專利名稱：干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在短期內(nèi)使干細(xì)胞以高產(chǎn)量分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及通過在特別適合于分化步驟的不同培養(yǎng)基和時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)，使干細(xì)胞分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、感光細(xì)胞前體細(xì)胞、感光細(xì)胞和其它視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及按照所述方法產(chǎn)生的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、感光細(xì)胞前體細(xì)胞、感光細(xì)胞和其它視網(wǎng)膜細(xì)胞，包含所述細(xì)胞的用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的組合物，以及利用所述組合物治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的方法。
背景技術(shù)：
失明是由于生理學(xué)或神經(jīng)學(xué)原因而喪失視覺感知的醫(yī)學(xué)病癥。數(shù)以千萬計(jì)的人(占世界人ロ的O. 2-0. 5%)受到失明的影響，并且在個(gè)人、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)方面正遭受巨大的損失。視網(wǎng)膜光受體退化是先天或通過其它多種因素引起的失明的更占主導(dǎo)地位的病因之一，包括視網(wǎng)膜發(fā)育異常、視網(wǎng)膜退化、老年黃斑退化、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜色素變性、先天性視網(wǎng)膜失養(yǎng)癥、Leber先天性黑朦、視網(wǎng)膜脫落、青光眼、視神經(jīng)病變和外傷。迄今還沒有開發(fā)出用于對(duì)這類疾病進(jìn)行基礎(chǔ)治療的藥物。到目前為止，用新的感光細(xì)胞替換這些視網(wǎng)膜疾病的α型和ω型異常感光細(xì)胞被認(rèn)為是唯一有前景的療法。感光細(xì)胞植入被認(rèn)為通過延遲或抑制視網(wǎng)膜退化、再生退化的視網(wǎng)膜以及增強(qiáng)視網(wǎng)膜功能來預(yù)防失明或恢復(fù)有缺陷的視力。干細(xì)胞已經(jīng)成為用于視網(wǎng)膜疾病的細(xì)胞療法的有用備選者，所述干細(xì)胞包括骨髄干細(xì)胞(BMSC)、臍帶血干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞(RSC)、胚胎干細(xì)胞(ESC)、誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)和體細(xì)胞核移植細(xì)胞(SCNT)。對(duì)于干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞(尤其是感光細(xì)胞)以及基于此的細(xì)胞療法還沒有得出有意義的研究結(jié)果。這些干細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化可使以下幾點(diǎn)成為可能I)保證了用于有效細(xì)胞療法的無限細(xì)胞來源，2)識(shí)別尚不清楚的由胚胎細(xì)胞和視網(wǎng)膜前體細(xì)胞成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化機(jī)制，3)發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜分化相關(guān)基因和分子及其損傷，4)理解視網(wǎng)膜退化性疾病的發(fā)病機(jī)理，以及5)開發(fā)用于預(yù)防視網(wǎng)膜退化和保護(hù)視網(wǎng)膜的藥物。自從其首次確立，人胚胎干細(xì)胞系就被認(rèn)為具有分化成為用于多種疾病的細(xì)胞療法的有用的各種類型細(xì)胞的能力。當(dāng)人胚胎干細(xì)胞允許在臨床治療中精確檢查發(fā)病機(jī)理并提供能夠替代異常細(xì)胞的新鮮細(xì)胞時(shí)，其似乎具有高潛能。在完全確定的可再生條件下產(chǎn)生人ESC來源的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞及其在移植法中的用途保證了其是用于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞相關(guān)疾病的極其有力且有效的療法。假設(shè)人ESC來源的細(xì)胞與通過正常分化過程所形成的細(xì)胞具有相同的性質(zhì)和功能。基于這種假設(shè)，以與產(chǎn)生以下細(xì)胞的發(fā)育階段相似的條件下誘導(dǎo)分化表達(dá)胰激素的內(nèi)分泌細(xì)胞(D’Amour, et al.，Nat. Biotechnol.，2006 ；24:1392-401)、神經(jīng)元(Pankratz, et al. , Stem Cells 2007;25:1511-20)、肌細(xì)胞(Barberi et al. , Nat. Med. , 2007 ; 13:642-8)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(Wang, et al. , Nat.Biotechnol. , 2007 ;25:317_8)。并且，已經(jīng)進(jìn)行多次嘗試來將人ESC分化成為可有效用于治療視網(wǎng)膜疾病的感光細(xì)胞，但是大多數(shù)情況都以失敗告終。
實(shí)際上，從人胚胎干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞是在該領(lǐng)域內(nèi)迄今為止所作出的最大成就，但是從視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞卻失敗了(分化率低于O. 01%)(Lamba, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006 ； 103:12769-74)。一項(xiàng)報(bào)道稱，人胚胎干細(xì)胞被成功誘導(dǎo)分化成為感光細(xì)胞，但是其中所用的方法對(duì)于分化總共需要超過200天，而其中的分化率低至8%,因此不可能用于臨床治療失明(Osakada et al. , Nat. Biotechnol. , 2008 ；26:215-24)。發(fā)明概述技術(shù)問題由本發(fā)明人對(duì)人ESC分化成為感光細(xì)胞進(jìn)行了廣泛且深入的研究而產(chǎn)生了本發(fā)明，產(chǎn)生以下發(fā)現(xiàn)在既不用基因植入也不用與視網(wǎng)膜組織共培養(yǎng)的條件下，化學(xué)限定的用于分化成為感光細(xì)胞的體外條件允許人干細(xì)胞在四周內(nèi)以高產(chǎn)量分化成為感光細(xì)胞，所述體外條件與體內(nèi)條件相似。并且最終分化的細(xì)胞群體比起始人胚胎干細(xì)胞更高260倍，因而可應(yīng)用于臨床移植。解決問題的方案因此，本發(fā)明的目的是在無需基因植入和與視網(wǎng)膜組織共培養(yǎng)的條件下，通過在化學(xué)限定的條件下實(shí)施與體內(nèi)胚胎發(fā)育相似的分化過程，提供誘導(dǎo)干細(xì)胞在較短的時(shí)間內(nèi)以高產(chǎn)量分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞(包括大量的感光細(xì)胞及其祖細(xì)胞)的方法。本發(fā)明的另一目的是提供根據(jù)所述方法所產(chǎn)生的感光細(xì)胞及其祖細(xì)胞，以及包括它們的視網(wǎng)膜細(xì)胞，當(dāng)這些細(xì)胞被植入退化或受損的視網(wǎng)膜時(shí)，能夠在其中植入并融合。本發(fā)明的又一目的是提供包含視網(wǎng)膜細(xì)胞的用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的組合物，所述視網(wǎng)膜細(xì)胞包括感光細(xì)胞及其祖細(xì)胞和其它類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞。本發(fā)明的還ー目的是提供用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的方法，所述方法包括將所述組合物給予有需要的個(gè)體。發(fā)明的有益效果如上文所述，通過實(shí)施與體內(nèi)胚胎發(fā)育相似的分化過程能夠使干細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)以高產(chǎn)量分化成為大量感光細(xì)胞，當(dāng)所分化的感光細(xì)胞被植入到退化或受損的視網(wǎng)膜吋，能夠在視網(wǎng)膜內(nèi)植入并融合，從而預(yù)防或治愈視網(wǎng)膜退化。并且由本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的參與視網(wǎng)膜分化的新基因和分子能用于檢查由此引起的視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的病因，井能開發(fā)出用于預(yù)防視網(wǎng)膜退化并保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)元的藥物。附圖簡(jiǎn)要說明圖I是細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡照片(A)左圖，來自第28代的細(xì)胞在培養(yǎng)5天之后，處于未分化狀態(tài)的hESC的典型細(xì)胞絮凝物(29代；40X放大倍數(shù))。通過與鄰近的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞明確分離來表征。具有光滑的表面和均勻的形態(tài)。(A)右圖，從圖IA左圖的hESC絮凝物分離之后，在超低吸附平板培養(yǎng)4天的懸浮聚集物(40X放大倍數(shù))。球形形態(tài)，每個(gè)懸浮聚集物由大約292±53個(gè)細(xì)胞組成。(B)-(D).分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡照片。
⑶.誘導(dǎo)分化后第14天，即在懸浮聚集物被轉(zhuǎn)移至聚D賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板并在其中培養(yǎng)10天的細(xì)胞，其為誘導(dǎo)未分化的hESC分化后的第14天。觀察到細(xì)胞從懸浮聚集物分離并經(jīng)歷分化。分化早期的細(xì)胞形態(tài)具有較少的細(xì)胞質(zhì)和既圓又大的細(xì)胞核。(C).誘導(dǎo)分化后第19天的細(xì)胞，即未分化的hESC在誘導(dǎo)分化19天后的細(xì)胞。這些細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，并伴隨活性増殖?；钚詨堉澈头只癄顟B(tài)下的細(xì)胞絮凝物形成漩渦排列或玫瑰樣結(jié)構(gòu)。(D).誘導(dǎo)分化后第21天的細(xì)胞，顯示出由活性增殖導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量的増加。這些細(xì)胞變得更富含細(xì)胞質(zhì)，且它們的細(xì)胞核大小比圖IC中進(jìn)行分化的細(xì)胞的細(xì)胞核更小。這些細(xì)胞似乎起對(duì)光響應(yīng)的作用。(E)-(H).誘導(dǎo)分化后第29天的細(xì)胞絮凝物的各種形態(tài)。(E).大多數(shù)細(xì)胞，尤其是在細(xì)胞密集區(qū)所觀察到的細(xì)胞的形態(tài)。隨著分 化的進(jìn)行，與誘導(dǎo)后第21天的細(xì)胞相比，細(xì)胞顯示出相同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但具有更豐富的細(xì)胞質(zhì)和更小且更致密的細(xì)胞核。(F).細(xì)胞稀少區(qū)的細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞絮凝物表現(xiàn)出方向性井向依賴于細(xì)胞簇的某個(gè)點(diǎn)移動(dòng)。觀察到更豐富的向兩端聚集的細(xì)胞質(zhì)和紡錘樣的細(xì)胞核。(G).細(xì)胞絮凝物，某些具有多個(gè)神經(jīng)束。(H)左圖，細(xì)胞絮凝物，某些顯示出長(zhǎng)的神經(jīng)軸突。(H)右圖，細(xì)胞絮凝物，某些表現(xiàn)出分化的神經(jīng)元的形態(tài)。*顯微鏡視野(A)(左圖，右圖40X放大倍數(shù))；(B)_(G)(左圖50X放大倍數(shù)；右圖200 X放大倍數(shù))；(H)(左圖和右圖200 X放大倍數(shù))。圖2顯示視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)志物Crx、恢復(fù)蛋白(recoverin)、視紫紅質(zhì)(rhodopsin)、外周蛋白2(peripherin2)和Ki67的表達(dá)水平隨培養(yǎng)時(shí)間的變化。圖3是ー組顯示向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天所獲得的細(xì)胞并對(duì)恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)(二者指示感光細(xì)胞)進(jìn)行免疫染色的顯微鏡照片。在hESC被誘導(dǎo)分化成為感光細(xì)胞之后，對(duì)感光細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。受試的分化細(xì)胞中超過80%對(duì)恢復(fù)蛋白(通用感光細(xì)胞標(biāo)志物)和視紫紅質(zhì)(視桿細(xì)胞特有的)為陽性。(A)和(B).分化的感光細(xì)胞絮凝物。(C).細(xì)胞稀少區(qū)的個(gè)體細(xì)胞恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)在分化的感光細(xì)胞中表達(dá)不同。*顯微鏡視野(A) 100 X放大倍數(shù)；(B) 200 X放大倍數(shù)；(C) 400 X放大倍數(shù)。*合并對(duì)恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)進(jìn)行熒光免疫染色的細(xì)胞的疊加照片。表達(dá)兩種抗原的細(xì)胞顯黃色(緑+紅)。+合并/DAPI =DAPI是細(xì)胞核染色的細(xì)胞群。合并/DAPI圖像是用于檢測(cè)恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)表達(dá)以及DAPI表達(dá)的疊加熒光照片，同時(shí)顯示了細(xì)胞輪廓和兩種抗原的表達(dá)模式。圖4是誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天之后所獲得的細(xì)胞的熒光顯微鏡照片，顯示了感光細(xì)胞標(biāo)志物視紫紅質(zhì)、rom-1和外周蛋白2的表達(dá)。觀察到分化的感光細(xì)胞表達(dá)Rom-I和外周蛋白2 ( 二者是視紫紅質(zhì)陽性的視桿細(xì)胞外段特有的)。
(A).對(duì)視紫紅質(zhì)和rom-1都為陽性的細(xì)胞絮凝物。(B).對(duì)視紫紅質(zhì)和rom-1都為陽性的個(gè)體細(xì)胞。在每個(gè)細(xì)胞中，視紫紅質(zhì)和!·om-1在明顯不同的位置處表達(dá)。隨著分化的進(jìn)行，視紫紅質(zhì)在內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而rom-1定位在最外部的細(xì)胞質(zhì)。(C).對(duì)視紫紅質(zhì)和外周蛋白2都為陽性的分化的感光細(xì)胞的絮凝物。(D).對(duì)視紫紅質(zhì)和外周蛋白2都為陽性的個(gè)體細(xì)胞。*顯微鏡視野(A) 100X放大倍數(shù)；(B)400X放大倍數(shù)；(C) 100X放大倍數(shù)；(D)400X放大倍數(shù)。圖5是誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天后所獲得的細(xì)胞的熒光顯微鏡照片，顯示了感光細(xì)胞標(biāo)志物視紫紅質(zhì)、光導(dǎo)蛋白(phosducin)和Pde6b的表達(dá)。這些蛋白負(fù)責(zé)對(duì)光響應(yīng)， 表明分化的感光細(xì)胞表現(xiàn)出其特有的功能。(A).對(duì)視紫紅質(zhì)和光導(dǎo)蛋白都為陽性的分化的感光細(xì)胞的絮凝物。 ⑶.對(duì)視紫紅質(zhì)和光導(dǎo)蛋白都為陽性的個(gè)體細(xì)胞。(C).對(duì)視紫紅質(zhì)和Pde6b都為陽性的分化的感光細(xì)胞的絮凝物。⑶.對(duì)視紫紅質(zhì)和Pde6b為陽性的個(gè)體細(xì)胞。*顯微鏡視野(A) 100X放大倍數(shù)；(B)400X放大倍數(shù)；(C) 100X放大倍數(shù)；(D)400X放大倍數(shù)。圖6是誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天后所獲得的細(xì)胞的熒光顯微鏡照片，顯示了感光細(xì)胞標(biāo)志物視紫紅質(zhì)和突觸蛋白(synaptophysin)的表達(dá)。(A).對(duì)視紫紅質(zhì)和突觸蛋白都為陽性的分化的感光細(xì)胞的絮凝物。這些蛋白的表達(dá)表明，分化的感光細(xì)胞與其它視網(wǎng)膜神經(jīng)元發(fā)生突觸相互作用，并參與視網(wǎng)膜神經(jīng)回路的形成。(B).對(duì)視紫紅質(zhì)和突觸蛋白為陽性的個(gè)體細(xì)胞。*顯微鏡視野㈧100 X放大倍數(shù)；⑶400 X放大倍數(shù)。圖7是誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天后所獲得的細(xì)胞并針對(duì)視錐細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的熒光顯微鏡照片。左圖，對(duì)藍(lán)視蛋白(blue opsin)為陽性的細(xì)胞絮凝物。右圖，對(duì)藍(lán)視蛋白為陽性的個(gè)體細(xì)胞。藍(lán)視蛋白的表達(dá)表明分化的細(xì)胞是藍(lán)視蛋白-視錐細(xì)胞。*顯微鏡視野(左)100 X放大倍數(shù)；(右)400 X放大倍數(shù).圖8是誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天后所獲得的細(xì)胞的并對(duì)典型的感光細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的熒光顯微鏡照片。觀察到已經(jīng)歷進(jìn)ー步分化的各種類型的細(xì)胞。左圖，對(duì)恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)都為陽性的細(xì)胞，顯示了感光細(xì)胞的特有形態(tài)。中圖，對(duì)突觸蛋白和視紫紅質(zhì)為陽性的細(xì)胞，顯示了進(jìn)ー步的成熟分化。右圖，通過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)豐富的視紫紅質(zhì)分子表征的視紫紅質(zhì)陽性細(xì)胞。*顯微鏡視野400 X放大倍數(shù)。圖9是誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天后所獲得的細(xì)胞并針對(duì)神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和感光細(xì)胞前體細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的熒光顯微鏡照片。(A).對(duì)Rax和Pax6都為陽性的細(xì)胞絮凝物。
(B).對(duì)Rax和Pax6都為陽性的個(gè)體細(xì)胞。觀察到大多數(shù)細(xì)胞都表達(dá)兩種抗原，但是它們之間的表達(dá)水平不同，這表明分化誘導(dǎo)29天后所獲得的視網(wǎng)膜細(xì)胞來源于神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。(C).對(duì)增殖性標(biāo)志物Ki67和感光細(xì)胞前體細(xì)胞標(biāo)志物Crx為陽性的細(xì)胞絮凝物。(D).對(duì)Ki67和Crx都為陽性的個(gè)體細(xì)胞。大多數(shù)Crx陽性細(xì)胞不表達(dá)Ki67。這與感光細(xì)胞前體細(xì)胞離開細(xì)胞增殖周期后立即表達(dá)Crx這一事實(shí)相符。有吋，少量Crx陽性細(xì)胞仍繼續(xù)表達(dá)Ki67。*顯微鏡視野(A)IOOX放大倍數(shù)；(B)400X放大倍數(shù)；(C) 100X放大倍數(shù)；(D)400X放大倍數(shù)。

圖10是誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天后所獲得的細(xì)胞并針對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞而非感光細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的熒光顯微鏡照片。(A).對(duì)Islet-I和NF-200都為陽性的細(xì)胞絮凝物(左)和個(gè)體細(xì)胞，這證實(shí)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞核和軸突分別對(duì)Islet-I和NF-200為陽性。(B).對(duì)PKC-α為陽性的細(xì)胞絮凝物(左)和個(gè)體細(xì)胞(右)，這證實(shí)為雙極細(xì)胞。(C).對(duì)Prox-I為陽性的細(xì)胞絮凝物(左)和個(gè)體細(xì)胞(右)，這證實(shí)為水平細(xì)胞。⑶.對(duì)GFAP為陽性的細(xì)胞絮凝物(左)和個(gè)體細(xì)胞(右)，這證實(shí)為米勒膠質(zhì)細(xì)胞。(E).對(duì)Rpe65和Z0_1都為陽性的細(xì)胞絮凝物(左)和個(gè)體細(xì)胞(右)，這證實(shí)為視網(wǎng)膜色素上皮。*顯微鏡視野(A).左，100 X放大倍數(shù)，右，400 X放大倍數(shù)；(B)左，100 X放大倍數(shù)，右，400 X放大倍數(shù)；(C)左，100X放大倍數(shù)，右，400 X放大倍數(shù)；(D)左，100X放大倍數(shù)，右，400 X放大倍數(shù)；(E)左，100X放大倍數(shù)，右，400 X放大倍數(shù)。圖11是分別用BIO和purmorphamine而不是Wnt3a和Shh誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天所產(chǎn)生的細(xì)胞并針對(duì)感光細(xì)胞前體細(xì)胞和感光細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的熒光顯微鏡照片。(A).對(duì)增殖性細(xì)胞標(biāo)志物Ki67和感光細(xì)胞前體細(xì)胞特異性抗原Crx都為陽性的細(xì)胞絮凝物。(B).對(duì)Ki67和Crx都為陽性的個(gè)體細(xì)胞。(C).對(duì)感光細(xì)胞標(biāo)志物恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)為陽性的細(xì)胞絮凝物。(D).對(duì)恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)為陽性的個(gè)體細(xì)胞。*顯微鏡視野(A)IOOX放大倍數(shù)；(B)400X放大倍數(shù)；(C) 100X放大倍數(shù)；(D)400X放大倍數(shù)。圖12是分別用BIO和purmorphamine而不是Wnt3a和Shh誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天所產(chǎn)生的細(xì)胞并針對(duì)感光細(xì)胞標(biāo)志物視紫紅質(zhì)、外周蛋白2和rom-1進(jìn)行免疫染色的熒光顯微鏡照片。(A).對(duì)視紫紅質(zhì)和外周蛋白2都為陽性的細(xì)胞絮凝物。(B).對(duì)視紫紅質(zhì)和外周蛋白2都為陽性的個(gè)體細(xì)胞。(C).對(duì)視紫紅質(zhì)和rom-1都為陽性的細(xì)胞絮凝物。⑶.對(duì)視紫紅質(zhì)和IOm-I都為陽性的個(gè)體細(xì)胞。
*顯微鏡視野(A) IOOX放大倍數(shù)；(B)400X放大倍數(shù)；(C) 100X放大倍數(shù)；(D)400X放大倍數(shù)。圖13是分別用BIO和purmorphamine而不是Wnt3a和Shh誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天所產(chǎn)生的細(xì)胞并針對(duì)視錐細(xì)胞進(jìn)行免疫染色的熒光顯微鏡照片。左圖，藍(lán)視蛋白陽性的細(xì)胞絮凝物。右圖，藍(lán)視蛋白陽性的個(gè)體細(xì)胞。*顯微鏡視野(左)100X放大倍數(shù)；(右)400X放大倍數(shù)。圖14是人iPSC的顯微鏡照片。(A).細(xì)胞形態(tài)顯微鏡照片。(A)左圖，來自第43代的細(xì)胞在培養(yǎng)6天后處于未分化狀態(tài)的人iPSC的典型細(xì)胞絮凝物(第43代；顯微鏡視野40X放大倍數(shù))。通過與鄰近 的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞明確分離來表征。具有光滑的表面和均勻的形態(tài)，這也是未分化的hESC所特有的。(A)右圖，從圖14A左圖的人iPSC絮凝物分離后，在超低吸附平板培養(yǎng)4天的懸浮聚集物(顯微鏡視野40X放大倍數(shù))。(B)對(duì)特征標(biāo)志物進(jìn)行免疫染色的未分化的人iPSC的熒光顯微鏡照片。細(xì)胞絮凝物中的大多數(shù)細(xì)胞對(duì)SSEA4和Nanog都為陽性，這證實(shí)保持在未分化狀態(tài)。*顯微鏡視野(最左)40X放大倍數(shù)；(其它)100X放大倍數(shù)。圖15是ー組顯示誘導(dǎo)人iPSC向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天所獲得的細(xì)胞并對(duì)恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)(二者均為感光細(xì)胞特有的)進(jìn)行免疫染色的顯微鏡照片。分析由人iPSC分化的感光細(xì)胞的感光細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)。(A).分化的感光細(xì)胞絮凝物。(B).低細(xì)胞密度區(qū)的個(gè)體細(xì)胞。(C).細(xì)胞稀少區(qū)的個(gè)體細(xì)胞?；謴?fù)蛋白和視紫紅質(zhì)在分化的感光細(xì)胞中表達(dá)不同。*顯微鏡視野(A) 100 X放大倍數(shù)；(B) 400 X放大倍數(shù)；(C) 400 X放大倍數(shù).圖16是顯示對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞特異的基因的RT-PCR照片。利用RT-PCR測(cè)定通過誘導(dǎo)未分化的hESC向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天所產(chǎn)生的細(xì)胞中與視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、感光細(xì)胞和其它視網(wǎng)膜細(xì)胞相關(guān)的基因的mRNA表達(dá)水平。(A).視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特異的基因 RAX (495bp)、PAX6 (275bp)、SIX3 (307bp)、SIX6 (272bp)、LHX2 (285bp)和 CHXlO (281bp)的 RT-PCR 產(chǎn)物。其中，RAX 和 PAX6 的表達(dá)程度同定量對(duì)照基因GAPDH (PCR產(chǎn)物大小302bp) —樣高。相比之下，在RT-PCR產(chǎn)物中未見發(fā)育中的大腦皮層相關(guān)基因ARX(462bp)，發(fā)育中的中胚層基因T(541bp)或發(fā)育中的內(nèi)胚層基因AFP (318bp)，這表明本發(fā)明的方法特異地針對(duì)視網(wǎng)膜相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。(B).感光細(xì)胞和其它視網(wǎng)膜細(xì)胞相關(guān)基因的RT-PCR產(chǎn)物。通過RT-PCR擴(kuò)增觀察到感光細(xì)胞相關(guān)基因 CRX(353bp)、NRL(206bp)、RCVRN (150bp)、RH0(258bp)、PDE6B(409bp)、SAG(400bp)和OPNlSW(206bp)。在RT-PCR產(chǎn)物中還發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞基因ATH07(246bp)和P0U4F2 (175bp)，無長(zhǎng)突細(xì)胞基因NEUR0D1 (523bp)和雙極細(xì)胞基因ASCLl(467bp)。感光細(xì)胞相關(guān)基因的特征如下CRX和NRL分別為感光細(xì)胞前體細(xì)胞和視桿細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)錄基因。RCVRN(恢復(fù)蛋白)是對(duì)視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞測(cè)試均為陽性的通用感光細(xì)胞基因。RHO(視紫紅質(zhì))是視桿細(xì)胞特異的。PDE6B和SAG (人arrestin)參與感光細(xì)胞的光轉(zhuǎn)換。這些基因的表達(dá)證實(shí)感光細(xì)胞自身功能的發(fā)育和成熟。OPNlSW是短波(藍(lán)視蛋白)_視錐細(xì)胞特有的。M :標(biāo)志物。圖17顯示了感光細(xì)胞特征基因的RT-PCR和堿基測(cè)序結(jié)果。對(duì)誘導(dǎo)未分化的hESC向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化29天所產(chǎn)生的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR，以便能夠檢測(cè)感光細(xì)胞特異性基因RCVRN(NM_002903. 2)和RHO (NM_000539. 3)。通過堿基測(cè)序鑒定RT-PCR產(chǎn)物為RCVRN和RH0。(A). RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示RCVRN為150bp，RHO為258bp。M :標(biāo)志物。(B).喊基測(cè)序分析的色譜圖，顯不RCVRN的喊基序列(頂圖)和RHO的喊基序列(底圖)。發(fā)現(xiàn)RCVRN和RHO基因的堿基序列與人類標(biāo)準(zhǔn)序列(http://www. ncbi. nlm. nih.gov/)完全一致，這表明感光細(xì)胞表達(dá)人RCVRN和RHO基因。
圖18是已植入hESC來源的感光細(xì)胞或未植入hESC來源的感光細(xì)胞的視網(wǎng)膜退化小鼠rd/SCID的視網(wǎng)膜電圖。(A). 8周齡未植入小鼠的視網(wǎng)膜電圖。未發(fā)現(xiàn)特征ERG波形。ERG b_波對(duì)于右眼的振幅為6. 29 μ V，對(duì)于左眼為O. 0542 μ V。(B). 8周齡小鼠在植入后4周的視網(wǎng)膜電圖。與未植入的右眼相比，來自感光細(xì)胞植入的左眼的ERG b-波形成了特征波形，振幅高達(dá)74. 5 μ V。如視網(wǎng)膜電圖描記術(shù)所測(cè)量，植入了 hESC來源的感光細(xì)胞的rd/SCID小鼠對(duì)光刺激表現(xiàn)出明確應(yīng)答。圖19是對(duì)已植入或未植入hESC來源的感光細(xì)胞的視網(wǎng)膜退化rd/SCID小鼠之間的b-波振幅進(jìn)行比較的圖。來自植入感光細(xì)胞的rd/SCID小鼠的ERG b_波形成了特征波形，振幅為48. 4(±3. 4) μ V(樣品大小=13)。相比之下，在未植入組的ERG中沒有發(fā)現(xiàn)任何ー處形成特征波形，其顯示b-波振幅為10. 3 (±2. 5) μ V (樣品大小=17)，這在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著不同于植入組(Ρ〈0· 0001)(表 6，圖 19)。圖20是hESC來源的感光細(xì)胞被植入視網(wǎng)膜退化的小鼠模型(rd/SCID)后的熒光顯微鏡照片。植入后4周，利用視紫紅質(zhì)和恢復(fù)蛋白(二者是人線粒體和感光細(xì)胞特有的)分析hESC來源的感光細(xì)胞是否植入視網(wǎng)膜。當(dāng)視紫紅質(zhì)和恢復(fù)蛋白陽性細(xì)胞對(duì)人線粒體抗原表現(xiàn)出陽性應(yīng)答時(shí)，可以確定這些細(xì)胞是hESC來源的感光細(xì)胞。(A).對(duì)植入組中的人特異的線粒體和視紫紅質(zhì)進(jìn)行的免疫染色。所形成的新的外核層(ONL)為視紫紅質(zhì)陽性感光細(xì)胞層的4或5倍。(B).對(duì)作為対照的同齡(8周齡)的未植入組rd/SCID小鼠的人特異的線粒體和視紫紅質(zhì)進(jìn)行的免疫染色。觀察到僅有ー層外核層，主要由視錐細(xì)胞組成。由于退化幾乎沒有觀察到視桿細(xì)胞，而僅檢測(cè)到正在進(jìn)行退化的兩個(gè)殘留細(xì)胞。(C).對(duì)植入組中的人特異的線粒體和恢復(fù)蛋白進(jìn)行的免疫染色。4或5倍的恢復(fù)蛋白陽性細(xì)胞層形成了新的外核層。在植入組中，在外核層和內(nèi)核層(INL)中形成了 4或5倍的恢復(fù)蛋白陽性細(xì)胞層。(D).對(duì)作為対照的未植入組中的人特異的線粒體和恢復(fù)蛋白進(jìn)行的免疫染色。在全部40個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到陽性應(yīng)答。單層恢復(fù)蛋白陽性外核層由視錐細(xì)胞組成，而恢復(fù)蛋白陽性內(nèi)核層由錐形雙極細(xì)胞形成。*顯微鏡視野(A)和(C)左圖，200 X放大倍數(shù)；(A) - (D) :400 X放大倍數(shù)。*0NL:外核層INL:內(nèi)核層RGC:視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞圖21是顯示人ESC來源的感光細(xì)胞被植入視網(wǎng)膜退化的小鼠模型(rd/SCID)后的植入結(jié)果的圖。在未植入組中，在每個(gè)所觀察的顯微鏡視野的共199個(gè)細(xì)胞中，只有2個(gè)檢測(cè)到 視紫紅質(zhì)(陽性率1.0%)。另ー方面，在植入組中，每個(gè)顯微鏡視野的共215個(gè)細(xì)胞中，有88個(gè)為視紫紅質(zhì)陽性(陽性率40. 8%) (p〈0. 0001)。因此，發(fā)現(xiàn)植入的視桿細(xì)胞占視網(wǎng)膜切片總面積的大約40%。在未植入組中，在每個(gè)顯微鏡視野的共168個(gè)細(xì)胞中，有40個(gè)檢測(cè)到對(duì)恢復(fù)蛋白的陽性應(yīng)答(陽性率23. 8%)，但在植入組中，在每個(gè)顯微鏡視野的共292個(gè)細(xì)胞中，有120個(gè)檢測(cè)到對(duì)恢復(fù)蛋白的陽性應(yīng)答(陽性率41.0%)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(ρ〈0· 0001)。圖22是hESC來源的感光細(xì)胞被植入視網(wǎng)膜退化的小鼠模型(rd/SCID)后的熒光顯微鏡照片。植入后4周，對(duì)人線粒體和感光細(xì)胞抗原突觸蛋白進(jìn)行免疫染色和分析。在未植入組中，恢復(fù)蛋白表示內(nèi)核層的雙極細(xì)胞和外核層的視錐細(xì)胞。在植入組中，發(fā)現(xiàn)4或5倍的突觸蛋白陽性細(xì)胞層形成新的外核層，這表明新形成的外核層中的感光細(xì)胞與植入小鼠視網(wǎng)膜的其它視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞發(fā)生突觸相互作用。*顯微鏡視野左.200 X放大倍數(shù)；其它為400 X放大倍數(shù)。實(shí)施發(fā)明的最佳方式一方面，本發(fā)明涉及用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，其包括(a)在含有IGFlR(胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體)活化劑、BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，從而使它們分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞；(b)在含有IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和Shh (音猬因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，從而使它們分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞；以及(c)在含有IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑、Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和RA (視黃酸)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述感光細(xì)胞前體細(xì)胞，從而使它們分化成為包括感光細(xì)胞在內(nèi)的視網(wǎng)膜細(xì)胞。在所述方法的實(shí)施方案中，當(dāng)在存在IGFlR活化劑、BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的條件下培養(yǎng)時(shí)，干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。此外，在某些培養(yǎng)條件下(例如，組成培養(yǎng)基的成分、成分的含量、培養(yǎng)時(shí)間等)，神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞。沒有對(duì)培養(yǎng)技術(shù)和條件給予具體限定，只要這些技術(shù)和條件可有效用于將神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞、感光細(xì)胞和其它視網(wǎng)膜細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“干細(xì)胞”指能夠產(chǎn)生三種原胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的所有衍生物的多能細(xì)胞或能夠分化成為在組織類型和功能上密切相關(guān)的成熟細(xì)胞的多能細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“動(dòng)物”意圖包括人類、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、牛、豬、綿羊、馬、狗、小鼠、大鼠和貓，優(yōu)選人類。本文所用的術(shù)語“胚胎干細(xì)胞”指來源于受精卵剛要著床于子宮壁之前的胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的多能細(xì)胞，其能夠分化成為任何類型的動(dòng)物細(xì)胞，并且更廣泛的含義意圖包括干細(xì)胞樣細(xì)胞如類胚體和誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS)。
本文所用的術(shù)語“成體干細(xì)胞”意指從組織分離并離體培養(yǎng)的多能細(xì)胞，并且意圖包括骨髄干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞、視網(wǎng)膜內(nèi)的米勒膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“視網(wǎng)膜”指感光組織。視網(wǎng)膜是眼球內(nèi)最深處的(感覺)透明層，且與視覺直接相關(guān)。正好在感覺神經(jīng)性視網(wǎng)膜外側(cè)的是由色素細(xì)胞組成的視網(wǎng)膜色素上皮。在更廣泛的含義上，視網(wǎng)膜包括內(nèi)部感覺層和外部視網(wǎng)膜色素上皮。視網(wǎng)膜位于眼后面，并且在胚胎發(fā)育中作為發(fā)育大腦的副產(chǎn)物而產(chǎn)生。視網(wǎng)膜像一塊五層的蛋糕，由三層核心層和穿插在它們之間的兩層網(wǎng)絡(luò)層組成。三層核心層是由感光細(xì)胞組成的最外層的核心層；由水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞和米勒膠質(zhì)細(xì)胞組成的內(nèi)核層；以及由視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核心組成的最內(nèi)層的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。通過眼睛的眼角膜和晶狀體之后，光線依次通過視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)層達(dá)到外核層，在感光細(xì)胞處產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng)。這些神經(jīng)沖動(dòng)向反方向轉(zhuǎn)換。即，當(dāng)感光細(xì)胞受神經(jīng)沖動(dòng)刺激時(shí)，神經(jīng)電流傳導(dǎo)至內(nèi)核層，然后通過視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層進(jìn)入視神經(jīng)纖維。本文所用的術(shù)語“祖細(xì)胞”或“前體細(xì)胞”指能夠進(jìn)行不對(duì)稱分裂的細(xì)胞。不對(duì)稱分裂指這樣的情況，其中祖細(xì)胞或前體細(xì)胞或者能夠以特定概率產(chǎn)生另外的兩個(gè)祖細(xì)胞或前體細(xì)胞，或者能夠分化，使得盡管它們經(jīng)歷相同輪數(shù)的傳代，但是所產(chǎn)生的細(xì)胞可具有不同的年齡和性質(zhì)。本文所用的術(shù)語“視網(wǎng)膜祖細(xì)胞”意指能夠分化成為存在于視網(wǎng)膜中的細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的多能祖細(xì)胞。通常，視網(wǎng)膜祖細(xì)胞可經(jīng)歷對(duì)稱或不對(duì)稱分裂，因而或者可分化成為多種類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，或者可產(chǎn)生另外兩個(gè)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，培養(yǎng)步驟中所用的用于分化成為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的細(xì)胞包括在干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞期間所產(chǎn)生的多種類型的細(xì)胞以及視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。視網(wǎng)膜祖細(xì)胞包括神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞，并且通過選自以下的至少ー種、兩種或三種標(biāo)志物來表征Rax、Pax6、ChxlO、0tx2、Sox2、Lhx2、Six3、Six6 和 Mitf0如上文提到的與視網(wǎng)膜發(fā)育相關(guān)，視網(wǎng)膜祖細(xì)胞能夠分化成為多種類型的視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞(視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒膠質(zhì)細(xì)胞等)和視網(wǎng)膜色素上皮，特征為諸如Crx、恢復(fù)蛋白、視紫紅質(zhì)、紅綠視蛋白(red/green opsin)、藍(lán)視蛋白、外周蛋白 2、PDE6B、SAG、Isletl/NF200、ProxU PKC_a、Hu C/D、GFAP和RPE65的標(biāo)志物為陽性表達(dá)。然而，這些標(biāo)志物的表達(dá)水平和陽性率在視網(wǎng)膜祖細(xì)胞中變得比在成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮中更弱。本文所用的術(shù)語“神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞”意圖表示偏愛神經(jīng)元的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。SP，本文的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞是決定分化成為視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)元(視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞及米勒膠質(zhì)細(xì)胞)的祖細(xì)胞。通常，神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞可經(jīng)歷對(duì)稱或不對(duì)稱分裂，或者分化成為多種類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，或者產(chǎn)生另外的兩個(gè)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，在分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)步驟中包括干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞以及神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞期間所產(chǎn)生的各種類型的細(xì)胞。神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞通過表達(dá)選自以下的至少ー種、兩種或三種標(biāo)志物來表征Rax、Pax6、ChxlO 和 Crx。除了表達(dá)這些標(biāo)志物之外，神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞還可以通過表達(dá)Crx、恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)的能力來表征，所述Crx、恢復(fù)蛋白和視紫紅質(zhì)是下一分化階段的細(xì)胞，即感光細(xì)胞前體細(xì)胞和感光細(xì)胞的標(biāo)志物。相反，觀察到神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的以下標(biāo)志物的表達(dá)水平降低0tX2、SOX2、Lhx2、SiX3、SiX6和Mitf，這些是表明它們自身為前一分化階段的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的特征標(biāo)志物。 本文所用的術(shù)語“視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞”意指偏愛視網(wǎng)膜色素上皮的分化的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞通過表達(dá)選自Mift和Pax6的一種或多種標(biāo)志物來表征。在優(yōu)選實(shí)施方案中，干細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，骨髄干細(xì)胞(BMSC)、臍帶血干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞(RSC)、視網(wǎng)膜內(nèi)米勒膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESC)、誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)和體細(xì)胞核移植細(xì)胞(SCNTC)，最優(yōu)選的是人ESC或iPSC。在一實(shí)施方案中，iPSC以及人ESC通過本發(fā)明的分化方法被成功誘導(dǎo)分化成為包括感光細(xì)胞在內(nèi)的視網(wǎng)膜細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“IGF1R(胰島素樣生長(zhǎng)因子I受體)活化劑”用來指這樣的物質(zhì)，其能夠結(jié)合并活化IGF-I (胰島素樣生長(zhǎng)因子-1)受體(IGFlR)，該受體為酪氨酸激酶受體家族的成員。與IGFlR結(jié)合啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化的IGFlR與胰島素受體底物(IRS)相互作用，胰島素受體底物反過來充當(dāng)兩條途徑的活化劑由PI3k、Akt和mTOR組成的一條途徑；由Raf、MEK和ERK組成的另一條途徑(Ryan & Goss, Oncologist. 2008 ； 13:16-24)。IGF-I和IGF-2落入本發(fā)明所用的IGFlR活化劑的范圍內(nèi)。IGF-1具有與胰島素相似的分子結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞増殖、分化和細(xì)胞死亡。只要其能活化IGFlRJiM IGFlR活化劑都可不受限制地用于本發(fā)明的實(shí)施方案中。優(yōu)選IGF-I或IGF-2，更優(yōu)選IGF-I。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于使視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)基含有量為O. 01至100ng/ml，優(yōu)選量為0. I至50ng/ml，更優(yōu)選量為I至20ng/ml，以及最優(yōu)選量為 10ng/ml 的 IGFlR0本文所用的術(shù)語“BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑”表示一組能夠抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)。BMP屬于ー組稱為TGF-β (轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β )超家族的生長(zhǎng)因子，并且參與胎兒早期分化、胎兒組織形成和成體組織的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)胚胎發(fā)育吋，BMP的水平尤其在胎兒早期的背腹軸形成中起關(guān)鍵作用。此外，BMP的抑制對(duì)于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物胎兒階段的神經(jīng)元形成是必不可少的。細(xì)胞外分泌的BMP與I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，啟動(dòng)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。當(dāng)活化吋，II型受體募集并磷酸化I型受體。然后，I型受體磷酸化細(xì)胞內(nèi)底物受體調(diào)節(jié)的Smad(R-Smad)，介導(dǎo)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。R-Smad中有Smad_l、2、3、5和8。憐酸化的R-Smad立即結(jié)合共同伴侶Smad (Co-Smad)Smad-4。R-SMAD/co-SMAD復(fù)合物遷移入細(xì)胞核并在其中累積，在那里該復(fù)合物充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子并參與革G基因表達(dá)的調(diào)控(Yamamoto &Oelgeschlager, Naturwissenschaften. 2004 ；91:519-34)。BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑指這樣的物質(zhì)，其阻斷細(xì)胞外BMP與細(xì)胞表面受體的結(jié)合。BMP信號(hào)途徑抑制劑的實(shí)例包括頭蛋白(noggin)、腱蛋白(chordin)、扭曲原腸胚形成(Tsg)、cerberus、coco、gremlin、PRDC(與 DAN 和 Cerberus 相關(guān)的蛋白)、DAN(在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中差異篩選選出的基因aberrative)、dante、卵泡抑素、USAG-I (子宮敏感性相關(guān)基因I)、dorsomorphin和硬化蛋白(sclerostin)。通過抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，頭蛋白在神經(jīng)誘導(dǎo)和背腹神經(jīng)外胚層或中胚層中起重要作用。同樣,作為BMP(BMP-2、BMP-4和BMP-7)的拮抗齊U，頭蛋白阻斷這些BMP與其受體的結(jié)合(Yanagita, Cytokine Growth Factor Rev. 2005 ；16:309-17)。
只要其抑制BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，任何BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑都可以用在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中。優(yōu)選頭蛋白、腱蛋白、扭曲原腸胚形成(Tsg)、cerberus、coco、gremlin、PRDC、DAN、dante、卵泡抑素、USAG-I (子宮敏感性相關(guān)基因I)、dorsomorphin和硬化蛋白，最優(yōu)選頭蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)基含有量為0. 01至100ng/ml，優(yōu)選量為0. I至50ng/ml，更優(yōu)選量為0. 5至20ng/ml，以及最優(yōu)選量為10ng/ml的BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑。本文所用的術(shù)語“FGF(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑”指參與有絲分裂發(fā)生(包括細(xì)胞増殖和細(xì)胞分化)、血管再生、骨形態(tài)發(fā)生和神經(jīng)誘導(dǎo)的多功能因子。迄今已鑒定出FGF家族的22個(gè)成員。FGF受體家族有4個(gè)成員。可選的mRNA剪接產(chǎn)生FGF受體的變體。每種受體與FGF的特定子集結(jié)合?；罨腇GFR通過Ras/Raf/MeK途徑介導(dǎo)信號(hào)至MAP激酶，MAP激酶立即遷移入細(xì)胞核并在其中累積，在那里充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子并參與靶基因表達(dá)的調(diào)控(Bottcher & Niehrs, Endocr Rev. 2005 ;26:63-77)。FGF 家族的 FGF2 也被稱為堿性 FGF (bFGF)，主要與 FGFR lb、FGFR lc, FGFR 2c、FGFR 3c 和 FGFR 4Δ 結(jié)合，并強(qiáng)烈活化 FGFR Ic 和 FGFR 3c 等。FGFR Ic 和 FGFR 3c 的活化劑以及 FGF1、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17和FGF19可以用作FGF2的替代物。只要其能刺激FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，任何FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑都可以不受限制地用于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中。優(yōu)選FGFRlc或FGFR 3c活化劑、FGFl、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17 或 FGF19，最優(yōu)選 FGF2。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)基含有量為0. 01至100ng/ml，優(yōu)選量為0. I至50ng/ml，更優(yōu)選量為I至20ng/ml，以及最優(yōu)選量為5ng/ml的FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。本文所用的術(shù)語“Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑”意指能夠活化Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，其被發(fā)現(xiàn)調(diào)控胚胎發(fā)生期間的多個(gè)過程，包括細(xì)胞命運(yùn)決定、組織重建、極性、形態(tài)、粘附和生長(zhǎng)，以及未分化細(xì)胞的維持和增通(Logan & Nusse, Annu Rev Cell Dev Biol. 2004 ；20:781-810)。只要其能轉(zhuǎn)導(dǎo)Wnt介導(dǎo)的或β -連環(huán)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)，任何活化劑都可以包括在fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是由引發(fā)物Wnt與其受體結(jié)合啟動(dòng)的或由下游因子β_連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性所介導(dǎo)的一系列過程。接下來描述如何活化fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。I)通過添加Wnt蛋白Wnt為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第一引發(fā)物,屬于分泌糖蛋白家族。已經(jīng)鑒定出 19 種 Wnt ffntl> Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6>Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a> Wnt9b> WntlOa、WntIOb> Wntll 和 Wntl6b。2)通過增加連環(huán)蛋白的水平大多數(shù)細(xì)胞通過增加連環(huán)蛋白水平而響應(yīng)于Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。即去磷酸化的β_連環(huán)蛋白水平的増加或β_連環(huán)蛋白的穩(wěn)定表示β -連環(huán)蛋白轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核。3)通過蓬亂蛋白(dishevelled)的磷酸化或Wnt相關(guān)受體即LRP尾的磷酸化。 4)通過使用GSK3 (糖原合酶激酶3)抑制劑鋰(Li)、LiCl、ニ價(jià)Ζη、ΒΙ0 (6-溴靛玉紅 _3，-肟)、SB216763、SB415286、QS11 水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛紅_3，-肟、TDZD-8和Ro 31-8220甲磺酸鹽。5)通過阻斷Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的負(fù)調(diào)節(jié)劑，例如Axin和APC，或通過使用RNAi。6)使用 Wnt 途徑的活化劑，例如 norrin和 R_spondin2 :Norrin 結(jié)合Frizzled4 受體，而 R-spondin2 與 Frizzled8 和 LRP6 相互作用。7)通過基因轉(zhuǎn)移，包括轉(zhuǎn)染使用Wnt過表達(dá)構(gòu)建體或β-連環(huán)蛋白過表達(dá)構(gòu)建體能夠活化fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以不受限制地使用Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。優(yōu)選Wntl、Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a>Wnt9b、WntlOa、WntlOb、WntlI、Wntl6b ;增加β-連環(huán)蛋白水平的物質(zhì)；GSK3抑制劑，如鋰、LiCl、ニ價(jià)鋅、BIO、SB216763、SB415286、CHIR99021、QSll 水合物、TWS119、Kenpaullone,alsterpaullone、靛紅 _3，-肟、TDZD-8 和 Ro 31-8220 甲磺酸鹽；Axin 抑制劑、APC 抑制劑、norrin 和 R-spondin 2,且最優(yōu)選 Wnt3a> ffntl> Wnt5a> WntlI、norrin、LiCl、BIO 和SB415286。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)基含有除LiCl、BIO和SB415286之外的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，其量為O. 01至500ng/ml，優(yōu)選量為O. I至200ng/ml，且更優(yōu)選量為I至100ng/ml。在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑中，培養(yǎng)基中用到的LiCl的量為O. I至50mM，優(yōu)選量為O. 5至10mM，且更優(yōu)選量為I至IOmM ;使用BIO的量為O. I至50 μ M，優(yōu)選量為O. I至10 μ Μ，且更優(yōu)選量為0. 5至5 μ M ; 使用SB415286的量為0. I至500 μ Μ，優(yōu)選量為I至100 μ Μ，且更優(yōu)選量為5至50 μ Μ。在改良的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可以含有50ng/ml的Wnt3a或Wntl ;50或100ng/ml的Wnt5a和Wntll ；50ng/ml 的 norrin ；2. 5 或 5mM 的 LiCl ;2 μ M 的 BIO 或 30 μ M 的 SB415286。按照該實(shí)施方案，當(dāng)使用GSK3抑制劑和norrin以及Wnt蛋白時(shí),成功地進(jìn)行了本發(fā)明的方法，由此實(shí)現(xiàn)所期望的分化。因此，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑對(duì)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞起重要作用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在用于誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞一天或更長(zhǎng)，優(yōu)選I至30天，更優(yōu)選I至10天，且最優(yōu)選5天。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)步驟還可以包括確定分化的細(xì)胞是否為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。因此，該培養(yǎng)的時(shí)間可以被調(diào)整，從而進(jìn)ー步包括實(shí)施該確定所需的時(shí)間。為了確定視網(wǎng)膜祖細(xì)胞是否分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，可以分析神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特異的mRNA或蛋白的表達(dá)水平。在優(yōu)選實(shí)施方案中，Rax、Pax6、ChxlO和Crx是神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的特征標(biāo)志物。只要是本領(lǐng)域內(nèi)公知，本發(fā)明可不受限制地使用在mRNA水平上分析特異基因的任何技術(shù)。優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄酶PCR (RT-PCR)、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、Rnase保護(hù)測(cè)定、Northern印跡和DNA芯片分析。在蛋白水平上分析特異基因的公知技術(shù)可以不受限制地用于本發(fā)明中。優(yōu)選 Western印跡、ELISA、放射免疫測(cè)定、放射免疫擴(kuò)散、Ouchterlony免疫擴(kuò)散、火箭免疫電泳、免疫組織染色、免疫沉淀測(cè)定、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、FACS和蛋白芯片分析。與分化前的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞相比，分化后的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞表現(xiàn)出以下特征中的至少ー種(i)Rax的表達(dá)水平增加；(ii)Pax6的表達(dá)水平增加；(iii) ChxlO的表達(dá)水平增加；(iv)0tx2的表達(dá)水平降低；(v)Sox2的表達(dá)水平降低；(vi)巢蛋白(nestin)的表達(dá)水平降低；(vii)Ki67的表達(dá)水平降低；(viii)Crx的表達(dá)水平增加；(ix)恢復(fù)蛋白的表達(dá)水平増加；(X)視紫紅質(zhì)的表達(dá)水平増加；(xi)外周蛋白2的表達(dá)水平増加；以及(Xii)Mitf的表達(dá)水平降低。可以利用由基因編碼的蛋白的抗體或利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法如RT-PCR鑒定基因表達(dá)水平的増加或降低。隨著它們表現(xiàn)出更多的特征，分化的細(xì)胞被定義為更接近神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。按照本發(fā)明分化的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞表現(xiàn)出所述特征的至少兩種、優(yōu)選至少三種，且更優(yōu)選至少五種。優(yōu)選地，分化后，多于大約40%、60%、80%、90%、95%或98%的細(xì)胞群具有所期望的特征。更優(yōu)選更高的比例。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在存在IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和Shh(音猬因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的條件下培養(yǎng)時(shí)，神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞。此外，在某些培養(yǎng)條件下(例如，培養(yǎng)基的成分、成分的含量、培養(yǎng)時(shí)間等)，感光細(xì)胞前體細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞。沒有對(duì)培養(yǎng)技術(shù)和條件給予具體限定，只要這些技術(shù)和條件可有效允許感光細(xì)胞前體細(xì)胞分化成為如下的感光細(xì)胞和其它視網(wǎng)膜細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中所用的干細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，骨髄干細(xì)胞(BMSC)、臍帶血干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞(RSC)、視網(wǎng)膜內(nèi)米勒膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESC)、誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)和體細(xì)胞核移植細(xì)胞(SCNTC)，最優(yōu)選人ESC或iPSC。在一實(shí)施方案中，iPSC以及人ESC通過本發(fā)明的分化方法被成功地誘導(dǎo)分化成為包括感光細(xì)胞在內(nèi)的視網(wǎng)膜細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“感光細(xì)胞前體細(xì)胞”表示偏愛分化成為感光細(xì)胞的前體細(xì)胞，通過具有選自Crx (視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞前體細(xì)胞)和Nrl (視桿細(xì)胞前體細(xì)胞)的一種或多種標(biāo)志物來表征。通常，感光細(xì)胞前體細(xì)胞可經(jīng)歷對(duì)稱或不對(duì)稱分裂，或者分化成為多種類型的視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，或者產(chǎn)生另外兩個(gè)感光細(xì)胞前體細(xì)胞。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，在培養(yǎng)分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞的步驟中的細(xì)胞包括從干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞期間所產(chǎn)生的各種類型的細(xì)胞以及感光細(xì)胞前體細(xì)胞。除了表達(dá)標(biāo)志物之外，感光細(xì)胞前體細(xì)胞還可以通過表達(dá)恢復(fù)蛋白、視紫紅質(zhì)、外周蛋白2和roml中的至少ー種、兩種或三種的能力來表征，這些標(biāo)志物是分化感光細(xì)胞特有的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以不受限制地使用能夠活化IGFlR的任何IGFlR活化劑。優(yōu)選IGF-I或IGF-2，優(yōu)先考慮IGF-I。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞的培養(yǎng)基含有量為O. 01至100ng/ml，優(yōu)選量為O. I至50ng/ml，更優(yōu)選量為I至20ng/ml，且最優(yōu)選量為10ng/ml的IGFlR活化劑。只要其能活化Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，任何Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑都可以用于本發(fā)明中。用于本發(fā)明中的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的實(shí)例包括Wntl、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a> Wnt9b> WntlOa、WntlOb、WntlU Wnt 16b ;增加β-連環(huán)蛋白水平的物質(zhì)；GSK3抑制劑如鋰、LiCl、ニ 價(jià)鋅、BI0、SB216763、SB415286、CHIR99021、QS11 水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛紅_3’ -肟、TDZD-8和Ro 31-8220甲磺酸鹽；Axin抑制劑、APC抑制劑、norrin和R-spondin 2，且最優(yōu)選 Wnt3a、Wntl、Wnt5a、WntlI、norrin、LiCl、BIO 和 SB415286。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞的培養(yǎng)基含有除LiCl、BI0和SB415286之外的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，其量為O. 01至500ng/ml，優(yōu)選量為0. I至200ng/ml，且更優(yōu)選量為I至100ng/ml。在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑中，培養(yǎng)基中所使用LiCl的量為0. I至50mM，優(yōu)選量為0. 5至10mM，且更優(yōu)選量為I至IOmM ;使用BIO的量為0. I至50 μ M，優(yōu)選量為0. I至10 μ Μ，且更優(yōu)選量為0. 5至5 μ M ;使用SB415286的量為0. I至500 μ Μ，優(yōu)選量為I至100 μ Μ，且更優(yōu)選量為5至50 μ Μ。在改良的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可以含有50ng/ml的Wnt3a或Wntl ;50或100ng/ml的Wnt5a和Wntll ；50ng/ml 的 norrin ；2. 5 或 5mM 的 LiCl ;2 μ M 的 BIO 或 30 μ M 的 SB415286。按照該實(shí)施方案，當(dāng)使用GSK3抑制劑和norrin以及Wnt蛋白時(shí),成功地進(jìn)行了本發(fā)明的方法，由此實(shí)現(xiàn)所期望的分化。因此，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑對(duì)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞起重要作用。本文所用的術(shù)語“Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑”意指能夠活化與胚胎發(fā)生期間多個(gè)過程的調(diào)節(jié)相關(guān)的Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的物質(zhì)，所述多個(gè)過程包括細(xì)胞命運(yùn)決定、組織重建、極性、形態(tài)、增通和分化(Bertrand&Dahmane, Trends Cell Biol. 2006 ;16:597_605)。音猜因子(Shh)是哺乳動(dòng)物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑家族中被稱為刺猬蛋白(hedgehog)的三種蛋白之一，另外兩種為印度刺猬因子(Ihh)和沙漠刺猬因子(Dhh)。Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及兩種跨膜蛋白，即Ptc (Patched)和Smo(Smoothened)。在不存在Shh的情況下，Ptc與Smo相互作用并抑制Smo。當(dāng)Shh結(jié)合Ptc時(shí),Ptc與Smo的相互作用被改變,使得Smo不再受抑制,導(dǎo)致Ci/Gli蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，并作為靶基因的轉(zhuǎn)錄活化劑。對(duì)Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑沒有給予具體限定，只要其能增強(qiáng)Shh介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。用于本發(fā)明中的Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的實(shí)例包括屬于刺猬蛋白家族(例如Shh)的蛋白，Ptc與Smo相互作用的抑制劑，Smo受體活化劑,Shh受體活化劑(例如Hg-Ag,purmorphamine等)，增加Ci/Gli家族水平的物質(zhì)，Ci/Gli因子細(xì)胞內(nèi)降解的抑制劑和通過轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的Shh過表達(dá)構(gòu)建體或Ci/Gli過表達(dá)構(gòu)建體。只要其能活化Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，任何Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑都可以用于本發(fā)明中。優(yōu)選Shh、Smo受體活化劑、Ptc與Smo相互作用的抑制劑、増加Ci/Gli家族水平的物質(zhì)、Ci/Gli因子細(xì)胞內(nèi)降解的抑制劑和Shh受體活化劑如Hg-Ag和purmorphamine,最優(yōu)選 Shh 或 purmorphamine。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞的培養(yǎng)基含有Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，其量為O. I至5，000ng/ml，優(yōu)選量為I至2，500ng/ml,更優(yōu)選量為10至1，OOOng/ml，且最優(yōu)選量為250ng/ml。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基含有量為250ng/ml的Shh或量為I μ M的purmorphamine。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在誘導(dǎo)分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞I天或更長(zhǎng)時(shí)間，優(yōu)選I至30天，更優(yōu)選I至10天，且最優(yōu)選3天。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞的培 養(yǎng)步驟還可以包括確定分化的細(xì)胞是否為感光細(xì)胞前體細(xì)胞。因此，可以調(diào)整該培養(yǎng)的時(shí)間，從而進(jìn)ー步包括實(shí)施該確定所需的時(shí)間。為了確定神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞是否成功地分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞，可以分析感光細(xì)胞前體細(xì)胞特異的mRNA或蛋白的表達(dá)水平。在優(yōu)選實(shí)施方案中，Crx和Nrl是感光細(xì)胞前體細(xì)胞的特征標(biāo)志物。只要是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，本發(fā)明可以不受限制地使用在mRNA水平上分析特異基因的任何技術(shù)。優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、Rnase保護(hù)測(cè)定、Northern印跡和DNA芯片分析。在蛋白水平上分析特異基因的公知技術(shù)可以不受限制地用于本發(fā)明中。優(yōu)選Western印跡、ELISA、放射免疫測(cè)定、放射免疫擴(kuò)散、Ouchterlony免疫擴(kuò)散、火箭免疫電泳、免疫組織染色、免疫沉淀測(cè)定、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、FACS和蛋白芯片分析。與分化前的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞相比，分化后的感光細(xì)胞前體細(xì)胞表現(xiàn)出以下特征中的至少ー種(i)神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的表達(dá)水平降低；(ii)ChxlO的表達(dá)水平降低；(iii)Sox2的表達(dá)水平降低；(iv)Ki67的表達(dá)水平增加；(vi)Crx的表達(dá)水平降低；(vi)視紫紅質(zhì)的表達(dá)水平増加；以及(vii)外周蛋白2的表達(dá)水平増加?？梢岳糜苫蚓幋a的蛋白的抗體或利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法如RT-PCR鑒定基因表達(dá)水平的増加或降低。隨著它們表現(xiàn)出更多的特征，分化的細(xì)胞被定義為更接近感光細(xì)胞前體細(xì)胞。按照本發(fā)明分化的感光細(xì)胞前體細(xì)胞表現(xiàn)出所述特征的至少兩種、優(yōu)選至少三種，且更優(yōu)選至少五種。優(yōu)選地，分化后，多于大約40%、60%、80%、90%、95%或98%的細(xì)胞群具有所期望的特征。更優(yōu)選更高的比例。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在存在IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑、Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和RA(視黃酸)的條件下培養(yǎng)時(shí)，感光細(xì)胞前體細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成為感光細(xì)胞。此外，在某些培養(yǎng)條件下(例如，培養(yǎng)基的成分、成分的含量、培養(yǎng)時(shí)間等)，感光細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞。沒有對(duì)培養(yǎng)技術(shù)和條件給予具體限定，只要這些技術(shù)和條件能有效用于將感光細(xì)胞分化成為以下的視網(wǎng)膜細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中所用的干細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，骨髄干細(xì)胞(BMSC)、臍帶血干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞(RSC)、視網(wǎng)膜內(nèi)米勒膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESC)、誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)和體細(xì)胞核移植細(xì)胞(SCNTC)，最優(yōu)選人ESC或iPSC。在一實(shí)施方案中，iPSC以及人ESC通過本發(fā)明的分化方法被成功地誘導(dǎo)分化成為包括感光細(xì)胞在內(nèi)的視網(wǎng)膜細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“感光細(xì)胞”是指存在于眼睛視網(wǎng)膜中能夠光轉(zhuǎn)換并允許識(shí)別形狀和顔色的特化類型的神經(jīng)元當(dāng)光通過眼角膜和晶狀體到達(dá)視網(wǎng)膜時(shí)，感光細(xì)胞將光能轉(zhuǎn)化為電能，然后該電能被傳入大腦。存在兩種主要的感光細(xì)胞類型視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞，二者分別適合暗光和亮光。視錐細(xì)胞向視網(wǎng)膜的中央(即黃斑)逐漸變密，起到感知圖像和色彩的作用，而視桿細(xì)胞主要分布在視網(wǎng)膜的周圍，允許感知圖像和光。感光細(xì)胞通過表達(dá)選自以下的至少ー種、兩種或三種標(biāo)志物的能力來表征恢復(fù)蛋白(視桿細(xì)胞，視錐細(xì)胞)、視紫紅質(zhì)(視桿細(xì)胞)、外周蛋白2 (視桿細(xì)胞)、roml (視桿細(xì)胞，視錐細(xì)胞)、Pde6b (視桿細(xì)胞)、arrestin sag(視桿細(xì)胞)、光導(dǎo)蛋白(視桿細(xì)胞,視錐細(xì)胞)、突觸蛋白(視桿細(xì)胞，視錐細(xì)胞)、紅綠視蛋白(視錐細(xì)胞)和藍(lán)視蛋白(視錐細(xì)胞)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以不受限制地使用能夠活化IGFlR的任何IGFlR活化劑。優(yōu)選IGF-I或IGF-2，優(yōu)先考慮IGF-I。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)感光細(xì)胞前體細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞的培養(yǎng)基含有IGFlR活化劑，其量為O. 01至100ng/ml，優(yōu)選量為O. I至50ng/ml，更優(yōu)選量為I至20ng/ml,且最優(yōu)選量為10ng/ml。只要其能活化Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，任何Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑都可以用于本發(fā)明中。用于本發(fā)明中的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的實(shí)例包括Wntl、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b> Wnt9a> Wnt9b> WntlOa、WntlOb、WntlU Wnt 16b ;增加β-連環(huán)蛋白水平的物質(zhì)；GSK3抑制劑如鋰、LiCl、ニ價(jià)鋅、BI0、SB216763、SB415286、CHIR99021、QS11 水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛紅_3’ -肟、TDZD-8和Ro 31-8220甲磺酸鹽；Axin抑制劑、APC抑制劑、norrin和R-spondin 2，并且優(yōu)選 Wnt3a、Wntl、Wnt5a、WntlI、norrin、LiCl、BIO 和 SB415286。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)感光細(xì)胞前體細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞的培養(yǎng)基含有除LiCl、BI0和SB415286之外的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，其量為0. 01至500ng/ml，優(yōu)選量為0. I至200ng/ml，且更優(yōu)選量為I至100ng/ml。在Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑中，培養(yǎng)基中用到的LiCl的量為0. I至50mM，優(yōu)選量為0. 5至10mM，且更優(yōu)選量為I至IOmM ;使用BIO的量為0. I至50 μ M，優(yōu)選量為0. I至10 μ Μ，且更優(yōu)選量為0. 5至5 μ M ;使用SB415286的量為0. I至500 μ Μ，優(yōu)選量為I至100 μ Μ，且更優(yōu)選量為5至50 μ Μ。在改良的實(shí)施方案中，培養(yǎng)基可以含有 50ng/ml 的 Wnt3a 或 Wntl ;50 或 100ng/ml 的 Wnt5a 和 Wntll ；50ng/ml的norrin ；2. 5或5mM的LiCl ;2 μ M的BIO或30 μ M的SB415286。按照該實(shí)施方案，當(dāng)使用GSK3抑制劑和norrin以及Wnt蛋白時(shí)，成功地進(jìn)行了本發(fā)明的方法，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)所期望的分化。因此，發(fā)現(xiàn)fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑對(duì)分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞起重要作用。只要其能活化Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，任何Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑都可以用于本發(fā)明中。優(yōu)選Shh、Smo受體活化劑、Ptc與Smo相互作用的抑制劑、増加Ci/Gli家族水平的物質(zhì)、Ci/Gli因子細(xì)胞內(nèi)降解的抑制劑和Shh受體活化劑如Hg-Ag和purmorphamine,最優(yōu)選 Shh 或 purmorphamine。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞的培養(yǎng)基含有Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，其量為0. I至5，000ng/ml，優(yōu)選量為I至2，500ng/ml,更優(yōu)選量為10至1，000ng/ml，且最優(yōu)選量為250ng/ml。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基含有量為250ng/ml的Shh或量為I μ M的purmorphamine。本文所用的術(shù)語“RA (視黃酸)”是指維生素A的代謝物，其是通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來參與多種生物過程(包括細(xì)胞増殖、分化和死亡)的親脂性分子。存在兩類RA:全順式視黃酸和9-順式視黃酸。RA被轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核，在細(xì)胞核內(nèi)其分別結(jié)合RAR(視黃酸受體)和RXR(類視色素X受體)，并參與靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，用于誘導(dǎo)感光細(xì)胞前體細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞的培養(yǎng)基中所含的RA可以為反式或順式，且使用濃度可以為O. 5至10，OOOnM，優(yōu)選濃度為5至5，OOOnM,更優(yōu)選濃度為50至2，OOOnM,且最優(yōu)選濃度為500nM。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在用于誘導(dǎo)分化成為感光細(xì)胞的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)感光細(xì)胞前體細(xì)胞I天或更長(zhǎng)時(shí)間，優(yōu)選I至60天,更優(yōu)選I至30天,且最優(yōu)選8至15天。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于誘導(dǎo)感光細(xì)胞前體細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞的培養(yǎng)步驟還可以包括確定分化的細(xì)胞是否為感光細(xì)胞。因此，可以調(diào)整該培養(yǎng)的時(shí)間，從而進(jìn)ー步包括實(shí)施該確定所需的時(shí)間。為了確定感光細(xì)胞前體細(xì)胞是否成功地分化成為感光細(xì)胞，可以分析感光細(xì)胞特異的mRNA或蛋白的表達(dá)水平。按照優(yōu)選實(shí)施方案,恢復(fù)蛋白、視紫紅質(zhì)、夕卜周蛋白2、roml、Pde6b、arrestin sag、光導(dǎo)蛋白、突觸蛋白、紅綠視蛋白和藍(lán)視蛋白是感光細(xì)胞的特征標(biāo)志物。本領(lǐng)域內(nèi)公知的用于在mRNA水平上分析特異基因的任何技術(shù)都可不受限制地用在本發(fā)明中。優(yōu)選逆轉(zhuǎn)錄酶PCR (RT-PCR)、競(jìng)爭(zhēng)RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR、Rnase保護(hù)測(cè)定、Northern印跡和DNA芯片分析。在蛋白水平上分析特異基因的公知技術(shù)可以不受限制地用于本發(fā)明中。優(yōu)選Western印跡、ELISA、放射免疫測(cè)定、放射免疫擴(kuò)散、Ouchterlony免疫擴(kuò)散、火箭免疫電泳、免疫組織染色、免疫沉淀測(cè)定、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、FACS和蛋白芯片分析。與分化前的感光細(xì)胞前體細(xì)胞相比，分化后的感光細(xì)胞表現(xiàn)出以下特征中的至少ー種(i)Pax6的表達(dá)水平増加；(ii)Sox2的表達(dá)水平増加；(iii)巢蛋白的表達(dá)水平降低；(iv)Ki67的表達(dá)水平降低；(v)Crx的表達(dá)水平降低；(vi)恢復(fù)蛋白的表達(dá)水平増加；(vii)視紫紅質(zhì)的表達(dá)水平増加；以及(vii)外周蛋白2的表達(dá)水平増加?？梢岳糜苫蚓幋a的蛋白的抗體或利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法如RT-PCR鑒定基因表達(dá)水平的増加或降低。隨著它們表現(xiàn)出更多的特征，分化的細(xì)胞被定義為更接近感光細(xì)胞前體細(xì)胞。按照本發(fā)明分化的感光細(xì)胞前體細(xì)胞表現(xiàn)出所述特征的至少兩種、優(yōu)選至少三種，且更優(yōu)選至少五種。優(yōu)選地，分化后，多于大約40%、60%、80%、90%、95%或98%的細(xì)胞群具有所期望的特征。更優(yōu)選更高的比例。按照ー實(shí)施方案，本發(fā)明的方法還可以包括使干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。在這種背景下，可以利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的或允許產(chǎn)生視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的任何技木。優(yōu)選地，視網(wǎng)膜祖細(xì)胞可以通過以下方法來獲得(a’ )在含有以下成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞從而使它們分化成為懸浮聚集形式的眼區(qū)前體細(xì)胞=IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑；以及
(b’ )在含有以下成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述懸浮聚集形式的眼區(qū)前體細(xì)胞從而使它們分化成為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞=IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)，眼區(qū)前體細(xì)胞的懸浮聚集物可以在平板上貼壁生長(zhǎng)?？梢岳帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的任何粘附細(xì)胞的平板。優(yōu)選地，平板用如下細(xì)胞外基質(zhì)包被例如聚D-賴氨酸、層粘連蛋白、聚L-賴氨酸、基質(zhì)膠、瓊脂、聚鳥氨酸、明膠、膠原蛋白、纖維連接蛋白或玻璃粘連蛋白。最優(yōu)選用聚D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板。每個(gè)貼壁的懸浮聚集物的細(xì)胞群是最高效的細(xì)胞群。優(yōu)選地，懸浮聚集物由200-400個(gè)細(xì)胞組成。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中所用的干細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于，骨髄干細(xì)胞(BMSC)、臍帶血干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞(RSC)、視網(wǎng)膜內(nèi)米勒膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESC)、誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)和體細(xì)胞核移植細(xì)胞(SCNTC)，最優(yōu)選的是人ESC或iPSC。在一實(shí)施方案中，iPSC以及人ESC通過本發(fā)明的分化方法被成功地誘導(dǎo)分化 成為包括感光細(xì)胞在內(nèi)的視網(wǎng)膜細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“眼區(qū)前體細(xì)胞”指表達(dá)前腦神經(jīng)板的眼區(qū)祖細(xì)胞中存在的標(biāo)志物(眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子；Zuber, et al. , Development, 2003 ；130:5155-67)的細(xì)胞團(tuán)。通過選自Six3、Rax、Pax6、0tx2、Lhx2和Six6中的至少一種、兩種或三種標(biāo)志物來表征眼區(qū)前體細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“懸浮聚集物”是指干細(xì)胞絮凝物在沒有飼養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞和血清的非貼壁平板中培養(yǎng)至少I天時(shí)所產(chǎn)生的培養(yǎng)基中懸浮的細(xì)胞團(tuán)。取決于所用培養(yǎng)基的組成，眼區(qū)前體細(xì)胞可以表達(dá)眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子。本文所用的術(shù)語“Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑”意指阻斷細(xì)胞外Wnt蛋白與膜蛋白Frizzled受體或LRP之間的相互作用或者抑制細(xì)胞內(nèi)Wnt介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子(Kawano& Kypta, J Cell Sci. 2003 ;116:2627_34)。只要其能抑制Wnt介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，任何Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑都可以用于本發(fā)明中。在本發(fā)明中使用的fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑的實(shí)例包括Dkk (Dickkopf)家族(Dkk-l、Dkk-2、Dkk-3和Dkk-4)，其是能夠與共受體LRP相互作用的Wnt拮抗劑；Wise ；sFRP (分泌型Frizzled相關(guān)蛋白)家族，其作為與Wnt受體結(jié)合的fct拮抗劑發(fā)揮功能；Frizzled-CRD結(jié)構(gòu)域；WIF_1 (Wnt抑制因子-I) ;IWP_2 ；IWP-3 ；IWP-4 ；cerberus ;Wnt抗體；顯性負(fù)作用的Wnt蛋白；Axin的過表達(dá)；GSK(糖原合成酶激酶)的過表達(dá)；顯性負(fù)作用的TCF;顯性負(fù)作用的蓬亂蛋白和酪蛋白激酶抑制劑(CKI-7、D4476 等)，優(yōu)選 Dkk-I。除了 Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑之外，還可以通過抑制參與Wnt途徑的每ー種成分來抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如用RNAi。在優(yōu)選實(shí)施方案中，IGF-I或IGF-2可以用作IFGlR活化劑，優(yōu)先考慮IGF-2。BMP信號(hào)途徑抑制劑的實(shí)例包括頭蛋白、腱蛋白、扭曲原腸胚形成(Tsg)、cerberus、coco、gremlin、PRDC>DAN、dante、卵泡抑素、USAG-1、dorsomorphin和硬化蛋白，優(yōu)選頭蛋白。作為FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，可以使用能活化FGRRlc或FGFR3c的因子、FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17或FGF19。優(yōu)選FGF2?？捎糜诒景l(fā)明中的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的實(shí)例包括 Wntl、Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a>Wnt8b>Wnt9a>Wnt9b>WntlOa>WntlOb>WntlI>Wntl6b ;增加 β-連環(huán)蛋白水平的物質(zhì)；GSK3抑制劑如鋰、LiCl、ニ價(jià)鋅、BIO、SB216763、SB415286、CHIR99021、QSll 水合物、TffS 119、Kenpaullone、alsterpaullone、親紅-3，-西、TDZD-8 和 Ro 31-8220 甲橫酸鹽；Axin 抑制劑、APC 抑制劑、norrin 和 R-spondin 2,且優(yōu)選 Wnt3a> Wntl、Wnt5a、WntlI、norrin、LiCl、BIO和SB415286?？捎糜诒景l(fā)明中的Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的實(shí)例包括Shh、Smo受體活化劑、Ptc與Smo相互作用的抑制劑、増加Ci/Gli家族水平的物質(zhì)、Ci/Gli因子細(xì)胞內(nèi)降解的抑制劑和Shh受體活化劑如Hg-Ag和purmorphamine,最優(yōu)選Shh或purmorphamine。用于本發(fā)明中的RA可以是反式或順式的視黃酸。就分化開始后培養(yǎng)的時(shí)間而言，優(yōu)選給予步驟(a’)1-30天，步驟(b’)為5_15天，步驟(a)為1-30天，步驟(b)為1-30天，以及步驟(c)為1-60天，并且最優(yōu)選步驟(a’)為4天，步驟(b’)為9天，步驟(a)為5天，步驟(b)為3天，以及步驟(c)為8_15天。在優(yōu)選實(shí)施方案中，僅需花費(fèi)約29天來完成干細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化，從而允許所述方法 有效應(yīng)用于臨床治療?？梢酝ㄟ^利用Wnt和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共抑制誘導(dǎo)和促進(jìn)胚胎發(fā)生期間前腦的發(fā)育來實(shí)現(xiàn)步驟(a’)中向眼區(qū)前體細(xì)胞的分化(Piccolo, et al. , Nature, 1999 ；397:707-10)。因此，培養(yǎng)基含有作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑的Dkk-I，作為BMP抑制劑的頭蛋白以及作為IGFlR活化劑的IGF-I (起促進(jìn)前腦中眼區(qū)形成的作用)。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、BMP抑制劑和IGFlR活化劑的種類和培養(yǎng)基水平如上文所述。用于步驟(a’)中的培養(yǎng)基含有濃度為O. 01-100ng/ml的IGF-1，濃度為O. 01-10, 000ng/ml的Dkk-I和濃度為0. 01-100ng/ml的頭蛋白，最優(yōu)選含有濃度為5ng/ml的IGF-I，濃度為lng/ml的Dkk-I和濃度為lng/ml的頭蛋白。培養(yǎng)干細(xì)胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基可用于步驟(a’)中誘導(dǎo)向眼區(qū)前體細(xì)胞的分化。優(yōu)選含有以下的DMEM/F12 10%knockout血清替代物、ImML-谷氨酰胺、0. ImM非必需氨基酸、0. ImM巰基こ醇和1%B27補(bǔ)充物。步驟(b’)中向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化可以在含有FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，優(yōu)選FGF2以及步驟(a’)中的因子(即IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和BMP抑制劑)的培養(yǎng)基中進(jìn)行。Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、BMP抑制劑、IGFlR活化劑以及FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑的種類和培養(yǎng)基水平如上文所述。. 步驟(b’)中使用的培養(yǎng)基含有濃度為0. 01-100ng/ml的IGF-1，濃度為0. 01-10，000ng/ml 的 Dkk-Ι，濃度為 0. 01-100ng/ml 的頭蛋白和濃度為 0. 01-100ng/ml 的FGF2，且優(yōu)選含有濃度為10ng/ml的IGF-1，濃度為10ng/ml的Dkk_l，濃度為10ng/ml的頭蛋白和濃度為5ng/ml的FGF2。步驟(b’)中視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向步驟(a)的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化必須在沒有Dkk-I ( ー種Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑)的條件下進(jìn)行，這是為了有高水平的Pax6表達(dá)(Pax6是產(chǎn)生神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞所必需的)，并且在含有以下成分的培養(yǎng)基中進(jìn)行用于促進(jìn)Wnt途徑的Wnt3a，在胚胎發(fā)生期間視泡和視杯發(fā)育階段用于將下面的視網(wǎng)膜色素上皮轉(zhuǎn)化為神經(jīng)視網(wǎng)膜的頭蛋白，用于抑制視網(wǎng)膜色素上皮所必需的基因表達(dá)和促進(jìn)神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞產(chǎn)生的FGF2，以及負(fù)責(zé)感光細(xì)胞抗凋亡的IGF-I。用于步驟(a)中的培養(yǎng)基含有濃度為0. 01-100ng/ml的IGF-1，濃度為O. 01-100ng/ml 的頭蛋白，濃度為 0. 01-100ng/ml 的 FGF2 和濃度為 O. 01-500ng/ml 的Wnt3a,并且最優(yōu)選含有濃度為10ng/ml的IGF-1,濃度為10ng/ml的頭蛋白，濃度為5ng/ml的FGF2和濃度為50ng/ml的Wnt3a。步驟(b)中向感光細(xì)胞前體細(xì)胞的分化在不含頭蛋白和FGF2的培養(yǎng)基中進(jìn)行，所述頭蛋白和FGF2分別抑制Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑和Shh誘導(dǎo)的視紫紅質(zhì)表達(dá)，并且該培養(yǎng)基中含有使視桿細(xì)胞前體細(xì)胞增殖的IGF-1、促進(jìn)Wnt途徑的Wnt3a，以及Shh。步驟(b)中所用的培養(yǎng)基含有濃度為O. 01-100ng/ml的IGF-1，濃度為O. 01-500ng/ml的Wnt3a和濃度為O. 1-5，000ng/ml的Shh,并且最優(yōu)選地，含有濃度為10ng/ml 的 IGF-1,濃度為 50ng/ml 的 Wnt3a 和濃度為 250ng/ml 的 Shh。步驟(c)中向感光細(xì)胞的分化在含有用于進(jìn)ー步促進(jìn)分化的RA(視黃酸)與IGF-l、Wnt3a和Shh的組合的培養(yǎng)基中進(jìn)行。步驟(c)中所用的培養(yǎng)基含有濃度為O. 01-100ng/ml的IGF-1，濃度為O. 01-500ng/ml 的 Wnt3a,濃度為 O. 01-5, 000ng/ml 的 Shh 和濃度為 O. 5-10, OOOnM 的 RA,并且最優(yōu)選地，含有濃度為10ng/ml的IGF-1,濃度為50ng/ml的Wnt3a,濃度為250ng/ml的Shh和濃度為500nM的RA。在步驟(a)至(c)中，可以使用Wntl、Wnt5a、Wntll、norrin、LiCl、BI0 或 SB415286替代Wnt3a,而Shh可以用purmorphamine替代。用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基都可以用作步驟(b’)、(a)、(b)和(C)中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。優(yōu)選含有ImM L-谷氨酰胺、O. ImM非必需氨基酸、O. ImM巰基こ醇、1%B27補(bǔ)充物和1%N2補(bǔ)充物的DMEM/F12。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，按照本發(fā)明方法分化的視網(wǎng)膜細(xì)胞可以包括感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞和/或視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，具有感光細(xì)胞組成優(yōu)選超過50%，最優(yōu)選超過70%的細(xì)胞群。按照本發(fā)明的一實(shí)施方案，通過以下五步誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞系H9和H7分化成為感光細(xì)胞。第一歩，將人胚胎干細(xì)胞或人誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞在不含血清和FGF2但含有IGF-UDkk-I和頭蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，以便產(chǎn)生懸浮聚集形式的眼區(qū)前體細(xì)胞(實(shí)施例2)。第二步，使用除補(bǔ)充了 FGF2外與第一歩相同(的培養(yǎng)基誘導(dǎo)眼區(qū)前體細(xì)胞9天，從而使前體細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(實(shí)施例3)。第三步，在除不含Dkk-I且補(bǔ)充了 Wnt3a外與第二步相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞5天，從而誘導(dǎo)向神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化(實(shí)施例4)。第四步，向已誘導(dǎo)細(xì)胞3天的培養(yǎng)基中添加Shh，從而促進(jìn)向感光細(xì)胞前體細(xì)胞的分化(實(shí)施例5)。第五步，在存在RA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞8天或更長(zhǎng)時(shí)間，從而產(chǎn)生感光細(xì)胞并使其成熟(實(shí)施例6)。利用免疫化學(xué)測(cè)定、RT-PCR和堿基測(cè)序鑒定和分析由此獲得的細(xì)胞(實(shí)施例7)。將產(chǎn)生的感光細(xì)胞植入作為免疫缺陷的視網(wǎng)膜退化模型的rd/SCID小鼠中，在該小鼠中評(píng)價(jià)感光細(xì)胞的性質(zhì)和臨床適用性(實(shí)施例8)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)感光細(xì)胞被安全移植和植入小鼠中，并正確地發(fā)揮功能。另ー方面，可以使用Wnt3a和Shh各自的替代物。在這種背景下，在相同條件下實(shí)施相同時(shí)間的培養(yǎng)過程，除了用50ng/ml的Wntl ;50或100ng/ml 的 Wnt5a 或 Wntll ；50ng/ml 的 norrin ;2· 5 或 5mM 的 LiCl ;2 μ M 的 BIO ;或 30 μ M的SB415286替代Wnt3a作為Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，并且用purmorphamine作為Shh的替代物。結(jié)果是這些替代物以與用fct3a和Shh所獲得的相似模式產(chǎn)生分化且成熟的感光細(xì)胞(實(shí)施例9)。此外，通過本發(fā)明的方法，所用超過70%的人胚胎干細(xì)胞被成功分化成為感光細(xì)胞，所產(chǎn)生的細(xì)胞群比最初的人胚胎干細(xì)胞更大257倍。發(fā)現(xiàn)所得到的感光細(xì)胞表達(dá)光導(dǎo)蛋白(49.8±2. 2%)和突觸蛋白(43.0±2.0%)，以及結(jié)構(gòu)蛋白恢復(fù)蛋白(82.4±4.6%)、視紫紅質(zhì)(81. 2 土 2. 5%)、外周蛋 白2 (41. 2 ± 2. 0%)和roml (76. O ±4. 6%)，其中光導(dǎo)蛋白參與可見光轉(zhuǎn)換的調(diào)控，突觸蛋白負(fù)責(zé)與其它視網(wǎng)膜內(nèi)神經(jīng)元的突觸相互作用。除了感光細(xì)胞之外，還觀察到其它視網(wǎng)膜細(xì)胞，包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出.0±0.6%)、雙極細(xì)胞(5. 7±1.7%)、水平細(xì)胞(7. 1±0.6%)、米勒膠質(zhì)細(xì)胞(8. 7±2.9%)和視網(wǎng)膜色素上皮(12.5±1.4%)。這些細(xì)胞的陽性率與人正常視網(wǎng)膜內(nèi)的這些細(xì)胞的組成比率幾乎相同。在植入四周齡rd/SCID小鼠(其中感光細(xì)胞已經(jīng)退化并完全消失)后，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)形成4或5層的光受體層，并且同時(shí)表達(dá)光導(dǎo)蛋白和突觸蛋白，這表明植入的細(xì)胞參與與先前存在的視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)生突觸相互作用的視網(wǎng)膜神經(jīng)元和光回路的構(gòu)建。因此，通過本發(fā)明的方法，人胚胎干細(xì)胞被成功地誘導(dǎo)，從而高效完美地分化成為增加數(shù)量的成熟感光細(xì)胞。在第二步中分化的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(實(shí)施例3)表達(dá)眼區(qū)前體細(xì)胞以及這些視網(wǎng)膜祖細(xì)胞自身的特征標(biāo)志物，Rax的陽性率為86. 6±3. 0%,Pax6的陽性率為63. 9±0. 9%, 0tx2為 76. 4±2. 0%, Sox2 為 83. 0±1· 9%,以及 ChxlO 為 46. 3±1· 0%。Mitf (視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞的標(biāo)志物)和巢蛋白(神經(jīng)祖細(xì)胞的標(biāo)志物)被表達(dá)的陽性率分別為17. 2±0. 4%和65. 7±2· 7%(表 I)。觀察到在第三步中分化的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(實(shí)施例4)具有受調(diào)節(jié)的標(biāo)志物表達(dá)水平與前面步驟中的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞相比，標(biāo)志物Pax6、Rax和ChxlO (三者均為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特有的)、Crx (感光細(xì)胞前體細(xì)胞特有的)、恢復(fù)蛋白(全體感光細(xì)胞特有的)、視紫紅質(zhì)(視桿細(xì)胞特有的)以及外周蛋白2 (感光細(xì)胞外段特有的)的表達(dá)水平提高；同吋，0tx2和Sox2(視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特有的)以及巢蛋白(神經(jīng)祖細(xì)胞特有的)、(Ki67表明細(xì)胞増殖)的表達(dá)水平降低(表I和表3)。此外，觀察到從第四步得到的感光細(xì)胞前體細(xì)胞(實(shí)施例5)具有受調(diào)節(jié)的標(biāo)志物表達(dá)水平與前面步驟中的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞相比，Pax6和ChxlO (每種都是視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特有的)以及Sox2(視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特有的)的表達(dá)水平降低；同吋，Ki67(表明細(xì)胞増殖)以及視紫紅質(zhì)和外周蛋白2(二者是感光細(xì)胞特有的)的表達(dá)水平提高(表I和表3)。在第五步分化的感光細(xì)胞中也檢測(cè)到了標(biāo)志物表達(dá)水平的調(diào)節(jié)(實(shí)施例6):視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特有的Pax6，視網(wǎng)膜祖細(xì)胞特有的Sox2以及感光細(xì)胞特有的恢復(fù)蛋白、視紫紅質(zhì)和外周蛋白2的表達(dá)水平提高；同時(shí)，神經(jīng)祖細(xì)胞特有的巢蛋白，表明細(xì)胞増殖的Ki67以及感光細(xì)胞前體細(xì)胞特有的Crx的表達(dá)水平降低(表I和表3)。另ー方面，本發(fā)明提供了按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。又一方面，本發(fā)明提供了按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的感光細(xì)胞前體細(xì)胞。另ー方面，本發(fā)明提供了按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的感光細(xì)胞。還ー方面，本發(fā)明提供了全部按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜細(xì)胞，包括感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞或視網(wǎng)膜色素上皮。另ー方面，本發(fā)明提供了用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的組合物，其包含按照本發(fā)明方法分化的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。又一方面，本發(fā)明提供了用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的組合物，其包含按照本發(fā)明方法分化的感光細(xì)胞前體細(xì)胞。另ー方面，本發(fā)明提供了用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的組合物，其包含按照本發(fā)明方法分化的感光細(xì)胞。還ー方面，本發(fā)明提供了用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的組合物，其包含全部按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜細(xì)胞，所述視網(wǎng)膜細(xì)胞選自感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮及以上的組合。
術(shù)語“視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病”意指由先天或后天視網(wǎng)膜退化或異常引起的任何疾病。視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的實(shí)例包括視網(wǎng)膜發(fā)育異常、視網(wǎng)膜退化、老年黃斑退化、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜色素變性、先天性視網(wǎng)膜失養(yǎng)癥、Leber先天性黑朦、視網(wǎng)膜脫落、青光目艮、視神經(jīng)病變和外傷。由利用本發(fā)明的方法從人胚胎干細(xì)胞體外分化和増殖出的神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞(包含神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、感光細(xì)胞前體細(xì)胞和/或感光細(xì)胞)制備的用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的組合物可被配制成常見的劑量形式，例如注射劑，其可被給予患有這類疾病的患者。組合物可以利用手術(shù)方法直接植入視網(wǎng)膜位置，或者可以通過靜脈注射并移至視網(wǎng)膜位置。如上文所討論，本發(fā)明的組合物可包含作為活性成分的完全分化的視網(wǎng)膜細(xì)胞如感光細(xì)胞，或者分化中的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞或感光細(xì)胞前體細(xì)胞。后一種情況下，當(dāng)給予機(jī)體時(shí)，分化中的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞或光受體前體細(xì)胞可以在原先存在的因子的調(diào)控下進(jìn)行進(jìn)一歩的分化，進(jìn)而發(fā)揮治療作用。本發(fā)明的組合物還可包含免疫抑制劑以抑制對(duì)植入物的免疫排斥反應(yīng)。給予患者的組合物的治療有效量可以隨醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公知的多種因素而改變，包括疾病的嚴(yán)重程度、治療方案、給藥時(shí)間和途徑、治療方案、治療時(shí)間周期、患者的年齡、體重、健康狀況、性別以及飲食，并且該有效量應(yīng)當(dāng)由本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員在合理的醫(yī)學(xué)判斷下來確定。另ー方面，本發(fā)明提供了通過將本發(fā)明的組合物給予有需要的個(gè)體來治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的方法。本發(fā)明的組合物也適用于包括以下的動(dòng)物家畜或?qū)櫸?，例如牛、豬、綿羊、馬、狗、小鼠、大鼠、貓等以及人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物。本文所用的術(shù)語“給予”意指通過合適的途徑(包括移植分化的細(xì)胞)將本發(fā)明的組合物引入患者中。使本發(fā)明的組合物能夠到達(dá)目的組織的任何給藥途徑都可以用于本發(fā)明中。優(yōu)選視網(wǎng)膜內(nèi)注射。另ー方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，包括用Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑處理分化培養(yǎng)基，并在分化期間從所述培養(yǎng)基去除fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑。由于Wnt蛋白在后腦發(fā)育中起重要作用，因此在分化的早期階段使用Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑，以便誘導(dǎo)向前腦和視網(wǎng)膜分化，同時(shí)抑制向后腦分化。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，只要是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，任何Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑都可不受限制地使用。優(yōu)選Dkk-I。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在分化的早期階段向培養(yǎng)基添加Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑，從而抑制向后腦分化，并且在從干細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜祖細(xì)胞之后，從該培養(yǎng)基中去除fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑，目的在于使感光細(xì)胞以高產(chǎn)量分化和成熟的。另ー方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，其包括用BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑處理分化培養(yǎng)基，并在分化期間從所述培養(yǎng)基中去除BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑。在分化的早期階段使用BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑，從而誘導(dǎo)和促進(jìn)胚胎發(fā)生期間前腦的發(fā)育，然后在晚期階段去除BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑，以免其抑制Shh途徑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，只要是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，任何BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑都可 不受限制地使用。優(yōu)選頭蛋白。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在分化的早期階段向培養(yǎng)基添加BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑，并且在從干細(xì)胞產(chǎn)生感光細(xì)胞前體細(xì)胞之后，從該培養(yǎng)基中去除BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制齊 。另ー方面，本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，其包括用FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑處理分化培養(yǎng)基，并在分化期間從所述培養(yǎng)基中去除FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。在分化的早期階段使用FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，從而促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的增殖，然后在晚期階段去除FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，以免其抑制Shh誘導(dǎo)的視紫紅質(zhì)表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，只要是本領(lǐng)域內(nèi)公知的，任何FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑都可不受限制地使用。優(yōu)選FGF2。在優(yōu)選實(shí)施方案中，在從干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞之后，向培養(yǎng)基中添加FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑，然后在從干細(xì)胞產(chǎn)生感光細(xì)胞前體細(xì)胞之后，從所述培養(yǎng)基中去除FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。發(fā)明的實(shí)施方式通過以下的實(shí)施例可以更好地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例是說明性，不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :干細(xì)胞的培養(yǎng)<1-1>人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞(hESC)系H9 (WA09,正常核型XX)和H7 (WA07,正常核型XX)購(gòu)自WiCell Research Institute(Madison, WI, USA) 通過在以下培養(yǎng)基的飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)使hESC發(fā)生未分化的增殖(H9細(xì)胞 第25-33 代；H7 細(xì)胞 第 23-28 代)DMEM/F12 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) ,20%(v/v) KnockOut 血清替代物(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ImM L-谷氨酸胺(Invitrogen),0. ImM非必需氨基酸(Invitrogen), 0. ImM疏基こ醇(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和4ng/ml重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF2, Invitrogen),所述飼養(yǎng)細(xì)胞例如福射過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF，ATCC, Manassas, VA, USA)或絲裂霉素處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(EmbryoMax Primary Mouse Embryo Fibroblasts, Millipore, Billerica, MA, USA)。
盡管姆天更換新鮮的培養(yǎng)基,但姆隔6或7天手動(dòng)或用膠原酶IV(Invitrogen)以1:9-1:15的比例對(duì)未分化的干細(xì)胞進(jìn)行傳代，然后轉(zhuǎn)移到新鮮的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞上。在hESC傳代期間，用未分化的hESC特有的抗原0CT-4和SSEA-4(Chemicon, Temecula, CA, USA)在固定的時(shí)間間隔進(jìn)行免疫化學(xué)染色，以監(jiān)測(cè)分化的程度。去除所發(fā)現(xiàn)的已進(jìn)行分化的細(xì)胞。定期用試劑盒(MycoAlert支原體檢測(cè)試劑盒，Lonza, Rockland, ME, USA)監(jiān)測(cè)hESC培養(yǎng)物中支原體污染物的存在，該污染物能對(duì)hESC的分化造成不利影響?！?-2>誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)的培養(yǎng)人iPSC 系 iPS (Foreskin)-I (克隆 I)(正常核型 XY)購(gòu)自 WiCell ResearchInstitute(Madison, WI, USA)。通過在以下培養(yǎng)基的飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)人iPSC，使它們發(fā)生未分化的增殖(第37-47 代):DMEM/F12(Invitrogen, Grand Island, NY, USA),20%(v/v)KnockOut 血清替代物(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),ImM L-谷氨酸胺(Invitrogen), O. ImM 非必需氨基酸(Invitrogen),O. ImM 疏基こ醇(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)和10ng/ml重組人FGF2 (Invitrogen),所述飼養(yǎng)細(xì)胞例如福射過的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF，ATCC, Manassas, VA，USA)或絲裂霉素處理的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(EmbryoMaxPrimary Mouse Embryo Fibroblasts, Miilipore，Billerica, MA，USA)。盡管姆天更換新鮮的培養(yǎng)基,但姆隔6或7天手動(dòng)或用膠原酶IV(Invitrogen)以1:4-1:6的比例對(duì)未分化的干細(xì)胞進(jìn)行傳代，然后轉(zhuǎn)移到新鮮的MEF飼養(yǎng)細(xì)胞上。在hESC傳代期間，用未分化的人iPSC特有的抗原SSEA-4 (Chemicon, Temecula, CA, USA)和Nanog(abeam, Cambridge, MA, USA)在固定的時(shí)間間隔進(jìn)行免疫化學(xué)染色，以監(jiān)測(cè)分化的程度。去除經(jīng)鑒定已進(jìn)行分化的細(xì)胞。定期用試劑盒(MycoAlert支原體檢測(cè)試劑盒，Lonza, Rockland, ME, USA)監(jiān)測(cè)hESC培養(yǎng)物中支原體污染物的存在，該污染物能對(duì)hESC的分化造成不利影響。實(shí)施例2 :從hESC或人iPSC向眼區(qū)前體細(xì)胞的分化將實(shí)施例I中培養(yǎng)的hESC或人iPSC與MEF細(xì)胞分離(圖I和圖14)，并接種至6孔超低吸附平板(Corning Incorporated, Corning, NY, USA)。向6孔超低吸附平板中的hESC或人iPSC添加能誘導(dǎo)向眼區(qū)前體細(xì)胞分化的培養(yǎng)基[DMEM/F12，10%Knock0ut血清替代物，ImM L-谷氨酰胺，O. ImM非必需氨基酸，O. ImM巰基こ醇，1%B27 補(bǔ)充物(Invitrogen), lng/ml 重組頭蛋白(R&D Systems), lng/ml 重組 Dkk-I (Dickkopf-1, R&D Sytstems)和 5ng/ml 重組 IGF-I (胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，R&DSystems)]。將細(xì)胞培養(yǎng)4_5天，以產(chǎn)生懸浮聚集形式的眼區(qū)前體細(xì)胞，每隔三天更換一次新鮮的培養(yǎng)基(圖I)。實(shí)施例3 :從眼區(qū)前體細(xì)胞向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化將實(shí)施例2中產(chǎn)生的眼區(qū)前體細(xì)胞(懸浮聚集物)以每孔53±8個(gè)細(xì)胞的密度(292±53個(gè)細(xì)胞/懸浮聚集物)接種至6孔聚D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板(BDBiosciences),并以姆孔12±4個(gè)細(xì)胞的密度接種至8孔聚D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的平板，然后提供能誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化的培養(yǎng)基[DMEM/F12 (Invitrogen)，ImM L-谷氨酸胺(Invitrogen), O. ImM非必需氨基酸(Invitrogen), O. ImM疏基こ醇(Sigma-Aldrich)，1%B27 補(bǔ)充物，1%N2 補(bǔ)充物(Invitrogen), 10ng/ml Dkk_l, 10ng/ml 頭蛋白，10ng/ml I GF-1和5ng/ml FGF2]，培養(yǎng)9天，以產(chǎn)生視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。實(shí)施例4 :從視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化將實(shí)施例3中所產(chǎn)生的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞在所提供的誘導(dǎo)向神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化的培養(yǎng)基[DMEM/F12 (Invitrogen), ImM L-谷氨酸胺(Invitrogen), O. ImM 非必需氨基酸(Invitrogen),O. ImM 疏基こ醇(Sigma-Aldrich)，1%B27 補(bǔ)充物(Invitrogen)，1%N2 補(bǔ)充物(Invitrogen), 10ng/ml 頭蛋白，10ng/ml IGF-1, 5ng/ml FGF2, 50ng/ml 重組 Wnt3a (R&DSystems)]中培養(yǎng)5天，從而產(chǎn)生神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(圖I)。實(shí)施例5 :從神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞向感光細(xì)胞前體細(xì)胞的分化將實(shí)施例4中產(chǎn)生的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞在所提供的培養(yǎng)基[DMEM/F12 (Invitrogen), ImM L-谷氨酸胺(Invitrogen), 0. ImM 非必需氨基酸(Invitrogen),0. ImM疏基こ醇(Sigma-Aldrich), 1%B27補(bǔ)充物(Invitrogen), 1%N2補(bǔ)充物(Invitrogen),10ng/ml IGF-1, 50ng/ml Wnt3a 和 250ng/ml 重組 Shh (音猬因子氨基末端妝，Shh, R&D Systems)]中培養(yǎng)3天,從而誘導(dǎo)分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞。從所述培養(yǎng)基中去除前面步驟中用到的頭蛋白和FGF2(圖I)。實(shí)施例6 :從感光細(xì)胞前體細(xì)胞向感光細(xì)胞的分化通過提供特化培養(yǎng)基[DMEM/F12(Invitrogen), ImM L-谷氨酰胺(Invitrogen),0. ImM 非必需氨基酸(Invitrogen), 0. ImM 疏基こ醇(Sigma-Aldrich), 1%B27 補(bǔ)充物(Invitrogen), 1%N2 補(bǔ)充物(Invitrogen), 10ng/ml IGF-1, 50ng/ml Wnt3a, 250ng/ml Shh,500nM (全反式視黃酸(RA, Sigma-Aldrich) ] 8天或更長(zhǎng)時(shí)間來誘導(dǎo)感光細(xì)胞前體細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞。在實(shí)施例2-6中，每隔2或3天將所有培養(yǎng)基更換成新鮮的培養(yǎng)基，并將細(xì)胞在37° C下5%C02的環(huán)境中培養(yǎng)。所有誘導(dǎo)和分化實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少三次，并都獲得了相同的結(jié)果O實(shí)施例7 :細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物的測(cè)定<7-1>細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的免疫化學(xué)染色和鑒定利用如下的免疫化學(xué)染色法檢測(cè)實(shí)施例3至6中所獲得的細(xì)胞的分化。在與用于向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、感光細(xì)胞前體細(xì)胞和感光細(xì)胞分化相同的條件下，在8孔聚D-賴氨酸/層粘連蛋白包被的載片中(BD Biosciences, Bedford, MA)培養(yǎng)眼區(qū)前體細(xì)胞(懸浮聚集物)。用4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定每步中充分培養(yǎng)的細(xì)胞，之后用含有3%BSA (Jackson Immunoresearch Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)和 0.25%TritonX-100 (Sigma-Aldrich)的PBS封閉非特異性反應(yīng)。封閉90分鐘之后，在4° C下利用以下對(duì)每個(gè)分化步驟的細(xì)胞特異的抗體過夜孵育姆個(gè)分化步驟的載片兔-藍(lán)視蛋白(1:500，Chemicon)、綿羊-Chxl0(l: 100, Chemicon)、兔-Crx (I:200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA, USA) >兔-GFAP (1:200, Invitrogen)、小鼠-人特異的線粒體(1:50, Chemicon)、免-人特異的線粒體(I:200，Chemicon)、小鼠-Isletl(I:10，Developmental Studies HydromaBank, DSHB ；Iowa City, IA, USA)、小鼠 _Ki67(1:100, Vector Laboratories, Peterborough, England)、小鼠-Mitf (I: I, 000, abeam, Cambridge, MA, USA)、小鼠-巢蛋白(1:250, BDSciences)、免-神經(jīng)絲蛋白-200 (I: I, 000, Sigma-Aldrich)、兔 _Otx2 (1:100, abeam)、兔-Pax2 (1:250，abeam)、小鼠 _Pax6 (1: 2，DSHB)、小鼠-外周蛋白 2 (1:500，GenScript, Piscataway, NJ, USA)、兔-Rax (1:250, abeam)、兔-恢復(fù)蛋白(1:1，000, Chemicon)、視網(wǎng)膜色素上皮 65 (RPE65, 1:100，Chemicon)、兔-視紫紅質(zhì)(1:500，Sigma-Aldrich)、小鼠-視紫紅質(zhì)(1:500，Ret-Pl, Lab Vision, Fremont, CA, USA)、小鼠-視紫紅質(zhì)(1: 2，000，Ret-P1，Sigma-Aldrich)、小鼠-roml(1:50, ABR-Affinity Bioreagents, Golden, CO, USA)>兔-PDE6β (1:100，abeam)、免-光導(dǎo)蛋白(I:500，Santa Cruz Biotechnology)>小鼠-PKC-α (1:500，Sigma-Aldrich)、小鼠-Proxl(I:2，000，Chemicon)、小鼠-Sox2 (1:250，R&D Systems)、免-突觸蛋白(I: 2，000，Santa Cruz Biotechnology)和兔-ZO-1(1:100, Zymed-Invitrogen)。使用之前，將這些抗體稀釋于含1%BSA和0. 25%Triton X-100的PBS溶 液中。用PBS將每步載片上培養(yǎng)的細(xì)胞洗滌三次，毎次5分鐘，并用與Cy3偶聯(lián)的種特異性ニ抗(1:800, Jackson Immunoresearch Laboratory)或與 Alexa488 偶聯(lián)的種特異性 ニ抗(1:500，Invitrogen)在室溫下孵育2小時(shí)。適于作為ー抗和ニ抗的標(biāo)準(zhǔn)材料用來檢測(cè)非特異性染色或抗體間的相互作用。然后，用PBS將細(xì)胞洗滌三次，毎次5分鐘，用 DAPI (4’，6_ ニ脈基-2_ 苯基卩引噪)復(fù)染并在 Vectashield (Vector Laboratories)中封片，隨后在落射熒光顯微鏡(Nikon Eclipse, E800, Tokyo, Japan)和共聚焦顯微鏡(Leica, Leica Microsystems Inc,Bannockburn,IL, USA or ZeissLSM510,CarlZeiss, Inc, Thornwood, Ny, USA)下顯像。從在200倍放大倍數(shù)下隨機(jī)選擇的20個(gè)顯微鏡視野計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，并評(píng)價(jià)對(duì)每種抗體的陽性應(yīng)答。在評(píng)價(jià)至少三次之后，確定對(duì)抗體的陽性應(yīng)答。利用MedCalc 8. I. 1.0版的 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)和 Bland-Altman 圖(Bland and Altman, 1986)以及 SAS 9. I 版的GEE (Generalized Estimating Equations)模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將所有數(shù)據(jù)表示為將所有數(shù)據(jù)表示為平均值土平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(S. E. Μ)，p〈0. 05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著。對(duì)于前腦眼區(qū)前體細(xì)胞和視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的特征標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)在實(shí)施例3中所產(chǎn)生的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞中表達(dá)的Rax的陽性率為86. 6±3· 0%，Pax6的陽性率為63. 9±0· 9%，0tx2的陽性率為76. 4±2. 0%，Sox2的陽性率為83. O ± I. 9%以及ChxlO的陽性率為46.3±1.0%。還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表達(dá)視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞的特征標(biāo)志物Mitf的陽性率為
17.2±0. 4%，神經(jīng)祖細(xì)胞特有的標(biāo)志物巢蛋白的陽性率為65. 7±2. 7%(表I和表2)。表I標(biāo)志物水平隨培養(yǎng)時(shí)間的變化
權(quán)利要求
1.使干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，其包括在含有以下成分的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞IGF1R(胰島素樣生長(zhǎng)因子-I受體)活化劑、BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、FGF (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜祖細(xì)胞被培養(yǎng)I至30天以產(chǎn)生所述神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。
3.使干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，其包括在含有以下成分的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)干細(xì)胞來源的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞=IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞被培養(yǎng)I至30天以產(chǎn)生所述感光細(xì)胞前體細(xì)胞。
5.使干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，其包括在含有以下成分的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)干細(xì)胞來源的感光細(xì)胞前體細(xì)胞分化成為感光細(xì)胞=IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑、Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和RA (視黃酸)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述感光細(xì)胞前體細(xì)胞被培養(yǎng)I至60天以產(chǎn)生所述感光細(xì)胞。
7.誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，其包括 (a)在含有以下成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞來源的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞以使它們分化成為神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞=IGFlR活化劑、BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑、FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑和Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑； (b)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞以使它們分化成為感光細(xì)胞前體細(xì)胞，該培養(yǎng)基除了從其中去除BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑并向其中添加Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑之外，與步驟(a)中的培養(yǎng)基相同；以及 (c)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述感光細(xì)胞前體細(xì)胞以使它們分化成為包括感光細(xì)胞在內(nèi)的視網(wǎng)膜細(xì)胞，該培養(yǎng)基除了向其中添加RA之外，與步驟(b)中的培養(yǎng)基相同。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)分別進(jìn)行以下時(shí)間1至30天、I至30天和I至60天。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中通過以下步驟獲得所述視網(wǎng)膜祖細(xì)胞 (a’)在含有以下成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)干細(xì)胞以使它們分化成為懸浮聚集形式的眼區(qū)前體細(xì)胞=IGFlR活化劑、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑和BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑；以及 (b’)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述懸浮聚集形式的眼區(qū)前體細(xì)胞以使它們分化成為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，該培養(yǎng)基除了再向其中添加FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑之外，與步驟(a’)中的培養(yǎng)基相同。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述步驟(a’)和(b’)分別進(jìn)行I至30天和5至15天的時(shí)間。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述干細(xì)胞選自骨髄干細(xì)胞(BMS)、臍帶血干細(xì)胞、羊水干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞(RSC)、視網(wǎng)膜內(nèi)米勒膠質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESC)、誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)和體細(xì)胞核移植細(xì)胞(SCNT)。
12.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述IGFlR活化劑是IGF-I或IGF-2。
13.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有濃度為0.01至100ng/ml 的 IGFlR 活化劑。
14.如權(quán)利要求1、7和9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑選自頭蛋白、腱蛋白、扭曲原腸胚形成(Tsg)、cerberus、coco、greml in>PRDC (與 DNA 和 cerberus相關(guān)的蛋白)、DAN(在成神經(jīng)細(xì)胞瘤中差別篩選選出的基因aberrative)、dante、卵泡抑素、USAG-I (子宮敏感性相關(guān)基因I)、dorsomorphin、硬化蛋白及以上的組合。
15.如權(quán)利要求1、7和9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有濃度為O.01至100ng/ml的BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑。
16.如權(quán)利要求1、7和9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑活化FGFR Ic 或 FGFR 3c。
17.如權(quán)利要求1、7和9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑選自FGFI、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17、FGF19 及以上的組合。
18.如權(quán)利要求1、7和9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有濃度為O.01至100ng/ml的FGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。
19.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑選自ffntl> Wnt2> Wnt2b> Wnt3> Wnt3a> Wnt4> Wnt5a> Wnt5b> Wnt6> Wnt7a> Wnt7b> Wnt8a> Wnt8b>Wnt9a>ffnt9b>ffntl0a>ffntl0b>ffntll>ffntl6b ;增加 β -連環(huán)蛋白表達(dá)水平的物質(zhì)；GSK3(糖原合酶激酶3)抑制劑，選自鋰(Li)、LiCl、ニ價(jià)鋅(ニ價(jià)Zn)、BI0(6-溴靛玉紅-3’ -肟)、SB216763、SB415286、CHIR99021、QSll 水合物、TWS119、kenpaullone、alsterpaullone、靛紅_3，-肟、TDZD-8、Ro 31-8220甲磺酸鹽及以上的組合；Axin抑制劑；APC (腺瘤性息肉病)抑制劑；norrin ；R-spondin 2 ;以及以上的組合。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有除LiCl、BI0和SB415286之外濃度為0. 01至500ng/ml的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中LiCl、BI0或SB415286被用作Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑時(shí)，所述培養(yǎng)基含有濃度為0. I至50mM的LiCl ;濃度為0. I至50 μ M的BIO ；以及濃度為 0. I 至 500 μ M 的 SB415286。
22.如權(quán)利要求3、5和7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑選自Shh> Smo (smoothened)受體活化劑、Ptc (Patched)與Smo相互作用的抑制劑、増加Ci/Gli家族水平的物質(zhì)、Ci/Gli因子細(xì)胞內(nèi)降解的抑制劑、Hg-Ag、purmorphamine及以上的組合。
23.如權(quán)利要求3、5和7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有濃度為0.I至5，000ng/ml的Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。
24.如權(quán)利要求5或7所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有濃度為0.5至10，OOOnM的RA。
25.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑選自Dkk-I、Dkk_2、Dkk-3 和 Dkk-4。
26.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有濃度為0.01至10，000ng/ml的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑。
27.如權(quán)利要求1、3、5和7中任一項(xiàng)所述的方法，其還包括確定分化的細(xì)胞是否為靶細(xì)胞。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述確定步驟通過分析以下細(xì)胞的特征基因的mRNA或蛋白表達(dá)水平來進(jìn)行視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞、感光細(xì)胞前體細(xì)胞或感光細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的特征基因是選自Rax、Pax6、ChxlO和Crx中的至少兩種基因的組合。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述感光細(xì)胞前體細(xì)胞的特征基因是Crx或Nrl。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述感光細(xì)胞的 特征基因選自恢復(fù)蛋白、視紫紅質(zhì)、夕卜周蛋白2、roml、Pde6b、arrestin sag、光導(dǎo)蛋白、突觸蛋白、紅綠視蛋白、藍(lán)視蛋白及以上的組合。
32.如權(quán)利要求9所述的方法，其中步驟(b’)中所述懸浮聚集形式的眼區(qū)前體細(xì)胞在包被有選自以下細(xì)胞外基質(zhì)的平板上貼壁生長(zhǎng)聚D-賴氨酸、層粘連蛋白、聚L-賴氨酸、基質(zhì)膠、瓊脂、聚鳥氨酸、明膠、膠原蛋白、纖維連接蛋白和玻璃粘連蛋白。
33.如權(quán)利要求9所述的方法，其中步驟(b’)中的每ー懸浮聚集物包含200-400個(gè)眼區(qū)前體細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求9所述的方法，其中步驟(a’)中的培養(yǎng)基還包含DMEM/F12、10%Knockout血清替代物、ImM L-谷氨酰胺、O. ImM非必需氨基酸、O. ImM巰基こ醇和1%B27補(bǔ)充物。
35.如權(quán)利要求7或9所述的方法，其中步驟(b’)、(a)、(b)或(c)中的培養(yǎng)基還包含DMEM/F12、lmM L-谷氨酰胺、O. ImM非必需氨基酸、O. ImM巰基こ醇、1%B27補(bǔ)充物和1%N2補(bǔ)充物。
36.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜細(xì)胞選自感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮及以上的組合。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述感光細(xì)胞組成超過50%的視網(wǎng)膜細(xì)胞群。
38.權(quán)利要求7所述方法的步驟(a)中所產(chǎn)生的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，其通過以下特征中的至少三個(gè)來表征 (i)Rax的表達(dá)水平增加； (ii)Pax6的表達(dá)水平增加； (iii)ChxlO的表達(dá)水平增加； (iv)0tx2的表達(dá)水平降低； (v)Sox2的表達(dá)水平降低； (vi)巢蛋白的表達(dá)水平降低； (vii)Ki67的表達(dá)水平降低； (viii)Crx的表達(dá)水平增加； (ix)恢復(fù)蛋白的表達(dá)水平増加； (X)視紫紅質(zhì)的表達(dá)水平增加； (xi)外周蛋白2的表達(dá)水平増加；以及 (xii)Mitf的表達(dá)水平降低。
39.權(quán)利要求7所述方法的步驟(b)中所產(chǎn)生的感光細(xì)胞前體細(xì)胞，其通過以下特征中的至少三個(gè)來表征(i)Pax6的表達(dá)水平降低； (ii)ChxlO的表達(dá)水平降低； (iii)Sox2的表達(dá)水平降低； (iv)Ki67的表達(dá)水平增加； (v)Crx的表達(dá)水平降低； (vi)視紫紅質(zhì)的表達(dá)水平増加；以及 (vii)外周蛋白2的表達(dá)水平増加。
40.權(quán)利要求7所述方法的步驟(c)中所產(chǎn)生的感光細(xì)胞，其通過以下特征中的至少三個(gè)來表征 (i)Pax6的表達(dá)水平增加； (ii)Sox2的表達(dá)水平増加； (iii)巢蛋白的表達(dá)水平降低； (iv)Ki67的表達(dá)水平降低； (v)Crx的表達(dá)水平降低； (vi)恢復(fù)蛋白的表達(dá)水平増加； (vii)視紫紅質(zhì)的表達(dá)水平増加；以及 (viii)外周蛋白2的表達(dá)水平増加。
41.通過權(quán)利要求7所述的方法從干細(xì)胞分化的視網(wǎng)膜細(xì)胞，其包括至少ー種選自以下的細(xì)胞感光細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、米勒膠質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮祖細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮，并且所述感光細(xì)胞組成超過50%的視網(wǎng)膜細(xì)胞群。
42.用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的組合物，其包含作為活性成分的至少ー種選自以下的細(xì)胞權(quán)利要求38所述的神經(jīng)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，權(quán)利要求39所述的感光細(xì)胞前體細(xì)胞，權(quán)利要求40所述的感光細(xì)胞和權(quán)利要求41所述的視網(wǎng)膜細(xì)胞.
43.如權(quán)利要求42所述的組合物，其中所述視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病選自視網(wǎng)膜發(fā)育異常、視網(wǎng)膜退化、老年黃斑退化、糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜色素變性、青光眼、視神經(jīng)病變、外傷、視網(wǎng)膜脫落、Leber先天性黑朦、先天性視網(wǎng)膜失養(yǎng)癥及以上的組合。
44.誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法，其包括用Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑處理分化培養(yǎng)基，并在分化期間從所述培養(yǎng)基去除fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中在分化的早期階段使用所述Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑。
46.如權(quán)利要求44所述的方法，其還包括在從所述培養(yǎng)基去除fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制劑時(shí)添加fct信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化劑。
47.治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的方法，其包括將權(quán)利要求42所述的組合物給予有需要的個(gè)體。
全文摘要
公開了在既不用基因植入也不用與視網(wǎng)膜組織共培養(yǎng)的情況下，通過在化學(xué)限定的條件下實(shí)施與體內(nèi)胚胎發(fā)育相似的分化過程來誘導(dǎo)干細(xì)胞在短期內(nèi)以高產(chǎn)量分化成為視網(wǎng)膜細(xì)胞的方法。并且公開了按照所述方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜細(xì)胞，包括感光細(xì)胞和它們的祖細(xì)胞以及各種類型的其它視網(wǎng)膜細(xì)胞。提供了用于治療視網(wǎng)膜退化相關(guān)疾病的包含所述視網(wǎng)膜細(xì)胞的組合物和方法。分化的感光細(xì)胞被植入退化的或受損的視網(wǎng)膜中時(shí)，能植入并融合入視網(wǎng)膜中，從而預(yù)防或治愈視網(wǎng)膜退化。
文檔編號(hào)C12N5/02GK102712900SQ201080058099
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月6日
發(fā)明者樸圣燮, 金志妍 申請(qǐng)人:金志妍, 首爾大學(xué)校 產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)