單個(gè)b細(xì)胞培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】單個(gè)B細(xì)胞培養(yǎng)方法
[0001] 本申請(qǐng)為2011年5月26日提交的、發(fā)明名稱(chēng)為"單個(gè)B細(xì)胞培養(yǎng)方法"的PCT申 請(qǐng)PCT/EP2011/058616的分案申請(qǐng)，所述PCT申請(qǐng)進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段的日期為2012年11 月28日，申請(qǐng)?zhí)枮?01180026559. 6。
[0002] 本文報(bào)導(dǎo)了得到由單個(gè)B細(xì)胞分泌的單克隆抗體的至少可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序 列的方法，所述單個(gè)B細(xì)胞是通過(guò)單細(xì)胞沉積和在飼養(yǎng)混合物存在下與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)從 來(lái)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的B細(xì)胞群中得到的。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 為了得到分泌單克隆抗體的細(xì)胞，廣泛使用Koehler和Milstein開(kāi)發(fā)的雜交瘤技 術(shù)。但是在雜交瘤技術(shù)中，只能融合和增殖從經(jīng)免疫的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中得到的B細(xì)胞的一部分。 B細(xì)胞的來(lái)源通常是經(jīng)免疫的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的器官，例如脾。
[0005] Zubler等人從1984年開(kāi)始開(kāi)發(fā)不同的方法用于得到分泌單克隆抗體的細(xì)胞（見(jiàn) 例如Eur.J.Immunol. 14 (1984) 357-63,J.Exp.Med. 160 (1984) 1170-1183)。其中從經(jīng)免疫的 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液中得到B細(xì)胞，并在包含細(xì)胞因子的飼養(yǎng)混合物的存在下與鼠EL-4B5飼 養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)。使用此方法，在共培養(yǎng)10-12天后可得到多達(dá)50ng/ml的抗體。
[0006]Weitkamp,J-H.，等人，（J.Immunol.Meth. 275(2003)223-237)報(bào)導(dǎo)了 從用熒 光病毒樣顆粒選擇的單個(gè)抗原特異性B細(xì)胞中生成針對(duì)輪狀病毒的重組人單克隆抗體。 在US2006/0051348中報(bào)導(dǎo)了生產(chǎn)針對(duì)多種同源抗原的多種分離的抗體的方法。在TO 2008/144763和W0 2008/045140中分別報(bào)導(dǎo)了針對(duì)IL-6的抗體及其用途，以及得到抗原特 異性B細(xì)胞的克隆群的培養(yǎng)方法。在US2007/0269868中報(bào)導(dǎo)了得到抗原特異性B細(xì)胞的 克隆群的培養(yǎng)方法。Masri等人（在Mol.Immunol. 44(2007)2101-2106中）報(bào)導(dǎo)了在大腸 桿菌（E.coli)中克隆和表達(dá)功能性Fab片段，所述片段從針對(duì)炭疽毒素的單個(gè)人淋巴細(xì)胞 中得到。在W0 2007/031550中報(bào)導(dǎo)了制備免疫球蛋白文庫(kù)的方法。
[0007] 發(fā)明概沐
[0008] 本文報(bào)導(dǎo)了從具有特殊性質(zhì)的B細(xì)胞群中分離B細(xì)胞的方法。首先，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物第 一次免疫后4周內(nèi)已經(jīng)可以分離誘導(dǎo)的抗體生產(chǎn)細(xì)胞，并可測(cè)定抗體的結(jié)合特異性。其次， 可通過(guò)以下任一步驟提高抗體生產(chǎn)細(xì)胞的數(shù)量和/或質(zhì)量（例如抗體生產(chǎn)/分泌能力）： i)預(yù)孵育步驟，和/或ii)離心步驟，和/或iii)淘選步驟。第三，可通過(guò)加入IL-21，或 IL-6,或SAC，或BAFF改善用于B細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)的飼養(yǎng)混合物。
[0009] 因此，在一個(gè)方面本文報(bào)導(dǎo)了選擇B細(xì)胞的方法，所述方法包括以下步驟：
[0010] a)任選地標(biāo)記B細(xì)胞群的B細(xì)胞，
[0011] b)單獨(dú)地共培養(yǎng)已沉積為單細(xì)胞的B細(xì)胞群的每個(gè)B細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞，
[0012] c)選擇在步驟b)中增殖并分泌抗體的B細(xì)胞。
[0013] 在一個(gè)方面，本文還報(bào)導(dǎo)了得到B細(xì)胞克隆的方法，所述方法包括以下步驟：
[0014] a)從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中得到B細(xì)胞，
[0015] b)標(biāo)記B細(xì)胞，
[0016] c)將標(biāo)記的B細(xì)胞沉積為單細(xì)胞，
[0017] d)單獨(dú)地共培養(yǎng)單細(xì)胞沉積的B細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞，
[0018] e)選擇在步驟d)中增殖并分泌抗體的B細(xì)胞并因此得到B細(xì)胞克隆。
[0019] 在另一個(gè)方面，本文報(bào)導(dǎo)了生產(chǎn)特異性結(jié)合靶抗原的抗體的方法，所述方法包括 以下步驟：
[0020] a)任選地用至少一種熒光染料標(biāo)記B細(xì)胞群的細(xì)胞，
[0021] b)在飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)混合物的存在下培養(yǎng)已在單獨(dú)的容器中沉積為單細(xì)胞的B 細(xì)胞群的每個(gè)B細(xì)胞，以得到單獨(dú)的B細(xì)胞克隆和培養(yǎng)物上清液，
[0022] c)選擇生產(chǎn)特異性結(jié)合靶抗原的抗體的B細(xì)胞克隆，
[0023] d)培養(yǎng)含有編碼特異性結(jié)合靶抗原的抗體的核酸的細(xì)胞，所述抗體由步驟c)中 選擇的B細(xì)胞克隆生產(chǎn)，或?yàn)槠淙嗽椿凅w，并從細(xì)胞或培養(yǎng)物上清液中回收抗體，從而生 產(chǎn)抗體。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括一個(gè)或多個(gè)以下步驟：
[0025] 在步驟c)后：cl)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR測(cè)定編碼抗體的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域和可變重鏈 結(jié)構(gòu)域的核酸序列，
[0026] 在步驟cl)后：c2)用包含編碼抗體可變輕鏈結(jié)構(gòu)域和可變重鏈結(jié)構(gòu)域的核酸序 列的核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0027] 在一個(gè)方面，本文還報(bào)導(dǎo)了生產(chǎn)抗體的方法，所述方法包括以下步驟：
[0028] a)提供（成熟的）B細(xì)胞群（從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液中得到），
[0029] b)用至少一種熒光染料（在一個(gè)實(shí)施方案中用1至3種，或2至3種熒光染料） 標(biāo)記B細(xì)胞群的細(xì)胞，
[0030] c)在單獨(dú)的容器中沉積經(jīng)標(biāo)記的B細(xì)胞群的單個(gè)細(xì)胞（在一個(gè)實(shí)施方案中，容器 是多孔板的孔），
[0031] d)在飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)混合物的存在下培養(yǎng)沉積的各個(gè)B細(xì)胞（在一個(gè)實(shí)施方案 中，飼養(yǎng)細(xì)胞是EL-4B5細(xì)胞，在一個(gè)實(shí)施方案中，飼養(yǎng)混合物是天然TSN，在一個(gè)實(shí)施方案 中，飼養(yǎng)混合物是合成的飼養(yǎng)混合物），
[0032] e)測(cè)定在各個(gè)B細(xì)胞的培養(yǎng)基中分泌的抗體的結(jié)合特異性，
[0033] f)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測(cè)序來(lái)測(cè)定特異性結(jié)合抗體的可變輕和重鏈結(jié)構(gòu) 域的氨基酸序列，并從而得到單克隆抗體可變輕和重鏈結(jié)構(gòu)域的編碼核酸，
[0034] g)為了表達(dá)抗體，將單克隆抗體可變輕和重鏈可變結(jié)構(gòu)域編碼核酸引入表達(dá)盒，
[0035] h)將核酸引入細(xì)胞，
[0036] i)培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中回收抗體，并從而生產(chǎn)抗體。
[0037] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在單細(xì)胞沉積以前，在 共培養(yǎng)培養(yǎng)基中孵育B細(xì)胞群的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，在約37°C進(jìn)行孵育。在一個(gè)實(shí) 施方案中，孵育進(jìn)行0.5至2小時(shí)。在特定的實(shí)施方案中，孵育進(jìn)行約1小時(shí)。在一個(gè)實(shí)施 方案中，在約37°C進(jìn)行孵育約1小時(shí)。
[0038] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在共培養(yǎng)以前離心單細(xì) 胞沉積的B細(xì)胞的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，離心進(jìn)行約1分鐘至約30分鐘。在特定的實(shí) 施方案中，離心進(jìn)行約5分鐘。在一個(gè)實(shí)施方案中，以約100xg至約l，000xg進(jìn)行離心。 在特定的實(shí)施方案中，以約300xg進(jìn)行離心。在一個(gè)實(shí)施方案中，以約300xg離心約5分 鐘。
[0039] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括緊接標(biāo)記步驟以前的以 下步驟：用固定的抗原淘選B細(xì)胞。
[0040] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)密度梯度離心從動(dòng)物血液中得到 B細(xì)胞群。
[0041] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在免疫后4天從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液中得到 B細(xì)胞群。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從在免疫后從4天到至少9天的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液中得到B細(xì) 胞群。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，從在免疫后從4天到9天的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液中得到B細(xì)胞群。
[0042] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)密度梯度離心分離B細(xì)胞群。
[0043] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞是成熟的B細(xì)胞。
[0044] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，用1至3種熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。在特 定的實(shí)施方案中，用2至3種熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。
[0045] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞的標(biāo)記導(dǎo)致總B細(xì)胞群的0. 1% 至2. 5%的細(xì)胞的標(biāo)記。
[0046] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞是小鼠B細(xì)胞，或倉(cāng)鼠B細(xì)胞， 或兔B細(xì)胞。
[0047] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，在多孔板的孔中進(jìn)行單細(xì)胞沉積。
[0048] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞是鼠EL-4B5細(xì)胞。
[0049] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體。
[0050] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記是IgG+⑶19+_B細(xì)胞，IgG+⑶38+_B 細(xì)胞，IgG+CD268+-B細(xì)胞，IgGCD138+-B細(xì)胞，CD27+CD138+-B細(xì)胞，或CD3CD27+-B細(xì)胞。
[0051] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述B細(xì)胞是小鼠來(lái)源的，且標(biāo)記是 IgG+CD19+-B細(xì)胞，和 / 或IgGCD138+-B細(xì)胞。
[0052] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述B細(xì)胞是倉(cāng)鼠來(lái)源的，且標(biāo)記是 IgG+IgM-B細(xì)胞。
[0053] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述B細(xì)胞是兔來(lái)源的，且標(biāo)記是 IgG+_B細(xì)胞和/或CD138+-B細(xì)胞，或CD138+IgG+-B細(xì)胞和/或IgG+IgM-B細(xì)胞。
[0054] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)是在補(bǔ)充了 10% (v/v) FCS，包含青霉素和鏈霉素的1% (w/v)的200mM谷氨酰胺溶液，2% (v/v)的100mM丙酮酸 鈉溶液，和1%&八）的說(shuō)2-(4-(2-羥乙基）-1-哌嗪）-乙烷磺酸〇^?￡3)緩沖液的1?^1 1640培養(yǎng)基中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述共培養(yǎng)培養(yǎng)基還包含0. 05mMf3-巰基乙醇。
[0055] 在本文報(bào)導(dǎo)的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案中，B細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)混合物共培 養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述飼養(yǎng)混合物是天然的胸腺細(xì)胞培養(yǎng)物上清液（TSN)或合成的 飼養(yǎng)混合物。
[0056] 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述飼養(yǎng)混合物是合成的飼養(yǎng)混合物。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述合成的飼養(yǎng)混合物包含白介素-10和腫瘤壞死因子a。在一個(gè)實(shí)施方案中，所 述合成的飼養(yǎng)混合物包含白介素-2 (IL-2)和/或白介素-10 (IL-10)。在一個(gè)實(shí)施方案中， 所述合成的飼養(yǎng)混合物還包含金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus)Cowans菌株細(xì)胞 (SAC)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述合成的飼養(yǎng)混合物包含白介素-21 (IL-21)。在一個(gè)實(shí)施方 案中，所述合成的飼養(yǎng)混合物包含腫瘤壞死因子家族的B細(xì)胞活化因子（BAFF)。在一個(gè)實(shí) 施方案中，所述合成的飼養(yǎng)混合物包含白介素-6 (IL-6)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述合成的飼 養(yǎng)混合物包含白介素(IL-4)。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在存在胸腺細(xì)胞培養(yǎng)物上清液作為飼養(yǎng)混合物時(shí)進(jìn)行共培 養(yǎng)。在特定的實(shí)施方案中，從年輕動(dòng)物胸腺的胸腺細(xì)胞中得到胸腺細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
[0058] 在一個(gè)實(shí)施方案中，得到B細(xì)胞克隆的方法還包括以下步驟：
[0059] f)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測(cè)序測(cè)定由步驟e)的選擇的B細(xì)胞克隆生產(chǎn)的抗 體的可變輕和重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并從而得到單克隆抗體氨基酸可變結(jié)構(gòu)域序列。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選自小鼠、倉(cāng)鼠和兔。
[0061] 發(fā)明詳沐
[0062] 本文報(bào)導(dǎo)的方法允許快速表征從單獨(dú)的B細(xì)胞克隆得到的單克隆抗體的結(jié)合特 異性，即在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的第一次免疫4周內(nèi)可分離誘導(dǎo)的抗體生產(chǎn)細(xì)胞，并可測(cè)定從其生產(chǎn) 的抗體的結(jié)合特異性，其中根據(jù)B細(xì)胞共培養(yǎng)物上清液中的抗體量/濃度可進(jìn)行至少4種 不同的實(shí)驗(yàn)。
[0063]免痔：
[0064] 通常使用非人動(dòng)物，例如小鼠、兔、倉(cāng)鼠和大鼠作為評(píng)估基于抗體的療法的動(dòng)物模 型。因此，經(jīng)常需要提供結(jié)合非人動(dòng)物抗原以及人抗原的交叉反應(yīng)性抗體。本文報(bào)導(dǎo)的方 法可用于提供交叉反應(yīng)性抗體。在本文報(bào)導(dǎo)的方法中，可使用從例如小鼠、倉(cāng)鼠和兔中得 到的B細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，小鼠是NMRI-小鼠或balb/c-小鼠。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，倉(cāng)鼠選自亞美尼亞倉(cāng)鼠（灰倉(cāng)鼠（Cricetulusmigratorius))、中國(guó)倉(cāng)鼠（黑線(xiàn)倉(cāng)鼠 (Cricetulusgriseus))和敘利亞倉(cāng)鼠（金黃倉(cāng)鼠（Mesocricetulusauratus))。在特定的 實(shí)施方案中，倉(cāng)鼠是亞美尼亞倉(cāng)鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，兔選自新西蘭白（NZW)兔、齊默爾 曼兔（ZIKA)、Alicia突變株兔、basilea突變株兔、具有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因兔、 rblgM敲除兔，及其雜種。
[0065] 在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇進(jìn)行免疫的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，例如小鼠、倉(cāng)鼠和兔不大于12周。
[0066] B細(xì)胞的來(lái)源和分離：
[0067] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液提供了高多樣性的抗體生產(chǎn)B細(xì)胞。從中得到的B細(xì)胞分泌的抗 體在CDR內(nèi)幾乎不具有相同或重疊的氨基酸序列，因此顯示了高多樣性。
[0068] 在一個(gè)實(shí)施方案中，得到從免疫后4天直到免疫或最近的加