí)施例7-抗體打靶 給WT小鼠接種2 x 107 LLC細(xì)胞或B-16細(xì)胞。為了 封閉VEGFR-1，給小鼠腹膜內(nèi)注射抗VEGFR1的大鼠抗小鼠抗體 (mf-l, IgGl， 400|ug, ImClone)或抗VEGFR2的大鼠抗小鼠抗體(DC101, IgGl, 800|ig, ImClone)或組合，在第7-22天內(nèi)每48小時一次，在第 24天處死小鼠。為了封閉VLA-4的a4亞基，在第4、 8和12天， 給小鼠靜脈內(nèi)注射抗CD49d的大鼠抗小鼠抗體(克隆R1-2, IgG2bK, 200fxg, BD Biosciences Pharmingen)。在笫14天處死動物，評價蔟的 形成。為了在腫瘤發(fā)育后期靶向轉(zhuǎn)移，在第6、 10、 14、 18和22天 注射抗ot4抗體，在笫24天處死動物。所有組都與大鼠抗小鼠IgG2aK
同種型對照(KLH/G2al-1， Southern Biotech)進(jìn)行比較，該對照是按照 與實(shí)驗組相同的時間表來給藥的。
實(shí)施例8 - MMP-9 KO 得自Jackson Laboratory的小鼠具有C57BL6背景。
實(shí)施例9-體外聚集測定 在笫14天，從植入B16細(xì)胞的小鼠分離出BM衍生的 VEGFRl+細(xì)胞。對Rl+細(xì)胞(5 x 105)進(jìn)行焚光紅(PKH26-GL, Sigma, St. Louis, MO)染色，并培養(yǎng)在含0.2%明膠的M199培養(yǎng)基(補(bǔ)充10% FCS) 中，與rhVEGF (10 ng/mL, R&D Systems)、抗VEGFR1 (10嗎/ml， mf-1, ImClone)或抗a4 (CD49, PS_2, 20)ug/ml, Southern Biotec)—起孵育14 小時。同樣，將VEGFRl+細(xì)胞與rhVEGF、抗VEGFR1、抗a4 —起 孵育1小時，然后與腫瘤細(xì)胞一起孵育14小時，進(jìn)行研究。將R1+ 細(xì)胞與B-16腫瘤細(xì)胞或LLC腫瘤細(xì)胞、標(biāo)記的熒光綠(PKH2-GL, Sigma)共培養(yǎng)(Lee等，"In Situ Labeling of Adherent Cells with PKH26 (貼壁細(xì)月包與PKH26的原位標(biāo)記),"/" FzYra Ce〃. Dev.說o/,Jm'ma/. 36:4-6 (2000)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)，分析聚集和增 殖。
實(shí)施例10-條件培養(yǎng)基研究 按照以下文獻(xiàn)，從在B-16細(xì)胞或LLC細(xì)胞上培養(yǎng)18 小時的無血清培養(yǎng)基中過濾出條件培養(yǎng)基(0.22)i): Kessinger等,
"Circulating Factors may be Responsible for Murine Strain-specific Responses to Mobilizing Cytokines (循環(huán)因子負(fù)責(zé)針對游動細(xì)胞因子的 鼠品系特異性反應(yīng))，"Ex/ , /femato/ogy. 29:7"-778 (2001),所述文獻(xiàn) 通過引用全部結(jié)合到本文中)。如上所述，每天將CM (300|11)經(jīng)腹膜 內(nèi)注射給4周前已經(jīng)接受Rosa-26 BMT的WT小鼠，共注射9天。
對組織的纖連蛋白(TV-l, Chemicon)和(3-gal進(jìn)行染色。對于胂瘤改道 研究，腹膜內(nèi)注射黑素瘤CM (300pl)或PIGF (300jxl, Peprotec), 2天 后皮內(nèi)植入LLC細(xì)胞，再每日繼續(xù)注射21天。給予有或無胂瘤的對 比對照組無血清培養(yǎng)基。為了抑制胂瘤改道，按照抗體打靶研究所 述，將抗VEGFR1抗體注射給具有LLC腫瘤接受MCM的實(shí)驗組。 第22天檢查組織。如上所述，有或無腫瘤的以上對比對照組用或不 用抗體進(jìn)行治療。 每天給WT動物注射黑素瘤條件培養(yǎng)基(300jLiL),共7 天，然后尾靜脈注射B16黑素瘤腫瘤細(xì)胞。將MCM或無血清RPMI 給予小鼠，然后每天注射B16，直到它們在給予靜脈內(nèi)腫瘤后24小 時或4天#1處死。用PBS灌注肺部，然后冷凍包埋在OCT內(nèi)。
實(shí)施例11 -遷移測定 接下來研究了 VEGFR1細(xì)胞響應(yīng)條件培養(yǎng)基的遷移。 如上所述分離出VEGFR1細(xì)胞，將懸浮于無血清培養(yǎng)基中的lx105 細(xì)胞放入5)tim pore transwells (Costar, Corning Incorpomted)的上室。 讓細(xì)胞在條件培養(yǎng)基或相應(yīng)對照培養(yǎng)基中遷移18小時，每6小時將 細(xì)胞從膜下和下室中刮下并搗碎，并用血球計數(shù)器和錐蟲藍(lán)對細(xì)胞 計數(shù)進(jìn)行分析。如先前所述，用12|tim pore transwells進(jìn)行B16腫瘤 細(xì)胞或LLC腫瘤細(xì)胞向VEGFR1+細(xì)胞的遷移(Redmond等，
"Endothelial Cells Inhibit Flow-induced Smooth Muscle Cell Migration: Role of Plasminogen Activator Inhibitor-1 (內(nèi)皮細(xì)胞才卬制流動i秀導(dǎo)的平 滑肌細(xì)胞遷移纖溶酶原激活物抑制劑-1的作用),"C/rcw/a^w 103:597-603 (2001)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。將焚光 標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞(PKH2-GL, Sigma)以1 x 105細(xì)胞接種在上室中，將1
xlO5 VEGFR1細(xì)胞接種在下室的無血清培養(yǎng)基中。上下室沒有濃度 梯度。每6小時進(jìn)行一次分析，用倒置熒光顯耀:鏡(Nikon Eclipse TE 2000-U)進(jìn)行直接觀察和手工統(tǒng)計每200x視野下的細(xì)胞數(shù)目。
實(shí)施例12 -多種組織中纖連蛋白的定量PCR分析 如前所述，用組織勻漿器在TriZol中將肺組織勻漿， 抽提RNA (Hashimoto等，"Bone Marrow-derived Progenitor Cells in Pulmonary Fibrosis (肺纖維化中的骨髓衍生祖細(xì)胞)."77^ Jowma/ o/ C//wc"http://m^對/g加朋113:243-252 (2004),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié) 合到本文中)。如前所述，用TaqMan基因表達(dá)測定(Applied Biosystems) 定量測定纖連蛋白基因表達(dá)，并歸一化至GAPDH (Jensen等，"The Human Herpes Virus 8-encoded Chemokine Receptor is Required for Angioproliferation in a Murine Model of Kaposi's Sarcoma (人皰滲病毒
8編碼的趨化因子受體是卡波西肉瘤鼠模型中血管增殖所必需的)," Jowma/ q/7附mw"o/ogy 174:3686-94 (2005)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié) 合到本文中)。
實(shí)施例13-趨化因子測定 按照各制造商使用說明書，用ELISA (Quantikine, R&D Systems)分析條件培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基以及腫瘤衍生血漿的VEGF 和P1GF濃度。胂瘤衍生血漿得自LLC腫瘤細(xì)胞或B16腫瘤細(xì)胞后 第14天的小鼠。
實(shí)施例14 -流式細(xì)胞術(shù)研究 按照以下文獻(xiàn)，將外周血單核細(xì)胞與熒光綴合的單克 隆抗體CDllb (Ml/70, PE抗小鼠，BD Pharmingen)、 Sca-1 (E13-161.7, PE和FITC抗小鼠Ly-6A/E, Becton Dickinson)和VEGFRl (克隆mf國 1, FITC, ImClone Systems)—起醉育Gill等，"Vascular Trauma Induces Rapid But Transient Mobilization of VEGFR2+AC133+ Endothelial Precursor Cells (血管創(chuàng)傷誘導(dǎo)VEGFR2+AC133+內(nèi)皮祖細(xì)胞的快速而 瞬時動員)，"Orw/加ow We; earc/2 88:167-174 (2001)，所述文獻(xiàn)通過 引用全部結(jié)合到本文中。如前所述，在用PBS通過右心室注射對肺
進(jìn)行灌注后，對整個右肺也進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)，再將肺切成小塊，用
lOOpm和40fim濾器(BD BioSciences)過濾，形成單細(xì)胞懸液。得到 單細(xì)胞懸液之后，對于cKit流式分析，將細(xì)胞用perCP cKit直接染 色，無需固定，再放入PBS中，在Coulter FC500細(xì)胞計數(shù)器上進(jìn)行 分析。
實(shí)施例15-人體標(biāo)本 人體標(biāo)本包括腫瘤、近端正常(胂瘤邊界之外)、遠(yuǎn)端正 常和淋巴結(jié)。如上所述,將組織包埋在石蠟中，冷凍固定，用抗VEGFR1 (FB5, ImClone Systems)和Flt-l (Calbiochem)的抗體染色。按照已批準(zhǔn) IRB申請獲取和處理組織樣品。
實(shí)施例16 -定量免疫組織化學(xué)分析 利用IP Lab和Adobe Photoshop 7.0,隨機(jī)得到100x視 野，通過選擇標(biāo)準(zhǔn)顏色范圍分析(3-gal或免疫組織化學(xué)染色。 一旦描 繪該邊界，就可求出pixilation直方圖下面積，將總?cè)旧娣e與總組 織面積進(jìn)行比灃交。
實(shí)施例17 -統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果用平均值士標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。采用學(xué)生檢驗分析數(shù) 據(jù)，用GmphPad Prism統(tǒng)計學(xué)程序進(jìn)行方差分析。P值O.05為顯著。 誤差條(Error bar)描述了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。 申請人:分析了在皮內(nèi)原發(fā)性胂瘤注射后(3-半乳糖苷酶+ (P-gar)骨髓(BM)衍生細(xì)胞的命運(yùn)。采用Lewis肺癌(LLC)腫瘤細(xì)胞(其 通常轉(zhuǎn)移至肺部，很少轉(zhuǎn)移至肝臟)，或B16黑素瘤腫瘤細(xì)胞(其具有 更廣泛的播散性轉(zhuǎn)移潛力)。在皮內(nèi)注射各腫瘤類型之后，將肺、肝、 脾、腎和性腺切片并染色，用于觀察(3-gar BM細(xì)胞是否存在，或者 篩選GFP+BM細(xì)胞。輻射后但在腫瘤植入前，在小鼠肺部極少或未
見P國gar (0.01%±0.01 (3誦gal染色/100x視野)或GFP+ BM衍生細(xì)胞(圖 1A&1B左圖)。到腫瘤植入后笫14天、腫瘤細(xì)胞到達(dá)之前，在終末 細(xì)支氣管和遠(yuǎn)端肺泡附近檢測到P-gar (3.2%±1.2 (3-gal染色/100x視 野，經(jīng)學(xué)生氏t檢驗，口<0.05)或0 + BM衍生細(xì)胞的外滲和簇形成， 終末細(xì)支氣管和遠(yuǎn)端肺泡都是未來轉(zhuǎn)移的常見部位(圖1A&1B,左中 圖&插圖)。到第16天，P-gal+簇(包含20-100個具有組織化的基質(zhì)元 件的細(xì)胞)顯示出未來轉(zhuǎn)移性病灶的外廓(圖1A，右中圖)。在第18 天可見各個紅色熒光腫瘤細(xì)胞，與先前存在的BM衍生簇相結(jié)合(圖 1B,右中圖)，到第23天發(fā)展成微小轉(zhuǎn)移(圖1A&1B,右圖)。甚至 在已確定腫瘤轉(zhuǎn)移時仍保持p-gal+BM細(xì)胞的存在(圖1A,右圖插圖)。
實(shí)施例18-骨髓衍生細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散前到達(dá) 為了進(jìn)一步確定胂瘤細(xì)胞到達(dá)的時間，進(jìn)行流式細(xì)胞 術(shù)研究，以確定GFP+骨髓衍生細(xì)胞和紅色熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的存 在。在第8天之前，肺部可見最小GFP+ BM衍生細(xì)胞(圖1C左圖& 表格)。自第12天開始，BM衍生細(xì)胞開始遷移到肺部，這與經(jīng)顯耀: 鏡觀察到的BM衍生簇是一致的(圖1C)。這些細(xì)胞數(shù)增加，在第18 天與腫瘤細(xì)胞結(jié)合(圖1C)。在16天之前，經(jīng)顯樹:鏡或流式細(xì)胞術(shù)都 未檢出肺部的腫瘤細(xì)胞。隨時間延長，通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定出肺部 腫瘤細(xì)胞的數(shù)量增加，與顯微照片圖像中可見的已建立的骨髓衍生 蔟部位的腫瘤細(xì)胞粘附和增殖是相互對應(yīng)的(圖1B&1C)。檢出腫瘤 細(xì)胞與GFP+ BM衍生簇的共成簇頻率大于95%(97%±1.1，圖1B, 右圖)。盡管用該方法可能會漏失少量腫瘤細(xì)胞，但是給予來自培養(yǎng) 的B16黑素瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基的小鼠，進(jìn)一步實(shí)驗表明，條件培 養(yǎng)基單用可引起骨髓衍生細(xì)胞的動員和轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成。采用 尾靜脈胂瘤轉(zhuǎn)移模型，用條件培養(yǎng)基刺激后引入腫瘤細(xì)胞(圖1D)與 單用培養(yǎng)基進(jìn)行比較(圖1D),在注射后1天，增加了肺部腫瘤細(xì)胞 數(shù)(圖1D, 141.3士10.2腫瘤細(xì)胞，對比2.7土0.6腫瘤細(xì)胞/肺橫切片，經(jīng)
學(xué)生氏t檢驗，p<0.01)。靜脈內(nèi)腫瘤細(xì)胞注射4天后，肺部轉(zhuǎn)移小結(jié) 的頻率和大小增加(207腫瘤細(xì)胞±5.6/肺橫切片，對比14腫瘤細(xì)胞±1.7/ 肺橫切片，經(jīng)學(xué)生氏t檢驗，p<0.01)。紅色熒光腫瘤細(xì)胞針對GFP+ 簇的共定位分析是在各時間點(diǎn)都大于93%,表明這些BM衍生細(xì)胞 有助于腫瘤細(xì)胞粘附和增殖。因此，在原發(fā)性胂瘤所釋放因子的影 響下，BM衍生細(xì)胞進(jìn)入血流并運(yùn)動到遠(yuǎn)端特異性轉(zhuǎn)移前部位。
實(shí)施例19 - BM衍生細(xì)胞蔟位點(diǎn)是腫瘤類型特異性的 檢查了腫瘤細(xì)胞類型是否決定BM簇在機(jī)體內(nèi)特異性 轉(zhuǎn)移前部位的分布(圖1E)。皮內(nèi)注射LLC腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致BM簇的 形成僅限于肺部(47.5土2.6/100x視野)和肝(10.8士U)，而在睪丸、脾 或腎未見簇，這是因為該類腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特異性。相比之下，B16 黑素瘤腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致多器官形成BM簇，例如肺(103.8士6.9)、肝(41.8 ±2.4)、睪丸(36.6士3.1)、脾(25±3.2)和腎(20.6±1.8)，對應(yīng)于該腫瘤 轉(zhuǎn)移的常見器官(圖1E)。此外，與B16黑素瘤細(xì)胞更具攻擊性轉(zhuǎn)移 特性一致的是，它們誘導(dǎo)比LLC腫瘤細(xì)胞明顯更多的簇(經(jīng)學(xué)生氏t 檢驗，pO.Ol)。
實(shí)施例20國這些BM衍生細(xì)胞的表征表明itifiL祖細(xì)胞的狀況 接下來表征了 BM衍生簇的細(xì)胞組成。腫瘤細(xì)胞類型 所誘導(dǎo)的簇表達(dá)VEGFR1 (圖1F, 3.9±0.2,高于野生型)。在單用輻 射之后，肺實(shí)質(zhì)中GFP+ BM衍生簇共表達(dá)VEGFR1 (圖1F),相比之 下，VEGFR1只有極少表達(dá)(圖1F)。對這些細(xì)胞簇進(jìn)一步表征，顯 示大多數(shù)BM衍生細(xì)胞是VEGFR1+共表達(dá)CD133 (圖1G)、 CD34 (圖 1G)和CD117 (cKit)(圖1G&圖1H)，這表明這些細(xì)胞亞類來源于原 始造血細(xì)胞。BM衍生簇也顯示出一定程度的成熟異質(zhì)性，因為某些 細(xì)胞上存在骨髓單核細(xì)胞標(biāo)記CDllb。原發(fā)性腫瘤植入后，對肺部 祖細(xì)胞進(jìn)行分析，概括了先前研究的時間進(jìn)程。正如流式細(xì)胞術(shù)所
見，CD117+細(xì)胞先于GFP標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞到達(dá)肺部(圖1H)。早期 VEGFR1+BM蔟缺乏VEGFR2 (圖5A)和CD31的表達(dá)(圖5A)。進(jìn)一 步的動力學(xué)研究表明，VEGFR2+ CEP遷移到BM衍生簇，與腫瘤細(xì) 胞的到達(dá)是一致的(圖5B)。完全形成的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位含有骨髓衍生 的VEGFR2+內(nèi)皮祖細(xì)胞(圖5)。這些發(fā)現(xiàn)確定，BM衍生的VEGFRr 造血細(xì)胞促使和維持轉(zhuǎn)移前生態(tài)位，并提供允許的微環(huán)境，以促使 和維持肺瘤轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例21 -在自發(fā)腫瘤模型中出現(xiàn)BM衍生簇 將植入肺瘤的發(fā)現(xiàn)與用自發(fā)腫瘤模型的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行比 較。選擇過量表達(dá)c-Myc的轉(zhuǎn)基因小鼠，用于其早期發(fā)作和高侵襲 性腫瘤擴(kuò)散到淋巴系統(tǒng)。在生命的笫40天，在腫瘤發(fā)作之前，在淋 巴結(jié)中明顯檢出VEGFRl+簇(145.1士16.4簇/100x視野，圖II,中圖 和插圖)，相比之下，野生型同窩出生幼仔可見缺乏蔟(0.4 ± 0.3簇/100x 視野，圖II,左圖，經(jīng)學(xué)生氏t檢驗，pO.OOl)。在肺和肝等其它器 官中未見這些簇。到生命的第4個月，VEGFRl+簇持續(xù)擴(kuò)散到已建 立的淋巴瘤中，但比轉(zhuǎn)移前狀態(tài)的程度更小(c-Myc小鼠中為67.8 ±9.5 簇/100x視野，對比同窩出生幼仔中為0.7±0.5簇/100x視野，圖II， 右圖和插圖，經(jīng)學(xué)生氏t檢驗，pO.OOl)。顯然，VEGFRl+細(xì)胞簇周 圍的淋巴瘤細(xì)胞并不表達(dá)VEGFR1 (圖II,右圖插圖)。
實(shí)施例22-人體組織中的常見轉(zhuǎn)移部位出現(xiàn)BM衍生細(xì)胞簇為了證實(shí)在小鼠模型中得到的數(shù)據(jù)說明VEGFRl+細(xì)胞
簇的腫瘤特異性形成，分析來自原發(fā)性實(shí)體瘤患者的人體組織。在 人原發(fā)性胂瘤和胂瘤轉(zhuǎn)移組織中都可見VEGFRl+簇(圖6A;乳癌-腋 窩淋巴結(jié)，圖6C;肺癌，圖6E;食道癌)。胂瘤擴(kuò)散之前，在轉(zhuǎn)移 常見部位細(xì)胞簇增加，說明該組織的惡性化潛力(圖6,簇/100x視野 圖6B;腋窩淋巴結(jié)21士5，圖6D;肺19±4,圖6F; GE連接25 ±4)。得自沒有惡性腫瘤的患者的正常人淋巴結(jié)和肺組織不顯示形成 VEGFRl+蔟(圖6B， 6D插圖)。
實(shí)施例23 -靶向選擇性BM群體，揭示腫瘤轉(zhuǎn)移中VEGFRl+細(xì)胞 的功能作用 通過將純化VEGFR1+BM細(xì)胞選擇性移植給受過輻射 的小鼠，評價這些祖細(xì)胞促進(jìn)轉(zhuǎn)移前簇的潛力。在LLC植入后24天， 移植完整BM的對照小鼠(WT)顯示出明顯的肺轉(zhuǎn)移(圖2A,左圖)， 與良好建立的血管相關(guān)(圖2A，左圖插圖)。然而，移植純化 VEGFR1+BM群體的小鼠在肺部形成多個由少量肺瘤細(xì)胞組成的微小 轉(zhuǎn)移(圖2A,中圖箭頭&表格，25±9微小轉(zhuǎn)移/100x視野)并具有異 常血管系統(tǒng)(圖2A，中圖插圖)。該結(jié)果表明，VEGFR1+HPC能夠促 進(jìn)轉(zhuǎn)移前簇，其可吸引腫瘤細(xì)胞，形成纟斂小轉(zhuǎn)移。相比之下，VEGFR1 + 細(xì)胞的BM耗盡，就不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)移前簇(圖2A右圖&表格，經(jīng)單側(cè) ANOVA， p<0.01)。 為了確定破壞VEGFRl+細(xì)胞簇是否能阻斷良好建立的 腫瘤的轉(zhuǎn)移，接種LLC或B16腫瘤的小鼠用特異性抗鼠VEGFR1、 VEGFR2或這兩者的單克隆抗體進(jìn)行治療。該方法允許選擇性把向 VEGFR1+HPC,因為這些腫瘤細(xì)胞不表達(dá)VEGFR1或VEGFR2。在 第24天，對兩種腫瘤類型來說，廣泛擴(kuò)散的轉(zhuǎn)移都是明顯的，正如 在具有LLC的動物肺部所見(圖2B，左圖&表^^或在具有B16黑素 瘤的動物脾臟所見(圖2B右圖和插圖)。單用抗VEGFR1抗體治療消 除了對簇的引發(fā)作用并預(yù)防轉(zhuǎn)移(圖2B&表格，經(jīng)單側(cè)ANOVA， p<0.01),而抗VEGFR2抗體不改變VEGFRl+簇的形成，但能預(yù)防孩i 小轉(zhuǎn)移的發(fā)展(15士11微小轉(zhuǎn)移/簇/100x)(圖2B,插圖&表格)。兩種 抗體的組合能阻斷簇的建立，與抗VEGFR1治療類似；然而，在一 只動物肺部觀察到分離的B16轉(zhuǎn)移性病灶(圖2B,插圖)?？偲饋碚f， 這些結(jié)果表明，靶向VEGFRl+細(xì)胞簇形成，可預(yù)防胂瘤細(xì)胞粘附、
增殖和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。
實(shí)施例24 - VLA4、 MMP-9和Id3參與轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成接下來研究了 HPC因其與轉(zhuǎn)移前微環(huán)境之間相互作
用，而從細(xì)胞蔟遷移的細(xì)胞機(jī)制和分子機(jī)制。整聯(lián)蛋白a4pi (VLA-4) 與其配體纖連蛋白的相互作用對骨髓基質(zhì)內(nèi)早期造血細(xì)胞的遷移是
必不可少的(Burger等，"CXCR4 Chemokine Receptors (CD184) and
ot4pl Integrins Mediate Spontaneous Migration of Human CD34+ Progenitors and Acute Myeloid Leukaemia Cells Beneath Marrow Stromal Cells (pseudoemperipolesis) (CXCR4趨化因子受體(CD184)和
a鄰l整聯(lián)蛋白介導(dǎo)人CD34+祖細(xì)胞和急性骨髓性白血病細(xì)胞下骨髓 基質(zhì)細(xì)胞的自發(fā)遷移(假伸入運(yùn)動)),"5n'to/ Jowma/ o/ //aemato/ogy 122:579-589 (2003)和Scott等，"Deletion of oc4 Integrins from Adult Hematopoietic Cells Reveals Roles in Homeostasis, Regeneration, and Homing (從成體造血細(xì)胞中缺失a4整聯(lián)蛋白，揭示了a4整聯(lián)蛋白在 體內(nèi)平衡、再生和歸巢中的作用),"Mo/ecM/ar a"<af Ce〃w/ar B/o/ogy 23:9349-9360 (2003),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)以及對循 環(huán)中成熟的白細(xì)胞的遷移也是必不可少的(Neeson等，"Lymphocyte-Facilitated Tumour Cell Adhesion to Endothelial Cells: The Role of High Affinity Leukocyte Integrins (淋巴細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞
上高親和性白細(xì)胞整聯(lián)蛋白的作用),"尸a^o/ogy 35:50-55 (2003) 和Jonjic等,"Molecules Involved in the Adhesion and Cytotoxicity of Activated Monocytes on Endothelial Cells (參與內(nèi)皮細(xì)月包上活4匕單才亥細(xì) 胞粘附和細(xì)胞毒性的分子),"T^Jow77a/o/7mww"o/ogv 148:2080-2083 (1992)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。因此，可以評價 VEGFRl+細(xì)胞是否也可表達(dá)整聯(lián)蛋白，因而促進(jìn)該細(xì)胞類型與轉(zhuǎn)移 前生態(tài)位的相互作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移前簇的VEGFR1+HPC表達(dá) VLA-4(圖3A和插圖，VEGFR1的共表達(dá))，但對av整聯(lián)蛋白卻是陰 性的。這表明這些細(xì)胞上VLA-4的表達(dá)允許BM衍生細(xì)胞粘附到轉(zhuǎn)
移前生態(tài)位上。簇形成后，在骨髓細(xì)胞及其相關(guān)基質(zhì)內(nèi)也是重要的
a4(37整聯(lián)蛋白以及a6(34在轉(zhuǎn)移生態(tài)位內(nèi)是明顯彌散性分布的。造血 細(xì)胞所產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶9 (MMP-9)等蛋白酶可通過釋放可溶性 Kit-配體和VEGF-A用于分解基底膜并改變局部微環(huán)境，以支持新引 入的細(xì)胞表達(dá)cKit (Hessig等,"Recruitment of Stem and Progenitor Cells
from the Bone Marrow Niche Requires MMP-9 Mediated Release of Kit-ligand (來自骨髓生態(tài)位的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的募集需要MMP-9介導(dǎo)的 Kit-配體的釋放),"CW/ 109:625-37 (2002)和Bergers等，"Matrix Metalloproteinase-9 Triggers the Angiogenic Switch During Carcinogenesis (在腫瘤發(fā)生期間，基質(zhì)金屬蛋白酶-9觸發(fā)血管生成開 關(guān)),"iWzf Ce〃說o/ 2:737-744 (2000),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到 本文中)。另外，因為纖連蛋白結(jié)合，通過oc鄰l信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可增加金屬 蛋白酶表達(dá)(Huhtala等，"Cooperative Signalling by alpha 5 beta 1 and alpha 4 beta 1 Intergrins Regulates Metalloproteinase Gene Expresson in Fibroblasts Adhering to Fibronectin (a5(31和a4(31整聯(lián)蛋白協(xié)同信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)，調(diào)節(jié)粘附于纖連蛋白的成纖維細(xì)胞中的金屬蛋白酶基因表達(dá))," Zowma/ o/ CW/ 129:867-879 (1995)和Yakubenko等，
"Differential Induction of Gelatinase B (MMP-9) and Gelatinase A (MMP-2) in T Lymphocytes Upon alpha(4)beta(l)-mediated Adhesion to VCAM畫l and the CS-l Peptide of Fibronectin (在a(4)p(l)介導(dǎo)的與 VCAM-l和CS-l纖連蛋白肽的粘附時，T淋巴細(xì)胞中的明膠酶B (MMP-9)和明膠酶A (MMP-2)的差異誘導(dǎo)),"Ce〃 i 仏260:3-84 (2000),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。在轉(zhuǎn)移前簇中可見 MMP-9的表達(dá)以及VLA-4分布，表明MMP-9的產(chǎn)生可能是在這些 VEGFR1+HPC中的整聯(lián)蛋白結(jié)合和活化的結(jié)果(圖3A)。這些發(fā)現(xiàn)與 Hiratsuka等先前的工作是一致的并擴(kuò)展了該工作，證明在轉(zhuǎn)移前肺 部VEGFR1介導(dǎo)的對MMP-9表達(dá)的誘導(dǎo)(Hiratsuka等，"MMP9 Induction by Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 is Involved in Lung-specific Metastasis (血管內(nèi)皮生長因子受體-1對MMP9的誘導(dǎo)，參與肺特異性轉(zhuǎn)移),"C朋cw Ce〃. 2:289-300 (2002)，所述文獻(xiàn)通
過引用全部結(jié)合到本文中)。 先前已經(jīng)知道，Id基因的上調(diào)對于原發(fā)性腫瘤生長的 祖細(xì)胞動員是至關(guān)重要的(Ruzinova等，"Effect of Angiogenesis Inhibition by Id Loss and the Contribution of Bone-marrow-derived Endothelial Cells in Spontaneous Murine Tumours (自發(fā)鼠腫瘤中,Id
缺失的血管生成抑制效應(yīng)和骨髓衍生內(nèi)皮細(xì)胞的貢獻(xiàn)),"C朋cw Ce〃. 4:277-289 (2003)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。與VLA-4 的分布一致，在簇內(nèi)也可見Id3的表達(dá)(圖3A和插圖，VEGFR1和Id3 的共表達(dá))。該結(jié)果表明，Id3上調(diào)可促進(jìn)VEGFRl+細(xì)胞向轉(zhuǎn)移前生 態(tài)位運(yùn)動。另外，特異性整聯(lián)蛋白的表達(dá)受到Id基因活化的調(diào)節(jié)， 并可負(fù)責(zé)BM衍生細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞相互作用、運(yùn)動性和募集(Ruzinova 等，"Effect of Angiogenesis Inhibition by Id Loss and the Contribution of Bone-marrow-derived Endothelial Cells in Spontaneous Murine Tumours (自發(fā)鼠腫瘤中，Id缺失的血管生成抑制效應(yīng)和骨髓衍生內(nèi)皮細(xì)胞的 貢獻(xiàn)),"Ca"ce廠Ce〃. 4:277-289 (2003)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合
到本文中)。 為了證實(shí)這些蛋白質(zhì)在已建立的轉(zhuǎn)移前生態(tài)位內(nèi)的功 能作用，在MMP-9和Id3敲除小鼠中抑制VLA-4的表達(dá)(用抗a4抗 體)或研究VEGFRl+細(xì)胞簇的形成。這些模型中的每一種都用腫瘤攻 擊，在腫瘤植入后3周，發(fā)現(xiàn)簇的形成減少(圖3)，轉(zhuǎn)移擴(kuò)散也減少。 與野生型對照相比(3,283 VEGFRl+CDllb+細(xì)胞/itU)，在響應(yīng)腫瘤接種 后，在Id突變型小鼠循環(huán)中的被動員的VEGFRl+細(xì)胞減少，說明HPC 動員減少(654 VEGFRl+CDllb+細(xì)胞/nl)(經(jīng)學(xué)生氏t檢驗，p<0.01， 圖9)。這證明先前在這些動物中所見到的原發(fā)性腫瘤生長減少，可 用于解釋它們的轉(zhuǎn)移性表型減少。 在Id3-Z-小鼠中，為了正式檢查野生型VEGFRl+細(xì)胞恢 復(fù)轉(zhuǎn)移缺陷的潛力，將W3活性GFP+ VEGFR1+HPC靜脈內(nèi)注射給帶 有LLC腫瘤的Id3 KO小鼠。在腫瘤植入后21天，單獨(dú)引入野生型 VEGFRl+細(xì)胞，重建簇形成和微小轉(zhuǎn)移(圖3B)。值得注意的是，LLC 轉(zhuǎn)移性病灶與預(yù)先設(shè)定的GFP+ BM衍生蔟相關(guān)(圖3B)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn) 一步強(qiáng)調(diào)了建立簇和轉(zhuǎn)移所需的VEGFR1+BM衍生細(xì)胞的功能作用。
實(shí)施例25 -組織實(shí)質(zhì)中纖連蛋白以VLA-4+ BM衍生細(xì)胞的趨觸性 配體的形式存在 在注射原發(fā)性胂瘤之后、81^衍生的￥1^-4+ VEGFR1+ 細(xì)胞歸巢之前，檢查組織實(shí)質(zhì)，以確定組織特異性配體的表達(dá)是否 可介導(dǎo)粘附和這些BM簇的形成。的確，通過免疫組織化學(xué)分析和 定量PCR,在LLC注射之后，隨時間延長，從第3-14天可見在肺部 的未來轉(zhuǎn)移生態(tài)位附近纖連蛋白表達(dá)增加，相比之下，在WT肺可 見基線纖連蛋白表達(dá)(圖3C和3E)。此外，響應(yīng)原發(fā)性腫瘤而增殖的 駐留成纖維細(xì)胞樣基質(zhì)細(xì)胞(圖3)可促進(jìn)局限性纖連蛋白。對于植入 B16的小鼠而言，可見肺部纖連蛋白表達(dá)與接種LLC的小鼠的分布 類似(圖3D)。此外，看來纖連蛋白在VEGFRl+簇中表達(dá)(圖3D)。在 暴露給黑素瘤條件培養(yǎng)基的多種組織(例如腸和輸卵管)中，纖連蛋白 表達(dá)明顯增加，這與B16腫瘤對這些部位的更具侵襲性的轉(zhuǎn)移特性 是一致的(經(jīng)單側(cè)ANOVA，對于來自給予MCM的小鼠輸卵管與LCM 處理的或WT組織進(jìn)行比較，對于笫3-5天的纖連蛋白表達(dá)，p<0.05, 對于第7-9天的纖連蛋白表達(dá)，pO.001;經(jīng)單側(cè)ANOVA,對于來 自給予MCM的小鼠腸組織與LCM處理的或WT組織進(jìn)行比較，對 于第7-9天的纖連蛋白表達(dá)，p<0.001，圖7A和7B)。
實(shí)施例26-VEGFRl+細(xì)胞促進(jìn)肺瘤細(xì)胞遷移、粘附和增殖 為了證實(shí)VEGFRl+祖細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的趨化性和附 著，分離來自植入腫瘤小鼠的VEGFRl+細(xì)胞，并進(jìn)行紅色熒光標(biāo)記 (PKH26-G1)(圖8)。在與綠色焚光標(biāo)記的(PKH2-GL) B16或LLC細(xì)
胞體外共孵育1小時中，造血祖細(xì)胞聚集并增殖(升高150%),促進(jìn) 腫瘤細(xì)胞的附著和增殖。相比之下，先前在抗VEGFR1或抗VLA-4 抗體存在下培養(yǎng)的VEGFR1+HPC阻斷該結(jié)合親和性和擴(kuò)增(圖8A)。 此外，進(jìn)行transwell遷移測定，其中與非VEGFR1細(xì)胞(11.2±0.4) 和單用培養(yǎng)基(9.9±0.9)相比，熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞運(yùn)動性增加，以 響應(yīng)骨髓衍生的VEGFRl+細(xì)胞(29.6士1.4胂瘤細(xì)胞/200x)(圖8B，經(jīng) 單側(cè)ANOVA, pO.OOl)。已知SDF-1/CXCR4軸在BM祖細(xì)胞歸巢 和保留在骨髓的某些生態(tài)位中起到突出作用(Ratajczak等，"Stem Cell
Plasticity Revisted: CXCR4-positive Cell Expressing mRNA for Early Muscle, Liver and Neural Cells 'Hide Out' in the Bone Marrow (干細(xì) 胞可塑性Revisted:在骨髓中，CXCR4陽性細(xì)胞表達(dá)mRNA,用于 早期肌肉、肝臟和神經(jīng)細(xì)胞"藏匿"),，，丄e由m/a. 18:29-40 (2004)， 所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。在許多生理過程中，類似于 來自骨髓的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的動員利用該軸，表達(dá)CXCR4的特 異性腫瘤細(xì)胞類型也以此方式遷移，以響應(yīng)局部趨化因子梯度(Lapidot 等,"Current Understanding of Stem Cell Mobilization: The Roles of Chemokines, Proteolytic Enzymes, Adhesion Molecules, Cytokines and Stromal Cells (目前對干細(xì)胞動員的理解趨化因子、蛋白水解酶、
粘附分子、細(xì)胞因子和基質(zhì)細(xì)胞的作用)"五義penwewto/ /fewato/ogy. 30:973-981 (2002), Balkwill, F.， "The Significance of Cancer Cell Expression of the Chemokine Receptor CXCR4 (癌細(xì)胞表達(dá)趨化因子受 體CXCR4的重要性),"Sew/wara ," Cawcer B/o/ogy. 14:171-179 (2004) 和Muller等,"Involvement of Chemokine Receptor in Breast Cancer Metastasis (趨化因子受體參與乳癌轉(zhuǎn)移)，"M^wre. 410:50-56 (2001), 所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。在完全形成的轉(zhuǎn)移前簇內(nèi)， 含有VEGFRl+細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和纖連蛋白(參見圖1A,左圖)，SDF-1 (CXCL12)被高表達(dá)(圖8C)。鑒定了 CXCR4以擴(kuò)散形式遍布于已建 立的原發(fā)性黑素瘤中，但對于LLC是在"活性"邊緣的局部區(qū)域(圖8D)。起源于轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的趨化因子梯度的存在，可用于吸引 CXCR4+腫瘤細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)表明，由腫瘤類型決定的纖連蛋白上調(diào)， 使VLA-4+ VEGFRl+造血簇能夠結(jié)合，是形成轉(zhuǎn)移前生態(tài)位所必需 的。另外，這些簇與腫瘤細(xì)胞之間通過VEGFR1和VLA-4和SDF-1 和CXCR4的表達(dá)相互作用，支持轉(zhuǎn)移前生態(tài)位發(fā)展成為轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例27 -腫瘤衍生的條件培養(yǎng)基有助于決定腫瘤轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的具體 模式 為了進(jìn)一步研究LLC細(xì)胞和B16細(xì)胞的選擇性轉(zhuǎn)移潛 力，從這兩類培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞中得到條件培養(yǎng)基。腹膜內(nèi)注射LLC 條件培養(yǎng)基(LCM),使得可能從駐留的成纖維細(xì)胞表達(dá)纖連蛋白并形 成BM衍生簇(圖4A)，與單用培養(yǎng)基相比(圖4),以類似方式，但比 原發(fā)性皮內(nèi)LLC更快。相當(dāng)于皮內(nèi)B16腫瘤效果，但是更快；黑素 瘤條件培養(yǎng)基(MCM)決定了肝臟中纖連蛋白表達(dá)比LCM更高(圖 4B)。與單用培養(yǎng)基相比(圖4B), MCM也引起成纖維細(xì)胞增殖和纖 連蛋白表達(dá)增加，同時在許多器官中形成簇，正如在腸中所見的一 樣(圖4B和圖7A和7B)。與帶有LLC的動物相比，在帶有B16腫 瘤的動物中，觀察到增加的簇(圖1)。假如MCM以比LCM更普遍 的方式促進(jìn)簇的形成，隨后研究生長因子的不同是否有助于解釋這 兩種條件培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)移潛力和特性(圖4C)。在這兩組條件培養(yǎng)基中 都發(fā)現(xiàn)高水平的VEGF，比來自荷瘤動物的血漿更高。然而，對于兩 種條件培養(yǎng)基，檢出胎盤生長因子(P1GF)水平的明顯差異，其信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)僅通過VEGFR1。 MCM和黑素瘤衍生的血漿含有顯著較高水平的 P1GF，相比之下，在LCM和LLC衍生血漿中發(fā)現(xiàn)極少或沒有P1GF (圖 4C)。此外，在低轉(zhuǎn)移性變異體LLC中，與其更具侵襲性的對應(yīng)物相 比，對于條件培養(yǎng)基和血漿來說VEGF和P1GF都低得多。在transwell 測定中，與其它生長因子條件相比，LCM和MCM最有效地增加 VEGFR1+骨髓衍生細(xì)胞的遷移(LCM 55% ±0.4, MCM 68.1% ±5,培
養(yǎng)基10.8%±1.7，圖4D，經(jīng)單側(cè)ANOVA， pO.OOl)?？紤]到這些 結(jié)果，有個疑問就是在MCM中細(xì)胞因子(例如P1GF)是否能將LLC 轉(zhuǎn)移改到非常規(guī)轉(zhuǎn)移部位。在LLC皮內(nèi)腫瘤植入之前，通過腹膜內(nèi) 注射給予MCM,此后每天注射，結(jié)果LLC轉(zhuǎn)移從肝和肺改為B16 黑素瘤中常見的部位，例如腎、脾、腸和輸卵管(圖4E)。在帶有LLC 腫瘤植入物和進(jìn)行MCM注射的小鼠中，VEGFR1抗體阻斷簇的形 成并阻止LLC轉(zhuǎn)移的改道。這些結(jié)果證明，條件培養(yǎng)基中存在的胂 瘤特異性趨化因子和/或細(xì)胞因子以及VEGFR1細(xì)胞簇在腫瘤擴(kuò)散的 復(fù)雜的多維生物化學(xué)和細(xì)胞程序中形成另一決定子。 決定具體胂瘤轉(zhuǎn)移到預(yù)定轉(zhuǎn)移位置的精確的細(xì)胞和分 子機(jī)制尚不知道。許多腫瘤偏好轉(zhuǎn)移到特定部位。根據(jù)目前的知識， 相信轉(zhuǎn)移傾向反映了腫瘤細(xì)胞本身固有的分子差異，并受周圍基質(zhì) 細(xì)胞的潛在影響，其包括血管結(jié)構(gòu)、結(jié)締組織和免疫細(xì)胞(Hynes，R.O.,
"Metastatic Potential: Generic Predisposition of the Primary Tumour or Rare, Metastatic Variants-or Both (轉(zhuǎn)移潛力原發(fā)性腫瘤或稀有轉(zhuǎn)移 變異體或這兩者的普遍傾向？ )," Ce〃. 113:821-3 (2003), Bergers等，
"Benefits of Targeting Both Pericytes and Endothelial Cells in the Tumour Vasculature with Kinase Inhibitors (在腫瘤血管系統(tǒng)中，用激 酶抑制劑靶向周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的益處," / C//" /wve成111:1287-95 (2003)， Fidler， I., "The Organ Microenvironment and Cancer Metastasis (器官微環(huán)境與癌轉(zhuǎn)移),"Dz#em "a"OM. 70:498-505 (2002), Duda等，
"Differential Transplantability of Tumour-associated Stromal Cells (腫 瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞的不同移植力)."Ca"cwi^yearch 64:5920-5924 (2004) 和Folkman, J., "Role of Anigiogenesis in Tumour Growth and Metastasis (血管生成在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的作用),"0"co/. 29:515-8 (2002),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。以上結(jié)果導(dǎo)出新概 念腫瘤轉(zhuǎn)移按明確定義的事件順序啟動，依賴于分子書簽(molecular bookmarking),即通過將VEGFR1+細(xì)胞發(fā)送以在革巴器官中形成特異
性允許的生態(tài)位。以上數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，腫瘤分泌體液因子的區(qū)別 促進(jìn)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散到特定遠(yuǎn)端器官中。在腫瘤植入后幾天內(nèi)，在某些位 置，纖連蛋白受到靶器官內(nèi)駐留的成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞 的上調(diào)，所述靶器官已知是對應(yīng)于特定原發(fā)性肺瘤的未來轉(zhuǎn)移部位。
同時，造血祖細(xì)胞從骨髓被動員進(jìn)入外周循環(huán)中，參見Hessig等, "Recruitment of Stem and Progenitor Cells from the Bone Marrow Niche Requires MMP曙9 Mediated Release of Kit-ligand (募集骨髓生態(tài)位中的 干細(xì)胞和祖細(xì)胞，需要MMP-9介導(dǎo)的Kit配體的釋放),"Ce〃. 109:625-37 (2002),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。作為來自 纖連蛋白的生態(tài)位特異性方向的提示，表達(dá)VLA-4并產(chǎn)生MMP-9 的VEGFR1+HPC可穿過已建立的內(nèi)皮，以便在腫瘤和VEGFR2+內(nèi)皮 細(xì)胞到達(dá)之前形成轉(zhuǎn)移前生態(tài)位。隨著MMP-9的產(chǎn)生并改變微環(huán)境， 這些簇增加了 SDF-1表達(dá)，產(chǎn)生趨化因子梯度，而Id3活化導(dǎo)致整 聯(lián)蛋白上調(diào)，允許吸引腫瘤細(xì)胞，它們結(jié)合到生態(tài)位上，因而發(fā)展 成完整轉(zhuǎn)移性病灶。正如所見到的，由VEGFRr抗體造成的抑制或 將VEGFRr細(xì)胞從骨髓中去除，會阻止轉(zhuǎn)移前簇的形成并因此轉(zhuǎn)移。 此外，阻斷VEGFR1或VLA-4，可防止造血簇細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的結(jié) 合和建立。將野生型VEGFRl+細(xì)胞引入Id3敲除小鼠中，恢復(fù)轉(zhuǎn)移 前生態(tài)位和轉(zhuǎn)移，表明Id3的表達(dá)誘導(dǎo)包括MMP-9、整聯(lián)蛋白和可 能的趨化因子在內(nèi)的必要元件的表達(dá)，其提供VEGFRl+細(xì)胞歸巢的 路徑圖，這是建立轉(zhuǎn)移前生態(tài)位必不可少的。 目前，許多關(guān)注都集中在炎性細(xì)胞在輔助腫瘤粘附和 侵襲遠(yuǎn)端器官中的作用方面(Coussens等，"Inflammation and Cancer (炎 癥與癌癥),"A^wre. 420:860-867 (2002), Borsig等，"Synergistic Effects of L- and P國selectin in Facilitating Tumour Metastasis can Involve Non-mucin Ligands and Implicate Leukocytes as Enhancers of Metastasis (L醫(yī) 選擇蛋白和P-選擇蛋白在促進(jìn)肺瘤轉(zhuǎn)移上的協(xié)同效應(yīng)，可包括非粘 蛋白配體并暗示白細(xì)胞作為轉(zhuǎn)移的促進(jìn)劑)，"Prac. M "爿cad
99:2193-2198 (2000), Lin等，"Colony Stimulating Factor 1 Promoted Progression of Mammary Tumours to Malignancy (集落刺、激因子1促進(jìn) 乳腺腫瘤發(fā)展成為惡性腫瘤)，"Exp. 139:727-740 (2001)和Qian 等,"L國selectin can Facilitate Metastasis to Lymph Nodes in a Transgenic Mouse Model Model of Carcinogenesis (在轉(zhuǎn)基因小鼠致癌模型中，L-選擇蛋白可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)),"尸rac. Ato/. Sci. [/&4
98:3976-3981 (2002),所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。該研究 中鑒定的VEGFR1+HPC表達(dá)的特性為炎癥生理途徑所共有，即通過 提供必要的粘附分子、蛋白酶、趨化因子和生長條件，以產(chǎn)生對腫 瘤細(xì)胞移植有利的微環(huán)境(Bergers等，"Matrix Metalloproteinase-9 Triggers the Angiogenic Switch During Carcinogenesis (在肺瘤發(fā)生期 間，基質(zhì)金屬蛋白酶-9觸發(fā)血管生成開關(guān)),"M^Ce〃A'o/. 2:737-744 (2000), Muller等, "Involvement of Chemokine Receptor in Breast Cancer Metastasis (趨化因子受體參與乳癌轉(zhuǎn)移),"M^wm. 410:50-56 (2001 )和Schoppman等,"Tumour-associated Macrophages Express Lymphatic Endothelial Growth Growth Factors and are Related to Peritumoural Lymphaniogenesis (腫瘤相關(guān)巨喧細(xì)胞表達(dá)'淋巴內(nèi)皮生長 因子，并與腫瘤周圍的淋巴發(fā)生相關(guān)),"力附.尸"&o/. 161:947-956 (2002)，所述文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中)。盡管與炎癥相似， 但轉(zhuǎn)移前生態(tài)位保持未分化狀態(tài)，當(dāng)觀察VEGFRl+祖細(xì)胞群體時。 這是第一個直接證據(jù)，表明非腫瘤細(xì)胞群體可預(yù)示未來的轉(zhuǎn)移部位。 此外，人體組織中造血簇的鑒定先于腫瘤擴(kuò)散的證據(jù)，這清楚表明， 使用抗VEGFR1和VLA-4，在臨床環(huán)境下鑒定和預(yù)防轉(zhuǎn)移。該概念 將對腫瘤分期產(chǎn)生巨大影響，并將改變輔助化療的前景。 本文盡管已經(jīng)詳細(xì)說明了優(yōu)選的實(shí)施方案，但是對于 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，只要不偏離本發(fā)明的精神，就 可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改、添加、取代等，因此這樣的修改、添 加、取代也被視為落入本發(fā)明所附權(quán)利要求書限定的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種抑制癌癥患者遠(yuǎn)離腫瘤原先形成部位的部位腫瘤形成的方法，所述方法包括在有效抑制癌癥患者遠(yuǎn)離腫瘤原先形成部位的部位腫瘤形成的條件下，給予所述癌癥患者血管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞抑制劑。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述給予是在刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員的相應(yīng)時間周期內(nèi)進(jìn)行的。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中通過化療、應(yīng)激、手術(shù)、炎癥、輻射或生長因子刺激血管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞動員。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中通過化療來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
5. 權(quán)利要求3的方法，其中通過應(yīng)激來剌激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
6. 權(quán)利要求3的方法，其中通過手術(shù)來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
7. 權(quán)利要求3的方法，其中通過炎性細(xì)胞的動員來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
8. 權(quán)利要求3的方法，其中通過輻射來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
9. 權(quán)利要求3的方法，其中通過生長因子來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞動員。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述生長因子選自粒細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子和刺激骨髓細(xì)胞生長的生長激素。
11. 權(quán)利要求i的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子受體r骨 髓衍生細(xì)胞抑制劑能結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求i的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子受體r骨 髓衍生細(xì)胞抑制劑能預(yù)防或減少血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生 細(xì)胞的形成。
13. 權(quán)利要求i的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子受體r骨 髓衍生細(xì)胞抑制劑是血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞特異性 抗體或其結(jié)合部分。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中給予多克隆抗體。
15. 權(quán)利要求13的方法，其中給予單克隆抗體。
16. 權(quán)利要求13的方法，其中給予抗體的結(jié)合部分。
17. 權(quán)利要求13的方法，其中所述抑制劑是能結(jié)合VLA-4 (oc4(31) 整聯(lián)蛋白的抗體。
18. 權(quán)利要求l的方法，其中所述給予是輔助治療方案的組成部分。
19. 一種預(yù)防癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括在有效預(yù)防癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，給予所述癌癥患者血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞抑制劑。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述給予是在刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員的相應(yīng)時間周期內(nèi)進(jìn)行的。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中通過化療、應(yīng)激、手術(shù)、炎癥、輻射或生長因子剌激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中通過化療來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
23. 權(quán)利要求21的方法，其中通過應(yīng)激來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
24. 權(quán)利要求21的方法，其中通過手術(shù)來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
25. 權(quán)利要求21的方法，其中通過炎性細(xì)胞的動員來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
26. 權(quán)利要求21的方法，其中通過輻射來刺激血管內(nèi)皮生長因 子受體1+骨髓衍生細(xì)胞動員。
27. 權(quán)利要求21的方法，其中通過生長因子來刺激血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞動員。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中所述生長因子選自粒細(xì)胞集落刺 激因子、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子和刺激骨髓細(xì)胞生長的生長激素。
29. 權(quán)利要求19的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞抑制劑能結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞。
30. 權(quán)利要求19的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子受體r骨 髓衍生細(xì)胞抑制劑能預(yù)防或減少血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生 細(xì)胞的形成。
31. 權(quán)利要求19的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子受體r骨 髓衍生細(xì)胞抑制劑是血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞特異性 抗體或其結(jié)合部分。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中給予多克隆抗體。
33. 權(quán)利要求31的方法，其中給予單克隆抗體。
34. 權(quán)利要求31的方法，其中給予抗體的結(jié)合部分。
35. 權(quán)利要求31的方法，其中所述抑制劑是能結(jié)合VLA-4(a4(31) 整聯(lián)蛋白的抗體。
36. 權(quán)利要求19的方法，其中所述給予是輔助治療方案的組成 部分。
37. —種用于抑制癌癥患者腫瘤形成或預(yù)防癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的 候選化合物的鑒定方法，所述方法包括提供試驗化合物；將所述試驗化合物與血管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞一 起孵育；和鑒定能結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的試驗化合 物，作為用于抑制癌癥患者肺瘤形成或預(yù)防癌癥患者肺瘤轉(zhuǎn)移的候 選化合物。
38. —種監(jiān)測癌癥患者腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括評價患者樣品的血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞水平，和將血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的上述水平與血管內(nèi) 皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的其它水平進(jìn)行比較，從而監(jiān)測癌 癥患者的腫瘤轉(zhuǎn)移。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中所述其它水平是癌癥患者血管內(nèi) 皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞的先驗水平，其中血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的水平增加了 ，就表明未來會有腫瘤轉(zhuǎn)移。
40. 權(quán)利要求38的方法，其中所述其它水平是標(biāo)準(zhǔn)水平或正常水平，其中血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的水平超出標(biāo)準(zhǔn) 或正常水平，就表明有腫瘤轉(zhuǎn)移。
41. 權(quán)利要求38的方法，其中所述患者樣品是組織樣品。
42. 權(quán)利要求38的方法，其中所述患者樣品是血液樣品。
43. 權(quán)利要求38的方法，所述方法還包括根據(jù)血管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞的所測水平與血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的其它水平進(jìn)行的所述比較，給 予治療藥。
44. 權(quán)利要求43的方法，其中所述給予包括輔助治療方案。
45. 權(quán)利要求43的方法，其中所述治療藥是化療藥，根據(jù)血管 內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞的所測水平與血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓限定細(xì)胞的其它水平進(jìn)行的所述比較，來選擇所述化療藥的規(guī)格。
46. 權(quán)利要求38的方法，其中所述方法在體外實(shí)施。
47. 權(quán)利要求38的方法，其中所述方法在體內(nèi)實(shí)施。
48. 權(quán)利要求47的方法，其中所述評價和所述比較包括對癌癥 患者的某一部位進(jìn)行造影。
49. 權(quán)利要求48的方法，其中所述方法是用對血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞具有特異性的標(biāo)記物來進(jìn)行的。
50. 權(quán)利要求48的方法，其中所述方法是將標(biāo)記的血管內(nèi)皮生 長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞導(dǎo)入癌癥患者體內(nèi)來進(jìn)行的。
51. —種抑制患者的遠(yuǎn)離腫瘤原先形成部位的部位纖連蛋白表達(dá) 的方法，所述方法包括在有效抑制所述患者的遠(yuǎn)離腫瘤原先形成部位的部位纖連蛋白 表達(dá)的條件下，給予所述患者血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì) 胞抑制劑。
52. 權(quán)利要求51的方法，其中所述給予是在刺激血管內(nèi)皮生長 因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞動員的相應(yīng)時間周期內(nèi)進(jìn)行的。
53. 權(quán)利要求51的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞抑制劑能結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞。
54. 權(quán)利要求51的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞抑制劑能預(yù)防或減少血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生 細(xì)月包的形成。
55. 權(quán)利要求54的方法，其中所述血管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞抑制劑是血管內(nèi)皮生長因子受體1+骨髓衍生細(xì)胞特異性 抗體或其結(jié)合部分。
56. —種抗血管內(nèi)皮生長因子受體r骨髓衍生細(xì)胞的抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及抑制癌癥患者遠(yuǎn)離腫瘤原先形成部位的部位腫瘤形成的方法，也涉及預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的方法。這些方法包括在有效抑制癌癥患者遠(yuǎn)離腫瘤原先形成部位的部位腫瘤形成或預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的條件下，給予癌癥患者血管內(nèi)皮生長因子受體1⁺骨髓衍生細(xì)胞抑制劑?？筛鶕?jù)候選化合物是否能結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子受體1⁺骨髓衍生細(xì)胞，并將血管內(nèi)皮生長因子受體1⁺骨髓衍生細(xì)胞的所測水平與先驗水平進(jìn)行比較，來篩選用于上述目的的候選化合物。
文檔編號G01N33/53GK101107011SQ200580046852
公開日2008年1月16日 申請日期2005年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月19日
發(fā)明者D·利登, R·D·里巴, R·N·卡普蘭, S·拉菲 申請人:康乃爾研究基金會有限公司