專利名稱：從酵母菌株生產(chǎn)生物柴油的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及產(chǎn)油酵母,包括庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichia kudriavzevii),畢赤酵母(Pichia)屬的一個種，以及以登記號MTCC 5493保藏的新型庫德里阿茲威畢赤酵母菌株，并涉及從產(chǎn)油酵母生產(chǎn)油和生物柴油。背景生物柴油是對于全球變暖、能源危機和枯竭的化石燃料供應(yīng)的對環(huán)境有益的解決方法。如今，生物柴油(例如，脂肪酸甲酯，“FAME”)是給予從生物的、可再生資源中產(chǎn)生的·可生物降解且無毒的清潔的燃燒替代燃料的名字。生物柴油可直接使用或可以以任何水平與石油產(chǎn)品例如石油柴油混合。在解決與溫室氣體有關(guān)的環(huán)境問題方面，生物柴油具有明顯的益處并給農(nóng)民提供新的收入。然而，傳統(tǒng)的富含油的農(nóng)作物受限于土地利用度，以及關(guān)于使用飼料和糧食作物用于燃料的環(huán)境和社會問題。以綠色且可持續(xù)的方式生產(chǎn)生物柴油而不競爭糧食作物的替代方式是使用微生物。自然界中存在幾種微生物，這些微生物當(dāng)在氮限制條件下生長時能夠積累或儲存油/脂質(zhì)至多達(dá)其干重的60%的固有能力。這些脂質(zhì)通常由80% -90%的具有與許多植物種子油相似的脂肪酸組成的三酰甘油組成(Rat I edge, C. , Evans,C. T. (1984)Influence of nitrogen metabolism on lipid accumulation in oleaginousyeasts, J. Gen.Microbiol. 1301693-704 ；Ykema A,Verbree EC, Kater MM, Smit H(1988)Optimization of lipid production in the oleaginous yeast Apiotrichum curvatumin whey permeate. Appl Microbiol Biotechnol 29 :211-218)。這些生物體被稱作產(chǎn)油微生物。微生物油，也稱作單細(xì)胞油，由某些產(chǎn)油微生物例如酵母、真菌、細(xì)菌和顯微藻類產(chǎn)生(Ma, Y. L. (2006)Microbial oils and its research advance. Chin. J. Bioprocess.Eng. 4(4) :7-11.)。已表明這些微生物油可用作生產(chǎn)生物柴油的原料。與其他植物油和動物脂肪相比，生產(chǎn)微生物油具有許多優(yōu)點與植物相比微生物具有短的生命周期，因此收獲的時間更短，需要較少的勞力，微生物油的產(chǎn)生較少受地點、季節(jié)和氣候的影響，且更容易放大(Li, Q. , Wang, M. Y. (1997)Use food industry waste to produce microbial oil.Science and Technology of Food Industry 6:65-69·)。因此，微生物油具有將來變成用于生產(chǎn)生物柴油的一種主要油原料的巨大潛力。盡管不是新概念，該領(lǐng)域的工作非常有限(Li，Qiang.，Wei，Du.，Dehua, Liu. (2008)Perspectives of microbial oils forbiodiesel production. AppI. Microbiol. Biotechnol. 80 :749-756.)。迄今研究的用于生產(chǎn)生物柴油的微生物細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母和真菌。優(yōu)選的真菌屬包括被孢霉屬(Mortierella)、須霉屬(Phycomyces)、蟲霉屬(Entomophthora)、腐霉屬(Pythium)、破囊壺菌(Thraustochytrium)、布拉氏霉(Blakeslea)、根毛霉屬(Rhizomucor)和曲霉屬(Aspergillus)。已研究的示例性的細(xì)菌包括丙酸桿菌屬(Propionibacterium)的那些細(xì)菌。研究的藻類包括腰鞭毛蟲(dinof Iagellate)和/或?qū)儆陔[甲藻屬(Crypthecodinium)、紫球藻屬(Porphyridium)或菱形藻屬(Nitschia),例如寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)。已研究了酵母例如耶羅維亞酵母屬(Yarrowia)、假絲酵母屬(Candida)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬抱酵母屬(Rhodosporidium)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、毛抱子菌屬(Trichosporon)和脂質(zhì)酵母屬(Lipomyces)以獲得其微生物油的性質(zhì),且在這些產(chǎn)油酵母中，彎曲隱球酵母(Cryptococcus curvatus)已引起注意，因為其可利用廉價的碳源例如乳清滲透物(Ykema, A. (1989) Lipid production in the oleaginous yeastApiotrichum curvatum. PhD thesis. Free University Amsterdam, The Netherlands.)和其他富含碳水化合物的農(nóng)業(yè)或食品加工廢料積累大量的油，多達(dá)細(xì)胞干重的60%(Ratledge, C. (1991)Microorganisms for lipids. Acta. Biotechnol. 11 :429-438)。彎曲隱球酵母(C. curvatus)產(chǎn)生的酵母油類似植物種子油如棕櫚油(Davies, R. J. (1988)Yeast oil from cheese whey ；process development.在Moreton RS (編)Single cell`oil. Longman,London的第99-145頁)。還已研究了畢赤屬和酵母屬的酵母，例如西弗畢赤酵母(Pichia ciferrii)。目前，生產(chǎn)酵母油比生產(chǎn)植物油更昂貴。因此，當(dāng)可生產(chǎn)帶有高附加值的特定油時，單細(xì)胞油發(fā)酵將是經(jīng)濟(jì)上可行的。因此，之前的方法已使用工藝工程產(chǎn)生更高的脂質(zhì)產(chǎn)率、更高的細(xì)胞脂質(zhì)含量，和更高的生物質(zhì)生產(chǎn)，所有這些都適合使工藝在經(jīng)濟(jì)上更可行。已報道增加培養(yǎng)物中產(chǎn)油微生物的細(xì)胞密度的不同的培養(yǎng)方式，包括補料分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵。然而，現(xiàn)有技術(shù)沒有側(cè)重于從發(fā)酵培養(yǎng)基中有效提取油。發(fā)明概述本文公開了稱為庫德里阿茲威畢赤酵母的新型、分離的產(chǎn)油酵母菌株，該菌株已以微生物典型培養(yǎng)物保藏中心(“MTCC”)登記號5493保藏。本文還公開了發(fā)酵產(chǎn)油酵母例如庫德里阿茲威畢赤酵母的某些方法、發(fā)酵產(chǎn)油酵母例如庫德里阿茲威畢赤酵母的方法、提取由產(chǎn)油酵母例如庫德里阿茲威畢赤酵母產(chǎn)生的油的方法和由產(chǎn)油酵母例如庫德里阿茲威畢赤酵母生產(chǎn)生物柴油的方法。在某些實施方式中，這些方法使用廉價且經(jīng)濟(jì)的組分和工藝。因此，本文公開了庫德里阿茲威畢赤酵母的分離的酵母細(xì)胞，MTCC保藏號為5493。在某些實施方式中，分離的酵母細(xì)胞能夠在產(chǎn)油條件下將其重量的至少50%，或約50%累積成油。在某些實施方式中，分離的酵母細(xì)胞處于培養(yǎng)基中。在某些實施方式中，培養(yǎng)基包括粗制甘油、玉米衆(zhòng)(corn steep liquor)和酵母自溶物。本文還公開了以登記號MTCC 5493保藏的庫德里阿茲威畢赤酵母菌株。本文還公開了庫德里阿茲威畢赤酵母MTCC 5493的生物學(xué)純培養(yǎng)物。本文還公開了包含庫德里阿茲威畢赤酵母MTCC 5493的分離的酵母細(xì)胞的微生物組合物。本文還公開了包含由分離的酵母細(xì)胞產(chǎn)生的油的組合物。在某些實施方式中，分離的酵母細(xì)胞是庫德里阿茲威畢赤酵母，MTCC保藏號5493。在某些實施方式中，油包括至少約10%的棕櫚酸、至少約8%的棕櫚油酸、至少約I %的硬脂酸、至少約41 %的油酸、至少約15%的亞油酸和至少約6%的亞麻酸。在某些實施方式中，已對提取的油進(jìn)行酯交換。本文還公開了包括分離的酵母細(xì)胞和培養(yǎng)基的組合物。在某些實施方式中，培養(yǎng)基包括約1% w/v的粗制甘油，約2% w/v的玉米衆(zhòng)、約O. 5% w/v的酵母自溶物、其中組合物具有約5. 5的pH。在某些實施方式中，酵母細(xì)胞包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母。本文還公開了用于培養(yǎng)酵母細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生油的方法。在某些實施方式中，該方法包括提供包含約1% w/v的粗制甘油、約2% w/v的玉米衆(zhòng)、約O. 5% w/v的隱球酵母自溶物的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基具有約5. 5的pH ;和使用補料分批發(fā)酵在約28°C下在培養(yǎng)基中發(fā)酵酵母細(xì)胞至少約100小時。在某些實施方式中，酵母細(xì)胞包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母。在某些實施方式中，發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行至少約110小時。在某些實施方式中，補料分批發(fā)酵包括在發(fā)酵期間加入甘油。在某些實施方式中，所加入的甘油包括粗制甘油。在某些實施方式中，當(dāng)發(fā)酵的甘油濃度低于約8g/L時向培養(yǎng)基中加入甘油。在其他實施方式中，發(fā)酵持續(xù)到酵母細(xì)胞的OD在約110和150之間。在某些實施方式中，發(fā)酵產(chǎn)生以干重計至少約14%的油產(chǎn)率。在其他實施方式中，發(fā)酵產(chǎn)生以干重計至少約·20%的油產(chǎn)率。又在其他實施方式中，發(fā)酵后經(jīng)發(fā)酵的細(xì)胞生物質(zhì)以干重計為至少約30g/L。在某些實施方式中，酵母細(xì)胞包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母。本文還公開了用于生產(chǎn)包括脂肪酸甲酯的油的方法。在某些實施方式中，該方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)分離的酵母細(xì)胞；和從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中提取油。在某些實施方式中，對提取的油進(jìn)行酯交換。在某些實施方式中，在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)包括提供包含約1% W/V的粗制甘油、約2% w/v的玉米衆(zhòng)、約O. 5% w/v的隱球酵母自溶物的培養(yǎng)基,其中培養(yǎng)基具有約5. 5的pH ;和使用補料分批發(fā)酵在約28°C下在培養(yǎng)基中發(fā)酵酵母細(xì)胞至少約100小時。在某些實施方式中，酵母細(xì)胞包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母。本文還公開了用于生產(chǎn)包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法。在某些實施方式中，該方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)酵母細(xì)胞，例如MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母；從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中提取油；并對提取的油進(jìn)行酯交換。本文還公開了用于生產(chǎn)包括脂肪酸甲酯的生物柴油的方法。在某些實施方式中，該方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母的酵母細(xì)胞；和通過直接酯交換提取脂肪酸甲酯。在其他實施方式中，該方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母的酵母細(xì)胞；和從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中分離脂肪酸甲酯。又在其他實施方式中，該方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)分離的酵母細(xì)胞，例如MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母；和從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中分離脂肪酸甲酯。因此，本文公開了以MTCC登記號5493鑒定的庫德里阿茲威畢赤酵母的分離的酵母細(xì)胞。在某些實施方式中，分離的酵母細(xì)胞能夠在產(chǎn)油條件下將其重量的約50%累積成油。在某些實施方式中，分離的酵母細(xì)胞處于培養(yǎng)基中。在某些實施方式中，培養(yǎng)基包括粗制甘油、玉米漿和酵母自溶物。本文還公開了以登記號MTCC 5493保藏的庫德里阿茲威畢赤酵母菌株的分離的酵母細(xì)胞。本文還公開了庫德里阿茲威畢赤酵母MTCC 5493的生物學(xué)純培養(yǎng)物。本文還公開了包括庫德里阿茲威畢赤酵母MTCC 5493的分離的酵母細(xì)胞的微生物組合物。本文還公開了包括由分離的酵母細(xì)胞產(chǎn)生的油的組合物；在某些實施方式中，分離的酵母細(xì)胞為庫德里阿茲威畢赤酵母，MTCC保藏號為5493。在某些實施方式中，油包括至少約10%的棕櫚酸、至少約8%的棕櫚油酸、至少約I %的硬脂酸、至少約41 %的油酸、至少約15%的亞油酸和至少約6%的亞麻酸。在某些實施方式中，已對提取的油進(jìn)行酯交換。本文還公開了包括分離的酵母細(xì)胞和培養(yǎng)基的組合物。在某些實施方式中，培養(yǎng)基包括約1% w/v的粗制甘油、約2% w/v的玉米衆(zhòng)、約O. 5% w/v的酵母自溶物,其中組合物具有約5. 5的pH。在某些實施方式中，酵母細(xì)胞包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母。本文還公開了用于培養(yǎng)酵母細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生油的方法。在某些實施方式中，該方法包括提供包括約1% w/v的粗制甘油、約2% w/v的玉米衆(zhòng)、約O. 5% w/v的隱球酵母自溶物的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基具有約5. 5的pH ;和使用補料分批發(fā)酵在約28°C下在培養(yǎng)基中發(fā)酵酵母細(xì)胞至少約100小時。在某些實施方式中，酵母細(xì)胞包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母。在某些實施方式中，發(fā)酵進(jìn)行至少約110小時。在某些實 施方式中，補料分批發(fā)酵包括在發(fā)酵期間加入甘油。在某些實施方式中，所加入的甘油包括粗制甘油。在某些實施方式中，當(dāng)發(fā)酵的甘油濃度低于約8g/L時向培養(yǎng)基中加入甘油。在其他實施方式中，發(fā)酵持續(xù)到酵母細(xì)胞的OD在約110和150之間。在某些實施方式中，發(fā)酵產(chǎn)生以干重計至少約14%的油產(chǎn)率。在其他實施方式中，發(fā)酵產(chǎn)生以干重計至少約20%的油產(chǎn)率。又在其他實施方式中，發(fā)酵后經(jīng)發(fā)酵的細(xì)胞生物質(zhì)以干重計為至少約30g/L。在某些實施方式中，酵母細(xì)胞包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母。本文還公開了用于生產(chǎn)包含脂肪酸甲酯的油的方法。在某些實施方式中，該方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)分離的酵母細(xì)胞，和從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中提取油。在某些實施方式中，對提取的油進(jìn)行酯交換。在某些實施方式中，在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)包括提供包含約1% w/V的粗制甘油、約2% w/v的玉米衆(zhòng)、約O. 5% w/v的隱球酵母自溶物的培養(yǎng)基,其中培養(yǎng)基具有約5. 5的pH ;和使用補料分批發(fā)酵在約28°C下在培養(yǎng)基中發(fā)酵酵母細(xì)胞至少約100小時。在某些實施方式中，酵母細(xì)胞包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母。本文還公開了用于生產(chǎn)包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法。在某些實施方式中，該方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)酵母細(xì)胞，例如MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母，從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中提取油，并對提取的油進(jìn)行酯交換。本文還公開了用于生產(chǎn)包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法。在某些實施方式中，該方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母的酵母細(xì)胞和通過直接酯交換提取脂肪酸甲酯。在其他實施方式中，該方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)包括MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母的酵母細(xì)胞和從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中分離脂肪酸甲酯。又在其他實施方式中，方法包括在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)分離的酵母細(xì)胞，例如，MTCC保藏號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母和從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中分離脂肪酸甲酯。附圖簡述以下附圖形成本說明書的部分并被包括以進(jìn)一步說明本公開內(nèi)容的某些方面，通過結(jié)合詳細(xì)說明參考一個或多個附圖可更好地理解這些方面。圖I示出了接種密度對庫德里阿茲威畢赤酵母(以MTCC登記號5493保藏)的生物質(zhì)生產(chǎn)的影響。圖2示出了培養(yǎng)基的pH對庫德里阿茲威畢赤酵母的生物質(zhì)生產(chǎn)的影響。
圖3示出了種齡對庫德里阿茲威畢赤酵母的生物質(zhì)生產(chǎn)的影響。圖4示出了碳源對庫德里阿茲威畢赤酵母的生物質(zhì)生產(chǎn)的影響。圖5示出了甘油濃度對庫德里阿茲威畢赤酵母的生物質(zhì)生產(chǎn)的影響。圖6示出了氮源對庫德里阿茲威畢赤酵母的生物質(zhì)生產(chǎn)的影響。圖7示出了玉米漿濃度對庫德里阿茲威畢赤酵母的生物質(zhì)生產(chǎn)的影響。圖8示出了對于產(chǎn)生庫德里阿茲威畢赤酵母的生物質(zhì)的分批發(fā)酵曲線。圖9示出了對于產(chǎn)生庫德里阿茲威畢赤酵母的生物質(zhì)的補料分批發(fā)酵曲線。

圖10示出了使用低成本培養(yǎng)基產(chǎn)生庫德里阿茲威畢赤酵母的補料分批發(fā)酵曲線。·圖11示出了使用來源于生物柴油工業(yè)的粗制甘油的高細(xì)胞密度發(fā)酵。圖12示出了不含麥芽汁的補料分批發(fā)酵。圖13示出了 27L水平下的無麥芽汁存在的補料分批發(fā)酵的放大試驗期間的曲線。圖14示出了使用去油隱球酵母作為氮源的補料分批發(fā)酵。圖15示出了使用具有相同組成的種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基的補料分批發(fā)酵。圖16示出了使用具有相同組成的種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)培養(yǎng)基的補料分批發(fā)酵的放大試驗。詳述I.定義如本文使用的術(shù)語“庫德里阿茲威畢赤酵母”指畢赤酵母屬的一個種。一個實例是以MTCC登記號5493保藏的新型酵母菌株。術(shù)語“生物柴油”是指包含長鏈烷基(甲基、丙基或乙基)酯的柴油燃料。生物柴油可包括從酵母分離到的油的脂肪酸甲酯(“FAME”)，包括FAME的化學(xué)變體或修飾。關(guān)于從酵母分離的油或由酵母產(chǎn)生的油，本文使用的術(shù)語“油”是指產(chǎn)生于酵母的脂質(zhì)(例如脂肪酸甲酯)或從酵母分離到的脂質(zhì)或總的脂質(zhì)內(nèi)容物。如本文使用的術(shù)語“產(chǎn)油條件”是指酵母將產(chǎn)生油的生長或發(fā)酵條件。這些條件可包括具有過量的碳和有限量的其他營養(yǎng)成分，尤其是氮的培養(yǎng)基。在某些實施方式中，當(dāng)生長培養(yǎng)基中的碳源與氮源之比為約40-50時實現(xiàn)“產(chǎn)油條件”。在某些實施方式中，當(dāng)抑制三羧酸循環(huán)，改變代謝途徑，蛋白合成停止并激活脂質(zhì)累積過程時實現(xiàn)“產(chǎn)油條件”。在某些實施方式中，當(dāng)與對照條件下的同一酵母菌株相比，產(chǎn)油酵母菌株中的NAD-IDH活性減小或缺乏，且產(chǎn)油酵母菌株可不再利用乙酸作為碳源，而可利用甘油或乳酸作為碳源時實現(xiàn)“產(chǎn)油條件”。如本文使用的，術(shù)語“約”和無論是否被術(shù)語約定量的一般范圍的使用是指所包括的數(shù)字不限于本文提供的精確數(shù)字，并意圖是指大體處于所引用的范圍而不偏離本發(fā)明的范圍的范圍。如本文使用的，“約”將被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解并將根據(jù)其使用背景在一定程度上變化。如果存在使用就其使用背景對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講不清楚的術(shù)語，“約”將指多至加或減具體術(shù)語的10%，包括加或減5%、1%、0. I%、0. 01%，或通常指當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)測量程序時所觀察到的標(biāo)準(zhǔn)差。如本文使用的，術(shù)語“酯交換(transesterification) ”或“酯交換(transesterifying) ”指交換酯的有機基團(tuán)R"與醇的有機基團(tuán)R'的過程。以下示出了圖解反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.ー種以MTCC登記號5493保藏或鑒定的庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)的分離的酵母細(xì)胞。
2.以MTCC登記號5493保藏或鑒定的庫德里阿茲威畢赤酵母菌株的分離的酵母細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的酵母細(xì)胞，其中所述酵母細(xì)胞位于培養(yǎng)基中。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分離的酵母細(xì)胞，其中所述培養(yǎng)基包括 粗制甘油； 玉米漿；和 酵母自溶物。
5.一種組合物，包括由權(quán)利要求I所述的分離的酵母細(xì)胞產(chǎn)生的油。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述油包括 至少約10%的棕櫚酸， 至少約8%的棕櫚油酸， 至少約I %的硬脂酸， 至少約41%的油酸， 至少約15%的亞油酸，和 至少約6%的亞麻酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所提取的油已經(jīng)受酯交換。
8.一種組合物,包括 a)權(quán)利要求I所述的分離的酵母細(xì)胞；和 b)—種培養(yǎng)基,包括 約1% w/v的粗制甘油， 約2% w/v的玉米衆(zhòng)， 約O. 5 % w/v的酵母自溶物， 其中所述組合物具有約5. 5的pH。
9.一種用于培養(yǎng)權(quán)利要求2所述的分離的酵母細(xì)胞以誘導(dǎo)所述細(xì)胞產(chǎn)生油的方法，所述方法包括 a)提供包含以下的培養(yǎng)基 約1% w/v的粗制甘油,約2% w/v的玉米衆(zhòng),約O. 5% w/v的酵母自溶物,其中所述培養(yǎng)基具有約5. 5的pH ; b)使用補料分批發(fā)酵在約28°C下在所述培養(yǎng)基中發(fā)酵權(quán)利要求2所述的酵母細(xì)胞至少約100小時。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述發(fā)酵持續(xù)進(jìn)行至少約110小吋。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述補料分批發(fā)酵包括在所述發(fā)酵期間加入甘油。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所加入的甘油包括粗制甘油。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中當(dāng)發(fā)酵的甘油濃度低于約8g/L時向所述培養(yǎng)基中加入甘油。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中發(fā)酵持續(xù)到所述酵母細(xì)胞的O.D.在約110和150之間。
15.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)生以干重計至少約14%的油產(chǎn)率。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述發(fā)酵產(chǎn)生以干重計至少約20%的油收率。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中發(fā)酵后經(jīng)發(fā)酵的細(xì)胞生物質(zhì)以干重計為至少約30g/L。
18.ー種用于生產(chǎn)包含脂肪酸甲酯的油的方法，所述方法包括 a)在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)權(quán)利要求I所述的分離的酵母細(xì)胞； b)從所培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中提取所述油。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，還包括對所提取的油進(jìn)行酯交換。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)包括 a)提供包含以下的培養(yǎng)基 約1% w/v的粗制甘油,約2% w/v的玉米衆(zhòng),約O. 5% w/v的酵母自溶物,其中所述培養(yǎng)基具有約5. 5的pH ; b)使用補料分批發(fā)酵在約28°C下在所述培養(yǎng)基中發(fā)酵權(quán)利要求I所述的酵母細(xì)胞至少約100小時。
21.
22.ー種用于生產(chǎn)包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法，所述方法包括 a)在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)權(quán)利要求2所述的分離的酵母細(xì)胞； b)從所培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中提取油； c)對所提取的油進(jìn)行酯交換。
23.ー種用于生產(chǎn)包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法，所述方法包括 a)在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)包括MTCC登記號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母的酵母細(xì)胞； b)通過直接酷交換提取脂肪酸甲酷。
24.ー種用于生產(chǎn)包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法，所述方法包括 a)在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)包括MTCC登記號為5493的庫德里阿茲威畢赤酵母的酵母細(xì)胞； b)從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中提取脂肪酸甲酷。
25.ー種用于生產(chǎn)包含脂肪酸甲酯的生物柴油的方法，所述方法包括 a)在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)權(quán)利要求I所述的分離的酵母細(xì)胞； b)從培養(yǎng)的酵母細(xì)胞中提取脂肪酸甲酷。
26.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離的酵母細(xì)胞，其中所述細(xì)胞能夠在產(chǎn)油條件下將其重量的約50%累積成油。
27.—種庫德里阿茲威畢赤酵母MTCC 5493的生物學(xué)純培養(yǎng)物。
28.—種包括庫德里阿茲威畢赤酵母MTCC 5493的分離的酵母細(xì)胞的微生物組合物。
29.以上要求保護(hù)的以MTCC登記號5493保藏或鑒定的庫德里阿茲威畢赤酵母的分離的酵母細(xì)胞、其組合物及其在生物柴油中的應(yīng)用方法，在本文在實施例和附圖中充分示例說明。
全文摘要
本文公開了與從產(chǎn)油酵母，例如畢赤酵母(Pichia)屬的新型酵母分離株生產(chǎn)和提取油和生物柴油有關(guān)的方法和組合物。本文還公開了為使用包括粗制甘油和玉米漿(corn steep liquor)在內(nèi)的廉價原材料高密度生產(chǎn)酵母提供發(fā)酵條件的方法。
文檔編號C12P7/64GK102834523SQ201080057931
公開日2012年12月19日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者V·蘭加斯瓦米, 薩烏拉博·薩蘭, 密斯拉·坎納比蘭, 梅坎德罕·蒂魯, 桑托?！ど；?申請人:利萊恩斯生命科學(xué)有限公司