專利名稱：：具有立體選擇性脂肪酶活性的酵母菌及其在生物拆分法制備s-型鹽酸倍他洛爾中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株酵母菌及其應(yīng)用，尤其涉及一株具有立體選擇性脂肪酶活的酵母菌及其在生物拆分法制備s-鹽酸倍他洛爾中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：青光眼是一種發(fā)病迅速、危害性大、隨時導(dǎo)致失明的常見疑難眼病。近年來發(fā)病率有所上升，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球青光眼患者約為6700萬，約450萬人因青光眼而失去視力，在我國，年齡大于40歲的人群中，原發(fā)性青光眼的發(fā)病率1%2%，以全國13億人口計，原發(fā)性青光眼患者已超過700萬，青光眼己成為我國第二大眼科常見疾病，約占眼科疾病的14.36%。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明青光眼己成為第二大致盲因素。目前青光眼的臨床治療以手術(shù)和藥物治療為主。手術(shù)只是暫時降低眼壓，對于某些類型的青光眼只能緩解癥狀，最終還是以失明告終。治療青光眼藥物主要包括擬副交感神經(jīng)藥、擬腎上腺素藥、腎上腺素受體阻滯劑、碳酸酐酶抑制劑、高滲脫水劑等。其中首選藥物腎上腺素受體阻滯劑如噻嗎洛爾、倍他洛爾等，但這些藥物容易引起支氣管痙攣、心動過緩、增加心臟阻滯、降低血壓等副作用，目前國外已不再將其作為首選藥物。左旋倍他洛爾是倍他洛爾的左旋體，它對卜受體的親和性遠遠高于其消旋體，這種高選擇性使其對具有心肺疾病的患者更為安全，它副作用也非常小，且不具有膜穩(wěn)定(局部麻醉)作用和內(nèi)源性擬交感胺作用。左旋倍他洛爾對眼纖毛上皮的^受體也有較高的親和力，可以減少房水的生成而降低眼內(nèi)壓，還可通過阻滯L一電壓依賴性鈣離子通道保護視神經(jīng)免受多種傷害。動物實驗表明左旋倍他洛爾產(chǎn)生的降低眼內(nèi)壓效應(yīng)比倍他洛爾要強l-2mmHg，也有報道稱左旋倍他洛爾降低眼內(nèi)壓的能力比其右旋體強25.9%左右，其有效期也比外消旋體和右旋體要長得多。眼用倍他洛爾最常見的副作用是有刺激性，通過使用效果相同但濃度減小的眼藥水可使這一副作用減至最小。國外己有左旋鹽酸倍他洛爾的滴眼劑上市，商品名為"BetopticS"，主要用于治療慢性開角型青光眼或高眼壓病人降低眼內(nèi)壓。RameshA.Joshi研究組于2005年報道了用化學(xué)合成法制備S-倍他洛爾的工藝，并申請了幾篇與此工藝有關(guān)的專利，這些工藝或者需要昂貴的試劑，或者需要昂貴的催化劑。自從微生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用于生產(chǎn)后，一般以化學(xué)法與微生物轉(zhuǎn)化相結(jié)合來制備手性藥物。生物催化拆分反應(yīng)立體選擇性和區(qū)域選擇性強，反應(yīng)條件溫和，可避免或減少使用強酸、強堿和一些有毒原料，改善操作條件，減少環(huán)境污染；可避免使用不對稱合成中所必需的昂貴的手性試劑或手性催化劑。生物催化劑生產(chǎn)成本低廉，可大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)影響，且催化劑可重復(fù)利用，進一步降低成本。Gius印peDB等人于1995年報道了化學(xué)-酶法制備S-倍他洛爾的方法，他們用于催化手性拆分反應(yīng)的是一些微生物脂肪酶。其中效果最好的是假單胞菌脂肪酶AK，該反應(yīng)在特丁基甲基醚介質(zhì)中反應(yīng)，反應(yīng)體系閃點低，易燃，存在安全隱患；酶和底物重量比1:7，催化劑成本很高；他們的光學(xué)純度僅能達到80%(拆分收率50%)，通過對其鹽酸鹽重結(jié)晶才使ee值達到90%。其它微生物酶催化的反應(yīng)立體選擇性要差得多，且酶-催化劑重量比為1:1，催化劑成本更高。另外，他們沒有報道酶的穩(wěn)定性，也沒有有關(guān)細胞或酶固定化的報道，距離工業(yè)化的要求尚遠。篩選立體選擇性強、催化效率高且穩(wěn)定性好微生物酶，并在此基礎(chǔ)上探索催化成本低的生產(chǎn)s-鹽酸倍他洛爾的新工藝并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)為我國目前制藥行業(yè)所迫切需求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種立體選擇性強、催化效率高且穩(wěn)定性好的酵母菌；另一目的在于以該酵母菌為催化劑，提供其在生物拆分法制備S-型鹽酸倍他洛爾中的應(yīng)用。本發(fā)明中的酵母菌能產(chǎn)生具有立體選擇性的脂肪酶，其特征在于可對手性中心含有?；幕衔镞M行對映體拆分。該酵母菌為粘質(zhì)紅酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198，已于2007年11月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏編號CGMCC.No.2257。該酵母菌的篩選包括以下步驟(1)以底物為唯一碳源進行富集培養(yǎng)和平板分離，得到能作用于底物的菌種。(2)通過對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行TLC和旋光測定，篩選轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中含有新化合物并且旋光值為負的菌種。(3)通過鑒定產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)最后確定能轉(zhuǎn)化底物為預(yù)期產(chǎn)物的菌種。(4)對菌種進行鑒定。本發(fā)明從土壤中篩選具有立體選擇性脂肪酶活性的酵母菌的具體篩選方法如下首先從不同地方取土樣，然后將土樣用富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)二次；富集培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后涂布選擇性平板培養(yǎng)，將分離良好且有透明圈的菌落挑至斜面；將斜面菌種培養(yǎng)一定時間后加入底物進行轉(zhuǎn)化，然后提取產(chǎn)物進行測定，并對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行鑒定。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可用旋光法、薄層色譜法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)進行分析。旋光值于589nm進行測定；TLC測定以硅膠GF254薄層板為固定相，氯仿-甲醇(10:1v/v)為展開劑，碘蒸氣為顯色劑，采用雙波長薄層掃描法進行；HPLC測定條件為以手性Chiralcel0J-H柱為固定相，正己烷-異丙醇(85:15)為流動相，流速1mL/min，檢測波長為273nm。產(chǎn)物倍他洛爾的HPLC測定條件為固定相0D-H柱，流動相正乙垸/異丙醇/二乙胺6/4/0.5，流速0.5mL/min,檢測波長254nm，進樣量20uL。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的ee值通過樣品HPLC圖譜上兩個異構(gòu)體的峰面積來計算，公式為ees(%)=(峰面積s-峰面積R)/(峰面積s+峰面積R)*100。對于具有立體選擇性的酶，立體選擇性是一個重要的技術(shù)指標(biāo)，這一指標(biāo)用E值表示，E值越大，菌種的立體選擇性越好。E=ln[(l-c)(l-ees)]/ln[(l-c)(l+ees)]=ln[l-c(l+ee》]/ln[l-c(l-eep)]，其中eeP=([P]-[Q])/([P]+[Q]),ees=([B]-[A])/([B]+[A])，c=ees/(ees+eep)。A、B分別為底物的兩種對映體；P、Q分別為產(chǎn)物的兩種對映體。產(chǎn)物結(jié)構(gòu)用MS、核磁法進行鑒定。根據(jù)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的旋光值和薄層結(jié)果來確定菌種的轉(zhuǎn)化能力。優(yōu)良菌種的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物應(yīng)該具有負的絕對值較大的比旋光值、薄層結(jié)果應(yīng)證實其產(chǎn)生了不同于底物的新物質(zhì)，MS結(jié)果應(yīng)證明其產(chǎn)生的新物質(zhì)是底物脫去乙?；a(chǎn)生的，其ee值也要較高，整個反應(yīng)的E值也要較高。對具有上述性質(zhì)的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行分離，得到純的脫乙酰產(chǎn)物，并通過陋R來確定其結(jié)構(gòu)。通過對菌落形態(tài)、菌體細胞形狀和大小、有無孢子和菌絲形成以及繁殖方式的觀察對菌種進行初步鑒定。經(jīng)過對該菌株16SDNA的分析，進行菌種的確定。確定其為粘質(zhì)紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198,保藏編號CGMCC.No.2257。可以用海藻酸鈉-活性碳-聚乙烯醇對篩選的菌株進行固定化，以此固定化細胞作為催化劑進行生物轉(zhuǎn)化，固定化細胞可重復(fù)利用。本發(fā)明制備S-鹽酸倍他洛爾中間體的生物轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟(1)產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)。(2)結(jié)合本研究開發(fā)的化學(xué)方法合成化合物(l)。(3)以化合物(l)為轉(zhuǎn)化底物。(4)將底物加入酵母培養(yǎng)液中進行轉(zhuǎn)化得到中間產(chǎn)物。(5)由得到的中間產(chǎn)物結(jié)合本研究室開發(fā)的工藝合成S-鹽酸倍他洛爾。在步驟(4)中，可以用靜息細胞進行轉(zhuǎn)化，也可以用固定化細胞進行轉(zhuǎn)化。以下是本發(fā)明的詳細描述。1、底物的制備化合物(l)的制備a:K2C02，CH3CN，C3H50Cl，b:CH30H，C3H7NH2c:Et3N，DMAP，(CH:iC0)20EtOAc取一定量對羥基苯乙醇，加入適量乙腈使其完全溶解，加入環(huán)氧氯丙烷和無水碳酸鉀，75'C油浴，回流反應(yīng)6h，冷卻，抽濾除去K2C03并用丙酮洗滌沉淀幾次，合并濾液，減壓蒸餾至基本干燥，并用石油醚重結(jié)晶后得到醚化產(chǎn)物1,4-(2,3環(huán)氧丙氧基)苯乙醇。將一定量醚化產(chǎn)物溶于甲醇中，邊攪拌邊緩慢加入異丙胺，于室溫下反應(yīng)7h，至薄層檢測反應(yīng)完全。減壓蒸餾除去溶劑和殘余異丙胺；再用氯仿溶解，用飽和NaHC03和飽和食鹽水萃取，將有機相蒸干，即得胺化產(chǎn)物4-[2-羥基-3-[(甲基乙基)氨基]丙氧基苯乙醇。取一定量胺化產(chǎn)物，用適量乙酸乙酯溶解，加入醋酐(按原料三倍當(dāng)量加入)，以DMAP為催化劑，在無水吡啶和醋酸酐中對產(chǎn)物進行乙?；?，室溫條件下，0.5h反應(yīng)完全，加適量水以停止反應(yīng)，用飽和NaHC03萃取有機相三次，飽和NaCl溶液萃取三次，然后用無水Na2S04干燥。即得到微生物轉(zhuǎn)化的底物(化合物l)。2、固定化細胞的制備現(xiàn)有文獻報道了用海藻酸鈉、海藻酸鋁、卡拉膠、卡拉膠-明膠、明膠-戊二醛制備固定化細胞。本發(fā)明用海藻酸鈉(CA)-活性炭(C)復(fù)合凝膠制備固定化細胞，方法如下將一定量的海藻酸鈉(15%)、蒸餾水及活性炭(05%)—起加熱煮沸，冷卻到室溫；將一定量的本發(fā)明篩選出的菌株加入到上述配置好的PVA混合物中攪拌均勻；用注射器將其勻速滴入110%硼砂和氯化鈣混合液中(混合并充分攪拌成乳狀)，過濾，洗凈，即得均勻固定化細胞小珠。聚乙烯亞胺(PEI)強化處理方法如下配制0.1%5%的聚乙烯亞胺溶液，加入1050mmol/L氯化鈣，調(diào)pH值至510，加入等量CA-C或PVA-CA-C包埋顆粒，震蕩1048h。取出用無菌水洗滌，再用戊二醛處理1060min，用無菌水洗凈。3、生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)將本發(fā)明菌體接種于培養(yǎng)基(玉米漿0.55%、蛋白胨0.15%、甘油0.55%,初始pH410)中，于20。C50。C培養(yǎng)1248h，然后加入底物(1)0.512g/L，再于20。C5(TC轉(zhuǎn)化545h。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用HPLC法測定轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物ee值。除在菌體培養(yǎng)液中加入底物直接轉(zhuǎn)化外，也可將微生物細胞過濾出來后，加入pH410的緩沖溶液，利用靜息細胞進行轉(zhuǎn)化。利用靜息細胞轉(zhuǎn)化時可以在轉(zhuǎn)化體系中可以加入氯仿、正乙烷或甲苯以提高轉(zhuǎn)化速度。用固定化細胞在填充床反應(yīng)器中進行轉(zhuǎn)化將固定化細胞裝入ci)1050X100500的反應(yīng)柱，通過恒溫箱205(TC保溫。進行連續(xù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)時，在填充床反應(yīng)器中填充固定化細胞凝膠50500g，底物濃度為110g/L，底物溶液由反應(yīng)柱上部流入，反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液從反應(yīng)器下部收集。在此條件下轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物用HPLC法測定轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物ee值。4、S-型鹽酸倍他洛爾的合成在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中加入適量的甲醇和過量的氫氧化鈉，反應(yīng)550分鐘。然后除去甲醇，用乙酸乙酯萃取水相得到脫乙?；a(chǎn)物。在脫乙?；a(chǎn)物中加入甲苯、苯甲醛和對甲苯磺酸，充入氬氣，油浴下回流。冷卻后用水洗滌，將有機層用硫酸鈉干燥，在減壓下蒸去甲苯得氨基乙醇衍生物。將氨基乙醇衍生物溶于無水DMF中，加入NaH，常溫下反應(yīng)130分鐘。加入溴甲基環(huán)丙垸后于0°C-5CTC反應(yīng)110h，然后在常溫下反應(yīng)15h。把反應(yīng)液倒入適量的碳酸氫鈉飽和溶液中，除去NaOH再用氯仿萃取。減壓蒸餾除去氯仿得到S-倍他洛爾。將S-倍他洛爾用適量異丙醇溶解，滴加兩倍當(dāng)量的濃鹽酸，減壓蒸餾除去異丙醇，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌產(chǎn)物，用氯仿洗滌水層(3*20ml),減壓下蒸餾除去氯仿，得到淡黃色液體，再用石油醚-丙酮混合體系進行重結(jié)晶，即得s-型鹽酸倍他洛爾。本發(fā)明優(yōu)點在于1、本發(fā)明提供了一種具有立體選擇性脂肪酶活性的酵母菌，利用該菌種進行倍他洛爾等e-受體阻滯劑、鹽酸麻黃堿、腎上腺素、左羥丙哌嗪、硫酸沙丁胺醇、卡普托利、佐芬普利等在手性中心含有?；幕衔锏氖中圆鸱?，對推動我國手性藥物開發(fā)的進程有重要的應(yīng)用價值；2、就合成工藝而言相對化學(xué)法來說，以具有立體選擇性脂肪酶活性的酵母菌為催化劑生產(chǎn)s-型鹽酸倍他洛爾，生物催化劑價格低廉、生產(chǎn)轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好并且生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)速度快、立體選擇性好，具有較好的應(yīng)用前景。圖l本發(fā)明工藝路線圖圖220tt菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC圖譜；圖327It菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC圖譜；圖4外消旋倍他洛爾的HPLC圖譜；圖5S-倍他洛爾產(chǎn)品的HPLC圖譜。具體實施方式為對本發(fā)明進行更好地說明，舉實施例如下。實施例1從鄭州市區(qū)飯店、油廠附近采集到15個被油脂污染的土樣，稱取各種土樣種10g，分別懸浮于0.9%NaCl溶液中，用8層紗布過濾除去較大的雜質(zhì)顆粒，接種富集培養(yǎng)基((NH4)2S040,2%;K2HP040.2%;NaCl0.05%;MgS(WH200.05%;底物3%;pH自然)，培養(yǎng)71h后取10mL培養(yǎng)液再用同樣方法再富集二次。涂布選擇性平板(組成同富集培養(yǎng)其含瓊脂2%)。經(jīng)過初篩得到52個能在以底物為唯一碳源的平板上生長，且產(chǎn)生透明圈的菌株，將其挑出轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基(酵母膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl1%，瓊脂2%，pH7.5)制成的斜面保藏，并用于轉(zhuǎn)化試驗。分別將上述初篩所得52個菌株接種至轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(酵母浸膏0.2%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，pH自然)中，培養(yǎng)24h后加入底物(濃度0.3%0.7%),再轉(zhuǎn)化培養(yǎng)48h，提取產(chǎn)物進行TLC及旋光測定。結(jié)合文獻選取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物旋光值為負值且絕對值較大，TLC結(jié)果表明有新產(chǎn)物生成的13個菌株進行復(fù)篩，復(fù)篩結(jié)果如表l。表l菌種復(fù)篩TLC及旋光結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>TLC結(jié)果有產(chǎn)物的以+記，沒有產(chǎn)物的以-計。本試驗中底物l在微生物酶的催化下發(fā)生不對稱水解，有立體選擇性酶活性的菌種水解底物所產(chǎn)生的產(chǎn)物具有旋光性，產(chǎn)物旋光值為負值且絕對值較大的菌種是本發(fā)明所需要的。由表1可知菌株20#和27#符合本發(fā)明要求。轉(zhuǎn)化結(jié)束后提取產(chǎn)物通過硅膠柱分離純化，然后將產(chǎn)物的各組分通過NMR和MS對其結(jié)構(gòu)進行確定。結(jié)果表明菌株20#和27#轉(zhuǎn)化底物生成的兩種產(chǎn)物(2)和(3)的有關(guān)數(shù)據(jù)如下。產(chǎn)物(2)的氫譜數(shù)據(jù)如下-7.14，6.8(each2H，d,J=8.5Hz,Ar-H);3.82(2H.t,J=6.6Hz,H-1);2.82(2H't,J=6.6Hz，H-2);3,60(1H,dd'J=l.44Hz,J=14.0Hz,H-3');3.33(1H，dd'J=7.5Hz,J=14.OHz，H-32);4.46(1H,Ws'H_4);4.10(1H,dd,H-5');4.03(1H,dd，H-52);3.70(1H,m'H_6);1.26,1.22(each3H,d,J=6.76Hz,J=6.56Hz,CH3*2);2.24(6H,s,-COCH:,)高分辨正離子ESI-MSm/z:338.1958[M+H]+;360.1774[M+Na]+其比旋光值均為負值，由20#菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離所得化合物(2)的比旋光值的[a]/"為-2700(C=l，CH3OH)，由27tt菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離所得化合物(2)的比旋光值的[a]嚴為-711，由于結(jié)構(gòu)類似化合物的旋光值都是負值，由此得知該化合物為本發(fā)明需要的s-型產(chǎn)物。產(chǎn)物(3)的氫譜數(shù)據(jù)如下7.14,6.80(each2H,d,J=8.5Hz,Ar-H);3.81(2H.t，J=6.6Hz,H-1);2.81(2H,t,J=6.6Hz,H_2);3.60(1H,dd,J=l.44Hz'J=14.OHz,H-31);3.43(1H,dd,J=7.5Hz,J=14.OHz,H-32);4.46(IH，Ws,H-4);4.10(1H,dd,H-5l);4.03(lH,dd'H-52)3.60(lH,m,H—6);1.26'1.21(each3H,d,J=6.76Hz'J=6.56Hz,CH3*2);2.20(3H，s,_C0CH3)高分辨正離子ESI-MSm/z:296.1876[M+H]+:318.1689[M+Na]'。由20tt菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離所得化合物(3)的比旋光值的[a]"為+116,由27#菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分離所得化合物(3)的比旋光值的[a]。2"為+285。由剛R和MS結(jié)果可知化合物(2)和化合物(3)的結(jié)構(gòu)如下(2)(3)微生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式兩個菌株轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC結(jié)果見圖2和圖3。圖2和圖3進一步證實了化合物(2)為本發(fā)明所需要的S-型產(chǎn)物。用HPLC法測定產(chǎn)物的ee值、轉(zhuǎn)化率并由此計算出E值。2(W菌株的E為10.6，27#菌株的E為5.3。由此可知20共菌株優(yōu)于27#菌株。最后選擇20tt菌株保藏于斜面保藏培養(yǎng)基(葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母膏O.2%，瓊脂2%)。實施例2通過對菌落形態(tài)、菌體形狀和大小、有無孢子和菌絲生成以及繁殖方式的觀察對菌種進行初步鑒定。結(jié)果如下細胞有圓形(5um)和橢圓形(5X6ym)，無孢子，無假菌絲，主要為裂殖，少數(shù)為芽殖。該菌株在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)不同，具體形態(tài)如下YEPD(—)培養(yǎng)基菌苔較小，呈粉紅色，表面光滑，有光澤，比較濕潤，邊緣較透明，較整齊，無褶皺，易挑取，呈粘稠狀，無味，細胞有圓形(5ym)和橢圓形(5X6"n0。麥芽汁培養(yǎng)基菌苔較小，呈水紅色，表面褶皺，無光澤，比較干燥，邊緣由于褶皺的影響不太整齊，無孢子，無假菌絲，易挑取，呈粘稠狀，無味，細胞圓形偏多(3.5m)。PDA培養(yǎng)基菌苔較大，呈粉紅色，表面光滑，有光澤，比較濕潤，邊緣顏色較淺，稍透明，比較整齊，無孢子，無假菌絲，易挑取，呈粘稠狀，無味，細胞橢圓偏多(4.5X6.5um)。豆芽汁培養(yǎng)基菌苔較大，呈粉紅色，表面光滑，有光澤，比較濕潤，顏色較深并一致，邊緣比較整齊，無孢子，無假菌絲，易挑取，呈粘稠狀，無味，細胞橢圓形偏多(2X33X4nm)。對該菌株16SDNA的分析結(jié)果表明其16SDNA有320個堿基對，該菌株的基因與粘質(zhì)紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)完全一致，經(jīng)基因庫檢索該菌株為粘質(zhì)紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198,保藏編號CGMCC.No.2257。實施例3將保藏的菌種CGMCC.No.2257接入培養(yǎng)基(玉米漿2%、蛋白胨0.5%、甘油2%，初始pH6)中，250mL三角瓶裝110mL(即45%)，于32。C培養(yǎng)16h后加入1g底物(1),28'C轉(zhuǎn)化12h。反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取發(fā)酵液三次，將乙酸乙酯相用飽和NaHC03洗三次、飽和NaCl溶液洗三次，再用蒸餾水洗一次，飽和NaHC03相和飽和NaCl相用乙酸乙酯反萃一次，合并有機相，并用無水N&S04干燥，得產(chǎn)物(2)0.42g，產(chǎn)率47.5%,產(chǎn)物ee值為95%。產(chǎn)物(3)0.58g，產(chǎn)率68%。其中產(chǎn)物(2)為我們的目的產(chǎn)物，由產(chǎn)物(2)按前面所述方法制備S-鹽酸倍他洛爾，其ee值為95%，比旋光度達到[a],為-19.7(C=l,CH,0H)。外消旋倍他洛爾和S-倍他洛爾的HPLC圖譜如圖3和圖4。HPLC圖譜可以進一步證明產(chǎn)物的左旋構(gòu)型。實施例4在實施例3中本發(fā)明的保藏菌種培養(yǎng)后經(jīng)過濾得到菌體，將菌體用PH=6的磷酸緩沖液沖洗三次，然后在相同的緩沖液中按實施例3中條件進行轉(zhuǎn)化，結(jié)果與實例3相似，優(yōu)點是轉(zhuǎn)化產(chǎn)物更容易萃取且細胞可重復(fù)利用，用同一批細胞轉(zhuǎn)化9次，細胞的轉(zhuǎn)化能力未見下降，表明該菌體中的酶穩(wěn)定性良好。實施例5將pH6的磷酸緩沖液分裝滅菌，冷卻后加入3g/L底物，然后加入不同量的甲苯，把已離心的細胞平均分至各瓶，于28'C，210r/min進行轉(zhuǎn)化。當(dāng)反應(yīng)體系中不加入有機溶劑時細胞轉(zhuǎn)化的速度很慢，最高速率為0.3mirf1，所需產(chǎn)物在反應(yīng)6h的最高轉(zhuǎn)化率為45%。反應(yīng)體系中加入甲苯后，細胞的通透性得到改變，酶與底物可以充分接觸，使底物的轉(zhuǎn)化率得到提高。加入甲苯在反應(yīng)1h時的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達到最大值66%，最高速率為0.65mirf1。反應(yīng)體系中加入不同量甲苯轉(zhuǎn)化0.5h后的結(jié)果表明，反應(yīng)體系中加入15%甲苯時轉(zhuǎn)化速度最高。轉(zhuǎn)化反應(yīng)的立體選擇性指標(biāo)E值與水相中基本相同。實施例6在實施例5用氯仿代替甲苯，其它條件相同。反應(yīng)體系中加入氯仿后，也增加了細胞的通透性，但效果沒有甲苯明顯，最高速率為0.12mirf1，反應(yīng)3h產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達到最大值55%，以后隨時間變化不明顯。轉(zhuǎn)化反應(yīng)的立體選擇性指標(biāo)E值與在水相中基本相同。實施例7在實施例5用正己烷代替甲苯，其它條件相同。反應(yīng)體系中加入正己烷后，也增加了細胞的通透性，但效果沒有甲苯明顯，反應(yīng)3h時幾乎達到最高，最高速率為0.08min—'，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達61%，以后隨時間變化不明顯。轉(zhuǎn)化反應(yīng)的立體選擇性指標(biāo)E值與在水相中基本相同。實施例8按前面所述方法用不同材料制備的固定化細胞機械強度如表2和表3。表2.不同固定化細胞的耐壓性能固定化方法CA海藻酸鋁卡拉膠明膠卡拉膠-明膠PVA-CAPVA-CA-C機械強度(g/)16.615.265.754.26012035.1注表中數(shù)據(jù)由砝碼加壓法測定表3.不同固定化細胞的耐振蕩性能包埋方法卡拉明卡拉-膠名CA海藻酸PVA-兩-CA-膠膠膠鋁CAC顆粒保持完好時間0.50,40.61.00.21.21.0(h)由上表可知由CA、PVA-CA和PVA-CA-活性炭所得顆粒比卡拉膠、明膠和卡拉膠-明膠的機械強度和耐壓性都好?；钚蕴嫉挠昧繉Π耦w粒的通透性存在一定的影響，結(jié)果見表4。表4.活性炭對包埋顆粒通透性和機械強度的影響活性炭(％)00.512轉(zhuǎn)化時間1211.51110注包埋材料中含PVA10%,CA2%,轉(zhuǎn)化時間為轉(zhuǎn)化率達到50%所需時間?？梢娂尤牖钚蕴渴狗磻?yīng)速率提高，但隨著活性炭的增加顆粒的機械強度逐步減小，故活性炭的用量也不能太多，可選擇0.5%。但經(jīng)上述方法固定化的細胞經(jīng)磷酸緩沖液浸泡后，顆粒機械強度明顯下降，加入底物轉(zhuǎn)化一刻鐘后顆粒全部溶化，說明這些顆粒不耐磷酸緩沖溶液。經(jīng)聚乙烯亞胺處理后，經(jīng)CA-C和CA-PVA-C固定化的細胞耐磷酸緩沖溶液的性能均大大提高。經(jīng)CA-PVA-C固定化的細胞機械強度變化不大，且由于PVA通透性特別差，其轉(zhuǎn)化速率特別慢。經(jīng)CA-C固定化的細胞機械強度有明顯的提高，用0.6%PEI的強化的固定化顆粒轉(zhuǎn)化效果最好，基本上與游離的細胞相當(dāng)，并且轉(zhuǎn)化后顆粒完好無損。最后選擇CA2%、活性炭0.5%固定化細胞，并用0.6%的PEI進行強化處理。固定化細胞在4)50X200mm的填充床反應(yīng)器通過恒溫箱28'C保溫進行連續(xù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在填充床反應(yīng)器中填充固定化細胞凝膠200g，底物濃度3g/L,底物溶液由反應(yīng)柱上部流入，反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液從反應(yīng)器下部收集。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?g/L,停留時間為15h時，底物的轉(zhuǎn)化率為80%，目的產(chǎn)物ee值為〉95%。當(dāng)停留時間一定時，底物轉(zhuǎn)化率會隨著底物(1)濃度的增大而減小，增加底物濃度時，停留時間要相應(yīng)增加。對體積產(chǎn)率而言，體積產(chǎn)率隨著停留時間的延長而減小。在停留時間一定時，增大底物濃度可以提高體積產(chǎn)率，但是若底物濃度過高，底物的轉(zhuǎn)化率很低，底物無法充分利用。在底物濃度為3g/L，停留時間為15h的條件下，該反應(yīng)器在連續(xù)運轉(zhuǎn)40天后仍保持穩(wěn)定。權(quán)利要求1.一株從土壤中篩選的微生物菌種，其特征在于，該菌株為粘質(zhì)紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198，能產(chǎn)生立體選擇性脂肪酶，經(jīng)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC.No.2257。2、如權(quán)利要求1所述粘質(zhì)紅酵母CGMCC.No.2257在制備S-型鹽酸倍他洛爾中的應(yīng)用，其特征在于，通過如下步驟(1)將粘質(zhì)紅酵母CGMCC.No.2257在如下條件下進行培養(yǎng)、發(fā)酵，獲得細胞培養(yǎng)液或濕菌體或固定化細胞，將其作為酶制劑；(a)斜面培養(yǎng)基為葡萄糖0.55%，蛋白胨0.15%，酵母膏0.15%，瓊脂2%;(b)種子及發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖05%,蛋白胨05%，玉米漿15%、蛋白胨0.15%、甘油15%，初始pH510;(c)培養(yǎng)條件為溫度205(TC，時間548h，裝液量系數(shù)1060%;(2)將上述酶制劑接種于組成為玉米漿0.55%、蛋白胨O.15%、甘油0.55%,初始pH410培養(yǎng)基中，于2(TC50。C培養(yǎng)1248h，然后加入4一(2—乙酰氧基一3—(N_(異丙基)一N-乙?；被?丙氧基苯乙醇乙酸酯0.512g/L做為底物，于20'C5(TC轉(zhuǎn)化550h,生成中間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，中間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用HPLC法測定轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物ee值；(3)合成S-型鹽酸倍他洛爾在中間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中加入適量的甲醇和過量的氫氧化鈉，反應(yīng)550分鐘，然后除去甲醇，用乙酸乙酯萃取水相得到脫乙酰化產(chǎn)物；在脫乙酰化產(chǎn)物中加入甲苯、苯甲醛和對甲苯磺酸，充入氬氣，油浴下回流，冷卻后用水洗滌，將有機層用硫酸鈉干燥，在減壓下蒸去甲苯得氨基乙醇衍生物；將氨基乙醇衍生物溶于無水DMF中，加入NaH，常溫下反應(yīng)130分鐘，加入溴甲基環(huán)丙垸后于0'C-5(TC反應(yīng)110h,然后在常溫下反應(yīng)15h，把反應(yīng)液倒入適量的碳酸氫鈉飽和溶液中，除去Na0H再用氯仿萃取，減壓蒸餾除去氯仿得到S-倍他洛爾；將S-倍他洛爾用適量異丙醇溶解，滴加兩倍當(dāng)量的濃鹽酸，減壓蒸餾除去異丙醇，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌產(chǎn)物，用氯仿洗滌水層，減壓下蒸餾除去氯仿，得到淡黃色液體，再用石油醚-丙酮混合體系進行重結(jié)晶，即得S-型鹽酸倍他洛爾。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于步驟(l)中所述固定化細胞用海藻酸鈉、聚乙烯醇和活性碳進行固定化，并用聚乙烯亞胺進行強化處理，海藻酸鈉用量15%、聚乙烯醇用量05%、活性碳用量05%，聚乙烯亞胺濃度0.15%。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于步驟(2)中用細胞培養(yǎng)液直接進行轉(zhuǎn)化，底物濃度為l10g/L，轉(zhuǎn)化溫度為2050°C，轉(zhuǎn)化時間為550h。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于在轉(zhuǎn)化體系中加入甲苯、正己垸、氯仿有機溶劑以提高轉(zhuǎn)化速度，有機溶劑加入量為110%。6、根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于步驟(2)中用靜息細胞在pH510的緩沖液中進行轉(zhuǎn)化，緩沖體系為Na2HP(V檸檬酸、Na2HP04-KH2P04、Na2HP04-NaH2P04、K2HP04-KH2P04，底物濃度為l10g/L，轉(zhuǎn)化溫度為205(TC，轉(zhuǎn)化時間為550h。7、根據(jù)權(quán)利要求2所述方法，其特征在于步驟(2)中固定化細胞用在填充床反應(yīng)器中進行轉(zhuǎn)化，填充床反應(yīng)器尺寸為cpl050x100500mm，通過恒溫箱2CTC5(TC保溫；底物濃度110g/L，底物溶液由反應(yīng)柱上部或下部流入，反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化液從反應(yīng)器另一端收集。8、如權(quán)利要求1所述粘質(zhì)紅酵母CGMCC.No.2257在手性化合物拆分中的應(yīng)用，其特征在于，利用該微生物進行手性中心含有?；⒘u基類化合物的手性拆分。9、如權(quán)利要求8所述粘質(zhì)紅酵母CGMCC.No.2257在手性化合物拆分中的應(yīng)用，其特征在于，所述的手性中心含有?；⒘u基類化合物為卩-受體阻滯劑、鹽酸麻黃堿、腎上腺素、左羥丙哌嗪、硫酸沙丁胺醇、卡普托利、佐芬普利。10、如權(quán)利要求1所述粘質(zhì)紅酵母CGMCC.No.2257在化合物上進行添加或脫去酰基反應(yīng)中的應(yīng)用，其特征在于，利用該微生物在化合物上進行添加或脫去?；?。全文摘要本發(fā)明公開了一株具有立體選擇性脂肪酶活性的酵母菌及其在生物拆分法制備S-型鹽酸倍他洛爾中的應(yīng)用。該方法從土壤中篩選到一株具有立體選擇性脂肪酶活性的酵母菌，并利用其濕菌體或用海藻酸鈉-活性碳-聚乙烯亞胺固定化所得固定化細胞作為酶制劑，對含有酰基的底物進行對映體拆分，制備出S-型鹽酸倍他洛爾。轉(zhuǎn)化方法簡便、成本低廉，立體選擇性較好。利用該菌種可對倍他洛爾等β-受體阻滯劑、鹽酸麻黃堿、腎上腺素、左羥丙哌嗪、硫酸沙丁胺醇、卡普托利、佐芬普利等手性中心含有羥基或?；幕衔镞M行手性拆分，對推動我國手性藥物的開發(fā)進程有著重要的應(yīng)用價值。文檔編號C12N1/16GK101220336SQ20071030006公開日2008年7月16日申請日期2007年12月25日優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日發(fā)明者于梅艷,劉宏民,李永紅,瑞王申請人:鄭州大學(xué)