用于細(xì)胞培養(yǎng)的方法
【專利說明】用于細(xì)胞培養(yǎng)的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)的方法。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明涉及使用一種或多種IaI(間 a胰蛋白酶抑制劑（inter-alphatrypsininhibitor)或間a抑制劑）蛋白或其部分作 為細(xì)胞培養(yǎng)基的組分或細(xì)胞培養(yǎng)表面材料上的包被層用于細(xì)胞培養(yǎng)的方法。此外，本發(fā)明 涉及細(xì)胞培養(yǎng)基和以一種或多種IaI蛋白或其部分提供的細(xì)胞培養(yǎng)包被層/基質(zhì)。
[0002] 發(fā)明背景 多能干（PS)細(xì)胞例如胚胎干（ES)細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干（iPS)細(xì)胞具有在長(zhǎng)期培養(yǎng)期 間維持多能性并且仍誘導(dǎo)分化成多種譜系的能力，因此潛在地提供用于例如基礎(chǔ)研究、毒 理學(xué)篩選、遺傳病癥的體外建?；蛑委熜约?xì)胞置換的新的細(xì)胞來源。直到可完全實(shí)現(xiàn)這些 終點(diǎn)之前，仍有許多障礙要克服。例如尋找支持安全、簡(jiǎn)單和穩(wěn)健的衍生化、生長(zhǎng)、維持和大 規(guī)模擴(kuò)增，同時(shí)保持這些難以培養(yǎng)的細(xì)胞的自我更新的培養(yǎng)條件會(huì)是必要的。尤其重要的 是需要用于體外維持人PS細(xì)胞的方法。這些方法必須足夠好以維持細(xì)胞群而不誘導(dǎo)誘變、 高水平的分化或多能性的喪失。
[0003] 小鼠ES細(xì)胞廣泛用于基礎(chǔ)研究以例如研究正常和病理性發(fā)育和功能，且使用這 些細(xì)胞獲得的知識(shí)常常轉(zhuǎn)移到人類系統(tǒng)中。現(xiàn)今使用的大多數(shù)小鼠ES(mES)細(xì)胞系生長(zhǎng) 在補(bǔ)充了選定批次的胎牛血清（FBS)和白血病抑制因子（LIF)的培養(yǎng)基中的預(yù)先平板接種 去有絲分裂活性的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF)飼養(yǎng)細(xì)胞上。飼養(yǎng)細(xì)胞提供支持mES細(xì)胞附 著和分泌提高mES細(xì)胞生長(zhǎng)存活和繁殖的各種生長(zhǎng)因子的基質(zhì)，而FBS提供激素和必需營(yíng) 養(yǎng)物，以及改變培養(yǎng)基的生理/生理化學(xué)性質(zhì)。LIF顯著提高mES細(xì)胞多能性的衍生化和 維持。已衍生出一些mES細(xì)胞系，并已適應(yīng)在含有血清和LIF的培養(yǎng)基中0. 1%明膠包被層 (存在于膠原中的高平均分子量的水溶性蛋白質(zhì)的異質(zhì)混合物，并從牛皮膚提取）上無飼 養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)。這兩種細(xì)胞培養(yǎng)方案有缺點(diǎn)，其組分（即FBS、牛血清白蛋白或BSA、明膠）中 的許多不確定，并且是動(dòng)物來源的。例如，F(xiàn)BS含有各種生長(zhǎng)因子和促進(jìn)ES細(xì)胞生長(zhǎng)的其 它不確定的組分，但它還表明含有可能影響mES細(xì)胞平板接種效率、生長(zhǎng)和分化的潛在分 化因子。因此FBS批次需要預(yù)先篩選和ES-合格以確保維持mES細(xì)胞維持和生長(zhǎng)的血清因 子的凈作用超過分化誘導(dǎo)因子的作用。飼養(yǎng)細(xì)胞反過來（intheirturm)分泌過多的無法 控制的因子，并且是致病性污染的可能來源。
[0004] 為了加強(qiáng)控制ES細(xì)胞實(shí)際上遇到什么因子，并且為了避免來自非所需的因子的 干擾，已建立了若干更新的和更確定的方案。在2003年，已表明BMP4可與LIF組合有效 地在不含血清和飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中用于mES衍生化和維持（Qi，Li等人，2004)。在2004 年，開發(fā)了化學(xué)上確定的（未描述確切配方）合成的敲除血清替代品（syntheticknockout serumreplacement，K0SR)以替代血清。然而，KOSR在缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)不能單獨(dú)支持mES 單細(xì)胞培養(yǎng)。在2008年，表明了mES可在缺乏血清和飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)作為自由漂浮的球體保持 在含LIF和bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）的N2補(bǔ)充培養(yǎng)基，本文稱為ESN2培養(yǎng)基中 (Andang，Moliner等人，2008,Moliner，Enfors等人，2008)。
[0005] 最近，加入B27和N2補(bǔ)充培養(yǎng)基中的補(bǔ)充2種抑制劑，促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK)激酶（MEK)抑制劑H)0325901和糖原合酶激酶3 (GSK3) 抑制劑CHIR99021的另一種確定的培養(yǎng)基（本文稱為2i培養(yǎng)基）顯示，在不加入外源因子 的情況下維持mES細(xì)胞自我更新（Ying，Wray等人，2008)。培養(yǎng)在2i培養(yǎng)基中的小鼠ES細(xì) 胞仍對(duì)LIF起反應(yīng)，所述LIF提高克隆效率和增殖速率。這個(gè)培養(yǎng)方案的缺點(diǎn)是在血清不存 在時(shí)，細(xì)胞不附著于組織培養(yǎng)板，而替代地作為自由漂浮的球體生長(zhǎng)（Tamm，PijuanGalito 等人，2013);而且，mES細(xì)胞的生長(zhǎng)速率降低。
[0006] 人PS(hPS)細(xì)胞及其分化細(xì)胞最常被在含有動(dòng)物來源的組分的存在的表面或培 養(yǎng)基的存在下培養(yǎng)，所述組分例如飼養(yǎng)層（小鼠來源的（通常為MEF)和人來源的（通常人 包皮成纖維細(xì)胞或HFF)二者）、Matrigel? (Engelbreth-Holm-SwarmEHS腫瘤的可溶性基 底膜提取物）、敲除血清替代品（KOSR)和/或衍生物如BSA。加入培養(yǎng)環(huán)境的這些動(dòng)物來 源的試劑使細(xì)胞暴露于潛在有害的病毒或其它感染劑中，其可能轉(zhuǎn)移給患者或損害hPS細(xì) 胞的一般培養(yǎng)和維持。另外，這類生物制品對(duì)于批次改變、免疫應(yīng)答和有限的存放期是脆弱 的，并且如果細(xì)胞待用于細(xì)胞療法，則細(xì)胞暴露于來自其它物種的分子還產(chǎn)生可在接受者 中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的改變。
[0007] 迄今為止，已描述了幾個(gè)利用化學(xué)上確定的培養(yǎng)基和合成的或確定的表面的完 全重組的無異源物（xeno-free)系統(tǒng)。人PS細(xì)胞培養(yǎng)中的最新成就發(fā)表于2011年的 Nature方法，其描述了化學(xué)上減少且完全確定的培養(yǎng)基，名為E8,只含8種不同的化學(xué)組 分，可支持hiPS細(xì)胞衍生化和在Matrigel?或基于玻連蛋白的表面上更成功的培養(yǎng)（Chen， Gulbranson等人，2011)。即使如此，當(dāng)使用確定的培養(yǎng)基時(shí)，不同的細(xì)胞系和不同的實(shí)驗(yàn) 室仍獲得不同的結(jié)果，而且最廣泛使用的方案對(duì)于hPS細(xì)胞依然是Matrigel?和mTESRl? (其含有從FBS純化的BSA)的組合；對(duì)于mES細(xì)胞為明膠包被層和補(bǔ)充FBS的培養(yǎng)基。而 且，如果不是在ROCK抑制劑分子（即Y-27632)的存在下，hPS細(xì)胞不能作為單細(xì)胞分裂 (Watanabe，Ueno等人，2007)，并且對(duì)于常規(guī)傳代需要使用和緩分離技術(shù)以團(tuán)塊分裂，這證 實(shí)了胞外環(huán)境對(duì)多能干細(xì)胞的關(guān)鍵作用。
[0008] 仍急需了解未分化未突變的多能干細(xì)胞的生長(zhǎng)和維持所必需的所有不同的組分。 重要的是得到胞外基質(zhì)（ECM)和培養(yǎng)基因子的正確組合用于最佳維持，特別用于人PS細(xì)胞 系，否則細(xì)胞顯示低的附著率、存活率和增殖速率以及高的分化水平。
[0009] 為了細(xì)胞存活和增殖速率，用于細(xì)胞培養(yǎng)的當(dāng)前方案在細(xì)胞培養(yǎng)基中仍使用FBS 或衍生物例如BSA，因此，仍需要不損害細(xì)胞、培養(yǎng)條件或多能性的改良的無血清方案。
[0010] 發(fā)明概述 在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)促進(jìn)細(xì)胞黏著和長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)活力的因子。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明 提供在部分或完全化學(xué)上確定的培養(yǎng)基存在下，間a胰蛋白酶抑制劑（laI)家族蛋白質(zhì) 或其部分，具體地說HC2 (重鏈2)作為表面包被層和/或培養(yǎng)基添加劑用于細(xì)胞黏著和長(zhǎng) 期培養(yǎng)、多能干細(xì)胞的維持和生長(zhǎng)至少20次傳代，而不誘導(dǎo)顯而易見的分化或核型異常的 新的用途。
[0011] 因此，第一方面，本發(fā)明提供用于干細(xì)胞或祖細(xì)胞培養(yǎng)的方法，所述方法包括將來 自IaI(間a胰蛋白酶抑制劑）蛋白質(zhì)家族的一種或多種蛋白質(zhì)或其部分加入細(xì)胞的無 血清培養(yǎng)物中。細(xì)胞優(yōu)選為干細(xì)胞。本發(fā)明的添加會(huì)促進(jìn)自我更新、附著、存活，且在PS細(xì) 胞的情況下，還促進(jìn)多能性。IaI蛋白或其部分自血清分離、作為重組蛋白產(chǎn)生或以化學(xué)方 法合成。
[0012] 細(xì)胞優(yōu)選為黏著細(xì)胞，而在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是PS(多能干）細(xì)胞，并 且可為ES(胚胎干）細(xì)胞或iPS(誘導(dǎo)多能干）細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞 為人細(xì)胞。
[0013] 優(yōu)選IaI蛋白或其部分選自IaI(laIHC1、IaIHC2和尿抑胰酶素）或 IaIH2，B?？梢允褂肐aI蛋白的重鏈，例如來自IaI的重鏈2 (HC2)。
[0014] 在PS細(xì)胞的情況下，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)是無血清的。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方案中，IaI蛋白或其部分作為包被劑包被在細(xì)胞培養(yǎng)表面，所述表 面例如塑料、載體、支架、基質(zhì)或網(wǎng)。
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，將IaI蛋白或其部分加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0017] IaI蛋白或其部分的濃度為〇?I)ig/ml-200Pg/ml、優(yōu)選2-100Pg/ml、最優(yōu)選 10-50 噸/ml培養(yǎng)基或包被溶液。
[0018] 本發(fā)明的方法適于在至少20次傳代期間不誘導(dǎo)細(xì)胞分化或突變的細(xì)胞培養(yǎng)。在 細(xì)胞培養(yǎng)后，可制備/提供PS細(xì)胞用于例如細(xì)胞療法、藥物篩選和毒性測(cè)定法。
[0019] 第二方面，本發(fā)明提供包含濃度為〇?IKg/ml-200Pg/ml、優(yōu)選2-100Pg/ml、最優(yōu) 選10-50 呢/ml的IaI蛋白或其部分的細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清培養(yǎng)基。
[0020] 第三方面，本發(fā)明提供包含以上述濃度含有IaI蛋白或其部分的