專利名稱：區(qū)分酵母菌株和/或測定酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性的新穎方法及其使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及區(qū)分酵母菌株的方法和測定酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性的方法，以及這些方法的使用和實(shí)施這些方法的試劑套件。
背景技術(shù)：
酵母菌的鑒定在多個(gè)領(lǐng)域是重要的，包括從臨床感染和食品污染物的鑒定到控制商業(yè)上用于生產(chǎn)啤酒、葡萄酒、蒸餾物、醇基生物燃料以及食品的酵母菌，所述食品生產(chǎn)指例如面包制作、醬油生產(chǎn)或天然補(bǔ)充劑和益生菌的生產(chǎn)。這些應(yīng)用中的每個(gè)應(yīng)用都需要一種或多種特定類型的酵母菌，并且選擇和控制用于每種工序中的酵母菌對(duì)于產(chǎn)物的質(zhì)量與一致性是極其重要的。
用于特定工序的酵母菌的一致性對(duì)于該工序所產(chǎn)生的產(chǎn)物的質(zhì)量是具關(guān)鍵性的， 因此制造商竭盡全力地控制所使用的酵母菌。例如，在釀造業(yè)中，公司使用專有的酵母菌株，將特定品牌所具有的特征給予其每一產(chǎn)物。因此，以無污染的純凈形式保存和使用這些專有的酵母菌株是至關(guān)重要的。
為保持酵母菌的完整性，通常在高度控制的條件下把酵母菌主樣本貯存在被稱為庫的設(shè)施內(nèi)。萬一實(shí)際使用的該批酵母菌證實(shí)被污染，這就提供了標(biāo)準(zhǔn)的酵母菌源。用于發(fā)酵的酵母菌通常從小樣本的增殖而獲得，然后將其在新鮮時(shí)或干燥后用于重新構(gòu)建和以后的使用。
在增殖過程中，酵母菌有可能改變其特征或受到污染。盡管培殖箱中的生長條件是受到高度控制的，確保了可引起突變的任何應(yīng)激被保持在最小且受到污染的風(fēng)險(xiǎn)很小， 但是也不能完全地消除突變和污染?？墒褂貌煌纳a(chǎn)方法從培殖箱連續(xù)性抽樣并將其用于發(fā)酵，或?qū)⒁淮伟l(fā)酵的成批增殖酵母菌移走、保存并用于后來的發(fā)酵。顯然，酵母菌在全發(fā)酵法的過程期間突變或受到污染比在受控增殖期間突變或受到污染的可能性更大，但兩種方法都有一些風(fēng)險(xiǎn)。在兩種情況下都重要的是確保用于發(fā)酵的酵母菌是對(duì)的酵母菌并且其不含污染物。
各種酵母菌不同的程度通常是很小的，其鑒定非常困難，而現(xiàn)有的方法太慢，無法有助于發(fā)酵的日常監(jiān)測。
目前，使用了多種技術(shù)來驗(yàn)證酵母菌株的一致性；然而，這些技術(shù)是費(fèi)時(shí)的，并且不能被大多數(shù)例如釀造廠的使用酵母發(fā)酵的生產(chǎn)商，例如釀造廠內(nèi)部運(yùn)用。尤其與釀造業(yè)有關(guān)，在釀造師開始在發(fā)酵系統(tǒng)中使用酵母菌株之前就知道該菌株的驗(yàn)證研究結(jié)果并不常見。因此，發(fā)酵可在識(shí)別到任何污染或錯(cuò)誤之前已在進(jìn)行，這具有很大的風(fēng)險(xiǎn)。這清楚意味著成本的顯著提高。在例如其他酒精飲料的生產(chǎn)中，還有在生物燃料的生產(chǎn)中的其他發(fā)酵工序都存有類似情況。

發(fā)明內(nèi)容
因此，需要有將允許用于發(fā)酵系統(tǒng)的酵母菌株在使用之前被快速驗(yàn)證的酵母菌鑒定方法。
按照第一方面，本發(fā)明提供了測定樣本中的酵母菌株的方法，其包括 -從樣本中的酵母菌獲得核酸； -將所述核酸進(jìn)行兩個(gè)或更多靶序列的篩查，其中所述核酸中的靶序列至少其中之一包括酵母線粒體DNA中的某基因的整體或部分，或與酵母線粒體DNA中的某基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)。
-從篩查結(jié)果斷定樣本中的酵母菌株。
優(yōu)選地，使用PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來實(shí)施本發(fā)明的篩查步驟，以擴(kuò)增從酵母菌樣本獲得的核酸中的所述兩個(gè)或更多靶序列(如存在)。優(yōu)選地，使用針對(duì)各所述靶序列的引物或引物對(duì)來進(jìn)行所述PCR。優(yōu)選地，對(duì)于每一個(gè)所篩查的靶序列都使用引物對(duì)。所述 PCR可為實(shí)時(shí)PCR?？梢越怆x曲線來測定是否擴(kuò)增了正確的產(chǎn)物。
或者，可利用一個(gè)或更多的探針來測定有否存在著所述兩個(gè)或更多的靶序列。可將所述一個(gè)或更多的探針標(biāo)記。
優(yōu)選地，通過探測有否存在著來自PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物來斷定核酸樣本中有否存在著靶序列。這種探測可利用凝膠電泳法做到。當(dāng)測定有否存在著某特定靶序列時(shí)，除了考慮有否存在著擴(kuò)增產(chǎn)物，亦可考慮所述擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和/或序列。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，所述靶序列至少其中之一包括至少一個(gè)非線粒體基因的整體或部分，或者包括與至少一個(gè)非線粒體基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)。
所述非線粒體基因和/或其側(cè)翼區(qū)可為編碼選自包括酵母細(xì)胞壁相關(guān)的蛋白、與糖類代謝相關(guān)的蛋白、線粒體相關(guān)蛋白以及與酵母應(yīng)激有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白的群組中的蛋白的基因。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，僅需要把線粒體基因和/或其側(cè)翼區(qū)用作靶序列。例如，能夠僅基于其線粒體DNA把用來生產(chǎn)麥酒(ale)的酵母與用來生產(chǎn)儲(chǔ)藏啤酒(lager) 的酵母相區(qū)別。同樣，能夠僅基于所述線粒體DNA中的靶序列把很多野生酵母從各種酵母區(qū)別出來。然而，對(duì)于另外一些酵母菌株來說，優(yōu)選的是還使用染色體基因和/或其側(cè)翼區(qū)來區(qū)別菌株。例如區(qū)別各種的儲(chǔ)藏啤酒酵母菌株。
本發(fā)明的方法可使用多組適合不同酵母菌株的PCR引物或探針。各組引物或探針可包括被設(shè)計(jì)成能擴(kuò)增酵母核酸中兩個(gè)或更多靶序列的引物，其中所述靶序列中至少其中之一是在所述酵母線粒體DNA中。各組引物或探針可包括被設(shè)計(jì)成能探測酵母核酸中兩個(gè)或更多靶序列的的探針，其中所述靶序列中至少其中之一是在所述酵母線粒體DNA中。優(yōu)選地，各組引物或探針包括針對(duì)酵母核酸中三個(gè)或更多、四個(gè)或更多、五個(gè)或更多、六個(gè)或更多、七個(gè)或更多、八個(gè)或更多、九個(gè)或更多、十個(gè)或更多等等靶序列的引物或探針。
本發(fā)明的方法可利用不同菌株之間的基因排序/位置的差異。
進(jìn)行所述酵母發(fā)酵工序的制造商通常會(huì)知道應(yīng)使用何種酵母以及可能存在的污染物為何，因而能夠?qū)⒈景l(fā)明的方法修改以適合篩查這些菌株?？赡艽嬖诘奈廴疚锿ǔＪ侵圃鞆S中使用的其他菌株和/或野生酵母。
野生酵母可出現(xiàn)在所述工序或產(chǎn)物中并導(dǎo)致變質(zhì)，其種類的例子包括畢赤酵母 (Pichia)屬、有孢漢遜酵母(Hanseniaspora)屬、魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces)屬、
7假絲酵母(Candida)屬和德克酵母/酒香酵母(Dekkera/Brettanomyces)屬。
用于生產(chǎn)葡萄酒的酵母菌株的種類包括來自酵母(Saccharomyces)屬的菌株，尤其是酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
用于生產(chǎn)乙醇(生物燃料)的酵母菌株的種類包括來自通常用于糖漿發(fā)酵的釀酒酵母，以及可用于纖維素發(fā)酵的克魯弗氏酵母(Kluyveromyces cellobiovorus)的菌株。
用于生產(chǎn)啤酒的酵母菌株包括釀酒酵母，其為一種用于生產(chǎn)麥酒型啤酒(麥酒) 的所謂“頂部發(fā)酵”酵母或麥酒酵母菌株。
麥酒酵母菌株可選自UNYC7 (釀酒酵母)、UNYC8 (釀酒酵母)、UNYC9 (釀酒酵母)、 UNYClO (釀酒酵母)、NCYC 1119(釀酒酵母)、NCYC 2593 (釀酒酵母)和KSl (釀酒酵母) 或其相互之間的任何組合。
儲(chǔ)藏啤酒酵母菌株包括卡爾斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、德Hl維森啤酒 (Weihenstephan)的WiM或者釀酒酵母和貝酵母(Saccharomyces bayanus)的雜交種，所有這些用于生產(chǎn)儲(chǔ)藏啤酒型啤酒(儲(chǔ)藏啤酒)的酵母被稱為“底部發(fā)酵”酵母。
儲(chǔ)藏啤酒酵母菌株也可選自UNYC3 (釀酒酵母(巴斯德酵母))、UNYC4 (釀酒酵母 (巴斯德酵母))、UNYC5 (釀酒酵母(巴斯德酵母))、UNYC6 (釀酒酵母(巴斯德酵母))、 UNYC2 (釀酒酵母)、UNYCl (卡爾斯伯酵母)和NCYC1116 (卡爾斯伯酵母)或其相互之間的任何組合。
相比起生產(chǎn)儲(chǔ)藏啤酒的菌株，生產(chǎn)麥酒的酵母菌株通常更加穩(wěn)定，并且更易區(qū)別。 這可能是由于生產(chǎn)麥酒的菌株就進(jìn)化而言，是更加古老的。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法允許在一個(gè)樣本中鑒定兩、三、四、五、六、七、八、九、十個(gè)或更多的酵母菌株。
將酵母，尤其是釀造酵母區(qū)分、鑒定和表征(characterising)的傳統(tǒng)方法是以生長中的酵母的生化、形態(tài)和生理?xiàng)l件以及發(fā)酵特征例如絮凝為基礎(chǔ)的。這些方法實(shí)施起是費(fèi)時(shí)的(需要幾天至一周)并且所提供的結(jié)果經(jīng)常是非結(jié)論性的或不完整的。例如，目前為了測定特定啤酒的發(fā)酵過程中所存在著的酵母菌株，釀造師會(huì)采取釀造中的啤酒(儲(chǔ)藏啤酒或麥酒)或者用于特定發(fā)酵的增殖培養(yǎng)物的樣本，并把樣本交給實(shí)驗(yàn)室，接著實(shí)驗(yàn)室會(huì)用樣本中的酵母栽培其培養(yǎng)物，然后進(jìn)行一系列的“是/否”測試來測定所述酵母的某些表型。從所述“是/否”測試的結(jié)果可斷定酵母菌株。
盡管近來已經(jīng)利用分子技術(shù)來區(qū)分啤酒樣本中的酵母菌株，但這些技術(shù)利用酵母菌株在倍性、染色體長度多態(tài)性或序列差異上的不同來區(qū)別不同的酵母菌株(斯馬特 KA(2007)發(fā)酵過程中的釀酒酵母基因組和全基因組表達(dá)以及蛋白質(zhì)組圖譜。酵母。電子版比印刷版先發(fā)行)。通常，所使用的分子技術(shù)包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)(海蒙德， J(2002)釀造微生物學(xué)中的酵母遺傳學(xué)?？唆斘謱W(xué)術(shù)出版社多德雷赫特，荷蘭；67-113 ； 米登，P (1990)釀造學(xué)會(huì)志96 =195-200)、靶向HIS4和LEU2的基因特異性探針(彼得森M B (1985)嘉士伯研究通訊50 =263-272)以及脈沖場凝膠電泳(PFGE)(凱西G P、普林格爾A T和厄得曼P A(1990)美國釀造化學(xué)家協(xié)會(huì)志48:100-106)。所有這些技術(shù)需要分子方法上專業(yè)詳盡的知識(shí)，從而經(jīng)常會(huì)以相當(dāng)高的成本外包給第三方供應(yīng)商。此外，這些方法都是耗時(shí)的，并且由于需要花費(fèi)時(shí)間才得到結(jié)果，因此所提供的數(shù)據(jù)是回溯的，也就是，如果酵母菌株出現(xiàn)問題，就會(huì)太遲而無法停止和重新開始例如釀造工序中的發(fā)酵。
本發(fā)明提供了快速且準(zhǔn)確的方法來測定樣本中的酵母菌株。優(yōu)選地，能夠在少于約對(duì)小時(shí)，優(yōu)選地少于約18小時(shí)，優(yōu)選地少于約12小時(shí)之內(nèi)實(shí)施所述方法。優(yōu)選地，能夠無需高級(jí)專業(yè)技術(shù)人員和昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備而可以實(shí)施到所述方法。所述方法可在很多應(yīng)用中有用。例如，在釀造業(yè)中，為了保證最后產(chǎn)物的質(zhì)量，需要在發(fā)酵過程中保持同樣的釀造酵母菌株。如果酵母菌株或酵母菌株的平衡在發(fā)酵過程中改變，則生產(chǎn)出的啤酒質(zhì)量可能會(huì)降低。因此，能夠快速地測定存在于發(fā)酵期間任一階段的酵母是重要的。
本發(fā)明提供了通用的定制菌株檢驗(yàn)方法，其能夠提供用于酵母發(fā)酵業(yè)例如釀造業(yè)中的酵母菌株的可靠的質(zhì)量保證。例如，本發(fā)明能夠?yàn)閷Ｓ械尼勗旖湍柑峁┟鞔_并且重復(fù)性好的的區(qū)分。
本發(fā)明在經(jīng)濟(jì)上的重要性可以釀造業(yè)為例示。通常，啤酒經(jīng)常在大型“發(fā)酵容器” 中以幾千升的批次在四或五天內(nèi)釀造好。任一特定容器可代表逾100，000英鎊的昂貴投資，這強(qiáng)調(diào)了確保使用正確的酵母菌株在經(jīng)濟(jì)上的重要性。此外，釀造廠可能具有有限的生產(chǎn)能力并可能僅能夠釀造有限的數(shù)量，即每年50批上下的啤酒。因此，如果一桶/批啤酒中的酵母是不對(duì)的而產(chǎn)生的啤酒不是一流質(zhì)量的話，則會(huì)有很大的經(jīng)濟(jì)損失，并且實(shí)際上就會(huì)限制釀造廠的生產(chǎn)能力。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其允許在生產(chǎn)過程的任一階段，例如一天或甚至幾小時(shí)后，快速鑒定特定批次的酵母。如有必要，能夠接著停止并丟棄所述發(fā)酵或停止所述發(fā)酵并添加正確菌株的酵母。
本發(fā)明的第一方面的方法可在從發(fā)酵過程中獲得的樣本上實(shí)施，例如用于生產(chǎn)啤酒的樣本。
或者，可在開始發(fā)酵前使用本發(fā)明的方法，以在使用所述酵母或把其供應(yīng)到制造場所來進(jìn)行增殖和發(fā)酵之前提供菌株驗(yàn)證數(shù)據(jù)。
本方法也可在酵母增殖之后但未被用來給發(fā)酵反應(yīng)接種之前在該樣本上實(shí)施。
本發(fā)明的方法可用來保證用于任何發(fā)酵工序中的酵母的質(zhì)量，可在任何使用中的階段檢驗(yàn)酵母。關(guān)于酵母發(fā)酵所產(chǎn)生的產(chǎn)物，在其生產(chǎn)過程中對(duì)酵母的質(zhì)量控制至少有三個(gè)方面；第一、保證在發(fā)酵中實(shí)際使用的是正確的酵母，第二、進(jìn)行檢驗(yàn)以確保沒有被野生或不想要的酵母污染，第三、檢查在增殖或發(fā)酵過程中所添加的酵母中是否有任何可能引入異味或抑制性能的遺傳漂變。
可使用本發(fā)明的方法鑒定出供初期生長的菌株已經(jīng)是正確的選擇。由于在標(biāo)記時(shí)和供應(yīng)中有可能發(fā)生相當(dāng)基本的錯(cuò)誤，所以這是重要的。在該階段，需要提供能陽性鑒定想要的酵母菌株的途徑。能夠通過篩查僅能在某種菌株中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或更多靶核酸序列而調(diào)整本發(fā)明的方法以適合特定個(gè)別的菌株。
質(zhì)量控制的第二方面是在發(fā)酵過程中監(jiān)測污染。當(dāng)在發(fā)酵中出現(xiàn)野生酵母時(shí)(也就是在不受控制的方式下所添加的任何酵母)，就能產(chǎn)生污染，野生酵母可能產(chǎn)生于自然環(huán)境中大范圍的酵母源。通常，污染酵母是發(fā)酵廠使用的其他偶然“逃脫”并進(jìn)入所述發(fā)酵的菌株或者是存在于大氣中或由員工帶入的其他變質(zhì)酵母。能夠通過使用針對(duì)所述菌株所獨(dú)有的核酸序列的引物而使本發(fā)明的方法適合篩查想要的菌株以及可能存在的污染物。
質(zhì)量控制的第三方面是鑒定遺傳漂變，其可能發(fā)生在延長的增殖過程中或發(fā)酵過程中。能夠通過應(yīng)激，例如提升酒精濃度或溫度來誘發(fā)遺傳漂變，所述應(yīng)激導(dǎo)致基因序列產(chǎn)生變化，該變化可能非常小，但在最后產(chǎn)物的味道或酵母的性能方面可能是關(guān)鍵的。此外， 能夠?qū)⒈景l(fā)明的方法設(shè)計(jì)成來篩查允許這種不穩(wěn)定性被看得見的靶序列。
能夠使用本發(fā)明的方法去滿足質(zhì)量控制的所有三個(gè)方面。
如果通過在發(fā)酵過程中使用本發(fā)明的方法而在樣本中探測到不合需要的酵母菌株，則可停止發(fā)酵過程。如適當(dāng)，可接著使用正確的酵母菌株重新開始發(fā)酵過程?；蛘?，如果通過使用本發(fā)明的方法而鑒定出在所述發(fā)酵中的酵母菌株不是優(yōu)選的菌株，則可做出將所生產(chǎn)的產(chǎn)物用于替代產(chǎn)物中的決定。例如，在啤酒發(fā)酵的情況下，如果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中的酵母不是優(yōu)選的菌株，則所生產(chǎn)的啤酒可用于不同的品牌，也許是用于次一級(jí)的品牌。如果鑒定出正確/預(yù)定的酵母菌株，則制造商能對(duì)最后產(chǎn)物將如預(yù)期一樣有信心。
用于本發(fā)明的方法的樣本可為液體、漿體或固體。可從儲(chǔ)用培養(yǎng)物、增殖培養(yǎng)物、 在發(fā)酵開始之前的發(fā)酵混合物、在發(fā)酵過程中的發(fā)酵混合物或發(fā)酵產(chǎn)物提取所述樣本。所述樣本可為最初從發(fā)酵獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物或打算用于發(fā)酵的細(xì)胞培養(yǎng)物?？芍苯訌乃鰳颖咎崛『怂峄蚩稍谔崛『怂嶂芭囵B(yǎng)所述樣本。
用于本發(fā)明的任何方法的核酸可通過從所述樣本中的酵母細(xì)胞提取核酸而獲得。 可就地回收所述核酸，或者可使用第三方的服務(wù)將其從樣本提取。
所提取的核酸可包括全細(xì)胞抽提物，或者其可為純化或部分純化的核酸。使用的核酸可為來自酵母的總核酸，或者其可為基因組DNA和/或線粒體DNA和/或上述兩者的混合物。
用于本發(fā)明的方法的線粒體DNA的靶序列可包括選自以下組別的基因C0B、C0X1、 C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VAR1和RPMl的至少部分和/或任何位于這些基因的兩側(cè)或分隔這些基因的非編碼序列，或其相互之間的任何組合。
CYC3、CYC1和CYC2是參與編碼線粒體內(nèi)膜周邊蛋白(mitochondrial peripheral inner membrane proteins)的基因。
所述靶序列可包括一個(gè)或更多的酵母基因的整體或至少部分，該酵母基因選自下列組別IlR基因、DAN基因、FLO基因、ECM基因、BUD基因、KEL基因、MNT基因、SED基因、 MEL 基因、SUC 基因、ATF 基因、GST 基因、GAL 基因、MAL1-4、CYC1、CYC2、CYC3、CBPl、CBP2、 CBP3、CBP4 和 CBT1,以及線粒體基因 COB、COX 1、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl 和 RPMl 和/或上述基因的側(cè)翼區(qū)。
所述IlR基因可包括選自IlRl、TIR2和TIR4組別的基因或其相互之間的任何組口 O 所述DAN基因可包括選自DANl、DAN2、DAN3和DAN4組別的基因或其相互之間的任何組合。
所述TIR和DAN基因編碼釀酒酵母在缺氧期間表達(dá)的九種蛋白細(xì)胞壁甘露糖蛋白，即 DANl、DAN2、DAN3、DAN4、TIRl、TIR2、TIR3 和 TIR4。
所述ECM基因可包括選自下列組別的基因ECMl、ECM2、ECM3、ECM4、ECM5、ECM6、 ECM7、ECM8、ECM9、ECM10、ECM11、ECM12、ECM13、ECM14、ECM15、ECM16、ECM17、ECM18、ECM19、 ECM20、ECM21、ECM22、ECM23、ECM24、ECM24、ECM26、ECM27、ECM28、ECM29、ECM30、ECM31、 ECM32、ECM33和ECM34，或其相互之間的任何組合。
所述ECM基因編碼細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。
10 來自釀酒酵母的ECM33 (TOR078W)編碼糖基化磷脂酰肌醇(GPI)連接的蛋白。 如果將該基因破壞，則細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)溫度敏感的生長缺陷以及對(duì)氧化應(yīng)激的超敏反應(yīng)。 ECM34 (YBR043W)編碼未知功能蛋白，但該基因位于次端粒序列內(nèi)，朝向端粒。
所述FLO基因可包括選自下列組別的基因FLO1、FL05、FL08、FL09,FL010和FLO11， 或其相互之間的任何組合。
Flo基因編碼凝集素樣細(xì)胞表面蛋白，所述蛋白通過與其他細(xì)胞表面上的甘露糖糖鏈結(jié)合而把細(xì)胞聚集成“絮凝物”。這種細(xì)胞的絮凝是依賴鈣的和無性的，并由營養(yǎng)限制激發(fā)。這個(gè)過程對(duì)于酵母的釀造特性是非常重要的。
所述BUD1、BUD2、BUD3等基因編碼參與選擇萌芽位置并且是酵母細(xì)胞的軸向萌芽所需的蛋白。
所述KEL1、KEL2和KEL3基因編碼適當(dāng)?shù)募?xì)胞融合和細(xì)胞形態(tài)化所需的蛋白。
所述MNT1-4基因編碼參與0-糖基化的蛋白。
所述SED基因包括SED1-6。SEDl編碼與轉(zhuǎn)譯核糖體相關(guān)的應(yīng)激性的結(jié)構(gòu)性 GPI-細(xì)胞壁糖蛋白。它還在線粒體基因組的維護(hù)上具有假定(putative)的作用。SED2編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的糖基化整合膜蛋白。SED3編碼參與0-甘露糖基化和蛋白糖基化的蛋白。SED4 編碼與整合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)的蛋白。SED5編碼在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體之間的膜泡運(yùn)輸所需的蛋白。SED6編碼與麥角留醇生物合成途徑相關(guān)的酵母留醇至表留醇的蛋白。
使用本發(fā)明的方法中與酵母細(xì)胞壁相關(guān)的序列的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞壁相關(guān)DNA序列是多態(tài)的。該多態(tài)性提供了親緣關(guān)系密切的酵母菌株之間的明顯差別，并允許利用這些基因中的靶序列精確而可重復(fù)地區(qū)別菌株。
與酵母代謝相關(guān)的核酸中的靶序列可包括任何基因、操縱子、啟動(dòng)子的整體或部分或任何基因、操縱子、啟動(dòng)子的側(cè)翼區(qū)，其與酵母細(xì)胞代謝的作用或維護(hù)，或者跟酵母細(xì)胞代謝，優(yōu)選為底物代謝相關(guān)的蛋白的表達(dá)有關(guān)。所述核酸中的靶序列可為一個(gè)或更多的酵母基因的至少部分和/或酵母基因的側(cè)翼區(qū)，該酵母基因選自以下組別MEL基因、SUC基因、ATFl、ATF2、GSYl、GSY2 禾Π GAL1—10。
所述MEL基因可包括任何選自以下組別的基因MELl、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、 MEL6、MEL7、MEL8、MEL9和MELlO，或其相互之間的任何組合。
所述MEL基因編碼蜜二糖分解代謝性轉(zhuǎn)化為葡萄糖和半乳糖所需的分泌出來的 α-半乳糖苷酶。所有儲(chǔ)藏啤酒酵母菌株都能夠利用蜜二糖。
所述SUC基因可包括選自以下組別的基因SUC1、SUC2、SUC3、SUC4、SUC5和SUC7， 或其相互之間的任何組合。
所述SUC基因編碼轉(zhuǎn)化酶，其為一種蔗糖水解酶。這種酶也被稱作蔗糖酶、β -呋喃果糖苷酶或果糖苷酶，在蔗糖代謝中起著重要的作用。轉(zhuǎn)化酶催化了二糖的蔗糖水解為果糖和葡萄糖，并催化了三糖的棉子糖水解為果糖和蜜二糖。除SUC2外，所有SUC基因都位于次端粒序列內(nèi)。
ATFl和ATF2是編碼參與脂類和留醇代謝的蛋白的基因；其負(fù)責(zé)發(fā)酵過程中絕大部分的揮發(fā)性乙酸酯的生產(chǎn)。
GSYl和GSY2是編碼參與糖原合成的蛋白的基因。
GAL1-10是編碼參與半乳糖代謝的蛋白的基因。
與代謝，尤其是底物代謝相關(guān)的靶序列具有的優(yōu)點(diǎn)是所述方法著重于各菌株能夠代謝何種底物，其直接反映出酵母發(fā)酵的最后產(chǎn)物將會(huì)為何。能夠基于酵母菌株能利用何種底物來區(qū)分酵母菌株。
CYCl、CYC2、CYC3、CBPl、CBP2、CBP3、CBP4 和 CBTl 基因編碼與線粒體相關(guān)但不由線粒體基因組編碼的蛋白。
CYC3、CYCl和CYC2是參與編碼線粒體外周內(nèi)膜的基因。
CBPU CBP2、CBP3和CBP4是編碼與COB mRNA (信使RNA)相互作用并在其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)譯方面起著作用的線粒體蛋白的基因。
CBTl編碼參與將線粒體COB蛋白加工的蛋白。
所述兩個(gè)或更多的靶序列可選自一個(gè)或更多的下列基因的整體或部分或下列基因的側(cè)翼區(qū)C0B、RPM1、ATP9、VAR1、C0X1、C0X2、C0X3、ATP6、ATP8、TIR4、MELl、FLOl、SUC3 和SUC5。優(yōu)選地，所述靶序列至少其中之一包括一個(gè)或更多的下列基因的整體或部分或下列基因的側(cè)翼區(qū)C0B、RPM1、ATP9、VARl、COXl、C0X2、C0X3、ATP6 和 ATP8。
在本發(fā)明的任何使用到PCR來探測所述靶序列的方法中，可使用一個(gè)或更多的寡核苷酸引物。所述引物或探針可與所述靶序列互補(bǔ)或反向互補(bǔ)。所述一個(gè)或更多的引物或探針可與一個(gè)或更多的基因的部分或一個(gè)或更多的基因的側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)或反向互補(bǔ)，所述基因選自下列組別包括TIR基因，例如TIR1、TIR2、TIR4 ；DAN基因，例如DAN1、DAN2、DAN3和 DAN4 ；ECM 基因，例如 ECMl、ECM2、ECM3、ECM4、ECM5、ECM6、ECM7、ECM8、ECM9、ECMlO、ECMl 1、 ECMl 2 ECMl3, ECM14、ECMl5, ECM16、ECMl7, ECM18、ECM19、ECM20、ECM21、ECM22、ECM23、 ECM24、ECM24、ECM26、ECM27、ECM28、ECM29、ECM30、ECM31、ECM32、ECM33 和 ECM34 ；FLO 基因， 例如 FLO1、FL05、FL08、FL09,FL010 和 FLOll ； BUDl ；BUD2 ；BUD3 等等；KELl ；KEL2 ；KEL3 和 MNT1-4，或其相互之間的任何組合。
所述引物或探針可與一個(gè)或更多的基因的部分序列或所述一個(gè)或更多的基因的側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)或反向互補(bǔ)，所述基因選自下列組別包括MEL基因，例如MELl、MEL2、MEL5 和 MEL6 ；SUC 基因，例如 SUC1、SUC2、SUC3、SUC4、SUC5 和 SUC7 ；ATFl ；ATF2 ；GSYl ；GSY2 和 GAL1-10，或其相互之間的任何組合。
所述引物或探針可與一個(gè)或更多的基因的部分序列或一個(gè)或更多的基因的側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)或反向互補(bǔ)，所述基因選自下列組別包括CYCl、CYC2、CYC3、CBPl、CBP2、CBP3、CBP4 和CBTl，或其相互之間的任何組合。
所述引物或探針可與酵母線粒體DNA的部分序列，例如一個(gè)或更多的線粒體基因的部分或一個(gè)或更多的線粒體基因的側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)或反向互補(bǔ)。所述線粒體基因可選自下列組別包括COB、COXU C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl和RPMl，或其相互之間的任何組合。
本發(fā)明的方法可使用與酵母線粒體DNA的部分序列互補(bǔ)或反向互補(bǔ)的一個(gè)或更多的引物或探針，該酵母線粒體DNA的部分序列是例如一個(gè)或更多的線粒體基因的部分或一個(gè)或更多的線粒體基因的側(cè)翼區(qū)，其中所述線粒體基因優(yōu)選地選自下列組別包括COB、 COXl、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl和RPMl，連同與一個(gè)或更多的以下基因的部分序列或一個(gè)或更多的以下基因的側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)或反向互補(bǔ)的一個(gè)或更多的引物或探針，所述基因選自下列組別包括 MEL 基因，例如 MEL1、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、MEL8、MEL9和 MELlO ；MAL1-4、SUC 基因，例如 SUC1、SUC2、SUC3、SUC4、SUC5 和 SUC7 ；ATFl ；ATF2 ；GSYl ； GSY2 ；GAL1-10、TIR 基因，例如 TIR1、TIR2、TIR4 ；DAN 基因，例如 DAN1、DAN2、DAN3 和 DAN4 ； ECM 基因，例如 ECMl、ECM2、ECM3、ECM4、ECM5、ECM6、ECM7、ECM8、ECM9、ECMlO、ECMl 1、ECMl2、 ECMl3, ECM14、ECMl5, ECM16、ECMl7, ECM18、ECM19、ECM20、ECM21、ECM22、ECM23、ECM24、 ECM24、ECM26、ECM27、ECM28、ECM29、ECM30、ECM31、ECM32、ECM33 禾口 ECM34 ；FLO 基因，例如 FL01、FL05、FL08、FL09、FL010 和 FLOll ；BUDl ；BUD2 ；BUD3 等等；KELl ；KEL2 ；KEL3 ；MNT1-4 ； CYCl ；CYC2 ；CYC3 ；CBPl ；CBP2 ；CBP3 ；CBP4 和 CBTl 或其相互之間的任何組合。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法使用與酵母線粒體COB基因序列的部分序列或酵母線粒體 COB基因的側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)或反向互補(bǔ)的一個(gè)或更多的引物或探針，連同與MEL1、SEDU SUC5、 SUC3、FL011、FLOl、TIRl、TIR2和TIR4基因的部分序列或這些基因的側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)或反向互補(bǔ)的一個(gè)或更多的引物或探針。優(yōu)選地，這些引物或探針使得儲(chǔ)藏啤酒和麥酒的酵母菌株區(qū)別開來。
所述引物或探針可包括選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42 和43，或其相互之間的任何組合的序列，或者與SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 38、39、41、42和43的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
所述引物可包括引物對(duì)，其可包括正向引物SEQ ID NO :1和反向引物SEQ ID NO: 3，或與SEQ ID NOs :1和/或3的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列，并且該序列產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物與引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3所產(chǎn)生的PCR 產(chǎn)物相同。優(yōu)選地，引物對(duì)SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3對(duì)于麥酒酵母菌株是有特異性的。
所述引物可包括儲(chǔ)藏啤酒引物對(duì)，其可包括正向引物SEQ ID NO :1和反向引物SEQ ID NO :4，或與SEQ ID NOs 1和/或4的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、 98%或更高的序列，并且該序列產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物與引物SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 4所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物相同。優(yōu)選地，引物對(duì)SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3對(duì)于儲(chǔ)藏啤酒酵母菌株是有特異性的。
本發(fā)明的方法可與一個(gè)或更多、兩個(gè)或更多、三個(gè)或更多、四個(gè)或更多、五個(gè)或更多、六個(gè)或更多、七個(gè)或更多、八個(gè)或更多、九個(gè)或更多、十個(gè)或更多的引物對(duì)SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2,SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7 禾口 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 禾口 SEQ ID NO :10、SEQ ID N0:11 和 SEQ ID NO 12,SEQ ID N0:13 禾口 SEQ ID NO 14,SEQ ID N0:15 禾口 SEQ ID N0:16、 SEQ ID NO :17 禾口 SEQ ID NO 18,SEQ ID N0:19 禾口 SEQ ID NO 20、SEQ ID N0:21 禾口 SEQ ID NO 22,SEQ ID N0:23 禾口 SEQ ID NO 24、SEQ ID NO :31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 29,SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 33,SEQ ID NO 34 和 SEQ ID NO :6、 SEQ ID N0:35 禾口 SEQ ID NO 36、SEQ ID N0:38 禾口 SEQ ID NO 39、SEQ ID NO :41 禾口 SEQ ID NO 42以及SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 43或者與所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性為80 ^^85%, 90^^95^^98%或更高的序列一起使用，并且其中所述序列產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物與所指定的SEQ ID NOs的引物所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物相同。
優(yōu)選地，使用兩個(gè)或更多的下列引物對(duì)SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :3、SEQ ID NO: 1 和 SEQ ID NO :4,SEQ ID SEQ ID NO :5 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :17 禾口 SEQ ID N0:18、 SEQ ID NO :19 禾口 SEQ ID NO 20、SEQ ID N0:21 禾口 SEQ ID NO 22、SEQ ID N0:23 禾口 SEQ ID NO 24,SEQ ID NO :31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO 28、SEQ ID N0:29 禾口 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 35 和 SEQ ID NO :36、SEQ ID N0:38 禾口 SEQ ID NO 39、SEQ ID N0:41 禾口 SEQ ID N0:42 以及 SEQ ID N0:41 禾口 SEQ ID NO: 43，或者與所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性為至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %或更高的序列，并且其中所述序列產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物與所指定的SEQ ID NOs的引物所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物相同。
所述弓I物可包括麥酒弓I物對(duì)和儲(chǔ)藏啤酒引物對(duì)。
用于本發(fā)明的方法的引物可包括引物組，所述引物組可包括針對(duì)酵母基因組DNA 的引物對(duì)，連同一對(duì)或更多的針對(duì)線粒體DNA的引物對(duì)。用于本發(fā)明的方法的探針可包括探針組，所述探針組可包括針對(duì)酵母基因組DNA的一些探針，連同一個(gè)或以上針對(duì)線粒體 DNA的探針。可使用引物和探針的混合物。
所述引物或探針可對(duì)于特定酵母菌株是有特異性的。
所述引物或探針可包括一對(duì)對(duì)照引物和/或一個(gè)或更多的對(duì)照探針。所述對(duì)照引物可被設(shè)計(jì)成擴(kuò)增受檢驗(yàn)的不同酵母菌株所共有的DNA靶區(qū)。所述對(duì)照引物可包括帶有 SEQ ID NO :1的序列的正向引物和帶有SEQ ID NO :2的序列的反向引物。所述一個(gè)或更多的對(duì)照探針可被設(shè)計(jì)成能探測受檢驗(yàn)的不同酵母菌株所共有的一個(gè)或更多的DNA靶區(qū)或序列。
所述對(duì)照引物的好處是其保證PCR擴(kuò)增是成功的并且反應(yīng)/檢驗(yàn)條件是正確的。
術(shù)語“側(cè)翼區(qū)”可指基因的編碼區(qū)上游或下游約1000、500、300、100、50或25個(gè)核苷酸的DNA區(qū)域。側(cè)翼區(qū)可包括基因之間和/或之內(nèi)的內(nèi)含子。
除測定樣本中存在著何種酵母菌株外，了解所述酵母的穩(wěn)定性也是重要的。已知酵母會(huì)連續(xù)多代都突變，并最終因經(jīng)歷太多突變而導(dǎo)致表現(xiàn)不同，實(shí)際上一經(jīng)發(fā)酵就會(huì)產(chǎn)生不同的產(chǎn)物。這能對(duì)發(fā)酵反應(yīng)的產(chǎn)物的質(zhì)量具有顯著影響。如果酵母的突變導(dǎo)致發(fā)生表型改變，通常這發(fā)生在酵母處于應(yīng)激狀態(tài)并且出現(xiàn)被稱為小菌落(小菌落突變)的細(xì)胞時(shí)， 則酵母被定義為是不穩(wěn)定的?？稍陲@微鏡下鑒定這些突變體。這些突變體是普遍的并且其缺乏線粒體DNA，結(jié)果就降低了所述酵母的性能。例如，如果小菌落突變體出現(xiàn)在啤酒的發(fā)酵中，啤酒的味道就會(huì)受到影響，從而降低產(chǎn)品的價(jià)值。而且，小菌落突變體生長緩慢，從而減慢發(fā)酵反應(yīng)。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了測定樣本中的酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性的方法，包括 -從樣本中的酵母獲得核酸； -將所述核酸進(jìn)行兩個(gè)或更多的靶序列的篩查，其中所述核酸中的靶序列至少其中之一包括酵母線粒體DNA中的某基因的整體或部分，或與酵母線粒體DNA中的某基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)，或者位于染色體的次端粒區(qū)的某基因的整體或部分或與位于染色體的次端粒區(qū)的某基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)； -從篩查結(jié)果斷定所述酵母菌株在遺傳方面是否穩(wěn)定。
14 次端粒區(qū)指接近端粒的染色體區(qū)域。在酵母屬中，端粒區(qū)長約350個(gè)堿基對(duì)。優(yōu)選地，次端粒區(qū)中的基因與染色體的端部相距至少約500個(gè)堿基對(duì)。
將會(huì)理解到的是，很多根據(jù)所述發(fā)明的第一方面，尤其是根據(jù)優(yōu)選地使用PCR來實(shí)施所述發(fā)明、何時(shí)能實(shí)施所述方法、所述樣本的性質(zhì)、所述核酸的提取方法以及所述發(fā)明的低實(shí)施難度而論述的優(yōu)選特征，都能夠應(yīng)用在這一方面。
測定樣本中酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性的方法可包括使用實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)來測定所述酵母中的基因的相對(duì)的mtDNA(線粒體DNA)的拷貝數(shù)?；虻膍tDNA拷貝數(shù)的相對(duì)減少，(或低的基因的mtDNA拷貝數(shù))，可顯示所述酵母變得不穩(wěn)定或所述酵母是不穩(wěn)定的可能性增大。mtDNA中的C0X2基因的缺乏或缺失(deletion)可顯示酵母是不穩(wěn)定的可能性。 已知的是，ACTl基因中的拷貝數(shù)保持無顯著變化，可相對(duì)于例如ACTl基因中的拷貝數(shù)來測定所述mtDNA的拷貝數(shù)。
測定樣本中酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性的方法可包括使用解離曲線來測定產(chǎn)物性質(zhì)以及觀察針對(duì)兩個(gè)或更多的靶序列的弓I物或探針的雜交性質(zhì)。
所述RT-PCR或解離曲線可使用任何選自SEQ ID NO :46、47、48或49的一個(gè)或更多的引物。所述RT-PCR可使用引物對(duì)SEQ ID N0:48和49。所述RT-PCR可把引物對(duì)SEQ ID NO 46和47用作對(duì)照物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能迅速而準(zhǔn)確地測定酵母菌株的穩(wěn)定性。例如，本發(fā)明能為專有的釀酒酵母提供在遺傳方面已經(jīng)變得或正在變得不穩(wěn)定并不應(yīng)再被用于發(fā)酵過程中的顯示，該顯示是明確并且重復(fù)性好的。傳統(tǒng)上，釀造師在最后的釀造過程檢驗(yàn)所釀造的啤酒， 如果由于酵母突變太大(變得不穩(wěn)定)而導(dǎo)致啤酒不合標(biāo)準(zhǔn)，則該批啤酒就會(huì)被丟棄或被便宜賣掉。釀造廠因而虧本。有利的是，本發(fā)明允許在酵母被用于隨后批次的釀造之前或在釀造過程中驗(yàn)證該酵母的穩(wěn)定性。
使用酵母發(fā)酵的制造商可通過定期更換酵母來嘗試預(yù)先阻止酵母出現(xiàn)缺乏穩(wěn)定性的情況，然而，因?yàn)榭赡軙?huì)不必要地丟棄在遺傳方面穩(wěn)定的酵母，所以這是不理想的。本發(fā)明的好處是在酵母開始突變時(shí)但在該突變未足以影響產(chǎn)物質(zhì)量之前鑒定到該酵母。因此，僅在必要時(shí)才需更換酵母。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明這一方面的方法是預(yù)報(bào)性質(zhì)的，并且能被用于顯示酵母何時(shí)變得不穩(wěn)定。為了讓酵母因基因組不穩(wěn)定而產(chǎn)生的表型改變表現(xiàn)出來，需要破壞線粒體DNA 的全部拷貝。酵母通常帶有20個(gè)線粒體，必須把全部破壞才看得到表型改變。通過使用本發(fā)明這一方面的方法作定期篩查，能夠在破壞開始出現(xiàn)時(shí)并在表型改變出現(xiàn)之前看得到該破壞。因此，能夠在基因組受的破壞影響到產(chǎn)物之前更換酵母。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括測定線粒體的拷貝數(shù)的步驟。能夠一并使用靶序列的篩查結(jié)果和線粒體的拷貝數(shù)來預(yù)測酵母菌株是否在遺傳方面變得不穩(wěn)定。
術(shù)語“穩(wěn)定”指酵母的遺傳不穩(wěn)定性。酵母核的某些區(qū)域中的DNA和/或線粒體 DNA由于缺失、重組或不合適的插入，而隨著時(shí)間變得不穩(wěn)定，并且能導(dǎo)致酵母出現(xiàn)不理想的形態(tài)和/或生理改變。在酵母菌株變得在基因方面不穩(wěn)定及不適合其使用目的之前，僅能使用或重復(fù)使用該酵母菌株一段有限的時(shí)間或?qū)⑵溆糜诨蛑貜?fù)用于有限次數(shù)的連續(xù)發(fā)酵。這種不穩(wěn)定性的檢測在經(jīng)濟(jì)上，尤其是對(duì)釀造業(yè)來說是重要的。
用于本發(fā)明這一方面的線粒體DNA的靶序列可包括選自下列組別包括C0B、C0X1、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VAR1和RPMl的基因的至少部分和/或任何位于這些基因的兩側(cè)或分隔這些基因的非編碼序列，或者其相互之間的任何組合。
用于本發(fā)明這一方面的次端粒DNA的靶序列可包括選自下列組別包括ECM34、 SUC1、SUC3、SUC4、SUC5、SUC7、MAL1、MAL2、MAL3、MAL4、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、 MEL8、MEL9和MELlO的基因的至少部分和/或任何位于這些基因的兩側(cè)或分隔這些基因的非編碼序列，或者其相互之間的任何組合。
優(yōu)選地，所述靶序列是在染色體I、VI、X或XI的次端粒區(qū)中。
本發(fā)明這一方面的方法可在PCR反應(yīng)中使用一個(gè)或更多的引物或探針，其與酵母線粒體DNA的部分序列或酵母染色體的端粒區(qū)互補(bǔ)或反向互補(bǔ)。所述引物或探針可與一個(gè)或更多的以下基因的部分序列或以下基因的側(cè)翼區(qū)互補(bǔ)或反向互補(bǔ)，以下基因?yàn)镃OB、 COXl、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl、RPMl、ECM34、SUCl、SUC3、SUC4、SUC5、SUC7、MALI、 MAL2、MAL3、MAL4、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、MEL8、MEL9 和 MEL10。
所述引物或探針可包括選自SEQ ID NOs :5、6、15、16、25、26、27、28、四、30、31、32、 33、48和49的序列或其相互之間的組合，或者與SEQ IDNOs :5、6、15、16、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、48和49的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
本發(fā)明這一方面的方法可與一個(gè)或更多的引物對(duì)SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6、 SEQ ID NO: 15 禾口 SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 34 和 SEQ ID NO 6,SEQ ID NO 48 禾Π SEQ ID NO :49 或者與所列 SEQ ID NOs 的序列的序列一致性為至少80%、85(%、90(%、95(%、98(%或更高的序列一起使用，并且其中所述序列產(chǎn)生的 PCR產(chǎn)物與所指定的SEQ ID NOs的引物所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物相同。
可根據(jù)本發(fā)明的方法的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量和/或長度和/或數(shù)量和/或序列大體上與某標(biāo)準(zhǔn)的分子量和/或長度和/或數(shù)量和/或序列吻合，來斷定酵母菌株是穩(wěn)定的。所述標(biāo)準(zhǔn)可為來自所預(yù)期的菌株的DNA。
可根據(jù)所述擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量和/或長度和/或數(shù)量和/或序列與所述標(biāo)準(zhǔn)的分子量和/或長度和/或數(shù)量和/或序列大體上不吻合，來斷定酵母菌株是不穩(wěn)定的?？筛鶕?jù)未能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物來斷定酵母菌株是不穩(wěn)定的。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了包括一個(gè)或更多的寡核苷酸的組合物，所述寡核苷酸帶有選自 SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42、43、46、47、48 和 49的序列，或者與所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、 98%或更高的序列。
按照另一方面，本發(fā)明提供了測定樣本中的酵母菌株的試劑套件，其包括針對(duì)酵母核酸中兩個(gè)或更多的靶序列的兩個(gè)或更多的引物或探針，其中所述引物或探針至少其中之一為針對(duì)酵母線粒體DNA中的基因中的靶序列，或針對(duì)酵母線粒體DNA中的基因的側(cè)翼區(qū)。
按照又一方面，本發(fā)明提供了測定樣本中的酵母菌株的穩(wěn)定性的試劑套件，其包括針對(duì)酵母核酸中兩個(gè)或更多的靶序列的兩個(gè)或更多的引物或探針，其中所述引物或探針
16至少其中之一為針對(duì)酵母線粒體DNA中的基因中的靶序列或在染色體次端粒區(qū)的基因中的靶序列，或針對(duì)酵母線粒體DNA中的基因的側(cè)翼區(qū)或在染色體次端粒區(qū)的基因的側(cè)翼區(qū)。
本發(fā)明的試劑套件可適合與PCR —起使用。
按照本發(fā)明的試劑套件進(jìn)一步包括PCR試劑。所述PCR試劑可為DNA聚合酶、DNA 聚合酶輔因子、PCR緩沖液以及一個(gè)或更多的脫氧核苷酸-5’ -三磷酸其中的一個(gè)或更多。
優(yōu)選地，按照本發(fā)明的任一方面的引物或探針包括12至60個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是 15至45個(gè)核苷酸。
用于本發(fā)明的引物或探針被選定為分別與將被擴(kuò)增或探測的各特定序列的不同的鏈“大體上互補(bǔ)”。這意味著所述引物或探針必須能充分地與其各自的鏈互補(bǔ)以與其各自的鏈雜交，從而形成想要的雜交產(chǎn)物，并且其中可用DNA聚合酶延伸所述引物。在優(yōu)選和最實(shí)用的情況下，所述引物或探針具有與靶核酸的精確的互補(bǔ)性(exact complementarity) 0 所述試劑套件還可包括試劑套件的使用說明，例如，所述說明可包括使用的PCR 條件和/或使用的核酸樣本和/或引物和/或其他試劑的量。
如果樣本包含特定酵母菌株，或如果酵母菌株是穩(wěn)定或不穩(wěn)定時(shí)，所述試劑套件還可包括所預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小細(xì)節(jié)。這可通過代表性的電泳凝膠的圖表或圖像來給出ο 所述試劑套件還可包括對(duì)照弓I物或?qū)φ仗结槨?br> 可在混合物中提供或分開提供所述PCR引物和/或PCR試劑?？稍诨旌衔镏刑峁┗蚍珠_提供兩個(gè)或更多的探針。
所述試劑套件可包括對(duì)照核酸樣本和引物，其被用于確保PCR條件是正確的。所述試劑套件可包括對(duì)照核酸樣本和探針，其被用于確保探針的雜交和/或探測條件是正確的。
所述試劑套件可包括更多用于探測任何PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的試劑。
所述試劑套件還包括關(guān)于如何從樣本中提取核酸并將其用于分析的說明。所述試劑套件還可包括有助于提取核酸的試劑。
測定樣本中酵母菌株的試劑套件可包括針對(duì)下列基因的一個(gè)或更多或其側(cè)翼序列的引物或探針C0B、COXl、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl和RPMl，或其相互之間的任何組合。所述試劑套件可同樣或替代性地包括針對(duì)一個(gè)或更多的酵母基因的整體或至少部分的一個(gè)或更多的引物或探針，所述酵母基因選自下列組別包括所述IlR基因、所述DAN 基因、所述FLO基因、所述ECM基因、所述BUD基因、所述KEL基因、所述MNT基因、所述SED 基因、所述MEL基因、SUC基因、所述ATF基因、所述GST基因、所述GAL基因、MAL1_4、CYC1、 CYC2、CYC3、CBP1、CBP2、CBP3、CBP4和CBT，或者其相互之間的任何組合。
所述試劑套件可包括一個(gè)或更多的引物或探針，其選自SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、38、39、41、42 和 43，或其相互之間的任何組合，或者與 SEQIDNOs :1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、38、39、41、42 和 43 的序列的序列一致性為至少 80% ,85% ,90 % ,95 % ,98% 或更高的序列。所述試劑套件可包括一個(gè)或更多的引物對(duì)的引物對(duì)SEQ ID NO :1和SEQ IDNO :2、SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11 禾口 SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :14、SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO: 17 禾口 SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 19 禾口 SEQ ID NO 20、SEQ ID N0:21 禾口 SEQ ID NO :22、 SEQ ID N0:23 禾口 SEQ ID NO 24、SEQ ID N0:31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO :28、SEQ ID NO 28 和 SEQ ID NO 29 和 SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 35 和 SEQ ID NO 36、SEQ ID N0:38 禾口 SEQ ID NO 39、SEQ ID NO :41 禾口 SEQ ID NO 42 以及 SEQ ID NO :41 禾口 SEQ ID NO :43，或者與所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列，并且該序列產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物與所指定的SEQ ID NOs的引物所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物相同。優(yōu)選地，兩個(gè)或更多的下列引物對(duì)用于所述試劑套件中SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 1 禾口 SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 17 禾口 SEQ ID NO :18、SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21 和 SEQ ID NO :22、、SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO :24、SEQ ID NO 31 禾口 SEQ ID NO :26、SEQ ID NO 32 禾口 SEQ ID NO :28、SEQ ID N0:29 禾口 SEQ ID NO 30、SEQ ID N0:25 禾口 SEQ ID NO 28、SEQ ID N0:35 禾口 SEQ ID NO: 36. SEQ ID NO :38 禾口 SEQ ID NO 39、SEQ ID N0:41 禾口 SEQ ID N0:42 以及 SEQ ID N0:41 禾口 SEQ ID NO :43或者與所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、 98%或更高的序列，并且其中所述序列產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物與所指定的SEQ ID NOs的引物所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物相同。
在測定樣本中酵母菌株的穩(wěn)定性的試劑套件中，可提供針對(duì)一個(gè)或更多的下列基因或其側(cè)翼序列的引物或探針COB,COXUC0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl、RPMl、ECM34、 SUC1、SUC3、SUC4、SUC5、SUC7、MAL1、MAL2、MAL3、MAL4、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、 MEL8、MEL9 和 MELlO。
所述試劑套件可包括一個(gè)或更多的引物或探針，所述引物或探針帶有選自SEQ ID NOs :5、6、15、16、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、46、47、48 和 49 的序列或其相互之間的任何組合的序列，或者與 SEQ ID NOs :5、6、15、16、25、26、27、28、四、30、31、32、33、34、46、 47,48和49的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
所述試劑套件可包括一個(gè)或更多的引物對(duì)SEQ ID NO 5和SEQ ID NO :6、SEQ ID NO: 15 禾口 SEQ ID NO 16, SEQ ID N0:31 禾口 SEQ ID NO 26、SEQ ID N0:32 禾口 SEQ ID NO :28、 SEQ ID N0:29 禾口 SEQ ID NO 30、SEQ ID N0:25 禾口 SEQ ID NO 28、SEQ ID N0:34 禾口 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 46和47以及SEQ ID NO 48和49，或者與所列SEQ ID NOs的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列，并且其中所述序列產(chǎn)生的PCR 產(chǎn)物與所指定的SEQ ID NOs的引物所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物相同。
按照另一方面，本發(fā)明提供了例如啤酒的發(fā)酵方法，其包括在發(fā)酵過程中的任何階段實(shí)施本發(fā)明的方法。可在增殖前獲得的酵母的樣本、在增殖過程中或增殖后獲得的樣本、在發(fā)酵過程中的任何時(shí)刻獲得的樣本，或最后產(chǎn)物的樣本上實(shí)施本發(fā)明的方法。
按照另一方面，本發(fā)明提供了例如在啤酒生產(chǎn)中的發(fā)酵方法，其包括在發(fā)酵過程中采集發(fā)酵混合物的樣本、實(shí)施本發(fā)明的方法以測定存在著何種酵母或測定該酵母的遺傳穩(wěn)定性、根據(jù)結(jié)果決定是否繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵和/或是否更換酵母和/或是否把產(chǎn)物重新用作另一用途。
按照另一方面，本發(fā)明提供了分析含酵母的樣本的的方法，其包括在所述分析中使用探針或引物； 其中如果酵母存在于所述樣本中，則所述探針或引物能夠與所供給的酵母的線粒體DNA雜交。
如在所述樣本中再存在著另一種酵母，則所述探針或引物可能就不能與該酵母的線粒體DNA雜交。
所供給的酵母可為巴斯德酵母。另一酵母可為釀酒酵母。或者，所供給的酵母可為釀酒酵母。另一酵母可為巴斯德酵母。
按照本發(fā)明的任何方面的方法可被用來測定包含酵母的樣本是否包含著不合需要的酵母。所述方法可被用來檢查打算用于隨后與酵母有關(guān)的發(fā)酵的樣本的質(zhì)量。所述方法可包括以下的步驟如質(zhì)量合格，使用所述酵母進(jìn)行發(fā)酵或如質(zhì)量不合格，停止發(fā)酵的步馬聚ο 按照另一方面，本發(fā)明提供了適合用于本發(fā)明的方法的探針或引物。
所述探針或引物可優(yōu)先與巴斯德酵母的mtDNA雜交，或優(yōu)先與釀酒酵母的mtDNA 雜交。
所述探針或引物的長度可為至少8個(gè)核苷酸。所述探針或引物的長度可為少于30 個(gè)核苷酸。
所述探針或弓I物可優(yōu)先與任何選自COB,COXU C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl 和RPMl的基因雜交。所述探針或引物可優(yōu)先與任何選自SEQ ID NO :37、40、44、45、50、51、 54、55、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71 和 72 的序列或其補(bǔ)體雜交。
所述探針或引物可優(yōu)先與SEQ ID N0:50或SEQ ID NO :54，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID N0:51或SEQ ID NO :55，或者其補(bǔ)體雜交。或者，所述探針或引物可優(yōu)先與SEQ ID N0:51或SEQ ID NO :55，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID NO 50或SEQ ID NO :54，或者其補(bǔ)體雜交。
所述探針或引物可優(yōu)先與SEQ ID NOS :58、59或60中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交， 并可選地不與SEQ ID NOS :61、62、63、64、65或66中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交?；蛘撸鎏结樆蛞锟蓛?yōu)先與SEQ ID NOS :61、62、63、64、65或66中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交， 并可選地不與SEQ ID NOS :58、59或60中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交。
所述探針或引物可優(yōu)先與SEQ ID NOS 67或68中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID N0S:69、70、71或72中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交?；蛘?，所述探針或引物可優(yōu)先與SEQ ID NOS :69、70、71或72中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID NOS 67或68中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交。
所述探針或引物可優(yōu)先與在圖15A、16A、17或18中的任一圖中星號(hào)(*)所顯示的一個(gè)或更多的核苷酸位點(diǎn)的 SEQ ID NOS :50、51、54、55、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71或72中任何序列的部分，或者這些序列的補(bǔ)體雜交。例如，所述探針或引物可優(yōu)先與圖15A中星號(hào)所標(biāo)記的核苷酸位點(diǎn)雜交，其包括SEQ ID NO 50的第147位核苷酸。
所稱“雜交”可指在嚴(yán)格條件下雜交。術(shù)語“優(yōu)先雜交”，或類似術(shù)語，是用來指相對(duì)于另一序列或靶區(qū)，引物或探針更可能與特定的序列或靶區(qū)雜交。優(yōu)先雜交可在嚴(yán)格條
19件下決定。雜交的嚴(yán)格條件是指例如在PCR中，允許引物或探針進(jìn)行雜交或者允許互補(bǔ)序列對(duì)彼此雜交的溫度和緩沖液組分的條件，其中條件決定了具有某些一致性的序列是否能夠彼此雜交。彼此不太相似的序列會(huì)在中度嚴(yán)格的條件下雜交。高度嚴(yán)格時(shí)雜交序列需完全相同，或幾乎完全相同才能進(jìn)行雜交。
本文中使用的術(shù)語“雜交”可指在技術(shù)人員可即時(shí)斷定的中度至高度嚴(yán)格條件下的雜交。
測定樣本中酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性的方法可包括通過用限制酶消化酵母mtDNA 來篩查該酵母，所述限制酶專門切割鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸(G~C)之間的核酸，以提供RFLP (限制性片段長度多態(tài)性)圖譜， 其中所述酵母核酸的RFLP圖譜與來自非不穩(wěn)定的酵母的已知的、保守的RFLP圖譜比較，并且其中在RFLP圖譜中所觀察到的顯著差異顯示了酵母菌株是不穩(wěn)定的。不穩(wěn)定的酵母菌株可被另稱為“小菌落突變體(petite mutant)”。
所述酵母核酸可包括全細(xì)胞DNA (包括mtDNA)，或mtDNA。
例如在用限制酶HaeIII或HinfI切割時(shí)，穩(wěn)定的酵母菌株的保守的RFLP圖譜可大體上匹配表4中所列的片段大小。
本文中本發(fā)明的任何方面的方法可用于釀酒。
本文中使用的“序列一致性”可指使用例如序列分析軟件BLASTN或BLASTP (在 www, ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/可得)來比較兩個(gè)序列。可使用BLASTN或BLASTP的默認(rèn)參數(shù)來測定序列一致性。
會(huì)被理解的是，能以任何組合和任何數(shù)目的形式使用適用于本發(fā)明的一個(gè)方面或?qū)嵤├目蛇x特征。而且，還能在適當(dāng)時(shí)以任何組合和任何數(shù)目的形式把所述可選特征與本發(fā)明的任何其他方面或?qū)嵤├黄鹗褂谩?br>

現(xiàn)參考附圖并僅通過例子來對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行描述，在附圖中 圖1顯示了所述TIR4基因的PCR擴(kuò)增的電泳圖譜。泳道1_WT (S288c)；泳道
2-UNYC3；泳道 3-UNYC2 ；泳道 4-NCYC1116 ；泳道 4UNYC1 ；泳道 5-UNYC7 ；泳道 6-UNYC8 ；泳道 7-NCYC1119 ；泳道 8-KS1 和泳道 9-NCYC2593 ； 圖2顯示了圖1中所提取的條帶的序列比對(duì)。弓丨物A+C和A+D的組合會(huì)把麥酒和儲(chǔ)藏啤酒菌株區(qū)分開來。引物組合A+B用作對(duì)照物； 圖3是表示所述釀酒酵母中的COB基因的示意圖。黑色區(qū)域表示內(nèi)含子。(F=正向引物，R=反向引物)； 圖4顯示了使用了引物Fl和Rl擴(kuò)增的COB基因的電泳圖譜。泳道l_WT(S^8c)； 泳道 2-UNYC3 ；泳道 3-UNYC2 ；泳道 4-NCYC1116 ；泳道 4UNYC1 ；泳道 5-UNYC7 ；泳道 6-UNYC7 ； 泳道 7-NCYC1119 ；泳道 8-KS1 和泳道 9-NCYC2593 ； 圖5是酵母菌株巴斯德酵母和釀酒酵母的mtDNA序列的示意圖。
圖6顯示了 MELl基因的電泳圖譜。泳道1_WT (S288c)；泳道2-UNYC2 ；泳道
3-UNYC1；泳道 4-UNYC3 ；泳道 5-UNYC4 ；泳道 6-UNYC7 ；泳道 7-UNYC8 ；泳道 8-UNYC9 和泳道 9-UNYC10 ；
20 圖7顯示了 SUC3和SUC5基因的電泳圖譜。泳道1_11Λ梯帶泳道2_WT(S^8c)； 泳道 3-UNYC1 ；泳道 4-UNYC2 ；泳道 5-NCYC1116 ；泳道 6-ffT (S288c)；泳道 7-UNYC1 ；泳道 8-UNYC2 ；泳道 9-NCYC1116 ； 圖8顯示了 FLOl基因的電泳圖譜。右側(cè)和左側(cè)泳道-11Λ梯帶泳道1_WT (S^8c)； 泳道 2-UNYC1 ；泳道 3-UNYC2 ；泳道 4-NCYC1116 ； 圖9顯示了本文中所提及的所有基因的GenBank(基因序列數(shù)據(jù)庫)登錄號(hào)。
圖10顯示了所述COB基因的電泳圖譜，以鑒定菌株UNYC2的小菌落突變體的基因組穩(wěn)定性。從右到左-泳道1-11Λ梯帶；泳道2-WT膠88c)；泳道3-UNYC1親本菌株；泳道 4-UNYC1小菌落突變菌株；泳道5-UNYC2親本菌株；泳道6-UNYC2小菌落突變菌株； 圖11詳細(xì)說明了一些位于次端粒的基因及其染色體位置。
圖12A顯示了用于標(biāo)準(zhǔn)PCR中的引物位置的示意圖，使用了引物IOFl和IORl來區(qū)分麥酒和儲(chǔ)藏啤酒菌株。(注意在釀酒酵母(Sc)中，IORl引物并不存在)；圖12B-通過用COXl基因的標(biāo)準(zhǔn)PCR來區(qū)分麥酒和儲(chǔ)藏啤酒酵母菌株的電泳圖譜。泳道1 大小的標(biāo)記；泳道 2 ；S288C(WT)；泳道 3 =NCYCl 119 ；泳道 4 =NCYC 2593 ；泳道 5 :W34 UON ；泳道 6 LBYl ；泳道 7 :LBY2 ；泳道 8 =NCYCl 116 和泳道 9 =LBYll)。引物對(duì) IOFl 和 IORl 是為 W34U0N 序列的線粒體基因組序列而設(shè)計(jì)的； 圖13A顯示了用于標(biāo)準(zhǔn)PCR中的引物位置的示意圖，使用了引物COXlFl和10R5 來區(qū)分麥酒和儲(chǔ)藏啤酒菌株；13B-通過用COXl基因的標(biāo)準(zhǔn)PCR來區(qū)分麥酒和儲(chǔ)藏啤酒酵母菌株的電泳圖譜。泳道1和10 =Ikb大小的標(biāo)記；泳道2 ；S288C(WT)；泳道3 :W34 UON ； 泳道4 =LBYll ；泳道5 =LBYl ；泳道6 :LBY2 ；泳道7 :NCYC2593 ；泳道8 :ABY6和泳道9 陰性對(duì)照)。泳道2、7和8對(duì)應(yīng)麥酒型菌株，泳道3-6對(duì)應(yīng)儲(chǔ)藏啤酒型菌株。引物對(duì)COXlFl和 10R5是為W34U0N序列的線粒體基因組序列而設(shè)計(jì)的； 圖14A顯示了用于實(shí)時(shí)PCR中的引物位置的示意圖，使用了 COB基因來區(qū)分麥酒和儲(chǔ)藏啤酒菌株；圖14B顯示了所述COB基因的擴(kuò)增曲線；以及圖14C顯示了圖14B的實(shí)時(shí) PCR產(chǎn)物的解離曲線； 圖15A 顯示了釀酒酵母(Sc) (SEQ ID NO 50)和巴斯德酵母(Sp) (SEQ ID NO 51) 的COXl開放讀碼框(open reading frame)的序列比對(duì)。外顯子邊際以黑底線標(biāo)注。序列差異以星號(hào)標(biāo)明；圖15B顯示了釀酒酵母(Sc) (SEQ ID NO 52)和巴斯德酵母(Sp) (SEQ ID NO 53)的COXl開放讀碼框的轉(zhuǎn)譯的序列比對(duì)。外顯子邊際以黑底線標(biāo)注。序列差異以星號(hào)標(biāo)明； 圖16A 顯示了釀酒酵母(Sc) (SEQ ID NO 54)和巴斯德酵母(Sp) (SEQ ID NO 55) 的COB開放讀碼框的序列比對(duì)。外顯子邊際以黑底線標(biāo)注。序列差異以星號(hào)標(biāo)明；圖16B 顯示了釀酒酵母(Sc) (SEQ ID NO 56)和巴斯德酵母(Sp) (SEQ ID NO 57)的COB開放讀碼框的轉(zhuǎn)譯的序列比對(duì)。外顯子邊際以黑底線標(biāo)注。序列差異以星號(hào)標(biāo)明； 圖17顯示了 W34PUB、W34U0N禾口 LBYlIUON的區(qū)域A、B和C的序列比對(duì)，以鑒定序列差異從而研制區(qū)分菌株的引物。W34PUB “區(qū)域A” = SEQ ID NO :58、W34PUB “區(qū)域B” =SEQ ID NO :59、W34PUB “區(qū)域 C” = SEQ ID NO 60 ；W34U0N “區(qū)域 A” = SEQ ID NO :61、 W34U0N “區(qū)域 B”= SEQ ID NO :62、W34U0N “區(qū)域 C”= SEQ ID NO 63 ；LBYlIUON “區(qū)域 A” =SEQ ID NO 64,LBYlIUON “區(qū)域 B” = SEQ ID NO :65、LBY11U0N “區(qū)域 C” = SEQ ID NO
2166。序列差異以星號(hào)標(biāo)明。數(shù)字是指W34PUB的序列登錄號(hào)EU852811的數(shù)字。W34PUB和 W34U0N的全線粒體基因組序列是7057m3Ps ； 圖18顯示了 W;34PUB、W34UON和LBY11U0N序列的區(qū)域D和E的序列比對(duì)，以鑒定差異。LBYlIUON “區(qū)域 D”= SEQ ID NO :67、LBY11U0N “區(qū)域 E”= SEQ ID NO 68 ；W34U0N “區(qū)域 D”= SEQ ID NO :69、W34U0N “區(qū)域 Ε”= SEQ ID NO :70 ；W34PUB “區(qū)域 D”= SEQ ID NO 71、W34PUB“區(qū)域E”= SEQ ID NO :72。數(shù)字是指LBYlIUON的線粒體基因組序列。LBY11U0N 的全線粒體基因組序列是70579bps ； 圖19顯示了使用限制酶HaeIII來消化全部DNA之后的線粒體DNA限制圖譜。泳道1和13 =Ikb DNA標(biāo)記；泳道2 LBYlIUON ；泳道3至12從釀酒發(fā)酵提取的LBYlIUON的小菌落。箭頭顯示主導(dǎo)的小菌落的RFLP圖譜； 圖20顯示了來自8株酵母菌株的部分C0X2序列的比對(duì)。1 ；貝酵母AF442211 (SEQ ID N0:73)。2 ；葡萄汁酵母 AY1303^(SEQ ID NO :74)。3 ；釀酒酵母 ef6397^ (SEQ ID NO: 75)。4 貝酵母 ef6397^(SEQ ID NO :76)。5 ；巴斯德酵母 _ef639727 (SEQ ID NO :77)。6; 卡爾斯伯酵母 AY1303^(SEQ ID NO :78)。7 ；巴斯德酵母 AF442212 (SEQ ID NO :79)。8 ；摩納酵母(S. monacensis))AY130325(SEQ ID NO :80)。堿基對(duì)替換以方塊標(biāo)明。C0X2的正向和反向引物以下劃線標(biāo)出。
圖21A顯示了解離曲線；圖21B顯示了使用C0X2和ACTl的引物(表5)的實(shí)時(shí) PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線； 圖22A和22B顯示了使用限制酶HaeIII (圖22A) HinfI (圖22B)消化總DNA之后的線粒體DNA限制圖譜。圖22A-泳道1 =Ikb DNA標(biāo)記；泳道2、3、56、7、8、9、11、12和13為釀酒小菌落。泳道4和10 =LBYlIUON ； 22B-泳道1 =Ikb DNA標(biāo)記；泳道2 =LBYlIUON ；泳道3至8 小菌落的釀酒提取物(brewery isolates).箭頭指示主導(dǎo)的小菌落的圖譜； 圖 23 顯示了 LBYl IUON (SEQ ID NO :81)和 LBYl IUON 部分小菌落序列(SEQ ID NO: 82)的序列比對(duì)以鑒定差異。數(shù)字是指LBYlIUON線粒體基因組序列。
具體實(shí)施例方式例子 下列例子說明了多個(gè)引物組的研制，能按照本發(fā)明使用所述引物組快速而準(zhǔn)確地鑒定用于釀酒的酵母菌株，從而為專有的用于釀酒的酵母提供明確并且重復(fù)性好的區(qū)分。
所顯示的數(shù)據(jù)表明能使用很多基因，包括MELl基因，來區(qū)分麥酒和儲(chǔ)藏啤酒酵母菌株。
所述數(shù)據(jù)還表明能使用mtDNA(線粒體DNA)來區(qū)分儲(chǔ)藏啤酒和麥酒酵母菌株。為針對(duì)線粒體基因COB而設(shè)計(jì)引物，并鑒定出那些能被用來區(qū)分各種不同的用于釀酒的酵母菌株的引物。鑒定出一組寡核苷酸以準(zhǔn)確地區(qū)分麥酒和儲(chǔ)藏啤酒菌株。這是跨越COB基因的保守區(qū)的設(shè)計(jì)。
使用在諾丁漢大學(xué)釀酒酵母培養(yǎng)物集存庫中可得的用于釀酒的酵母菌株來證實(shí)結(jié)果。
為設(shè)計(jì)特異性分子標(biāo)記而鑒定出合適的靶位點(diǎn) 從諾丁漢大學(xué)內(nèi)部培養(yǎng)物集存庫選擇十四種麥酒和儲(chǔ)藏啤酒酵母菌株來研制用
22以區(qū)分各種用于釀酒的酵母菌株的引物t 該項(xiàng)研究使用的菌株 1. UNYCl卡爾斯伯酵母(儲(chǔ)I耗啤酒) 2. UNYC2釀酒酉孝母(儲(chǔ)藏啤酒) 3. UNYC3釀酒酉孝母(巴斯德酉孝母)(儲(chǔ)扉戈啤酒) 4. UNYC4釀酒酉輯(巴斯德酉輯)(儲(chǔ)扉戈啤酒) 5. UNYC5釀酒酉輯(巴斯德酉輯)(儲(chǔ)扉戈啤酒) 6. UNYC6釀酒酉孝母(巴斯德酉輯)(儲(chǔ)扉戈啤酒) 7. NCYCl116卡爾斯伯酵母(儲(chǔ)I耗啤酒) 8. UNYC7釀酒酉孝母(麥酒) 9.UNYC8釀酒酉輯(麥酒) 10.UNYC9釀酒酉輯(麥酒) 11. UNYClO釀酒酉輯(麥酒) 12. NCYC 1119釀酒酉輯(麥酒) 13. NCYC 2593 釀酒酉輯(麥酒) 14. KSl釀酒酉孝母(麥酒) 15.野生型釀酒酵母(S^Sc)(用作對(duì)照物) 作為靶的核基因 分析在表1中顯示的五個(gè)核基因的序列以鑒定跨越該基因組的多態(tài)的區(qū)域。如表 1中所示，為這些區(qū)域設(shè)計(jì)引物。
表1
23
權(quán)利要求
1.測定樣本中的酵母菌株的方法，包括-從樣本中的酵母獲得核酸；-將所述核酸進(jìn)行兩個(gè)或更多靶序列的篩查，其中所述核酸中的靶序列至少其中之一包括酵母線粒體DNA中的某基因的整體或部分，或與酵母線粒體DNA中的某基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)；-從篩查結(jié)果斷定樣本中的酵母菌株。
2.測定樣本中的酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性的方法，包括-從樣本中的酵母獲得核酸；-將所述核酸進(jìn)行兩個(gè)或更多的靶序列的篩查，其中所述核酸中的靶序列至少其中之一包括酵母線粒體DNA中的某基因的整體或部分，或與酵母線粒體DNA中的某基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)，或者位于染色體的次端粒區(qū)的某基因的整體或部分或與位于染色體的次端粒區(qū)的某基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)；-從篩查結(jié)果斷定所述酵母菌株在遺傳方面是否穩(wěn)定。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中使用PCR來擴(kuò)增所述兩個(gè)或更多的靶序列來實(shí)施本發(fā)明的篩查步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中通過探測有否存在著來自PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物來斷定核酸樣本中有否存在著靶序列。
5.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中能在少于M小時(shí)之內(nèi)實(shí)施所述方法。
6.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中在發(fā)酵過程之前、期間或之后取得所述樣本。
7.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中在從釀造過程獲得的樣本上實(shí)施所述方法。
8.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述樣本是液體、漿體或固體。
9.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中線粒體DNA的靶序列包括選自以下組別的基因C0B、C0X1、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VAR1和RPMl的至少部分和/或任何位于這些基因的兩側(cè)或分隔這些基因的非編碼序列，或者其相互之間的任何組合。
10.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中所述靶序列至少其中之一包括至少一個(gè)非線粒體基因的整體或部分，或與至少一個(gè)非線粒體基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述非線粒體基因和/或其側(cè)翼序列是編碼酵母細(xì)胞壁相關(guān)的蛋白和/或與糖類代謝相關(guān)的蛋白的基因。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述DNA靶序列可包括一個(gè)或更多酵母基因的整體或至少部分和/或酵母基因的側(cè)翼區(qū)，所述酵母基因選自下列組別IlR基因、DAN基因、 FLO基因、ECM基因、BUD基因、KEL基因、MNT基因、SED基因、MEL基因、SUC基因、ATF基因、 GST 基因、GAL 基因、MAL1-4、CYC1、CYC2、CYC3、CBP1、CBP2、CBP3、CBP4 和 CBTl。
13.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，如依據(jù)權(quán)利要求2，其中一個(gè)或更多的靶序列包括選自下列組別包括 COB、COXl、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl、RPMl、ECM34、SUCl、 SUC3、SUC4、SUC5、SUC7、MAL1、MAL2、MAL3、MAL4、MEL2、MEL3、MEL4、MEL5、MEL6、MEL7、MEL8、 MEL9和MELlO的基因的至少部分和/或這些基因的任何側(cè)翼區(qū)，或者其相互之間的任何組合。
14.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其中使用一個(gè)或更多的與所述靶序列互補(bǔ)或反向互補(bǔ)的寡核苷酸引物或探針來探測所述靶序列。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中一個(gè)或更多的所述引物或探針包括選自SEQID NOS :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42和43的序列，或其相互之間的任何組合，或者與 SEQ ID NOS :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、38、39、41、42 和 43 的序列的序列一致性為至少 80%、85%、90%、95%、98% 或更高的序列。
16.包括一個(gè)或更多的寡核苷酸的組合物，所述寡核苷酸帶有選自包括SEQID NOS=U 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42、43、46、47、48 和 49 的序列，或者所列序列的序列同源性為至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
17.測定樣本中的酵母菌株的試劑套件，包括針對(duì)酵母核酸中兩個(gè)或更多的靶序列的兩個(gè)或更多的引物或探針，其中所述引物或探針至少其中之一為針對(duì)酵母線粒體DNA中的基因中的靶序列，或針對(duì)酵母線粒體DNA中的基因的側(cè)翼區(qū)。
18.測定樣本中的酵母菌株的穩(wěn)定性的試劑套件，包括針對(duì)酵母核酸中兩個(gè)或更多的靶序列的兩個(gè)或更多的引物或探針，其中所述引物或探針至少其中之一為針對(duì)酵母線粒體 DNA中的基因中的靶序列或染色體次端粒區(qū)中的基因中的靶序列，或針對(duì)酵母線粒體DNA 中的基因的側(cè)翼區(qū)或染色體次端粒區(qū)中的基因的側(cè)翼區(qū)。
19.按照權(quán)利要求17或18的試劑套件，其中所述試劑套件適合與PCR—起使用。
20.按照權(quán)利要求17至19的試劑套件，其進(jìn)一步包括PCR試劑。
21.按照權(quán)利要求17至20中任一權(quán)利要求所述的試劑套件，其包括試劑套件的使用說明，所述說明包括PCR的使用條件。
22.按照權(quán)利要求17至21中任一權(quán)利要求所述的試劑套件，其包括一個(gè)或更多的所預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小的詳細(xì)說明。
23.按照權(quán)利要求17至21中任一權(quán)利要求所述的試劑套件，其包括針對(duì)一個(gè)或更多的下列基因的整體或部分或下列基因的側(cè)翼區(qū)序列的引物或探針，下列基因?yàn)镃OB、COXU C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl和RPMl，或其相互之間的任何組合。
24.按照權(quán)利要求17至23中任一權(quán)利要求所述的試劑套件，其包括一個(gè)或更多的針對(duì)一個(gè)或更多的酵母基因的整體或至少部分和/或其側(cè)翼區(qū)的引物或探針，所述酵母基因選自下列組別包括所述IlR基因、所述DAN基因、所述FLO基因、所述ECM基因、所述BUD基因、所述KEL基因、所述MNT基因、所述SED基因、所述MEL基因、SUC基因、所述ATF基因、 所述 GST 基因、所述 GAL 基因、MAL1-4、CYC1、CYC2、CYC3、CBP1、CBP2、CBP3、CBP4 和 CBTl。
25.按照權(quán)利要求17至22中任一權(quán)利要求所述的試劑套件，其包括一個(gè)或更多的引物或探針，其選自 SEQ ID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42 和 43，或其相互之間的任何組合，或者與 SEQID NOs :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、38、39、41、42 和 43 的序列的序列一致性為至少80%、85%、90%、95%、98%或更高的序列。
26.分析含酵母樣本的方法，包括在所述分析中使用探針或引物；其中如果酵母存在于所述樣本中，則所述探針或引物能夠與所供給的酵母的線粒體DNA雜交。
27.按照權(quán)利要求沈所述的方法，其中如所述樣本中再存在另一酵母，則所述探針或引物就不能與該酵母的線粒體DNA雜交。
28.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其中所供給的酵母是巴斯德酵母或釀酒酵母。
29.按照權(quán)利要求2所述的方法，其中另一酵母是巴斯德酵母或釀酒酵母。
30.按照權(quán)利要求1至15以及沈至四中任一權(quán)利要求所述的方法，或按照權(quán)利要求 16所述的組合物，或按照權(quán)利要求17至25所述的試劑套件，用于測定含酵母樣本是否包含著不合需要的酵母。
31.按照權(quán)利要求1至15以及沈至30中任一權(quán)利要求所述的方法，或按照權(quán)利要求 16所述的組合物，或按照權(quán)利要求17至25所述的試劑套件，其被用來檢查打算用于隨后與酵母有關(guān)的發(fā)酵的樣本的質(zhì)量。
32.按照權(quán)利要求31所述的方法，其包括以下的步驟如質(zhì)量合格，使用所述酵母進(jìn)行發(fā)酵或如質(zhì)量不合格，停止發(fā)酵的步驟。
33.適合用于按照權(quán)利要求1至15以及沈至32中任一權(quán)利要求所述的方法的探針或引物。
34.如權(quán)利要求33所述的探針或引物，其中所述探針或引物優(yōu)先與巴斯德酵母的 mtDNA雜交，或優(yōu)先與釀酒酵母的mtDNA雜交。
35.如權(quán)利要求33或權(quán)利要求34所述的探針或引物，其中所述探針或引物優(yōu)先與任何選自 C0B、C0X1、C0X2、C0X3、ATP8、ATP6、ATP9、VARl 和 RPMl 的基因雜交。
36.如權(quán)利要求33至35中任一權(quán)利要求所述的探針或引物，其中所述探針或引物優(yōu)先與任何選自 SEQ ID NO :37、40、44、45、50、51、54、55、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、 69,70,71和72的序列或其補(bǔ)體雜交。
37.如權(quán)利要求33至35所述的探針或引物，其中所述探針或引物優(yōu)先與SEQID NO 50或SEQ ID NO :54，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID N0:51，或SEQ ID N0:55，或者其補(bǔ)體雜交；或者，其中所述探針或引物優(yōu)先與SEQ ID N0:51或SEQ ID NO :55，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID N0:50或SEQ ID NO :54，或者其補(bǔ)體雜交。38.如權(quán)利要求33至35所述的探針或引物，其中所述探針或引物優(yōu)先與SEQID NOS 58、59或60中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID NOS :61、62、63、64、65或 66中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交，或者其中所述探針或引物優(yōu)先與SEQ ID NOS :61、62、63、64、65或66中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID NOS 58,59或60中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交。
38.如權(quán)利要求33至35所述的探針或引物，其中所述探針或引物優(yōu)先與SEQID NOS 67或68中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID NOS :69、70、71或72中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交，或者，其中所述探針或引物優(yōu)先與SEQ ID N0S:69、70、71或72中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交，并可選地不與SEQ ID NOS :67或68中任何序列，或者其補(bǔ)體雜交。
39.如權(quán)利要求2所述的方法，其進(jìn)一步包括使用實(shí)時(shí)PCR(RT-PCR)來測定所述酵母中的基因的相對(duì)的mtDNA拷貝數(shù)。
40.如權(quán)利要求2所述的方法，其進(jìn)一步包括通過用限制酶消化酵母mtDNA來篩查所述酵母，所述限制酶專門切割鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸(G~C)之間的核酸，以提供 RFLP (限制性片段長度多態(tài)性)圖譜，其中所述酵母核酸的RFLP圖譜與來自非不穩(wěn)定的酵母的已知的、保守的RFLP圖譜比較，并且其中在RFLP圖譜中所觀察到的顯著差異顯示了酵母菌株是不穩(wěn)定的。
41.按照權(quán)利要求1至15J6至32、39和40中任一權(quán)利要求所述的方法，或按照權(quán)利要求16所述的組合物，或按照權(quán)利要求16至25中任一權(quán)利要求所述的試劑套件，或按照權(quán)利要求33至38中任一權(quán)利要求所述的探針或引物，是用于釀酒的。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定樣本中的酵母菌株的方法，包括從酵母中獲得并篩查核酸以得到靶序列，其中所述靶序列包括酵母線粒體DNA中的基因的整體或部分，或與酵母線粒體DNA中的基因有關(guān)的側(cè)翼區(qū)；從篩查結(jié)果斷定所述樣本中的酵母菌株。本發(fā)明還提供了測定樣本中的酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性的方法，其中所述核酸中的一個(gè)靶序列包括酵母線粒體DNA中的某基因的整體或部分，或與酵母線粒體DNA中的某基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)，或者位于染色體的次端粒區(qū)的某基因的整體或部分，或與位于染色體的次端粒區(qū)的某基因相關(guān)的側(cè)翼區(qū)；并且從篩查結(jié)果斷定所述酵母菌株在遺傳方面是否穩(wěn)定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102186988SQ200980139098
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2009年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月26日
發(fā)明者凱瑟琳·安妮·斯馬特, 提西拉·提倫及卡·維馬拉塞納, 莎拉·米歇爾·尼科爾斯 申請(qǐng)人:諾丁漢大學(xué)