專利名稱：具有下調的維生素b12系統(tǒng)的微生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及--種具有增加的維生素B12吸收效率的微生物。本發(fā)明還涉及這種微 生物用于獲取精細化學品(其生物合成需要維生素B12)包括甲硫氨酸的用途。
背景技術：
目前,世界上每年的甲硫氨酸產量大約500000噸。在家禽喂養(yǎng)的畜牧業(yè)中甲硫氨 酸是最早被限制的氨基酸并且因此主要用作飼料添加劑。與其他工業(yè)氨基酸比較，甲硫氨酸主要作為化學合成產生的D-和L 甲硫氨酸外 消旋物應用。因為動物可以代謝甲硫氨酸的兩種立體異構體，直接喂養(yǎng)化學生產的外消旋 混合物是可行的(D' Mello and Lewis,Effect ofNutrition Deficiencies in Animals Amino Acids, Rechgigl(Ed. ), CRCHandbook Series inNutrition and Food,441-490, 1978)ο但是,通過生物技術過程主要生產L 甲硫氨酸來替換現(xiàn)有化學生產仍是令人很 感興趣的。這是由于事實上與D-甲硫氨酸相比,添加更低水平的L-甲硫氨酸是硫氨基酸 更好的來源(Katz and Baker(1975)Poult. Sci. 545 1667-74)。而且，化學方法使用相當 有害的化學物并且產生大量廢氣。一個有效的生物技術方法可避免化學生產的所有這些缺 陷?，F(xiàn)在通常在微生物例如谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum),大 M IT (Escherichia coli)，M Sf # (Saccharomyces cerevisiae), ^ M M M W-母(Schizzosaccharomyces pombe)，巴其Jf 德畢赤酵母(Pichia pastoris)，黑曲霉 (Aspergillus niger),枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),棉桃阿舒氏囊霉(Ashbya gossypii)或氧化葡糖桿菌(Gluconobacter oxydans)中進行精細化學品如氨基酸,芳香 族化合物，維生素和輔因子的發(fā)酵生產。使用發(fā)酵方法生產氨基酸例如谷氨酸。為此目的，已證明某些微生物例如大腸桿 菌和谷氨酸棒桿菌是特別適合的。經發(fā)酵生產氨基酸也尤其具有優(yōu)勢即僅僅生產L 氨基 酸和避免了產生環(huán)境問題的化學物例如在化學合成中典型使用的溶劑。在現(xiàn)有技術中通過例如增加涉及各自精細化學品的生物合成路徑的基因表達而 嘗試在微生物例如大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中生產精細化學品例如氨基酸，脂質,維生素 或碳水化合物完成這個目標。例如WO 02/10209、WO 2006008097、W02005059093 或 Cremer 等(Appl. Environ. Microbiol, (1991)，57 (6)，1746-1752)的描述，通過上調涉及賴氨酸生產的生物合成路徑
的基因表達嘗試增加例如賴氨酸的產量。但是，仍非常需要在微生物例如谷氨酸棒桿菌中鑒定可用于有益影響甲硫氨酸或 其他精細化學品的生產的代謝途徑中的靶。發(fā)明目的和簡述鑒于此，本發(fā)明目的之一是提供可用于生產L 甲硫氨酸的微生物和優(yōu)選地是棒狀細菌。本發(fā)明更進一步的目的是提供在微生物和優(yōu)選在棒狀細菌中生產L-甲硫氨酸的 方法。
可明顯見于以下說明書的這些和其他目的為獨立權利要求中所述的發(fā)明所解決。 從屬權利要求涉及本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案。在一個實施方案中,本發(fā)明涉及--種微生物,其具有增強的維生素B12吸收效率。 本發(fā)明另一方面涉及一種微生物，其具有F調的維生素B12吸收系統(tǒng)。典型地，這種維生素 B12吸收系統(tǒng)包括編碼至少一種負調控蛋白質和/或至少一種ABC-型轉運蛋白質的核酸序 列。這種負調控蛋白質的典型實例是具有SEQ ID No. 2的谷氨酸棒桿菌的推定的btuR2阻 抑物。ABC-型轉運蛋白質的一個典型實例是在谷氨酸棒桿菌內來自ABC-型轉運蛋白的3 個亞基SEQ ID No.4，6和8。在谷氨酸棒桿菌中，由操縱子編碼上述基因，在此所述操縱子 稱為btu2操縱子,3個編碼序列(SEQ ID No. 3，5和7)分別稱為btuF2，btuC2和btuD2。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及具有下調的維生素B12吸收系統(tǒng)的微生 物，其中所述維生素B12吸收系統(tǒng)包括編碼至少一種負調控蛋白質和/或至少一種ABC-型 轉運蛋白質的核酸序列，其中編碼至少一種負調控蛋白質和至少一種ABC-型轉運蛋白 質的所述核酸序列被組構為操縱子以便所述至少一種負調控蛋白質調控所述至少一種 ABC-型轉運蛋白質的表達。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述微生物包含下調的維生素B12吸收 系統(tǒng)，其包含具有核酸序列的操縱子，所述核酸序列編碼至少一種SEQ ID No. 2的負調控蛋 白質或其功能性同源物或片段和包含SEQ IDNo. 4，6和8亞基的至少一種ABO型轉運蛋白 質或其功能性同源物或片段。在前述實施方案的一方面,本發(fā)明涉及微生物,其中與各自未呈現(xiàn)遺傳改變的起 始生物體比較，所述至少一種負調控蛋白質的量由于所述遺傳改變是至少部分減少的。優(yōu) 選地,與各自起始生物體比較,所述至少一種負調控蛋白質的量和/或活性是完全消除或 缺失的。通過例如破壞編碼所述至少一種負調控蛋白質的微生物的內源性核酸序列，上述 提及的至少一種負調控蛋白質的量和/或活性是至少部分減少的。通過例如在啟動子控 制下表達所述至少一種負調控蛋白質(該啟動子弱于驅動所述蛋白質表達的內源性啟動 子)和/或將突變導入所述至少一種負調控蛋白質(至少部分減少和優(yōu)選消除蛋白質對 ABC-型轉運蛋白質表達的負調控功能)’所述至少一種負調控蛋白質的量和/或活性也可 以減少。可選擇地或除本發(fā)明上述提及的實施方案，本發(fā)明涉及一種微生物，其中與未呈 現(xiàn)遺傳改變的各自起始生物體比較，由于所述遺傳改變所述至少一種ABC 型轉運蛋白質 的量和！或活性至少是部分增加的。與起始生物體比較，上述至少一種ABC-型轉運蛋白質的量和/或活性可通過增加 編碼所述蛋白質的核酸序列的拷貝數(shù)而增加。使用例如包含編碼所述ABC-型轉運蛋白質 的核酸序列的自主復制載體和/或通過將編碼所述ABO型轉運蛋白質的核酸序列的額外 拷貝染色體整合入起始生物體基因組可增加核酸序列的拷貝數(shù)。ABC-型轉運蛋白質的量和/或活性的增加可通過增加轉錄和/或翻譯編碼這種蛋 白的一或多個亞基的核酸序列實現(xiàn)。通過使用啟動子和/或增強子元件(與內源性啟動子支配這些核酸序列的表達相比,它們確保產生更強的表達)可獲得轉錄增加。如果編碼所 述酶的核酸序列的密碼子使用對于宿主生物體內的表達是最佳化的或如果核糖體改良的 結合位點和轉錄起始位點被安裝在所述編碼序列的上游區(qū)域則可實現(xiàn)翻譯增加。
ABC-型轉運蛋白質的活性可以通過在編碼所述蛋白質的核酸序列中導入增加所 述蛋白質活性的突變而使得與起始生物體相比是增加的。
在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方案中，通過組合前述方法，與起始生物體比較， ABC-型轉運蛋白質的量和/活性增加。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明以上提及的微生物選自革蘭氏陽性微生物,優(yōu) 選選自放線桿菌和更優(yōu)選選自放線菌。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述微生物選自棒桿菌屬(Corynebacterium)和優(yōu) 選選自谷氨酸棒桿菌?？捎糜诒景l(fā)明的優(yōu)選谷氨酸幫桿菌菌株是野生型菌株如ATCC 13032 或已被工程化用于改良的甲硫氨酸生產的菌株。后者菌株將呈現(xiàn)遺傳改變,如以下描述的 DSM17322, M2014 或 0M469 或 M2543。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種微生物，其中所述微生物選自谷 氨酸棒桿菌和其中下調的維生素B12吸收系統(tǒng)包含操縱子，所述操縱子帶有編碼SEQ ID No. 2的至少一種負調控蛋白質或其功能性同源物或片段和包含SEQ ID No. 4，6和8的亞基 的至少--種ABC-型轉運蛋白質或其功能性同源物或片段的核酸序列。所述至少一種負調控蛋白質的功能性同源物或片段可具有與SEQ IDNo. 2至少 50%的序列相同性。所述至少一種ABO型轉運蛋白質的功能性同源物或片段可具有與SEQ ID No. 4,6和8至少50%的序列相同性。--個特別優(yōu)選的實施方案涉及一種谷氨酸棒桿菌微生物,與未呈現(xiàn)遺傳改變的起 始生物體比較，其中SEQ ID No. 1的至少一種負調控蛋白質或與SEQ ID No. 2具有至少50% 序列相同性的功能性同源物或片段的表達通過所述遺傳改變被部分地和優(yōu)選地完全減少。另一個特別優(yōu)選的實施方案涉及一種谷氨酸棒桿菌微生物,其中與未呈現(xiàn)遺傳改 變的起始生物體比較，通過所述遺傳改變例如使用強啟動子和/或編碼所述亞基的核酸序 列的增加的拷貝數(shù)，包括SEQ ID No. 4，6和8的亞基的至少一種ABC-型轉運蛋白質或其分 別與SEQ ID No. 4，6和8具有至少50%序列相同性的功能性同源物或片段的表達至少是部 分增加的。--個同樣特別優(yōu)選的實施方案涉及一種谷氨酸棒桿菌微生物,其中與未呈現(xiàn)遺傳 改變的起始生物體比較，通過所述遺傳改變，SEQ ID No. 2的至少一種負調控蛋白質或其與 SEQ ID為No. 2具有至少50%序列相同性的功能性同源物或片段的表達至少是部分地和優(yōu) 選全部減少的,且其中通過遺傳改變例如使用強啟動子和/或編碼所述亞基的核酸序列的 增加的拷貝數(shù)，包含SEQ ID No. 4,6和8的亞基的至少一種ABC-型轉運蛋白質或其與SEQ ID No. 4，6和8具有至少50%序列相同性的功能性同源物或片段的表達至少是部分增加 的。本發(fā)明也涉及此前描述的微生物的應用和其特別優(yōu)選的實施方案用于獲得精細 化學品，需要維生素B12的生物合成。這種精細化學品包括甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸和 甲硫氨酸亞砜。本發(fā)明也涉及獲得生物合成需要維生素B12的精細化學品的方法，所述方法包括培養(yǎng)下文描述的微生物和獲得所述精細化學品的步驟。也可從上述組中再次選擇所述精細化學品。


圖1描述btuR2缺失對于維生素B12吸收的影響發(fā)明詳述本發(fā)明人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒桿菌包括維生素B12吸收系統(tǒng)，其由操縱子組 成,所述操縱子包含負調控蛋白質和ABO型轉運蛋白質的核酸序列,其中所述負調控蛋白 質似乎下調所述ABC-型轉運蛋白的表達。后文中通常命名為btu (B12吸收縮寫)的這樣的系統(tǒng)似乎確保維生素B12轉運進 細胞。通過下調所述系統(tǒng),可提供更有效使用維生素B12的微生物。因而，與常規(guī)使用比較， 在包含更少維生素B12的培養(yǎng)基中可生長微生物,所述微生物通常用于生產精細化學品如 需要維生素B12用于其合成的甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸和甲硫氨酸亞砜。因此，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)如果本文命名為btuR2的突變負調控蛋白質在谷氨酸棒桿 菌中缺失，細胞可在含有明顯少于常規(guī)的維生素B12的培養(yǎng)基中生長。由于這些發(fā)現(xiàn)，如果 二者選其一或另外過表達編碼ABC 型轉運蛋白的亞基的、也形成btu2操縱子的部分且命 名為butF2, butC2和butD2的序列也可實現(xiàn)同樣效果。此外,本文揭示的發(fā)現(xiàn)可被用于鑒 別其他革蘭氏陽性微生物中可比較功能的同源序列和特別用于選自放線桿菌屬的微生物 和更優(yōu)選選自放線菌屬，其將呈現(xiàn)可比較的維生素B12吸收系統(tǒng)。在更詳細描述本發(fā)明的特殊方面和一些優(yōu)選的實施方案之前,提供的如下定義將 指示本發(fā)明說明書的意義,除非明確指示,否則由相應部分指明。如下所述的本發(fā)明在缺少任何一個元件或多個元件、一個限定或多個限定時也可 以適當實施,雖然其沒有特異性在本文揭示。本發(fā)明將根據特定實施方案描述,但是本發(fā)明不局限于此，而是由權利要求書限定。在本發(fā)明說明書和權利要求書中使用術語“包含”時，其不排除其他元件。為本發(fā) 明目的，術語“由……組成”被認為是術語“包含”的優(yōu)選實施方案。若以下一組被認為包含 至少一定量的實施方案,這也被理解為揭示了一組,其優(yōu)選僅由這些實施方案組成。當提及單數(shù)名詞例如“一個”,“一種”或“所述”時使用的不定冠詞或定冠詞時,這 包括所述名詞的復數(shù)，除非特殊聲明。本發(fā)明中的術語“約”或“大約，，表示一個精確性的 區(qū)間，本領域技術人員將理解并仍可確保正被討論特征的技術效果。典型地,術語指出指示 數(shù)值士 10%的偏差,和優(yōu)選士5%的偏離。本發(fā)明中的術語“微生物”指任何原核類型微生物。因此,所述術語包含革蘭氏陰 性微生物如大腸桿菌和革蘭氏陽性微生物如谷氨酸棒桿菌。優(yōu)選地，微生物選自革蘭氏陽 性微生物或更優(yōu)選來自放線桿菌屬和甚至更優(yōu)選地放線菌屬。依據本發(fā)明，基因棒狀細菌 形成特別優(yōu)選的微生物子集。棒狀細菌包含菌種如谷氨酸棒桿菌,杰氏棒桿菌(Corynebacteriumjeikeum),醋 谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)，嗜乙酉先乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)，熱產氨棒桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)，棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)禾口 Corynebacterium efficiens。優(yōu)選的菌禾中是谷氛酸 棒桿菌。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，棒狀細菌可來自一組包含谷氨酸棒桿菌 ATCCl3032,谷氨酸棒桿菌KFCC10065,谷氨酸棒桿菌ATCC21608C,醋谷棒桿菌ATCC15806, 嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870,熱產氨棒桿菌FERMBP-1539,棲糖蜜棒桿菌ATCC17965, C. efficiens DSM 44547和C. efficiens DSM 44549的菌種以及通過例如經典誘變和選擇 或通過定點誘變衍生于其的菌株。其他特別優(yōu)選的谷氨酸棒桿菌菌株可選自包含ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851, ATCC21253, ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488, ATCC21649, ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159, ATCC21355, ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565, ATCC21566, ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572, ATCC21573, ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053, ATCC19054, ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060, ATCCl9185, ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRLB8183, NRRLW8182, B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 和 NRRLBl 1476 的組。
KFCC縮寫表示韓國聯(lián)邦菌物保藏中心，ATCC表示美國典型培養(yǎng)物保藏中心和DSM 縮寫表示德國微生物保藏中心。縮寫NRRL表示ARS培養(yǎng)物中心北區(qū)研究實驗室，Peorea, EL, USA0為了本發(fā)明目的,優(yōu)選的野生型菌株是谷氨酸棒桿菌ATCC13032。特別優(yōu)選的是已能夠生產甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌微生物。因此，特別優(yōu)選具有 相似作用呈現(xiàn)遺傳改變的菌株如下述DSM17322 ；M2014, 0M469或M2543。在本說明書中，特別的蛋白質可由編碼所述蛋白質的基因命名。例如“btuR2”可 表示基因btuR2或者由基因btuR2編碼的蛋白質。本發(fā)明中的術語“起始生物體”指一種微生物和優(yōu)選是棒狀細菌和特別優(yōu)選是谷 氨酸棒桿菌微生物,其被用于遺傳修飾以減少上述負調控蛋白質的量和/或活性和/或增 加上述ABC-型轉運蛋白質的量/活性。 術語“遺傳修飾”和“遺傳改變”以及在本發(fā)明意義內它們的語法變化傾向于表示 一種通過基因技術被修飾以表達改變量的一或多種在各自微生物中天然存在的蛋白質、在 各自微生物中天然不存在的一或多種蛋白質或與各自未修飾微生物的蛋白質相比具有改 變活性的一或多種蛋白質的微生物。未修飾的微生物被認為是“起始生物體”,其遺傳改變 產生本發(fā)明的微生物。因此，起始生物體是野生型谷氨酸棒桿菌菌株如ATCC13032。但是，優(yōu)選起始生物體也可以是例如已被優(yōu)化生產甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌菌 株。例如這樣--種生產甲硫氨酸的起始生物體可來自野生型棒狀細菌和優(yōu)選來自野 生型谷氨酸棒桿菌，其含在至少一個以下基因中的遺傳改變=Bskfbr, homfb1'，和metH，其中遺 傳改變導致這些基因任一個的過表達，因此導致與在沒有所述遺傳改變時產生的甲硫氨酸相比甲硫氨酸產量增加。在一個優(yōu)選的實施方案中,這樣一個甲硫氨酸生產起始生物體將 同時含有在aSkfbl'，homfb1'和metH中的遺傳改變，因此與在沒有遺傳改變時產生的甲硫氨酸 相比甲硫氨酸產量增加。在這些起始生物體中，典型地ask和hom的內源性拷貝改變?yōu)榉答伩剐缘任换颍?其不再受賴氨酸蘇氨酸，甲硫氨酸或這些氨基酸的組合的反饋抑制。這可通過突變和選擇 或通過將所述基因用編碼具有減少或降低的反饋抑制的蛋白質的突變等位基因的確定基 因置換來完成。包括這些遺傳改變的谷氨酸棒桿菌是例如谷氨酸棒桿菌DSM17322。本領域 技術人員已意識到以下描述的產生谷氨酸棒桿菌DSM17322的選擇性地遺傳改變也可以用 于實現(xiàn)askfbI', homfbr和metH的過表達。為本發(fā)明目的，Eiskfto表示反饋抗性天冬氨酸激酶。Homfto表示反饋抗性高絲氨酸 脫氫酶。MetH表示維生素B12依賴性甲硫氨酸合酶。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，生產甲硫氨酸的起始生物體可來自于野生型棒狀細 菌和優(yōu)選來自野生型谷氨酸棒桿菌,其在至少一種以下基因中含遺傳改變Bskfbr, homfbr, metH, metA (也表示為 metX)，metY (也表示為 metZ)和 hskmutated 禾口 metF和tkt,其中遺傳改變導致這些基因任一個的過表達，從而導致與缺乏遺傳改變時產生 的甲硫氨酸相比甲硫氨酸產量增加。在一個優(yōu)選實施方案中，這樣的甲硫氨酸生產起始生 物體同時在 askfbr humfbr, metH, met.A(也表示為 metX), met.Y(也表示為 metZ)和 hskmutated 和metF中含有遺傳改變，因而導致與缺乏遺傳改變時生產的甲硫氨酸相比甲硫氨酸產量 增加。在這些起始生物體中，典型地ask, hora和hsk的內源性拷貝被以上描述的aSkfto, hom-和hsk—1"1替換為askfbt'和honT·。包括這些遺傳改變的谷氨酸棒桿菌菌株是例如谷 氨酸棒桿菌M2014。本領域技術人員已意識到以下特異性描述的生成谷氨酸棒桿菌M2014 的選擇性地遺傳改變也可以用于實現(xiàn)askfbl:，homfbr, metH, metA(也表示為metX)，metY (也 表示為metZ)和hs:kmutated的過表達。為本發(fā)明目的,例如met.A表示來自大腸桿菌的高絲氨酸琥珀酰轉移酶。MetY表示 0-乙酰高絲氨酸硫化氫解酶。Hskmutated表示已被突變減少酶活性的高絲氨酸激酶。這通過 在SEQ ID No. 19的hsk的T190相應位點將蘇氨酸替換為絲氨酸或丙氨酸來實現(xiàn)?？蛇x擇 地或額外地，使用TTG起始密碼子可替代ATG起始密碼子。與未突變的hsk基因比較,這樣 的突變導致所得的hsk蛋白質的酶活性減少。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種生產甲硫氨酸的起始生物體可來自于野生型 棒狀細菌和優(yōu)選來自在至少一種以下基因中含遺傳改變的野生型谷氨酸棒桿菌^吐1^， homfblr,metH，metA(也表示為 metX) ,metY (也表示為 metZ), hskmutated 和 metF，其中遺傳改變 導致這些基因任一個的過表達,并組合在至少--種以下基因中的遺傳改變:mcbR和metQ, 其中遺傳改變減少這些基因任一個的表達，組合導致與當缺乏組合時的甲硫氨酸生產相比 微生物的甲硫氨酸產量增加。在一個優(yōu)選的實施方案中,這樣一種甲硫氨酸生產起始生物 體同時包含 askfbr, Horafbr, metH, metA (也表示為 metX), metY (也表示為 metZ), Hskmutated 禾口 metF中的遺傳改變,其中遺傳改變導致這些基因任一個的過表達,組合mcbR和met.Q中的遺 傳改變，其中遺傳改變減少這些基因任一個的表達，組合導致與沒有組合時的甲硫氨酸生 產相比微生物的甲硫氨酸產量增加。
在這些起始生物體中，當mcbR和metQ的內源性拷貝典型地被功能性破壞或缺失 時，ask, hom和hsk的內源性拷貝典型地如上述被替換。包括這些遺傳改變的谷氨酸棒桿 菌菌株是例如谷氨酸棒桿菌0M469。本領域技術人員將意識到下述特異性描述的用于生成 谷氨酸棒桿菌0M469的選擇性地遺傳改變也可用于實現(xiàn)ask·, Homfbr, metH, metA(也表示 為metX), metY (也表示為metZ), hskmutated和metF的過表達并減少mcbR和metQ的表達。為本發(fā)明目的，metF表示N5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(EC 1.5. 1.20)。McbR表 示硫代謝的TetR-型轉錄調節(jié)物(Genbank登錄號AAP45010)。MetQ表示D-甲硫氨酸結 合脂蛋白。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，生產甲硫氨酸的起始生物體可以來自于野生型棒狀 細菌和優(yōu)選來自于野生型谷氨酸棒桿菌，其包含至少一種以下基因中的遺傳改變^skfte, homftr，metH, metA(也表示為 metX)，metY (也表示為 metZ)，hstfflUtated 和 metF 和 tkt，其中 遺傳改變導致這些基因任一個的過表達,組合至少任意一種以下基因中的遺傳改變mcbR 和metQ,其中遺傳改變減少這些基因任一個的表達,其中組合導致與沒有所述組合的甲硫 氨酸生產相比微生物的甲硫氨酸生產增加。在一個優(yōu)選的實施方案中，這樣一種生產甲硫 氨酸的起始生物體將同時包含askfbw，humfbr, metH, metA (也表示為metX)，metY (也表示為 metZ), hs:kmutated和raetF和tkt中的遺傳改變,其中遺傳改變導致這些基因任一個的過表達， 組合mcbR和metQ中的遺傳改變,其中遺傳改變減少這些基因任--個的表達,其中組合導致 與沒有所述組合時甲硫氨酸生產相比微生物的甲硫氨酸生產增加。在這些起始生物體中， ask, hum和hsk的內源性拷貝典型地如上述被替換，而mcbR和metQ的內源性拷貝典型地 被功能性破壞或缺失。包括這些遺傳改變的谷氨酸棒桿菌菌株是例如谷氨酸棒桿菌M2543。 本領域技術人員將意識到以下特異性描述的用于生成谷氨酸棒桿菌M2543的選擇性地遺 傳改變也可以用于實現(xiàn)askfto，homfto，metH，metA (也表示為metX)，metY(也表示為metZ)， hskmutated, metF和tkt的過表達以及減少mcbR和metQ的表達。為本發(fā)明目的，tkt表示轉酮酶。如上文所提及,本發(fā)明涉及一種具有增強的維生素B12吸收效率的微生物。本發(fā) 明的另一方面涉及一種具有下調的維生素B12吸收系統(tǒng)的微生物。典型地，這樣的維生素 B12吸收系統(tǒng)包括編碼至少一種負調控蛋白質和/或至少一種ABC-型轉運蛋白質的核酸序 列。在一個優(yōu)選的實施方案中,本發(fā)明涉及一種具有下調的維生素B12吸收系統(tǒng)的微生物， 其中維生素B12吸收系統(tǒng)包含編碼至少--種負調控蛋白質和/或至少一種ABC-型轉運蛋 白質的核酸序列，其中編碼所述至少一種負調控蛋白質和至少一種ABC-型轉運蛋白質的 所述核酸序列被組構為操縱子以便所述至少一種負調控蛋白質調控所述至少一種ABC-型 轉運蛋白質的表達。因此,本發(fā)明的實例涉及包含下調的維生素B12吸收系統(tǒng)的微生物,該系統(tǒng)包含 操縱子，其具有編碼SEQ ID No. 2的至少一種負調控蛋白質或其功能性同源物或片段和包 含SEQ ID No. 4，6和8的亞基的至少一種ABC-型轉運蛋白質或其功能性同源物或片段的 核酸序列。在上述微生物中，與未呈現(xiàn)遺傳改變的各自起始生物體相比,通過所述遺傳改變 所述至少一種負調控蛋白質的量和/活性可以至少部分地減少。可選擇地或另外，與未呈 現(xiàn)遺傳改變的各自起始生物體相比,通過所述遺傳改變所述ABC-型轉運蛋白的至少一個和優(yōu)選所有亞基的量和/或活性是增加的。在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的微生物和方法特征在于另外一或多種以 下因子、其功能性同源物和/或功能性片段的量和/或活性與起始生物體相比是增加的-inetA/X,-metZ/'Y,
-metF,-metll,-thrA,-metE,和/或一或多種以下因子、其功能性同源物和/或功能性片段的量和/或活性與 起始生物體相比是減少的-raetK,-thrB。這樣的微生物和方法特別適用于生產甲硫氨酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所有前述因子meU/X，metZ/Y, metF, metH, thrA 和metE的量和/或活性額外增加以及metK和thrB的量和活性額外減少。MeU/X指編碼一種酶的基因,所述酶催化乙?；蜱牾；鶑募せ畹囊阴；o酶 A或從各自的琥珀酰輔酶A轉移至高絲氨酸的OH基團生成ο-乙?；呓z氨酸或ο-琥珀酰 高絲氨酸(Genbank accession :AF052652)。MetZ/Y指編碼一種酶的基因，所述酶催化轉移硫化物或甲硫醇到()-乙酰高絲氨 酸或ο-琥珀酰高絲氨酸生成高半胱氨酸。酶metZ/Y利用吡哆醛磷酸為輔因子(Genbank accession :AF220150)。Me tF涉及編碼一種酶的基因，所述酶利用NADf3II或NADH為輔因子和氫化物供體催 化亞甲基四氫葉酸還原為甲基四氫葉酸(EC 1. 7. 99. 5, Genbank accession :AAH68531)。MetH涉及編碼一種酶的基因,所述酶利用羥基鈷胺素為輔因子和SAM為第二輔因 子在高半胱氨酸上催化甲基四氫葉酸的甲基轉移(EC 2. 1. 1. 13，Genbank accession =Cgl 1507)。ThrA(高絲氨酸脫氫酶)涉及編碼一種酶的基因，所述酶利用NADWi或NADH為 輔因子催化天冬氨酸半醛的還原(EC 1. 1. 1. 3, Genbank accession :Cglll83, AAT03321, AAH68417, AEB 13106)。該酶可以突變的形式使用。ThrB (高絲氨酸激酶)涉及編碼一種酶的基因，所述酶利用ATP為輔因子催化高絲 氨酸磷酸化為磷酸高絲氨酸(EC 2. 7. 1. 89,Genbank accession =Cgl 1183)。該酶可以突變 的形式使用。MetE涉及編碼一種酶的基因，所述酶利用SAM為輔因子在高半胱氨酸....Ll催化從甲 基四氫葉酸酶的甲基轉移(EC 2. 1. 1. 14, Genbank accession :Cglll39)。MetK涉及編碼一種酶的基因,所述酶利用ATP為輔因子S-腺苷甲硫氨酸合成酶在 甲硫氨酸上酶催化轉移S-腺苷-殘基(EC 2. 5. 1. 6，Genbankaccession =Cgl 1603)。這些額外的修飾也當然可被導入上述起始生物體。在本發(fā)明中，與起始生物體比較，至少一種蛋白質如谷氨酸棒桿菌的btu操縱子的負調控蛋白質的術語“減少量”表示棒狀細菌被遺傳修飾以表達較低量的這種蛋白質。例 如這可以通過染色體缺失實現(xiàn)(見下)。至少一種蛋白質如谷氨酸棒桿菌的btu操縱子的負調控蛋白質的術語“減少活 性”涉及的情況是至少一種突變被導入這種蛋白質的各自的野生型序列，其導致產生其變 體,其中表達突變的形式而不是野生型蛋白質。但是由于所述突變,突變的蛋白質丟失其例 如負調控功能以致于即使表達相當量的蛋白質，但各自蛋白質的活性是降低的。
通過用驅動較少表達的啟動子替換內源性啟動子，這種蛋白盒子的量也可減少。在本發(fā)明中，與起始生物體比較，至少一種蛋白質的術語“增加量”表示棒狀細菌 和優(yōu)選谷氨酸棒桿菌被遺傳修飾以表達更高量的至少--種上述蛋白質。應理解至少一種蛋 白質量的增加涉及的情況是功能性蛋白質的量增加。本發(fā)明中，如果其如內源性蛋白質一 樣能夠完成相同的反應,則這種蛋白質被認為是功能性的。在棒狀細菌和優(yōu)選在谷氨酸棒 桿菌中存在本領域技術人員已知的多種選擇以增加蛋白質的量。這些選擇包括增加編碼上 述蛋白質的核酸序列的拷貝數(shù),增加這種核酸序列的轉錄和/或翻譯。將在以下詳細討論 這些不同的選擇。至少一種蛋白質的術語“增加活性”涉及的情況是至少一種突變被導入上述提及 蛋白質的各自野生型序列中，與表達同樣量野生型蛋白質的情況比較，其導致維生素B1.2 輸入增加。當然，增加至少一種蛋白質量和/或活性的方法可以聯(lián)合使用。因此，可以例如在 用突變體替換棒狀細菌中至少一種蛋白質的內源性拷貝，所述突變體編碼其突變形式。如 果這個突變的拷貝的轉錄被放置在強啟動子控制下,各自蛋白質的量和活性增加。應理解 在這種情況中實施蛋白質仍然能夠完成其通常參與的功能。因此人們可以例如通過從自主復制載體或額外插入的染色體拷貝(見下)過表達 各自谷氨酸棒桿菌的SEQ ID No. 4,6和8而在谷氨酸棒桿菌中增加谷氨酸棒桿菌ABC-型 轉運蛋白的亞基的量或人們可以使用來自例如枯草芽孢桿菌或大腸桿菌的相應蛋白質和 通過例如使用自主復制載體過表達所述蛋白質。在一些情況下，優(yōu)選使用內源性蛋白質，當例如谷氨酸棒桿菌的內源性編碼序列 相對于用于表達的密碼子使用已被優(yōu)化。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，在谷氨酸棒桿菌中維生素B1.2吸收系統(tǒng)的至少 --種ABC-型轉運蛋白質的量和/或活性是增加的。如上所述，本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案涉及一種微生物，其被遺傳修飾以提供增 加效率的維生素B12吸收，其中通過使用包含核酸的維生素B12吸收系統(tǒng)下調維生素B12 吸收系統(tǒng)來實現(xiàn)所述增加的效率,所述核酸編碼至少一種負調控蛋白質和/或至少一種 ABC-型轉運蛋白質,其被組構為操縱子以便所述至少一種負調控蛋白質調節(jié)所述至少一種 ABC-型轉運蛋白質的表達。一個優(yōu)選的實施方案涉及選自棒狀細菌的微生物，優(yōu)選谷氨酸棒桿菌。在本發(fā)明后面這個實施方案的一個特別優(yōu)選的方面,維生素B1.2吸收系統(tǒng)是操縱 子,其包含推定的負調控蛋白質的核酸序列，該蛋白質以下指定為SEQ ID秘.2的1^.1^2或 其功能性同源物或片段和優(yōu)選在谷氨酸棒桿菌中是相應于SEQ ID No. 4，6和8的3個亞基 或其功能性同源物或片段組成的至少一種ABO型轉運蛋白質。因此，在涉及谷氨酸棒桿菌來源的微生物的優(yōu)選實施方案中，維生素B12吸收系統(tǒng)是4個基因的操縱子,具有編碼負調 控蛋白質例如btuR的一個核酸序列和編碼ABC-型轉運蛋白質成分的其他3個核酸序列。 負調控蛋白質調節(jié)所述ABC-型轉運蛋白質的表達。
谷氨酸棒桿菌負調控蛋白質btuR2的核酸序列示于SEQ ID No. 1中。相應的氨 基酸序列示于 SEQ ID No. 2 中。genebank 登錄號(ht.tp/'/www. ncbi. nlm. nih. gov/)是 NCgl2034或geneID 1020066表示基因和NP 601315. 1表示蛋白質。在SEQ ID No. 3中示出組成谷氨酸棒桿菌維生素B12吸收系統(tǒng)的操縱子的ABC-型 轉運蛋白質的A亞基的核酸序列?；虮幻麨閎tuF2。在SEQ ID No. 4中描述相應的 氨基酸序列。genebank登錄號是登錄號NC_006958. 1或geneID =3345625表示基因和NP 601313. 1表示蛋白質。在SEQ ID No. 5中描述組成谷氨酸棒桿菌維生素B12吸收系統(tǒng)的操縱子的ABC-型 轉運蛋白質的B亞基的核酸序列?；虮幻麨閎tuC2。在SEQ ID No. 6中描述氨基酸序 列。genebank登錄號是NCgl2032或geneID =1020064表示基因和NP 601312. 1表示蛋白 質。在SEQ ID為No. 7中描述組成谷氨酸棒桿菌維生素B12吸收系統(tǒng)的操縱子的 ABC-型轉運蛋白質的C亞基的核酸序列?；虮幻麨閎tul)2。在SEQ ID No. 8中描述氨 基酸序列。genebank登錄號是NCgl2031或geneID 1020063表示基因和NP 601311. 1表 示蛋白質。本領域技術人員通過同源性分析其他生物體可容易確定組成谷氨酸棒桿菌維生 素B12吸收系統(tǒng)的上述谷氨酸棒桿菌序列相應功能性同源物。這可以通過確定氨基酸或核 酸序列之間的百分比相同性來確定由例如核酸序列btuR2, butF2編碼的基因或蛋白質和 以下提及的編碼的任意基因和蛋白質序列的推定同源物。例如通過視覺觀察或使用同源性算法確定百分比相同性。例如，為了確定2個氨基酸序列的百分比相同性,算法將排列序列以找到最佳比 較效果(例如可以在一種蛋白質的氨基酸序列中導入缺口以與另一種蛋白質的氨基酸序 列最佳排列)。然后比較在相應氨基酸位置的氨基酸殘基。當一個序列中的位置被另一個 序列中相應位置的相同氨基酸殘基占據時，在那個位置分子是相同的。2個序列之間的百 分比相同性是序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)(即％相同性=相同位置數(shù)/總位置數(shù)乘以 100)。已知本領域有多種計算機程序用于此目的。例如，通過使用Devereux etal. (1984)Nucl. Acids. Res. ,12 387 描述的和得自 University of WisconsinGenetics Computer Group (UWGCG)的GAP計算機程序比較序列信息可確定2個核酸或氨基酸序列的 百分比相同性。通過使用 Basic Local AlignmentSearch Tool (BLASTTM)程序(如Tatusova et al. (1999)FEMS Microbiol. Lett.，174 247描述)排列2個核酸或氨基酸序列也可以 確定百分比相同性。在本專利申請的申請日，提供BLAST程序的標準軟件包可以在NCBI的BLAST網頁 上找到(ht.tp://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。例如，若使用任意上述SEQ ID,可以例如 在大腸桿菌，釀酒酵母(S. cervisiae)，枯草芽孢桿菌等中進行基于核酸序列或基于氨基酸 序列的BLAST搜索和鑒定各自酶的密切相關的同源物。例如，使用BLAST 程序，對于核酸序列排列，默認設置如下匹配獎勵是2,錯配罰值是-2,開發(fā)缺口和延伸缺口罰值分別是5 和 2，gap. times, dropoff 是 50，expect 是 10，字體 11 號，和 filter 是 OFF。后面的算法是 優(yōu)選的。在 EMBL 數(shù)據庫(http://www.embl.org)或 Expasy 主頁(http://www. expasy. org/)可以進行比較序列搜索和分析。啊、在本申請申請日，所有上述序列搜索可以典型 地用數(shù)據庫提供者預裝的默認參數(shù)進行。使用軟件程序如使用CLUSTAL方法(Higgins et al. (1989)，Comput. Appl. Biosci. ,5(2) 151)的 DNA Star, Inc.，Madison, ffinconsin, USA 的激光基因軟件也可以常規(guī)進行同源性搜索。
本領域技術人員理解2個蛋白質將很可能執(zhí)行相同的功能(例如提供相同的酶活 性)如果它們具有一定程度的如上描述的相同性。關于氨基酸水平的典型的較低的限制是 典型的至少大約50%相同性。在核酸水平上,較低的限制是典型的至少40%。兩類序列優(yōu)選的相同性等級是至少大約55%,至少大約60%或至少大約70%。更 優(yōu)選的相同性水平是至少大約80 %,至少大約90 %或至少大約95 %。這些相同性水平被認 為是明顯的。如本文所用，術語“同源性”和“同源的”不限于具有理論上共同遺傳祖先的指定 蛋白質,包括可能遺傳不相關的蛋白質,但依然進化為執(zhí)行相似功能和/或具有相似結構。 要求同源物應是功能性的意思是在此描述的同源物涵蓋與參照蛋白質具有基本上相同功 能的蛋白質。對于具有功能性同源性的蛋白質而言，不需要它們在其氨基酸序列上具有顯 著的相同性，但是由于具有相似或相同活性例如酶活性被定義為具有功能性同源性的蛋白 質。優(yōu)選地,來自除例如宿主棒狀細菌的另一個生物體的蛋白質被認為是功能性同源 物，如果其顯示至少顯著的相似性，即在氨基酸水平大約50%序列相同性和在棒狀細菌中 如它的相應蛋白質一樣執(zhí)行相同功能。提供相同酶活性和共享更高程度相同性如在氨基酸 水平上至少大約60%,至少大約70%，至少大約80%或至少大約90%序列相同性的功能性 同源物是更優(yōu)選的功能性同源物。本領域技術人員已知人們也可以使用來自棒狀細菌的....匕述蛋白質的片段或突變 形式和它們在其他生物體中的功能性同源物,只要這些片段和突變形式呈現(xiàn)相同類型的功 能活性。當突變形式典型包含缺失,插入或點突變時,典型的功能性活性片段將呈現(xiàn)N末端 和/或C末端缺失。作為實例，枯草芽孢桿菌的序列被認為編碼谷氨酸棒桿菌btuR2的功能性同源 物，如果在氨基酸水平其與SEQ ID No. 2呈現(xiàn)上述相同性水平和對例如由SEQ ID No. 2,4 和6編碼的ABO型轉運蛋白質的表達呈現(xiàn)可比較的抑制活性。只要產生的蛋白質仍介導 如全長蛋白質一樣的相同類型的活性,人們也可以使用這些序列的片段或例如點突變。依據本發(fā)明，下調維生素B12吸收系統(tǒng)和特別地如以btu2操縱子形式用于描述谷 氨酸棒桿菌的那些允許微生物在培養(yǎng)基中生長和/或提高甲硫氨酸生產，與不包含這種下 調的維生素B12吸收系統(tǒng)的微生物比較所述培養(yǎng)基含較少的維生素B12。因此,依據本發(fā)明已被遺傳修飾的微生物也可以在培養(yǎng)基中生長,并與不呈現(xiàn)所 述遺傳改變的微生物具有相同效率，與微生物不包含提高維生素B12吸收效率的遺傳改 變的情況比較，所述培養(yǎng)基含有大約小于10%，大約小于20%，大約小于30%,大約小于40 % ,大約小于50 %,大約小于60 % ,大約小于70 % ,大約小于80 %,大約小于90 %或大約 小于95%的維生素B12。在一個優(yōu)選的實施方案中，如果所述培養(yǎng)基與通常使用的不包含如本發(fā)明所述改 良維生素B1.2吸收的遺傳改變的微生物的培養(yǎng)基相比包含少于50%,優(yōu)選少于大約60%, 更優(yōu)選少于大約70%,甚至更優(yōu)選少于大約80%和更優(yōu)選少于大約90%的維生素B12,依 據本發(fā)明遺傳修飾的生物體可以如沒有所述遺傳改變的微生物生長至可比較的和優(yōu)選相 同的效率。 因此,作為改良的維生素B12吸收系統(tǒng)的結果,本發(fā)明的微生物可以以較低成本 使用以提供生物合成需要維生素B12的精細化學品。這樣的精細化學品包括甲硫氨酸， S-腺苷甲硫氨酸和甲硫氨酸亞砜。在一些實施方案中，作為本文所述遺傳改變的后果，具有改良的維生素B12吸收 效率的微生物可以甚至改良甲硫氨酸的生產以及需要維生素B12用于其在微生物如棒狀 細菌和優(yōu)選在谷氨酸棒桿菌中生物合成的其他精細化學品的生產。在棒狀細菌中，改良甲硫氨酸生產例如是表示增加產率、最終滴度或甲硫氨酸合 成效率以及增加生產的甲硫氨酸量。術語“甲硫氨酸合成效率”描述甲硫氨酸的碳產率。這個效率計算為以碳底物形 式進入系統(tǒng)的能量輸入的百分比。在本發(fā)明中，這個值以百分比值的形式給出(mol甲硫氨 酸)(mol碳底物C1XlOO)。因此術語“增加的甲硫氨酸合成效率”涉及在起始生物體和實際 的棒狀細菌之間的比較，其中戊糖磷酸途徑的至少一種酶的量和/或活性已增加。依據本發(fā)明的優(yōu)選的碳源是糖如單糖,二糖或多糖。例如,選自包含葡萄糖,果糖， hanose,半乳糖,核糖，山梨糖,乳糖,麥芽糖,蔗糖,棉子糖,淀粉或纖維素的糖可作為特別 優(yōu)選的碳源。依據本發(fā)明的方法和棒狀細菌也可被用于生產比起始生物體更多的甲硫氨酸。依據本發(fā)明的方法和棒狀細菌也可被用于以比起始生物體更快的速度生產甲硫 氨酸。如果例如考慮典型的生產時間，所述方法和棒狀細菌將允許以更快的速度生產甲硫 氨酸，即與起始生物體比較，相同量的甲硫氨酸將在更早的時間點生產出來。這個特別用于 對數(shù)生長期。依據本發(fā)明的方法和棒狀細菌如果菌株在搖瓶中培養(yǎng),允許產生至少大約3g甲 硫氨酸/1培養(yǎng)體積。如果菌株在搖瓶中培養(yǎng),至少大約4g甲硫氨酸/1培養(yǎng)體積,至少大 約5g甲硫氨酸/1培養(yǎng)體積或至少大約7g甲硫氨酸/1培養(yǎng)體積的滴度是優(yōu)選的。如果菌 株在搖瓶中培養(yǎng),更優(yōu)選的量達到至少大約IOg甲硫氨酸/1培養(yǎng)體積和甚至更優(yōu)選至少大 約20g甲硫氨酸/1細胞群(cell mass)。如果使用攪動的和碳源補料發(fā)酵罐在發(fā)酵實驗中培養(yǎng)菌株,依據本發(fā)明的方法和 棒狀細菌允許產生至少大約25g甲硫氨酸/1培養(yǎng)體積。如果使用攪動的和碳源補料發(fā)酵 罐在發(fā)酵實驗中培養(yǎng)菌株，至少大約30g甲硫氨酸/1培養(yǎng)體積，至少大約35g甲硫氨酸/1 培養(yǎng)體積或至少大約40g甲硫氨酸/1培養(yǎng)體積的滴度是優(yōu)選的。如果使用攪動的和碳源 補料發(fā)酵罐在發(fā)酵實驗中培養(yǎng)菌株,更優(yōu)選的量達到至少大約50g甲硫氨酸/1培養(yǎng)體積和 甚至更優(yōu)選至少大約60g甲硫氨酸/1細胞群。在一個優(yōu)選的實施方案中，與起始生物體比較，本發(fā)明的方法和微生物允許甲硫氨酸合成的效率和/或甲硫氨酸量和/或滴度和/或甲硫氨酸合成速度增加至少大約2%, 至少大約5%，至少大約10%或至少大約20%。在一個優(yōu)選的實施方案中，與起始生物體比 較，甲硫氨酸合成效率和/或甲硫氨酸量和/或滴度和/或速度增加至少大約30 %，至少大 約40%，或至少大約50%。甚至更優(yōu)選的是增加至少大約2倍，至少大約3倍,至少大約5 倍,和至少大約10倍。但是,大約5%的增加也被認為是顯著的改良。上述序列的量和/或活性和它們的功能性同源物和片段優(yōu)選在谷氨酸棒桿菌中 也可以增加和/或減少。為此,可使用野生型菌株如ACC13032或帶有更多遺傳修飾的菌株 以增加和改善甲硫氨酸生物合成。
這樣的菌株可以例如表達反饋_抗性高絲氨酸脫氫酶(homfto)。這樣的菌株還表 達反饋-抗性天冬氨酸激酶(askfto)。這樣的菌株可以額外的呈現(xiàn)甲硫氨酸合酶(metH)增 加的表達。適于生產甲硫氨酸和過表達反饋 抗性高絲氨酸脫氫酶,反饋 抗性天冬氨酸 激酶和甲硫氨酸合酶的菌株是例如上述實例的DSM17322。優(yōu)選的用于本發(fā)明目的的其他谷氨酸棒桿菌起始菌株帶有上述DSM17322的修飾 和針對甲硫氨酸合成進一步優(yōu)化。例如這樣的菌株可以表達增加水平的突變的高絲氨酸激 酶OiSkmutatedlO，高絲氨酸琥珀酰轉移酶(metA)和0-乙?；呓z氨酸硫化氫解酶(metY)。 帶有所有這些遺傳改變的菌株是例如實施例1的M2014。在谷氨酸棒桿菌中一個特別有前 途的為本發(fā)明目的的起始生物體將因此呈現(xiàn)增加水平的metH, met.Y和metA, homfbr, askftr 和 hskmutated。反饋-抗性高絲氨酸脫氫酶的實例是在SEQ ID NO. 17的393位置帶有S393F突 變。這個homfto顯示降低的蘇氨酸和或甲硫氨酸的反饋抑制。反饋-抗性天冬氨酸激酶的 實例是在SEQ ID NO. 18的311位置帶有T311I突變。這個askfto顯示降低的賴氨酸和或 蘇氨酸的反饋抑制。帶有上述功能性突變的高絲氨酸激酶在SEQ ID NO. 19的190位置帶 有T190A突變或在190位置帶有T190S突變或TTG起始密碼子。通過缺失負調控物(mcbR)(Rey, I), et al. (2005)Mol. Microbiol. ,56. 871-887， Rey，D. et al. (2003) J. Biotechnol.，103，51-65’ US2005074802)和 D-甲硫氨酸結合脂蛋 白(metQ)的核酸序列以及通過增加N5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(metF)的表達可進一 步改良帶有上述遺傳改變的谷氨酸棒桿菌起始生物體如M2014。在實施例5中描述相應菌 株如0M469。與DSM17322, M2014或0M469呈現(xiàn)相同或可比較的遺傳改變的菌株優(yōu)選是谷 氨酸棒桿菌起始生物體?？梢允莾?yōu)選的起始生物體的其他菌株包含除了上述起始菌株DSM17322，M2014或 0M469的遺傳改變之外,還包含增加的轉酮酶(tkt)活性和/或量。在一個特別優(yōu)選的實 施方案中，這樣的起始生物體涉及谷氨酸棒桿菌生物體,其中谷氨酸棒桿菌中tkt之前的 內源性啟動子被強啟動子所替換,優(yōu)選這種方法的原因在于轉酮酶基因,6-磷酸-葡糖酸 內酯酶，葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶和稱為OPCA的基因被組構在一個單操縱子內。因此，tkt 之前的強啟動子而不是內源性啟動子如λ ΡΕ啟動子允許伴隨性增加酶的量和/或活性，酶 涉及不包括轉酮酶的戊糖磷酸途徑和它們有利于甲硫氨酸表面。表現(xiàn)相應遺傳改變的起始 生物體是以下描述的Μ2543。人們增加棒狀細菌中戊糖磷酸途徑的酶的量可以通過增加基因拷貝數(shù)即編碼所 述酶的核酸序列拷貝數(shù)、通過增加轉錄、通過增及翻譯和/或其組合進行。
本領域技術人員已熟悉遺傳改變的類型,這是增加核酸序列的基因拷貝數(shù)、增加 轉錄和/或增加翻譯所需的。通常，人們增加編碼多肽的核酸序列的拷貝數(shù)可以通過在棒狀細菌中表達含有 編碼所述多肽的核酸序列的載體來進行。這樣的載體可以自主復制以便在棒狀細菌中穩(wěn) 定保留。在谷氨酸棒桿菌中表達多肽和戊糖磷酸途徑的酶的典型載體包括Bott, M.和 Eggeling, L.，eds, Handbook ofCorynebacterium glutamicum. CRC Press LLC, Boca Raton，F(xiàn)L ;Deb，J. K. et al. (FEMS Microbiol. Lett. (1999)，175 (1)，11-20)，Kirchner 0. et al. (J. Biotechnol. (2003)，104 (1-3), 287-299), ff()2006069711 和 W02007012078 描述的 pCliKpB 和 pEKOo
在棒狀細菌中，增加編碼多肽的核酸序列的拷貝數(shù)的另一個方法是將編碼這種多 肽的核酸序列的額外的拷貝數(shù)整合進入谷氨酸棒桿菌的染色體中。例如，染色體整合可發(fā) 生在各自多肽的內源性拷貝定位的基因座上。附加地和可選擇地,編碼多肽的核酸序列的 染色體擴增可發(fā)生在棒狀細菌基因組的其他基因座上。在谷氨酸棒桿菌中，本領域技術 人員已知存在多種方法通過染色體整合增加基因拷貝數(shù)。例如，一個這樣的方法是利用 載體 pK19sacB,已在Schafer A，et al. J Bacteriol. 1994176 (23) :7309-7319 的出版物 中詳細描述。用于編碼多肽的核酸序列的染色體整合的其他載體包括TO2005059093或 W02007011845 中描述的 pCLIK int SacB0通過增加編碼各自酶的核酸序列的轉錄也可以實現(xiàn)增加戊糖磷酸途徑中至少一 種酶的量。增加的轉錄將導致更多的mRNA和最終導致更高量翻譯的蛋白質。本領域技術人員已意識到有許多方法在棒狀細菌中增加編碼序列的轉錄。因此， 通過使用強啟動子和/或強增強子元件可增加轉錄。也可以使用轉錄激活物例如適體或過 表達轉錄因子。在本發(fā)明中優(yōu)選使用強啟動子。在本發(fā)明中如果一個啟動子與野生型條件下的各自核酸序列之前的內源性啟動 子比較能夠為編碼各自多肽的核酸序列提供更高程度的轉錄,它就被認為是“強啟動子”。為本發(fā)明目的，可以考慮使用以下啟動子=Psqd (SEQ ID N0. 9), PgroES (SEQ ID NO. 10)，Peftu (SEQ ID NO. 11)和λ PL (SEQ ID NO. 12)。這些啟動子通常用于谷氨酸棒桿菌 中以過表達多肽和在一些情況下考慮啟動子強度,但不是所有情況都是必要的，可按照以 下順序λ PL > Peftu > Psod > Pgeoes通過最佳化編碼各自酶的核酸序列的密碼子使用可實現(xiàn)翻譯的改進。如果使用宿 主酶的核酸序列，典型地改編密碼子用法不是必要的，但也可以應用。但是，通過在谷氨酸 棒桿菌中過表達大腸桿菌的各自序列增加例如ABO型轉運蛋白質的量,改編大腸桿菌蛋 白質的編碼序列以適合谷氨酸棒桿菌的密碼子使用是值得考慮的。在本發(fā)明的一些實施方案中，優(yōu)選地是例如在谷氨酸棒桿菌的btu操縱子....Ll所觀 察到的通過在各自的棒狀細菌和優(yōu)選在谷氨酸棒桿菌的染色體的內源性基因的位置上以 多拷貝整合各自核酸序列可以增加編碼ABO型轉運蛋白質的亞基的核酸序列的拷貝數(shù)。 這個方法通常盡可能地保持基因組的基因組完整性。本領域技術人員也熟悉多種下調由核酸序列編碼的蛋白質例如谷氨酸棒桿菌中 btu2操縱子的負調控蛋白質btuR2的量和/或活性的方法。下調例如btuR2的量和/或活性的典型方法是將遺傳性破壞編碼這個載體的內源性基因以便不再產生無功能的產物。在 可選擇的實施方案中，可在例如SEQID No. 1的內源性序列中導入突變，因此產生的蛋白質 對至少一種ABC 型轉運蛋白質的表達不產生負抑制作用或至少程度更低。也可以使用將 弱于內源性啟動子的啟動子放置在編碼負調控蛋白質如谷氨酸棒桿菌的btu操縱子內的 btuR2的核酸序列之前的方法。
通過改變一個堿基使啟動子與在“_35”或“-10”區(qū)的共有啟動子較少相似從而制 造較弱的啟動子。共有的“-35”區(qū)具有序列TTGACA,共有的“-10”區(qū)具有序列TATAAT。當然，本領域技術人員也已意識到可以聯(lián)合上述方法。因此，可以設想一種微生物 優(yōu)選地選自棒桿菌屬和甚至更優(yōu)選來自谷氨酸棒桿菌,其中編碼btuR2或其對應物的核酸 序列被破壞并且由于使用強啟動子導致例如SEQ ID No. 2，6和8編碼的ABC-型轉運蛋白 質或其對應物過表達。下表1給出在下文中更詳細討論的酶或蛋白質和編碼它們的基因的序列的 genebank登錄號的總結。引用的genebank登錄號指GenBank或在網頁ht.tp://www. ncbi. nlm. nih. gov/上找到或進入的其他公共數(shù)據庫。使用F表的序列進行“詢問”在同一網頁 上的“BLAST”程序可找到下表中列出的任意基因或蛋白質的許多同源物，這是本領域熟知 的。表1-在此特別提及的蛋白質和其同源物 以上登錄號是Genbank官方登錄號或在Genbank交叉引用的登錄號。這些號可以 在 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ ....匕搜索并找到0以下給出如何增加和減少谷氨酸棒桿菌中多肽和基因的量和/或活性的綜述。當 將以下實例中揭示的實施方案之外的實施方案實施時,本領域技術人員可依賴于這些信息。
曾力禾口/gg蒲關于增加量，要區(qū)分2個基本情況。第一種情況，通過表達各自蛋白質的外源性版 本增加酶的量。另一種情況,通過影響例如啟動子和/或增強子核糖體結合位點元件的活 性和/或在轉錄、翻譯或翻譯后水平調控各自蛋白質的活性的其他調控活性來增加內源性 蛋白質的表達。因此，通過不同途徑例如在轉錄、翻譯和蛋白質水平關閉抑制調控機制或與起始 生物體比較增加編碼這些蛋白質的核酸的基因表達實現(xiàn)蛋白質的活性和量的增加,例如通 過強啟動子和/或通過導入編碼轉酮酶的核酸誘導內源性轉酮酶。在一個實施方案中，通過導入編碼表1中酶的核酸進入棒狀細菌、優(yōu)選谷氨酸棒 桿菌中實現(xiàn)表1中酶的量和/或活性的增加。原則上,可使用具有表1或2中列出的蛋白質的酶活性的不同生物體的每種蛋白 質。真核來源的這樣酶的基因組核酸序列含有內含子，已經被加工的核酸序列如相應的 cDNA被用于以下情況，當宿主生物體沒有能力或不能產生剪接相應mRNA時。說明書中提及 的所有核酸可以是例如RNA、DNA或cDNA序列。依據本發(fā)明，增加或導入蛋白質的量典型地包括以下步驟a)產生載體,其以5' -3'方向包含以下核酸序列,優(yōu)選DNA序列-在本發(fā)明的生物體中具有功能的啟動子序列-可操作地連接編碼例如表1的蛋白質、其功能性同源物、功能性片段或功能性突 變版本的DNA序列-在本發(fā)明的生物體中具有功能性的終止序列b)將步驟a)的載體轉移至本發(fā)明的生物體例如谷氨酸棒桿菌中，任選地整合入 各自的基因組中。如上所述,功能性片段涉及編碼例如表1或2的酶的核酸序列的片段，其表達仍產 生具有各自全長蛋白質的酶活性的蛋白質。上述方法可用于增加編碼例如表1中的酶或其功能性片段的DNA序列表達。包含 調控序列如啟動子和終止序列的這樣載體的用途是本領域技術人員已知的。而且，本領域 技術人員已知如何將步驟a)的載體轉移至生物體如谷氨酸棒桿菌和載體必須具有哪些特 性才能被整合進它們的基因組。依據本發(fā)明，編碼表1中酶的核酸的基因表達的增加也被理解為操縱生物體特別 是谷氨酸棒桿菌的各自內源性酶的表達。這可以例如通過改變編碼這些酶的基因的啟動子 DKA序列實現(xiàn)。通過用強啟動子替換和缺失和/或插入DNA序列可以實現(xiàn)這樣的改變,其導 致這些酶的改變、優(yōu)選增加的表達率。內源性基因的啟動子序列的改造通常導致基因表達量的改變且因此也導致細胞 或生物體內可檢測活性的改變。
而且,通過不出現(xiàn)在轉化的生物體中的與這些基因的啟動子相互作用的調控蛋白 質可分別實現(xiàn)內源性基因的改變的和增加的表達。這樣的調節(jié)物可以是嵌合蛋白，其由DNA 結合結構域和轉錄激活物結構域組成,如WO 96/06166所述。增加內源性基因的活性和含量的進一步可能性是通過過表達方式上調涉及內源 性基因轉錄的轉錄因子。本領域技術人員已知檢測轉錄因子過表達的方法。 通過表達特異性與基因的啟動子序列結合的適體，例如表1中的內源性酶的表達 可以被調控。依賴于適體結合來刺激或抑制啟動子區(qū)域,例如表1中酶的量可增加。而且，通過內源性基因拷貝的靶定的誘變可以實現(xiàn)內源性基因活性的改變。通過影響酶的翻譯后修飾也可以實現(xiàn)編碼例如表1中酶的內源性基因的改變。這 可以例如通過相應的測量如過表達或基因沉默方法來調控酶例如涉及酶的翻譯后修飾的 激酶或磷酸酶的活性實現(xiàn)。在另一個實施方案中,可以改良酶的效率或其破壞的別構調節(jié)區(qū)以防止產生的化 合物的反饋抑制。同樣地,通過替換、缺失或添加可以缺失或修飾降解性酶以便在未損害細 胞生存力時對于表1中的所需的酶，其降解活性是減少的。在每種情況中，甲硫氨酸的總體 產量，產率或量是增加的。也可能例如表1的蛋白質的這種改變可以提高其他精細化學品例如其他含硫化 合物如半胱氨酸或谷胱甘肽,其他氨基酸,維生素,輔因子,營養(yǎng)品，核酸,核苷和海藻糖的 生產。任意一種化合物的新陳代謝與細胞內的其他生物合成和降解途徑交織在一切，在一 個途徑中的必需輔因子，中間體，或底物可以由另一個這樣途徑提供或限制。因此,通過調 節(jié)一或多種表1中蛋白質的活性和除甲硫氨酸之外的其他精細化學品的量,效率和速度可 被正影響。增加或導入表1中酶的量和/或活性的....t述策略不是限制性的；對這些策略的變 化對于本領域技術人員是明顯的。減少酶量和/或活性以上已陳述使用已優(yōu)化甲硫氨酸生產的起始生物體是優(yōu)選的。在谷氨酸棒桿菌中 例如用—F調metQ的活性?？色@得多種策略用于減少酶的量和/或活性。通過表達特異性結合基因的啟動子序列的適體可例如調節(jié)例如表1中的內源性 酶的表達。依賴于適體結合刺激或抑制啟動子區(qū)域,例如表1中酶的量和因此在這種情況 中活性減少。也可以以某種方式設計適體以便特異性結合酶自身和減少酶活性例如通過結合 各自酶的催化中心。本領域技術人員已知通過基于載體的過表達(見上)實現(xiàn)適體的表 達以及適體的設計和選擇(Famulok et. al. , (1999) CurrTop Microbiol Immunol.，243， 123-36)。而且，本領域技術人員已知通過多種實驗措施方法實現(xiàn)表1的內源性酶的量和/ 或活性的減少。這些措施通?？偨Y為術語“基因沉默”。例如,通過轉移具有以反向順序編 碼酶或其部分的DNA序列的上述載體到生物體如谷氨酸棒桿菌可以沉默內源性基因的表 達。這是基于事實即在細胞內轉錄這樣的載體產生RNA，其可與內源性基因轉錄的mRNA雜 交并因此防止其翻譯。
原則上，反義策略可以與核酶方法結合。核酶是具有催化活性的RNA序列，如 與反義序列結合，催化切割靴序列(Tanner et al.，(1999)FEMSMicrobiol Rev. 23 (3)， 257-75)。這可以增強反義策略的效率。
為產生同源重組微生物,制備包含編碼表1中酶的基因的至少一部分的載體，向 其中導入缺失,添加或取代以改變例如功能性破壞內源性基因。在另一個實施方案中，設計載體，以便在同源重組時內源性基因被功能性破壞 (即不再編碼功能性蛋白質)。或者，設計載體，以便在同源重組時內源性基因被突變或發(fā) 生其他改變但仍然編碼功能性蛋白質,例如上游調控區(qū)域可以被改變因此改變例如表1中 內源性酶的表達。這個方法具有的優(yōu)點是不完全廢除酶的表達,而是減少到所需的最小水 平。本領域技術人員已知哪種載體可用于替換或缺失內源性序列。對于谷氨酸棒桿菌，這 種載體包括PK19和pCLIK int sacB.以下提供在谷氨酸棒桿菌中破壞染色體序列的特異 性描述。而且,通過減少轉錄因子的量可以抑制基因。抑制靶蛋白質自身的因子也可被導入細胞。蛋白質_結合因子可以是例如上述適 體(Famulok et al.，(1999)Curr Top Microbiol Immunol. 243,123-36)。作為其他的蛋白質-結合因子，其表達導致表1中酶的量和/或活性的減少,可 考慮酶_特異性抗體。在本領域已知生產重組酶特異性抗體例如單鏈抗體。從文獻也 己知抗體的表達(Fiedler et al. , (1997) Immunotechnology 3,205-216 ；Maynard and Georgiou(2000)Annu. Rev. Biomed. Eng. 2,339-76)0本領域技術人員已熟知提及的技術。因此，本領域技術人員已知用于例如反義方 法的核酸構建體的典型大小和各自的核酸序列必須具有的互補性、同源性或相同性。本領 域技術人員已知術語互補性、同源性或相同性。術語互補性描述由于2個互補堿基之間的氫鍵，一個核酸分子與另一個核酸分子 雜交的能力。本領域技術人員已知2個核酸分子為了能夠相互雜交不是必須呈現(xiàn)100% 互補性。與另一個核酸序列雜交的一個核酸序列優(yōu)選地與所述其他核酸序列分別是至少 30 %，至少40 %，至少50 %，至少60 %，優(yōu)選至少70 %，特別優(yōu)選至少80 %，也特別優(yōu)選至少 90%，特別優(yōu)選至少95%和最優(yōu)選至少98或100%互補。典型地，反義序列與內源性raRNA序列的雜交在細胞狀態(tài)下在體內或體外發(fā)生。依 據本發(fā)明,在體內或體外足以確保特異性雜交的嚴格條件下進行雜交。本領域技術人員已知并能夠從文獻獲得嚴格體外雜交條件(見例如Sambrook et al. ,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (2001))。術語“特異性雜交”指其中 在嚴格條件下一個分子優(yōu)先與某個核酸序列(如這個核酸序列是復雜的混合物例如DNA或 RNA分子的一部分)結合的情況。因此，術語“嚴格條件”指核酸序列優(yōu)先與靶序列結合但是不或至少以明顯降低的 程度結合其他序列的條件。嚴格條件依賴于環(huán)境。在較高的溫度較長序列特異性雜交。通常，以這種方式即 雜交溫度位于具有明確的離子強度和明確的PH值的特異序列解鏈溫度(Tm)以下5°C來 選擇嚴格條件。Tm是溫度(具有明確的pH值，明確的離子強度和明確的核酸濃度)，在此 與靶序列互補的50%的分子與所述靶序列雜交。典型地,嚴格條件包含鹽濃度在0. 01到1. OM鈉離子之間(或另一種鹽離子)和PH值在7. 0和8. 3之間。對于短分子溫度是至少 300C (例如這種分子包含10到50個核酸)。此外，嚴格條件可包含添加不穩(wěn)定試劑如甲酰 胺。典型的雜交和沖洗緩沖液是以下組合物。預雜交溶液0.5% SDSSxSSC50mM NaPO4, pH 6. 80.1%焦磷酸鈉SxDenhardt ‘ s 試劑100 μ g/ 鮭魚精雜交溶液預雜交溶液lxl_06cpm/ml 探針(5-10 分鐘 95°C )20xSSC :3M NaCl0. 3M檸檬酸鈉用 IICl 調節(jié) pH750xDenhardt ‘ s 溶液5g Ficol :[5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白ad500 ml A. dest.雜交的典型步驟如下任選在lxSSC/0. 1 % SDS ψ 65°C洗 Blot 30 分鐘預雜交50_55°C至少2小時雜交55-60°C過夜洗05分鐘 2xSSC/0. 1 % SDS雜交溫度30 分鐘 2xSSC/0. 1 % SDS雜交溫度30 分鐘 lxSSC/0. 1 % SDS雜交溫度45 分鐘 0. 2xSSC/0. 1% SDS 65 °C5 分鐘 0. IxSSC 室溫為了反義目的，互補性超過100個核酸、80個核酸、60個核酸、40個核酸和20個核酸的序列長度是足夠的。更長的核酸長度當然也是足夠的。上述方法的聯(lián)合應用也是可能 的。依據本發(fā)明，如果使用在生物體內以5' -3'方向與活性啟動子可操縱連接的 DNA序列,通?？蓸嫿ㄝd體,轉移到生物體細胞之后,其分別允許編碼序列過表達或產生阻 抑或競爭和阻礙其表達的內源核酸序列和蛋白質。特定酶的活性也可以通過在生物體中過表達其非功能性突變體而減少。因此，不 能催化研究的反應、但是能夠結合例如底物或輔因子的非功能性突變體可以通過過表達超過內源性酶和因此抑制反應。為了減少宿主細胞內的酶的量和/或活性的其他方法已被本 領域技術人員所熟知。依據本發(fā)明，非功能性酶分別具有與其功能性酶和功能性片段基本相同的核酸序 列和氨基酸序列,但是在核酸或氨基酸的一些位置具有點突變、插入或缺失，其具有的作用 是所述非功能性酶不能或只是以非常有限的程度催化各自的反應。這些非功能性酶不能與 仍能夠催化各自反應的酶混合，但是不再是反饋調節(jié)的。依據本發(fā)明，術語“非功能性酶”不 包含這樣的蛋白質，在氨基酸水平和核酸水平上其分別與各自的功能性酶不具有基本的序 列同源性。因此，通過定義,不能催化各自反應和與各自酶不具有基本的序列同源性的蛋白 質不是本發(fā)明術語“非功能性酶”。在本發(fā)明范圍內非功能性酶是指失活的或無活性的酶。 因此，具有上述點突變、插入和/或缺失的本發(fā)明的例如表1中的非功能性酶的特 征在于與本發(fā)明例如表1中野生型酶或其功能性等價物部分具有基本的序列同源性。為確 定基本的序列同源性，應用上述相同性等級。載體和宿主細胞本發(fā)明的一方面涉及載體，優(yōu)選含....Ll述核酸序列的表達載體。在此所用，術語“載 體”指一種核酸分子，其能夠轉運與之連接的另一個核酸。一種載體類型是“質?！?其指圓形雙鏈DNA環(huán),其中連接了額外的DNA片段。另一 種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA片段被連接到所述病毒基因組中。在它們導入的宿主細胞中某些載體能夠自動復制(例如，具有細菌復制起點的細 菌載體和游離型哺乳細胞載體)。其他載體在導入宿主細胞時被整合進入宿主細胞基因組 并因此隨同宿主基因組復制。而且,某些載體能夠指導與其可操縱連接的基因的表達。在此這樣的載體稱為“表達載體”。通常，在重組DNA技術中經常以質粒的形式利用表達載體。在本說明書中，“質?！?和“載體”可被交替使用，質粒是最常使用的載體形式。但是，本發(fā)明傾向于包括其他形式 的表達載體如提供等效功能的病毒載體。本發(fā)明的重組表達載體可包含在宿主細胞中適于表達各自核酸的形式的上述核 酸，意味著所述重組表達載體包括以宿主細胞為基礎選擇的用于表達的一或多個調控序 列，其被可操縱地連接到被表達的核酸序列。為本發(fā)明目的，可操縱連接理解為啟動子、編碼序列、終止子和任選地其他調控元 件以每個調控元件根據其決定簇可以在表達編碼序列時完成其功能的方式的順序排列。在重組表達載體中，因此“可操縱地連接”指感興趣的核酸序列以允許表達所述 核酸序列的方式與調控序列連接(例如當載體被導入宿主細胞時在體外轉錄/翻譯系統(tǒng) 或宿主細胞中)。術語“調控序列”應包括啟動子，阻抑物結合位點，激活物結合位點，增 強子和其他表達控制元件(例如終止子或其他mRNA 二級結構元件)。例如在Goeddel ； Gene ExpressionTechnology :Methods in Enzymology 185，Academic Press,San Diego, CA (1990)中描述的這種調控序列。調控序列包括在多種類型宿主細胞中直接組成型表達核 酸序列的那些和僅在某些宿主細胞中直接組成型表達核酸序列的那些。優(yōu)選的調控序列是 例如啟動子如 COS—, tac_, trp-, tet_, trp_, tet_, Ipp-, lac-, lpp-lac, IacIq-, T7_, T5_, T3-，gal-, trc-, ara-, SP6-，amy, SP02，噬菌體 λ Pr(也表示為 λ PR)，噬菌體 λ P1 (也表 示為 λ Pl)，噬菌體 SPOlP15,噬菌體 SPOlP26, pSOD, EFTu, EFTs, GroEL，MetZ (最后 5 個來自谷氨酸棒桿菌)，其優(yōu)選用于細菌。額外的調控序列是例如來自酵母和真菌的啟動子，例如 ADCl，MFa，AC, P-60，CYCl，GAPDH, TEF, rp28, ADH, EN02，來自植物的啟動子例如 CaMV/35S， SSU, OCS, 1 ib4，usp，STLS1, B33，nos或泛素-或菜豆蛋白啟動子。也可能使用人工啟動子。 本領域技術人員可以理解設計表達載體可依賴于被轉化的宿主細胞的選擇，所需蛋白的表 達水平等這些因素。本發(fā)明的表達載體可被導入宿主細胞從而產生蛋白質或肽,包括由上 述修飾的核酸序列編碼的融合蛋白質或肽。 最常使用含指導融合或非融合蛋白表達的組成型或可誘導啟動子的載體在原核 生物中進行蛋白質的表達。融合載體將大量氨基酸加入在此編碼的蛋白質中,通常加到重組蛋白質的氨基末 端，但是也可加到C末端或融合于蛋白質的適合區(qū)域內。典型地這種融合載體適用于4個 目的1)增加重組蛋白質的表達；2)增加重組蛋白質的可溶性；和3)在親和純化中當作配 體幫助純化重組蛋白質；4)提供“標簽”用于后來的蛋白質檢測。通常,在融合表達載體中， 蛋白水解切割位點被導入融合部分與重組蛋白質連接處而能夠在純化融合蛋白質后從融 合部分分離重組蛋白質。這樣的酶和它們的直系同源物識別序列包括因子Xa，凝血酶和腸 激酶。典型的融合表達載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc ；Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988)Gene 67 :31_40), pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA)禾口 pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J)，它們分別融合谷胱甘肽S-轉移酶(GST)，麥芽糖E結 合蛋白或蛋白A。適合用于棒狀細菌的誘導型非融合表達載體的實例包括PHM1519, pBLl, pSA77 或 pAJ667(Pouwels et al. , eds. (1985)Cloning Vectors. Elsevier :New York IBSN 0444904018)。適合的谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌穿梭載體的實例是例如pK19，PClik5aMCS pCLIKint sacB或可以在Eikmanns等(Gene. (1991) 102，93-8)和在以下文獻和專利 申請(Schafer A, et al. J Bacteriol. 1994176 :7309_7319，Bott, M. and Eggeling, L. , eds.Handbook of Corynebacteriumglutamicum.CRC Press LLC, Boca Raton, FL W02006069711, W02006069711)中找到。其他適合原核和真核細胞的表達系統(tǒng)見 Scimbrook, J. et al. Molecular Cloning ·Λ Laboratory Manual. 3rd ed. , Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003的16和17章。通過常規(guī)轉化或轉染技術可將載體DNA導入原核生物中。在此，術語“轉化”和 “轉染”，“接合”和“轉導”指多種本領域公認用于導入外源核酸的技術(例如線性DNA或 RNA(例如線性化的載體或沒有載體的單獨基因構建體))或載體形式的核酸(例如質粒,噬 菌體,質粒,噬粒,轉座子或其他DNA進入宿主細胞,包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀，DEAE-葡 聚糖介導的轉染，脂轉染，自然感受態(tài)，化學物介導的轉移或電穿孔。適合轉化或轉染宿主 細胞的方法可在 Sambrook, et al. (Molecular Cloning ALciborcitory Manual. 3rd ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003)和其他實驗室手冊中找到。為了鑒定和選擇這些整合體，通常編碼可選擇標記物的基因(例如抗生素抗性) 與感興趣的基因被導入宿主細胞。優(yōu)選的可選擇標記物包括賦予對藥物如G418,潮霉素，卡那霉素，四環(huán)素,氯霉素,氨芐青霉素和氨甲蝶呤的抗性的那些。編碼可選擇標記物的核酸 在與編碼上述修飾的核酸序列相同的載體內被導入宿主細胞或在單獨的載體內被導入。通 過藥物選擇(例如已摻入可選擇標記物基因的細胞將存活，而其他細胞死亡)可鑒定穩(wěn)定 轉染導入的核酸的細胞。在另--個實施方案中，可制備含允許導入基因調控表達的選擇系統(tǒng)的重組微生 物。例如，在載體....t包括被置于在Iac操縱子控制下的一個上述核酸序列則僅在IPTG存在 時允許基因表達。本領域已知這樣的調控系統(tǒng)。本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明的重組表達載體已被導入其中的生物體或宿主 細胞。在此交替使用術語“宿主細胞”和“重組宿主細胞”?？梢岳斫膺@樣的術語不僅涉及 特定對象細胞，也涉及這種細胞的子代或潛在子代。由于突變或環(huán)境影響，某些修飾可在隨 后的世代出現(xiàn),事實上這種子代與親代可能不同，但仍包括在在此使用的術語范圍內。谷氨酸棒桿茼的牛長-培養(yǎng)棊和培養(yǎng)條件 以下是關于谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)的常規(guī)教導。改變對于本領域技術人員是明顯的， 從大腸桿菌培養(yǎng)的標準教科書上可取得相關信息。遺傳修飾的棒桿菌典型地在合成和天然生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。許多不同的棒桿菌 生長培養(yǎng)基是已知和容易獲得的(Lieb et al. (1989) App:L Microbiol. Biotechnol. , 32 205-210 ；von der Osten et al. (1998)Biotechnology Letters,11 11-16 ；Patent DE 4, 120,867 ；Liebl(1992)“ The Genus Corynebacterium, in :TheProcaryotes, Volume II, Balows,A.et al.，eds.Springer-Verlag)。這些培養(yǎng)基由一或多種碳源,氮源，無機鹽，維生素和微量元素組成。優(yōu)選的碳源 是糖,例如單糖,二糖或多糖。例如，葡萄糖,果糖,甘露糖,半乳糖，核糖，山梨糖，核糖,乳 糖，麥芽糖，蔗糖，棉子糖，淀粉或纖維素作為非常好的碳源。通過復雜化合物例如糖蜜或制糖來源的副產品也可能為培養(yǎng)基提供糖。提供不同 碳源的混合物也具有優(yōu)勢。其他可能的碳源是醇和有機酸,例如甲醇，乙醇，乙酸或乳酸。氮 源通常是有機或無機氮化合物,或包含這些化合物的材料。氮源的實例包括氨氣或氨鹽,如 NH4Cl或(NH4)2SO4, NH4OH,硝酸鹽，尿素，氨基酸或復合氮源如玉米漿，大豆粉，大豆蛋白，酵 母提取物，肉汁和其他。培養(yǎng)基中包括的無機鹽化合物包括鈣，鎂,鈉，鈷，鉬,鉀,錳,鋅，銅和鐵的氯化物， 磷化物或硫酸鹽?？稍谂囵B(yǎng)基中加入螯合物以保持溶液中的金屬離子。特別有用的螯合物 包括二羥基苯酚，如兒茶酚或原兒茶酸酯，或有機酸，例如檸檬酸。典型地，培養(yǎng)基也含有 其他生長因子，例如維生素或生長促進劑,實例包括生物素，核黃素，硫胺素，葉酸，煙酸，泛 酸鹽/酯和吡哆醇。生長因子和鹽通常來自復雜的培養(yǎng)基組分例如酵母提取物,糖蜜，玉 米漿和其他。培養(yǎng)基化合物的精確組成強烈依賴于直接實驗和對于特殊情況可單獨確定。 在教禾斗書“Applied Microbiol. Physiology, APractical Approach (. Eds. P. Μ. Rhodes, P. F. Stanbury,IRL Press (1997) pp. 53-73，ISBN 0199635773)中可獲得培養(yǎng)基最佳化的信 息。也可能從廠商選擇生長培養(yǎng)基如standard 1 (Merck)或BHI (谷心浸液，I)IFC0)或其 他。通過加熱(20分種，1. Sbar和121 )或滅菌過濾，所有培養(yǎng)基組分將被滅菌。組 分可以一起滅菌，或如果需要,分別滅菌。
所有培養(yǎng)基組分可以在生長初期存在,或任選連續(xù)加入或成批方式加入。每個實 驗分別定義培養(yǎng)條件。溫度應在15°C和45°C范圍之間。溫度可以恒定不變或在實驗過程中變化。培養(yǎng) 基PH可以在5到8. 5范圍,優(yōu)選大約7. 0,和通過加入緩沖液到培養(yǎng)基維持pH。為此,緩沖 液實例是磷酸鉀緩沖液。合成緩沖液如MOPS,HEPES, ACES和其他可選擇或同時使用。在生 長過程中加入NaOH或NH4OH也可能維持恒定的培養(yǎng)pH。如果利用復雜的培養(yǎng)基組分如酵 母提取物，額外緩沖液的必要性將減少，由于事實是許多復雜的化合物具有高緩沖能力。如 果利用發(fā)酵罐培養(yǎng)微生物,使用氣態(tài)氨也可以控制P:H。 培養(yǎng)時間通常從幾小時到幾天。選擇這個時間以允許最大量產物的積累在肉湯 中。在多種容器如微滴定板，玻璃管，不同規(guī)格的玻璃瓶或玻璃或金屬發(fā)酵罐中進行揭示的 生長實驗。為篩選大量克隆，在微滴定板，玻璃管或有或沒有擋板的搖瓶中培養(yǎng)微生物。優(yōu) 選地使用IOOml或250m:[搖瓶，裝滿10% (體積)所需生長培養(yǎng)基。搖瓶在旋轉搖蕩器上 搖動(振幅25mm),使用100-300rpm速度范圍。通過維持潮濕氛圍可以減少蒸發(fā)損失,可選 擇地，進行蒸發(fā)損失的數(shù)學修正。若檢測遺傳修飾的克隆，也應檢測未修飾的對照克隆或含基礎質粒的沒有任何插 入的對照克隆。培養(yǎng)基培養(yǎng)到0D600的值在0. 5-1. 5，使用細胞在瓊脂板上生長如已在300C 培養(yǎng)的CM板(10g/l葡萄糖,2, 5g/l NaCl, 2g/l尿素，10g/l多聚蛋白胨,5g/l酵母提取物， 5g/l肉湯，2g/l尿素，10g/l多聚蛋白胨，5g/l酵母提取物，5g/l肉湯，22g/l瓊脂，2M NaOH 調PlI 6. 8)。通過導入CM板上的谷氨酸棒桿菌細胞的鹽水懸液或加入這種細菌的預培養(yǎng)液 進行培養(yǎng)基接種。其他培養(yǎng)方法可從W()2()()7() 12078獲得。常規(guī)方法常規(guī)方法的方案可在關于谷氨酸棒桿菌的手冊中找到(2005)eds. :L. Eggeling, Μ.Bott. ， Boca Raton, CRC Press, at Martin 等.(Biotechnology(1987)5,137^146), Guerrero 等.(Gene (1994), 138, 35-41), Tsuchiya und Morinaga (Biotechnology (1988), 6，428-430)，Eikmanns 等· (Gene(1991)，102，93-98)，EP 0472869，US 4，601，893， Schwarzer and Ptlhler (Biotechnology (1991) ,9，84-87，Reinscheid 等.(Applied and Environmental Microbiology (1994) ,60, 126-132), LciBarre 等.(Journal of Bacteriology(1993),175,1001^1007), WO 96/15246, Malurabres 等.(Gene (1993), 134,15-24), inJP-A-10-229891, at.Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering(1998)，58，191-195)，Makrides(Microbiological Reviews(1996)，60， 512-538)在W02006069711,在W02007012078，和在已知的遺傳和分子生物學教科書中找 到。菌株,培養(yǎng)基和質粒例如從如下列表中選擇菌株谷氨酸棒桿菌ATCC 13032,醋谷棒桿菌ATCC 15806,嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC 13870,熱產氨棒桿菌FERM BP-1539，棲糖蜜棒桿菌ATCC 17965,
黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067,乳糖發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum) ATCC 13869，和叉開短桿菌(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020或從此來源的菌株例如谷氨酸棒桿菌KFCC10065, DSM 17322or谷氨酸棒桿菌ATCC21608重組DNA技術 在 Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis，Τ.，in Molecular Cloning ALaboratory Manual,3rd edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press, NT, Vol. 1,2,3,禾Π Handbook on Corynebacterium glutamicum(2005)eds. L. Eggeling, M. Bott.，Boca Raton, CRC Press 中可找至丨J方案。氨基酸和甲硫氨酸中間體的量化通過具有 guard cartridge 禾口 Synergi 4μηι 柱(MAX—RP 80 A, 150*4. 6mm) (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany)的 HPLC(Agilent 1100, Agilent, ffaldbronn, Germany)進行分析。注射之前,使用鄰苯二甲醛(OPA)和巰基乙醇作為還原劑(2-MCE)衍 生化分析物。額外的巰基使用碘乙酸封閉。以lml/ml速率使用40mM NaH2PO4 (洗脫液A， 使用NaOH調pH= 7.8)作為極性和甲醇水混合液(100/ )作為非極性相(洗脫液B)進行 分離。使用以下梯度起始0% B, 39分鐘39% B ；70分鐘64% B ； 100% B, 3. 5分鐘；2分 鐘，0%B平衡。按下述在室溫自動化衍生化。最初0.5μ1溶于N, N-二(羥乙基)甘氨 酸的0. 5%的2-MCE (0. 5Μ, pH 8. 5)與0. 5 μ 1細胞提取物混合。隨后加入1. 5 μ 1溶于N， N- 二(羥乙基)甘氨酸的50mg/ml碘乙酸，之后加入2. 5 μ 1的N，N- 二(羥乙基)甘氨酸 緩沖液(0. 5:Μ:,ρΗ 8. 5)。通過加入 0. 5 μ 1 溶于 1/45/54ν/ν/ν 的 2-MCE/MeOH/N，N- 二 (羥 乙基)甘氨酸(0. 5M, pH 8. 5)的lOmg/mlOPA試劑完成衍生化。最終使用32 μ 1 H2O稀釋 混合物。在以上的每個移液步驟之間等待1分鐘。然后，將總體積37. 5μ1注入柱。注意， 如果在(例如等待時間內)和樣品制備后定期清洗自動進樣針，分析結果可明顯改善。通 過熒光檢測器CMOnra激發(fā)，發(fā)射450nm, Agi lent, Waldbromi, Germany)進行檢測。為了量 化,將α-氨基丁酸(ABA)作為內標。定義重組方案以下將描述如何構建甲硫氨酸生產效率增加的谷氨酸棒桿菌完成以上預測的發(fā) 現(xiàn)。在描述菌株構建之前,給出將在以下使用的重組事件/方案的定義。在此使用的“Campbell in”涉及最初宿主細胞的轉化株,其中完整環(huán)形雙鏈DNA 分子(例如通過一次同源重組事件(交叉事件(cross-in event))使得基于pCLIK int sacB或pK19的質粒被整合進入染色體)，所述同源重組事件有效導致所述環(huán)形DNA分子的 線性化版本插入染色體的第一個DNA序列,其與所述環(huán)形DNA分子的第一個DNA序列同源。 “Campbelledin”涉及線性化的DNA序列,其已被整合進入“Campbell in”轉化株的染色體。 "Campbell in”含一副第一個同源的DNA序列，每個拷貝包括和環(huán)繞一個拷貝的同源重組交 叉點。名字來自于Alan Campbell教授,他最先提出這種重組。在此使用的“Campbell out”涉及從“Campbe:[ 1 in”轉化株延續(xù)的細胞，其中在包 含在“Campbelled in"DNA的線性化的插入的DNA中的第二個DNA序列和染色體來源的與 所述線性化的插入序列的第二個DNA序列同源的第二個DNA序列之間發(fā)生第二次同源重組事件(刪除事件(cross-outevent)),第二次重組事件導致缺失(jettisoning)部分整合的 DNA序列，但是，重要地，也導致部分整合的Campbelled in DNA(可以小到一個堿基)保留 在染色體中，所以與最初的宿主細胞比較，“Campbell out”細胞包含染色體內一或多個有 意的改變(例如單堿基取代,多堿基取代,異源基因或DNA序列的插入，額外一或多個拷貝 的同源基因或修飾的同源基因的插入，或包含超過一種以上列出的前述實例的DNA序列的 插入)。通過反向選擇包含于"Campbelled in” DNA序列一部分(所述部分要求是缺失的 (jettisoned))的基因，通常但不必須可獲得“Campbel丨out”細胞或菌株,例如枯草芽孢桿 菌sacB基因,其在存在5%到10%蔗糖時生長的細胞內表達是致死的。使用或不使用反向 選擇，通過篩選所需細胞使用任何可篩選表型可獲得或鑒定所需的"Campbell out"細胞， 可篩選表型例如但不局限于菌落形態(tài)，菌落顏色，存在或沒有抗生素抗性，存在或沒有聚合 酶鏈反應給出的DNA序列,存在或沒有營養(yǎng)缺陷型,存在或沒有酶,菌落核酸雜交,抗體篩 選等。術語“Campbell in”和“Campbell out”也可以多種時態(tài)用作動詞涉及上述方法或 步驟。
可以理解的是導致“Campbell in”或“Campbell out”的同源重組事件可發(fā)生在 同源DNA序列內的DNA堿基的一定范圍內，和因為同源序列在至少部分這個范圍內彼此之 間是相同的，因此通常不可能精確指明交叉事件在哪里發(fā)生。換言之，不可能精確指出哪個 序列來源于插入的DNA，和哪個來源于染色體DNA。而且，通常第一個同源DNA序列和第二 個同源DNA序列由部分非同源區(qū)域分開,和正是這個非同源區(qū)域在“Campbell out”細胞的 染色體中保持沉積。為了實用性,在谷氨酸棒桿菌中，典型的第一個和第二個同源DNA序列在長度上 為至少大約200個堿基對，和長度....t可達到幾千個堿基對，但是所述方法也可用于更短或 更長的序列。例如,第一個和第二個同源序列的長度范圍大約是500到2000個堿基，和通過 排列大約相同長度的第一個和第二個同源序列可容易地從“Campbell in”獲得“Campbell out ”,優(yōu)選地是少于200個堿基對的不同和最優(yōu)選地兩個序列中短的序列的堿基對至少是 長的序列長度的70%。Campbell in和out方法的描述可獲得自W02007012078。
實施例以下的實施例證明如何過表達導致甲硫氨酸生產增加的谷氨酸棒桿菌轉酮酶。但 是，這些實施例決不以任何方式限制本發(fā)明。搖瓶實驗和IIPLC分析用標準糖蜜培養(yǎng)基使用菌株一式二份或一式四份進行搖瓶實驗。IL培養(yǎng)基中 含有的蜜糖培養(yǎng)基40g 葡萄糖；60g 糖蜜；20g(NH4)2SO4 ；0. 4gMgS04*7H20 ；0. 6g KH2PO4 ； IOg 酵母提取物(DIFCO) ；5ml 的 400mM 蘇氨酸；2mg FeSO4 · TH2O ；2mg MnSO4 · H2O ；和 50g CaCO3 (Riedel-de Iiaen)，使用 ddli20 補足體積。使用 20% NH4OH 調 pli 到 7. 8，20ml 連續(xù)攪 動的培養(yǎng)基(為了保持CaCO3懸浮)加入到250ml有擋板的Bellco搖瓶和搖瓶被高壓滅 菌20分鐘。高壓滅菌后，每L基礎培養(yǎng)基加入4ml “4B溶液”(或80μ1/瓶)。每L含有 的“4Β溶液” :0. 25g鹽酸硫胺素(維生素Bl)，50mg氰鈷胺素(維生素B12)，25mg生物素， 1.25g鹽酸吡哆醇(維生素B6)和使用12. 5mM KPO4, pH 7. 0緩沖溶解生物素,和過濾滅菌。在--些實驗中，維生素B12的終濃度是變化的多于或少于標準濃度。在有擋板的瓶中培養(yǎng)， Bioshield紙覆蓋，通過橡皮筋固定，在New Brunswick Scientific fIoorshaker 上培養(yǎng)48 小時，28°C或30 °C, 200或300rpm。在24小時和/或48小時收樣品。離心去除細胞，之后 使用等體積60%乙腈稀釋上清液,然后使用Centriccm 0. 45 μ m離心柱經膜過濾溶液。使 用HPLC分析濾出液的甲硫氨酸、甘氨酸和高絲氨酸、0-乙酰高絲氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、 賴氨酸和其他指示的氨基酸的濃度。為了 HPLC分析，濾出的上清液使用0.45μπι過濾的ImM Na2EDTAWl 100稀釋和 使用溶于硼酸緩沖液(80inM NaBO3, 2. 5m:M: ΕΟΤΑ,ρΗ 10. 2)的 OPA 試劑(AGILENT)衍生 1 μ 1 溶液并注入200x4. Imm Hypersil 5 μ AA-ODS柱,在裝備G1321A熒光檢測器(AGILENT)的 Agilent 1100系列HPLC上運行。激發(fā)波長是338nm和監(jiān)測的發(fā)射波長是425nm。氨基酸 標準溶液色譜分析并且用于確定不同氨基酸的保留時間和標準峰面積。Agilent提供的附 帶軟件包Chem Station被用于設備控制,數(shù)據獲取和數(shù)據處理。硬件是HP奔騰4電腦,支 W Microsoft Service Pack(SP6a) ^frW Microsoft Windows NT 4.0。實驗1-產生M2014菌株 使用DNA A(也表示為 pH273) (SEQ ID NO 13)和“Campbelied in”轉化谷氨酸棒 桿菌菌株 ATCC 13032 產生“Campbell in”株。然后“Campbel :[edout”所述“Campbell in” 株產生“Campbell out”株M440,其含編碼反饋抗性高絲氨酸脫氫酶Oiomfbf)的基因。產生 的高絲氨酸脫氫酶蛋白質包括S393改變?yōu)镕393的氨基酸改變(表示為Hsdh S393F)。隨后使用DNA B (也表示為pH373) (SEQ ID NO 14)轉化菌株M440產生“Campbell iη，，株。然后，“ Campbel led out ” 所述“Campbel ！ in"株產生“Campbe ！ 1 out ” 株 M603，其 含編碼負反饋抗性天冬氨酸激酶(Askfto)(由IysC編碼)的基因。在產生的天冬氨酸激酶 蛋白質中，T311改變?yōu)?311 (表示為LysC T311I)。已發(fā)現(xiàn)菌株M603產生大約17. 4mM賴氨酸，而ATCC13032菌株未產生可測量量的 賴氨酸。另外，菌株M603生產大約0. SraM高絲氨酸,而ATCC13032菌株未產生可測量量的 高絲氨酸，總結于表2。表2 菌株ATCC13032和M603產生的高絲氨酸，0_乙酰高絲氨酸，甲硫氨酸和賴氨 酸的量 使用DNA C(也表示為 ρΗ304) (SEQ ID NO 15)轉化菌株M603 產生“Campbell in” 株。然后被“Campbelled out” 產生“Campbell out” 株 M690。M690 株包含 metli 基因(表 示為P497raetH)上游的PgroES啟動子。SEQ IDNO 10描述P497啟動子的序列。M690菌株產 生大約77. 2mM賴氨酸和大約41. 6mM高絲氨酸,在以下表3中顯示。表3 菌株M603和M690產生的高絲氨酸，0_乙酰高絲氨酸，甲硫氨酸和賴氨酸的量 隨后按以下步驟誘變Μ690菌株在BHI培養(yǎng)基(BECTON DICKINSON)中生長的過 夜培養(yǎng)的M603在50mM檸檬酸緩沖液pH 5. 5中洗滌，使用N 甲基-N-亞硝基胍(IOmg/ ml溶于SOraM檸檬酸鹽pH 5. 5)在30°C處理20分鐘。處理后，又使用SOraM檸檬酸緩沖 液pH 5. 5洗細胞,鋪板在含有以下成分的培養(yǎng)基中(所有提及的量按照500ml培養(yǎng)基計 算)IOg(NH4)2SO4 ；0. 5g KH2PO4 ；0. 5g K2HPO4 ；0. 125g MgS04*7H20 ；21g MOPS ；50mg CaCl2 ； 15mg原兒茶酸；0. 5mg生物素；Img硫胺素；和5g/l D, L-乙硫氨酸(SIGMACHEMICALS, CATAL0G#E5139),使用KOH調節(jié)到pH 7. 0。另外培養(yǎng)基包含0. 5ml微量金屬溶液，由IOg/ 1 FeS04*7H20 ； lg/1 MnSO4^H2O ；0. lg/!ZnS04*7H20 ；0. 02g/l CuSO4 ；和 0. 002g/l NiCl2*6H20 組成，所有溶于0. IMHCl。最終的培養(yǎng)基過濾滅菌和加入培養(yǎng)基中，加入40ml無菌50%葡 萄糖溶液(40ml)和無菌瓊脂到終濃度1.5%。包含瓊脂的最終培養(yǎng)基倒入瓊脂板并標記 為最小乙硫氨酸培養(yǎng)基。誘變的菌株散布在平板上(最小乙硫氨酸)在3CTC培養(yǎng)3-7天。 分離培養(yǎng)基中長出的克隆，在同樣的最小乙硫氨酸培養(yǎng)基上劃菌。選擇幾個克隆用于甲硫 氨酸生產分析。按以下步驟分析甲硫氨酸生產。菌株在CM-瓊脂培養(yǎng)基中30 生長2天,其含有 10g/l D-葡萄糖，2. 5g/l NaCl ；2g/l尿素；IOg/!細菌蛋白胨(DIFCO) ；5g/l酵母提取物 (DIFCO) ；5g/l牛肉萃取物(DIFCO) ；22g/l瓊脂(DIFCO)；和高壓大約121°C，20分鐘。菌株長出后，刮取細胞并重懸在0. 15M NaCl中。對于主要培養(yǎng)，在600nm的起 始OD加入刮取的細胞懸液至大約1. 5-IOml的培養(yǎng)基II (見下)和0. 5g固體和高壓的 CaCO3(RIEI)EL DE HAEN)和細胞培養(yǎng)于100ml無擋板搖瓶,在軌道平臺振蕩器上200rpm大約 30°C培養(yǎng)72小時。培養(yǎng)基II包含40g/l蔗糖；60g/l來自糖蜜的總糖(計算糖含量)；IOg/ 1 (NH4)2SO4 ；0. 4g/l MgS04*7H20 ；0. 6g/l KH2PO4 ；0. 3mg/l 硫胺素 *HC1 ； lmg/1 生物素；2mg/l FeSO4 ；和2mg/l MnSO4。使用NH4OII調節(jié)培養(yǎng)基至pH7. 8和高壓大約121°C，20分鐘。高壓 并冷卻后，加入過濾滅菌原液(200ug/ral)的維生素B12 (氰鈷胺素)(SIGMA CHEMICALS)至ij 終濃度100μ8·/1ο從培養(yǎng)基中獲取樣品并分析氨基酸含量。在Agilent 1100系列LC系統(tǒng) IIPLC(AGILENT)上使用Agilent氨基酸方法確定產生的氨基酸,包括甲硫氨酸。使用鄰苯二 甲醛的樣品的柱前衍生化允許在Hypersil AA-柱(AGILENT)上分離后量化生成的氨基酸。顯示至少是M690中的兩倍的甲硫氨酸滴度的克隆被分離。用于進一步實驗的 這個克隆命名為M1197和在2005年5月18日保藏在DSMZ菌株保藏中心，菌株編號DSM 17322。這個菌株的氨基酸生產與菌株M690的比較,總結于以下表4中。
表4 菌株M690和Ml 197產生的高絲氨酸,0-乙酰高絲氨酸，甲硫氨酸和賴氨酸的 使用DNA F(也表示為 pH399，SEQ ID NO :16)轉化菌株M1197 產生“Campbell in” 株。隨后,其被“Campbelled out”產生M1.494菌株。這個菌株包含高絲氨酸激酶基因上的 --個突變，導致產生的高絲氨酸激酶上T190到A190(表示為HskT190A)的一個氨基酸改 變。菌株M1494的氨基酸生產與菌株Ml 197的比較，總結于表5。表5 :菌株Ml 197和M1494產生的高絲氨酸，0-乙酰高絲氨酸，甲硫氨酸和賴氨酸 的量 使用DNA D (也表示為 pH484，SEQ ID NO :17)轉化菌株M1494產生“Campbell in" 株,其隨后被“Campbelled out”產生M1990菌株。使用groES-啟動子和EFTU (延伸因子 Tu)-啟動子(表示為P497P1284metY) ,M1990菌株過表達metY等位基因。P497P1284啟動子的序 列在SEQ ID N0:18列出。菌株M1494的氨基酸生產與菌株M1990的生產比較，總結于表6。表6 菌株M1494和M1990產生的高絲氨酸，0-乙酰高絲氨酸，甲硫氨酸和賴氨酸 的量 使用DNA E (也表示為 ρΗ 491, SEQ ID NO 19)轉化菌株 Μ1990 產生 “Campbell in”株,其然后被“Campbelled out”產生“Campbell out”菌株M2014。使用超氧化物岐化酶啟動子(表示為P3119HietA),M2014菌株過表達meU等位基因。P3119啟動子的序列在SEQ ID NO 9列出。菌株M2014的氨基酸生產與菌株M1990的生產比較，總結于表7。表7 菌株M1494和M1990產生的高絲氨酸，0-乙酰高絲氨酸，甲硫氨酸和賴氨酸 的量 實驗2-從M2014 缺失 mcbR通過整合和切除(見WO2004/050694A1)使用包含:RXA00655缺失(SEQ ID No. 20) 的質粒PH429導入mcbR缺失進入谷氨酸棒桿菌。質粒pH429轉化進入帶有卡那霉素抗性選擇的M2014菌株(Campbellin)0使用 sacB反向選擇，轉化菌株的卡那霉素敏感性衍生物被分離，假定通過切除已丟失整合的質 粒(Campbell out)。產生卡那霉素敏感性衍生物的轉化菌株產生小菌落和更大的菌落。 通過PCR篩選兩種大小的菌落檢測mcbR缺失的存在。無更大的菌落包含所述缺失,但是 60-70%的更小的菌落包含預期的mcbR缺失。在BHI板上當原始分離物劃菌為單菌落時，出現(xiàn)微小和小菌落的混合物。當所述 微小菌落在BHI上劃菌,再次出現(xiàn)微小和小菌落的混合物。當所述小菌落在BHI上劃菌，菌 落大小通常是小的和均勻的。命名為0M403-4和0M403-8的2個小的單菌落分離物被選擇 用于進一步研究。搖瓶實驗(表8)顯示0M403-8產生至少親代M2014的2倍量的甲硫氨酸。這個 菌株也產生少于M2014的1/5量的賴氨酸,提示天冬氨酸半醛到高絲氨酸的碳通量的轉移。 第三個顯著不同是相對于M2014, 0M403在異亮氨酸累積上有超過10倍的增加。在標準蜜 糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)物生長48小時。表8 在搖瓶培養(yǎng)中使用新鮮生長細胞接種，0M403菌株分離物的氨基酸生產 也顯示在表9中，相對于M2014，0M403在0-乙酰高絲氨酸的累積上有超過15倍 的減少。這個結果的最可能解釋是M2014中積累的大多數(shù)0-乙酰高絲氨酸被轉化為0M403 中的甲硫氨酸，高絲氨酸和異亮氨酸。在標準蜜糖培養(yǎng)基中生長培養(yǎng)物48小時。表9 :在搖瓶培養(yǎng)中使用新鮮生長的細胞接種,2個0M403的分離物的氨基酸生產 實驗3-減少metQ表達metQ基因的啟動子和5’部分被缺失以減少0M403-8中甲硫氨酸的輸入。metQ 基因編碼甲硫氨酸輸入復合物的一個亞基，其是復合物發(fā)揮功能所需的。這通過使用質粒 pH449 (SEQ ID NO 21)使用標準 Campbelling in 和 Campbelling out 技術實現(xiàn)。在搖瓶 分析中分析0M403-8和0M456-2的甲硫氨酸生產。結果(表10)顯示0M456-2比0M403-8 產生更多的甲硫氨酸。培養(yǎng)物在標準蜜糖培養(yǎng)基中生長48小時。表10 :0M456-2的搖瓶分析 實驗4-構建 0M469構建表示為0M469的菌株，其包含用0M456-2中的噬菌體λ Pk啟動子替換metF啟動子產生的metQ缺失和metF過表達。這使用質粒pOM427 (SEQ ID NO 22)使用標準 Campbelling in和Campbelling out技術實現(xiàn)。在搖瓶培養(yǎng)分析中分析4個0M469分離物 的甲硫氨酸生產，他們都比0M456-2產生更多的甲硫氨酸，顯示于表11。培養(yǎng)物在含有2mM 蘇氨酸的標準蜜糖培養(yǎng)基中生長48小時。 表11 搖瓶分析0M469,包含噬菌體λ Pk啟動子替換met.F啟動子的0M456-2的衍生物。 實驗5-構建 M2543使用SEQ ID NO. 23 (圖 la)描述的質粒 pCLIK5A int sacB PSOD TKT 通過電穿孔 轉化菌株0M469-2。這使用標準Campbelling in和Campbellingout技術完成。在搖瓶培養(yǎng)分析中，分析標記為M2543的OM 469PS0D TKT分離物的甲硫氨酸生 產,它們比0M469-2產生更多的甲硫氨酸。菌株M2543的結果顯示于表12。表12搖瓶分析0M469和M2543 實驗6-構建 0M513, 0M589，0M590，0M597 和 0M598采用可增加蛋白質metX, raetY和metF表達的復制質粒p()M474 (SEQII) No. 24)經 電穿孔轉化菌株0M469。產生的菌株命名為0M513。然后，構建2 個整合質粒 p0M511 (SEQ ID No. 25)和 p0M512 (SEQ IDNo. 26)以構建 使用λΡ,啟動子替換btu2操縱子啟動子的谷氨酸棒桿菌菌株。質粒P0M511用于構建菌株 0M589,僅包含λ P^啟動子替換的0Μ469衍生物。同樣地,質粒ρ()Μ512用于構建菌株0Μ590， 包含Δ btuR2和λ Pl啟動子替換的0Μ469衍生物。
使用標準Campbelling in和out技術通過轉化上述質粒p0M511和p0M512進入 0M469獲得菌株。隨后，上述復制質粒p0M474被轉化進入0M589和0M590分別產生0M597和0M598。評估假定影響btu2操縱子表達的修飾的作用的方法是在搖瓶培養(yǎng)物中檢驗更低 的維生素B12濃度對于菌株生長和甲硫氨酸生產的作用。如果不理想濃度大于抑制天然維 生素B12吸收系統(tǒng)表達所需的濃度時，F(xiàn)調維生素B12輸入將允許菌株在不理想濃度下更 有效地積累維生素B12。在搖瓶分析中，在4個不同的維生素B12濃度分析上述帶有btu2 操縱子修飾的菌株。表13所示結果指示菌株對于100 μ g/L濃度更低的維生素B12顯示 出明顯不同的反應。在這個維生素B12濃度,包含λΡ,啟動子修飾的2個菌株(0Μ597和 0Μ598)與缺少這個修飾的兩個菌株比較能利用更多的葡萄糖和產生更多的甲硫氨酸。表13-搖瓶分析 0Μ513, 0Μ597 和 OM 598 *在48小時培養(yǎng)結束時保持葡萄糖(g/1)此外，在發(fā)酵罐中在lmg/1維生素B12濃度下比較名稱為0M597和0M5982的2個 菌株。兩個菌株中包含Δ btuR2缺失的菌株產生最高的甲硫氨酸滴度(36小時，23g/:[比 20g/l)實驗7-構建 0M599通過從0M469缺失btuR2獲得表示為0M542的菌株。為此目的，經電穿孔將質粒 p()M495 (SEQ ID No. 27)轉化進入 0M469 和隨后 Campbel Iedin 和 Campbel led out 獲得菌株 0M542。使用p0M474轉化0M542獲得菌株0M462。此夕卜，質粒p0M513 電穿孔以及 Campbelled in 和 Campbelled out0M542 產生菌 株0M592，其包含驅動tkt基因和下游基因的Psqd啟動子。最終，使用復制質粒P0M474轉化0M592獲得菌株0M599。隨后，在搖瓶中使用含有10mg/l維生素B12的標準蜜糖培養(yǎng)基比較菌株0M562和 0M599的甲硫氨酸生產。0M513是對照，其是使用p0M474轉化的0M469。0M562比0M513明 顯產生更多的甲硫氨酸,和0M599產生的比0M562多(見以下表14)。表14-搖瓶分析0M513, 0M562和0M599 (所有都包含p0M474) *在48小時培養(yǎng)結束時保持葡萄糖(g/1)從表1.4可見，btuR2缺失導致維生素B12積累的改善。實驗8-構建 0M566通過從M2543缺失btuR2獲得表示為0M566的菌株。為此目的，經電穿孔將質粒 p0M495 (SEQ ID No. 27)轉化進入 M2543 和隨后 Campbelledin 和 Campbelled out 獲得菌株 0M566。為了確定維生素B12類維生素吸收,在含有和不含有添加lmg/1氰鈷素的BHI培 養(yǎng)基中生長細胞。過夜生長后，離心收集細胞和使用鹽溶液洗兩次(0.85% NaCl)。使用 Hybaid廠商描述的Ribolyzer程序裂解細胞。裂解的細胞離心和經維生素B12ELISA分析 稀釋的上清液。依據廠家描述使用R-Biopharra(Germany)的維生素B12ELISA試劑盒。依據廠商說明書使用緩沖液稀釋標準和細胞裂解樣品。在ELISA中,谷氨酸棒桿 菌的樣品稀釋為1 100到1 800。獲得ELISA線性反應曲線值和確定包含的B12類維 生素濃度。以250mg/ml的蛋白質濃度作為谷氨酸棒桿菌胞質的常規(guī)胞內蛋白質濃度。從 這個值和裂解物的蛋白質濃度,確定細胞裂解后樣品稀釋液的值。通常地，發(fā)現(xiàn)不同實驗的 B12測定的數(shù)值誤差為大約10%。細胞內B12類維生素的值反應細胞內羥鈷胺濃度，因為氰鈷素將被轉化為羥鈷 胺。發(fā)現(xiàn)當lmg/1維生素B12加入培養(yǎng)基時，菌株M2543顯示細胞內羥鈷胺從3 μ M強 烈增加到198 μ Mo無維生素Β12加入BHI培養(yǎng)基時發(fā)現(xiàn)缺失btuR2的M2543即菌株0M566的羥鈷 胺濃度產生40倍的增加(124 μ Μ)。當加入Β12時,在0Μ566中羥鈷胺濃度進一步增加到 183 μ M(見圖1)。結果顯示缺失btuR2功能性誘導谷氨酸棒桿菌菌株B1.2吸收系統(tǒng)。在本文中考慮以下出版物1 . Marsh, EN Essays Biochem. 1 999 ； 34 1 39-54. Coenzyme B12(cobalamin)-dependent enzymes.
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rrinoidadenosyl~transfer&ise from Lactobacillus reuteri.
權利要求
一種微生物，其被遺傳修飾以使得維生素B12的吸收效率增加。
2.權利要求1的微生物,其中所述效率增加通過下調維生素B12吸收系統(tǒng)實現(xiàn)。
3.權利要求2的微生物，其中所述維生素B12吸收系統(tǒng)包括編碼SEQIDNo. 2的至少一 種負調控蛋白質或其功能性同源物或片段和/或由SEQ IDNo. 4,6和8的亞基形成的至少 一種ABO型轉運蛋白質或其功能性同源物或片段的核酸序列。
4.權利要求3的微生物,其中編碼至少一種負調控蛋白質和至少一種ABC-型轉運蛋 白質的所述核酸序列被組構為操縱子以便所述至少一種負調控蛋白質調控所述至少一種 ABC-型轉運蛋白質的表達。
5.權利要求3或4的微生物,其中與不呈現(xiàn)遺傳改變的各自起始生物體比較,所述遺傳 改變使得所述至少一種負調控蛋白質的量和/或活性是至少部分減少的。
6.權利要求3到5任一項的微生物，其中與不呈現(xiàn)遺傳改變的各自起始生物體比較，所 述遺傳改變使得所述至少一種ABC-型轉運蛋白質的量和/或活性是至少部分增加的。
7.權利要求1到5任一項的微生物,其中所述微生物選自革蘭氏陽性微生物，優(yōu)選放線 桿菌和更優(yōu)選放線菌。
8.權利要求7的微生物，其中所述微生物選自棒桿菌屬和優(yōu)選谷氨酸棒桿菌。
9.權利要求1到8任一項的微生物，其中所述微生物是革蘭氏陽性微生物和其中所述 維生素B12吸收系統(tǒng)包括操縱子,其具有編碼SEQ ID No. 2的至少一種負調控蛋白質或其 功能性同源物或片段和包含SEQ ID No. 4,6和8的亞基的至少一種ABC-型轉運蛋白質或 其功能性同源物或片段的核酸序列。
10.權利要求9的微生物，其中所述微生物選自谷氨酸棒桿菌和其中所述維生素B12吸 收系統(tǒng)包括操縱子，其具有編碼與SEQ ID No. 2具有至少50%序列相同性的至少一種負調 控蛋白質和包含與SEQ ID No. 4,6和8具有至少50%序列相同性的亞基的至少一種ABC-型 轉運蛋白質的核酸序列。
11.權利要求10的微生物，其中與不呈現(xiàn)遺傳改變的起始生物體比較，所述遺傳改變 使得與SEQ ID No. 2具有至少50%序列相同性的所述至少一種負調控蛋白質的表達是至少 部分減少的，和其中所述遺傳改變使得包含與SEQ ID No. 4,6和8具有至少50%序列相同 性的亞基的所述至少一種ABC-型轉運蛋白質的表達是至少部分增加的。
12.權利要求11的微生物,其中與不呈現(xiàn)遺傳改變的起始生物體比較，所述遺傳改變 使得與SEQ ID No. 2具有至少50%序列相同性的所述至少一種負調控蛋白質的表達是完全 減少的。
13.權利要求11或12的微生物，其中與不呈現(xiàn)遺傳改變的起始生物體比較，其中包含 與SEQ ID No. 4，6和8具有至少50%序列相同性的亞基的所述至少一種ABC-型轉運蛋白 質的表達通過強啟動子和/或編碼所述亞基的核酸序列的拷貝數(shù)增加而至少是部分增加 的。
14.權利要求1到13任一項的微生物，其中與不呈現(xiàn)遺傳改變的起始生物體比較，一或 多種以下因子、其功能性同源物和/或功能性片段的量和/或活性由于所述遺傳改變而是 額外增加的-metA/X,-metZ/Y,-metF， -metH,-thrA， inetE，和/或其中與不呈現(xiàn)遺傳改變的起始生物體比較，一或多種以下因子、其功能性同源 物和/或功能性片段的量和/或活性由于所述遺傳改變而是減少的 —metK, _thr:B.
15.權利要求1到14任一項的微生物獲得生物合成需要維生素B12的精細化學品的用途。
16.權利要求15獲得甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸和甲硫氨酸亞砜的用途。
17.獲得生物合成需要維生素B12的精細化學品的方法,其包含步驟 -培養(yǎng)權利要求1到14任--項的微生物；-獲得所述精細化學品。
18.權利要求17的方法，其中所述精細化學品選自包含甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸和 甲硫氨酸亞砜的組。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有改良的維生素B12利用效率的微生物。
文檔編號C12R1/15GK101849017SQ200880020285
公開日2010年9月29日 申請日期2008年6月9日 優(yōu)先權日2007年6月15日
發(fā)明者A·黑羅爾德, C·克洛普羅格, H·施羅德, O·澤爾德, S·黑夫納, T·帕特松 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限責任公司