專利名稱：視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)基因的鑒別以及與其相關(guān)的產(chǎn)品、方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳學(xué)、分子生物學(xué)，具體涉及遺傳性疾病致病基因的鑒定，特別是視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)基因的鑒定、用于鑒定的產(chǎn)品及其用途；以及所鑒定出的經(jīng)突變的基因、其翻譯產(chǎn)物或包含它們中的一種或多種的宿主細(xì)胞。
背景技術(shù)：
視網(wǎng)膜色素變性(Retinitis pigmentosa,RP)是一類以色素層和中央-周邊視網(wǎng)膜的黃斑部損傷為特征的進(jìn)行性視網(wǎng)膜色素變性。根據(jù)我國(guó)部分地區(qū)調(diào)查資料，群體患病率約為1/3500。該病的典型臨床特征包括早期出現(xiàn)夜盲，隨后出現(xiàn)進(jìn)行性視野縮小與視力下降、視網(wǎng)膜骨細(xì)胞樣色素沉著、視盤呈蠟黃色萎縮和視網(wǎng)膜電圖(Electooretinogram，ERG)桿錐細(xì)胞功能下降等。不同的RP患者因發(fā)病年齡、嚴(yán)重程度、臨床表型、進(jìn)展情況及遺傳模式的不同，而呈現(xiàn)出不同的表型和遺傳異質(zhì)性。許多和RP相關(guān)的不同基因突變導(dǎo)致類似的表型，這使得對(duì)RP患者根據(jù)表型來(lái)判斷基因型帶來(lái)了困難。近20-30%的RP患者同時(shí)伴有非眼部疾病，如聽(tīng)力損失、肥胖及認(rèn)知障礙等。根據(jù)遺傳方式可分為常染色體顯性遺傳(autosomal dominant RP，ADRP)、常染色體隱性遺傳(autosomal recessive RP，ARRP)、X-連鎖遺傳(X-linked RP, XLRP)、雙基因型遺傳(digenentic RP)和線粒體DNA遺傳等。不同遺傳方式的RP在不同人群所占的比例存在一定程度的差異，通常ADRP，ARRP和XLRP在RP病例中所占的比例分別為15_20%，20-25%和10-15%。其余40% -50%的患者無(wú)家族史，稱為散發(fā)性RP，其中大部分屬于常染色體隱性遺傳。迄今報(bào)道的雙基因遺傳RP是由ROMl雜合子突變合并RDS雜合子突變引起的RP病例，比較少見(jiàn)。線粒體突變導(dǎo)致的色素變性常伴有全身的綜合征，迄今為止所發(fā)現(xiàn)的與線粒體突變有關(guān)的基因有MTTS2基因和MTATP6基因。已報(bào)道的RP相關(guān)位點(diǎn)有50多個(gè) 。還有約一半的RP患者，致病原因不明(HartongDT, Berson EL, Dryja TP. Retinitis pigmentosa. Lancet. 2006,368 :1795-1809) 對(duì)于已知的任何一種RP致病基因，其在總的RP患者中所占的比例都比較小。攜帶這些異常的RP患者占到總RP患者人數(shù)的一半左右，還有約一半的RP，致病原因不明。加上之前所述的RP存在高度的遺傳異質(zhì)性，這給鑒定RP的致病突變的工作帶來(lái)了困難。因此，對(duì)已知候選基因進(jìn)行常規(guī)的桑格(sanger)測(cè)序來(lái)尋找致病突變的效率不聞。

發(fā)明內(nèi)容
最近，外顯子組測(cè)序(exome sequencing)被成功地應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)稀有單基因疾病的致病基因，如Freeman-Sheldon綜合癥的MYH3基因，Schinzel-Giedion綜合征的SETBPl基因，以及嚴(yán)重大腦畸形的WDR62突變等(Ng SB, Turner EH, Robertson PD，等人，Targeted capture andmassively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature2009,461 (7261) :272-276 ；Hoischen A, van Bon BW, Gilissen C,等人 De novomutationsof SETBPl cause Schinzel-Giedion syndrome. Nat Genet2010 ；42 (6) :483-5 ;BilguvarK, Ozturk AK, Louvi A,等人，Whole-exome sequencing identifies recessive WDR62mutations insevere brain malformations. Nature 2010,467 (7312) :207-210)。全外顯子測(cè)序技術(shù)已被證明為降低稀有單基因疾病候選基因甚至發(fā)現(xiàn)其致病基因的有力、有效手段，僅通過(guò)對(duì)幾個(gè)很少的個(gè)體(包括患者及正常對(duì)照)的全外顯子進(jìn)行測(cè)序來(lái)篩選與疾病相關(guān)的變異，其成功率大為提升。如研究人員(Ng et al. Exome sequencing identifiesthe causeof a mendelian disorder. Nat Genet (2010) vol. 42 (I) pp. 30-35)選擇了來(lái)自三個(gè)獨(dú)立家系的四名米勒綜合癥患者，對(duì)他們進(jìn)行外顯子測(cè)序，得到的數(shù)據(jù)與公共SNP數(shù)據(jù)庫(kù)和先前測(cè)得的8個(gè)HapMap個(gè)體的外顯子數(shù)據(jù)對(duì)比，過(guò)濾掉普通變異和個(gè)體獨(dú)有的變異后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在這四名患者中都具有以前未知的兩個(gè)突變位點(diǎn)，都位于一個(gè)稱之為DHODH的基因上，此基因編碼一種在嘧啶合成通路中起到關(guān)鍵作用的酶。隨后科學(xué)家又用Sanger測(cè)序在另外三個(gè)米勒綜合癥患病家系中驗(yàn)證，證實(shí)了米勒綜合癥患者均存在這一基因突變。本研究通過(guò)外顯子組測(cè)序技術(shù)對(duì)一伴有先天性白內(nèi)障，角膜厚度變薄和高度近視的RP家系(具體系譜圖見(jiàn)圖1)進(jìn)行了分析，成功鑒定出致病突變。該RP家系來(lái)自于四川省瀘州，共四代。通過(guò)對(duì)所有22位現(xiàn)存家系成員進(jìn)行詳細(xì)的眼科檢查(包括裂隙燈生物顯微鏡檢查，眼底檢查，眼底熒光血管造影(fundus fluorescein angiography, FFA),光學(xué)相干斷層掃描(optical coherencetomography, OCT), B 超,角膜中央厚度(central cornea thickness, CCT)和視網(wǎng)膜電圖(electroretinography, ERG)。確診了其中4位為RP患者,且均為第三代(見(jiàn)圖1)。所有患者均表現(xiàn)為類似的臨床特征(見(jiàn)圖2)，包括周邊視網(wǎng)膜色素沉著，發(fā)病較晚，無(wú)夜盲史，先天性白內(nèi)障，高度近視，角膜變薄。對(duì)患者的常見(jiàn)RP致病基因包括RH0，RDS, RPl，RP2，RPGR(包括0RF15，此基因的 突變熱區(qū))，R0M1，RPE65和TULPl基因的外顯子進(jìn)行測(cè)序后，未發(fā)現(xiàn)致病突變，在患者及正常對(duì)照中發(fā)現(xiàn)以下 SNP RP1 上的 rs444772, rs446227, rs414352 ；RDS 上的 rs7764439,rs390659, rs425876, rs434102 ;RPGR上的rs5918520，但是這些SNP似乎都與疾病沒(méi)有關(guān)
聯(lián)。這暗示著可能存在著更復(fù)雜的分子遺傳學(xué)機(jī)理有待揭示。因此，發(fā)明人進(jìn)一步研究了可能與RP相關(guān)的致病基因以及其中可能存在的相關(guān)突變。突變的CYP4V2基因、其翻譯產(chǎn)物及包含它們中的一種或多種的宿主細(xì)胞一方面，本發(fā)明涉及突變的人CYP4V2基因，其特征在于，含有所述突變的人CYP4V2基因和/或其翻譯產(chǎn)物的受試者患有視網(wǎng)膜色素變性(RP)疾病。所述突變的人CYP4V2基因也包括經(jīng)分離的包含所述基因的核酸分子。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變導(dǎo)致人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子(SEQ IDNO 3)和第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)不翻譯。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變導(dǎo)致經(jīng)突變的人CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物中不含有(I)第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO 3)所編碼的多肽或其部分；以及⑵第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)所編碼的多肽或其部分。
在特別的實(shí)施方式中，所述突變分別位于或包含人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)(見(jiàn)下面的SEQ ID N0:10中以下劃線標(biāo)示的堿基ag)以及第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)(見(jiàn)下面的SEQ ID NO 11中以下劃線標(biāo)示的堿基ag)。人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)cttctttgttgggtatttgatgggtatttagcatgccatgccttgatccacctgttctttttagatgtctgcacccccagcccccactgctctttcaggtcatcttatctacttgctttcatcagGGAAGTCTGACCGTCCCGCTACAGTAGAAGACCTGAAGAAACTTCGGTATCTGGAATGTGTTATTAAGGAGACCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTGCCCGTAGTGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGgtaagtatgctatacctaaagtagaagggagagggaaactttctaatgtctaccttgctccggtctcataatgtattgactacttcttgacagca ggttacagagttctaaaaggcactgaagccgtcatcattccctatgcattgcacagagatccgag(SEQ ID NO 10)人CYP4V2基因的第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)taaatgaaagaaactagcatattttataagaaaatgtgttaactagggtgcatccaagtccaaacagaagcatgtgattatcattcaaatcatacagGTCATCGCTGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGAAGACTGTAGAGGTGATGGCAGGGGCTCTGCCCCCTCCAAAAATAAACGCAGGGCCTTTCTTGACTTGCTTTTAAGTGTGACTGATGACGAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATTCGAGAAGAAGTTGACACCTTCATGTTTGAGgtattgtatattgttaggttcagatatcattaaacaaatttcagttattgttagaatctttagcattattttttaaaacaatcaaattttaaagtagtttaactaaagaagattcattatattttaattagaaatta(SEQ ID NO 11)在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變的人CYP4V2基因包含IVS8-2A和IVS6-8dell7bp的突變，其中所述IVS8-2A突變是指人CYP4V2基因第8號(hào)內(nèi)含子中-2處堿基A的突變；IVS6-8dell7bp突變指位于人CYP4V2基因第6號(hào)內(nèi)含子與第7號(hào)外顯子中的突變，其中從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位開(kāi)始的17個(gè)堿基缺失，所述缺失的17個(gè)堿基為從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位到第7號(hào)外顯子第9位的堿基。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變的人CYP4V2基因包含IVS8-2A — G和IVS6-8dell7bp/insGC突變，其中所述IVS8-2A — G突變是指人CYP4V2基因第8號(hào)內(nèi)含子中-2位處A — G的堿基突變；IVS6-8dell7bp/insGC突變指位于人CYP4V2基因第6號(hào)內(nèi)含子與第7號(hào)外顯子中的突變，其中從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位開(kāi)始的17個(gè)堿基被GC取代，而被取代的17個(gè)堿基為從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位到第7號(hào)外顯子第9位的堿基。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及所述突變的人CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及宿主細(xì)胞，其包含所述經(jīng)突變的人CYP4V2基因和/或其翻譯產(chǎn)物。試劑(診斷試劑)在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種試劑，其能夠鑒別出人CYP4V2基因中是否存在突變，含有具有所述突變的人CYP4V2基因的受試者患有視網(wǎng)膜色素變性疾病。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO 3)和第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)是否被翻譯。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物中是否含有(I)第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO 3)所編碼的多肽或其部分；以及⑵第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)所編碼的多肽或其部分。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)以及第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)處的突變。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因中的IVS8-2A和IVS6-8dell7bp突變，其中所述IVS8-2A突變指人CYP4V2基因第8號(hào)內(nèi)含子中_2位處堿基A的突變；IVS6-8dell7bp突變指位于人CYP4V2基因第6號(hào)內(nèi)含子與第7號(hào)外顯子中的突變，其中從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位開(kāi)始的17個(gè)堿基缺失，而所缺失的17個(gè)堿基為從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位到第7號(hào)外顯子第9位的堿基。特別地，所述試劑用于診斷視網(wǎng)膜 色素變性。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因中的IVS8-2A — G和IVS6-8dell7bp/insGC突變，其中所述IVS8-2A — G突變指人CYP4V2基因第8號(hào)內(nèi)含子中-2位處A — G的堿基突變；IVS6-8dell7bp/insGC突變指位于人CYP4V2基因第6號(hào)內(nèi)含子與第7號(hào)外顯子中的突變，其中從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位開(kāi)始的17個(gè)堿基被GC取代，而被取代的17個(gè)堿基為從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位到第7號(hào)外顯子第9位的堿基。特別地，本發(fā)明的所述試劑用于診斷視網(wǎng)膜色素變性。在具體的實(shí)施方式中，所述試劑可以是用于鑒定核酸中堿基修飾(例如堿基突變、添加、缺失等)的任何試劑，例如用于PCR反應(yīng)的引物、用于核酸雜交的探針等。特別地，所述試劑還可以是為了用于例如下列方法而設(shè)計(jì)的試劑單鏈構(gòu)象異構(gòu)多態(tài)分析技術(shù)(Single-strandconformationpolymorphism, SSCP)、異質(zhì)性雙鏈構(gòu)像多態(tài)性分析(Heteroduplex, HTX)、變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient GetElectrophoresis,DGGE)、錯(cuò)配裂解法(Dismate cleavage, DC)、變性高效液相色譜分析(Denaturing high-performanceIiquidchromatograph,DHPLC)、毛細(xì)管電泳(Capillaryelectrophoresis,CE)、堿基切割序列掃描(Base Exicision SequenceScanning BESS)、等位基因特異性寡核苷酸雜交(AS0H0)、等位基因特異性擴(kuò)增(ASA)、RNA單鏈鉤象多態(tài)性檢測(cè)(PCR-rSSCP)、雙脫氧測(cè)序單鏈片段構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-ddF)、限制性內(nèi)切酶指紋技術(shù)(PCR-REF)、酶錯(cuò)配裂解法(Enzyme mate cleavage, EMC)、錯(cuò)配化學(xué)切割法(Chemicalcleavage mate, CCM)、測(cè)序(Sequencing)、多重PCR測(cè)序、基因芯片測(cè)序、引物延伸(Primer Extension, PEX)等。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述試劑可以進(jìn)一步含有能夠檢測(cè)出其它常見(jiàn)RP致病基因(例如但不限于RH0，RDS, RP1，RP2，RPGR(包括0RF15，此基因的突變熱區(qū))，ROMl，RPE65和TULPl基因等)中的突變的試劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述試劑可以包含PCR引物，將所述引物用于PCR擴(kuò)增后所得的PCR產(chǎn)物(即PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物)指示樣品中是否存在突變的人CYP4V2基因，含有具有所述突變的人CYP4V2基因的受試者患有視網(wǎng)膜色素變性疾病。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示樣品中是否存在導(dǎo)致人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO 3)和第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)不被翻譯的突變。在具體的實(shí)施方式中，所述PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示樣品中人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)以及第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)是否存在突變。在具體的實(shí)施方式中，所述PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示樣品中是否存在人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A和IVS6-8dell7bp突變。在具體的實(shí)施方式中，所述PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示樣品中是否存在所述IVS8-2A — G 和 IVS6-8dell7bp/insGC 突變。本發(fā)明的每一個(gè)所述PCR引物均為多核苷酸，其含有至少5個(gè)堿基，例如5-10、5-15、5-20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50 個(gè)或者更多個(gè)堿基。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，每一個(gè)所述PCR引物均與人CYP4V2基因序列中至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸在嚴(yán)格條件下雜交。 在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，每一個(gè)所述PCR引物均與人CYP4V2基因序列中至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸有至少60%的序列同一性，例如65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述試劑包含至少兩對(duì)PCR引物，其中第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在導(dǎo)致人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子(SEQ IDNO 3)不被翻譯的突變；而其中第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在導(dǎo)致人CYP4V2基因的第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)不被翻譯的突變。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)處是否存在突變；而所述第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中人CYP4V2基因的第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)是否存在突變。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A突變；而第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在人CYP4V2基因中的所述IVS6-8dell7bp突變。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在所述IVS8-2A — G突變；而所述第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在所述IVS6-8dell7bp/insGC 突變。在具體的實(shí)施方式中，所述第一對(duì)引物與第二對(duì)引物不相混合。特別地，在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述第一對(duì)引物中的每一個(gè)引物均與SEQ IDNO 10所示序列中的至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸在嚴(yán)格條件下雜交；并且所述第二對(duì)引物中的每一個(gè)引物均與SEQ IDNO 11所示序列中的至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸在嚴(yán)格條件下雜交。在又一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述第一對(duì)引物中的每一個(gè)引物均與SEQID NO 10所示序列中的至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸有至少60%的序列同一性，例如65%、70%,75%,80%,85%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,100%的序列同一性；并且所述第二對(duì)引物中的每一個(gè)引物均與SEQ ID NO :11所示序列中的至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸有至少60%的序列同一性，例如65%、70%、75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100% 的序列同一性。
在又一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述第一對(duì)引物的序列分別如SEQ IDNO :6和SEQ IDN0:7所示。在另外的實(shí)施方式中，所述第二對(duì)引物的序列分別如SEQ ID NO :8和SEQ IDNO 9所示。試劑盒在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包含本發(fā)明所述的試劑。在具體的實(shí)施方式中，所述試劑盒還可以包含用于特定反應(yīng)的緩沖液、洗滌液和/或酶(例如DNA聚合酶)。特別地，所述試劑盒用于診斷視網(wǎng)膜色素變性。MS在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及所述突變的人CYP4V2基因、其翻譯產(chǎn)物、包含所述突變的人CYP4V2基因或其翻譯產(chǎn)物的宿主細(xì)胞、本發(fā)明的試劑或試劑盒用于診斷視網(wǎng)膜色
素變性的用途。在又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及所述試劑或試劑盒用于制備診斷工具(例如診斷劑、診斷試劑盒、診斷設(shè)備等)的用途，所述診斷工具用于診斷視網(wǎng)膜色素變性。此外，本發(fā)明的突變的人CYP4V2基因、其翻譯產(chǎn)物、包含所述突變的人CYP4V2基因或其翻譯產(chǎn)物的宿主細(xì)胞還可被用于構(gòu)建特定的疾病模型(例如RP疾病模型)，所述疾病模型可以通過(guò)制造攜帶所述基因、翻譯產(chǎn)物或宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因小鼠)等而實(shí)現(xiàn)。因而，在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的突變的人CYP4V2基因、其翻譯產(chǎn)物、包含所述突變的人CYP4V2基因或其翻譯產(chǎn)物的宿主細(xì)胞的用途，其用于產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素變性動(dòng)物模型，或用作藥物靶點(diǎn)，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素變性動(dòng)物模型，或用作藥物靶點(diǎn)。診斷方法在另外的方面，本發(fā)明涉及診斷受試者是否患有視網(wǎng)膜色素變性或處于患有視網(wǎng)膜色素變性的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，所述方法包括下列步驟從受試者中采取樣品，檢測(cè)所述樣品中是否存在本發(fā)明所述的人CYP4V2基因中的突變(例如上文中所列的突變)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述方法包括下列步驟I)從受試者中采取DNA樣品(其可來(lái)自于例如組織、血液如外周血、體液等)；2)從所述樣品中提取基因組DNA并任選地通過(guò)例如凝膠電泳對(duì)所提取的DNA進(jìn)行鑒定;3)將本發(fā)明的所述試劑與所述DNA樣品相混合；4)進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)并根據(jù)反應(yīng)的結(jié)果判斷所述樣品中是否含有本發(fā)明所述的人CYP4V2基因中的突變。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述方法包括下列步驟I)從受試者中采取DNA樣品(其可來(lái)自于例如組織、血液如外周血、體液等)；2)從所述樣品中提取基因組DNA并任選地通過(guò)例如凝膠電泳對(duì)所提取的DNA進(jìn)行鑒定；3)針對(duì)人CYP4V2基因的序列設(shè)計(jì)分別用于鑒定所述人CYP4V2基因中的突變的引物；
4)將所述引物加入樣品中，并任選地加入適當(dāng)?shù)拿?例如，DNA聚合酶)和/或緩沖液；并在PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)；5)對(duì)由步驟5)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序；6)將測(cè)序結(jié)果與正常人CYP4V2基因的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，判斷是否存在所述突變。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述突變是導(dǎo)致人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO ·3)和第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)不翻譯的突變。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變是導(dǎo)致經(jīng)突變的人CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物中不含有(I)第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO 3)所編碼的多肽或其部分；以及⑵第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)所編碼的多肽或其部分的突變。在特別的實(shí)施方式中，所述突變分別位于或包含人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)以及第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變?yōu)槿薈YP4V2基因的突變IVS8-2A和IVS6-8dell7bp。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變?yōu)槿薈YP4V2基因的突變IVS8-2A — G和IVS6-8dell7bp/insGC0在具體的實(shí)施方式中，每一個(gè)所述PCR引物均為多核苷酸，其含有至少5個(gè)堿基，例如 5-10、5-15、5-20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50 個(gè)或者更多個(gè)堿基。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，每一個(gè)所述PCR引物均與人CYP4V2基因序列中至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸在嚴(yán)格條件下雜交。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，每一個(gè)所述PCR引物均與人CYP4V2基因序列中至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸有至少60%的序列同一性，例如65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述PCR引物的序列分別與SEQ ID N0:10或SEQ IDNO 11所示序列中的至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸有至少60%的序列同一性，例如 65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性。在又一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述引物的序列分別如SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8 和 SEQ ID NO 9 所示。治療劑本發(fā)明還涉及一種治療劑，其用于在有需要的受試者中治療視網(wǎng)膜色素變性，所述治療劑包含選自下列的試劑I)能夠糾正患者中CYP4V2基因中的突變而使其回復(fù)為野生型的試劑；2)使得患者中所述經(jīng)突變的CYP4V2基因不能被轉(zhuǎn)錄或不能被翻譯的試劑；3)使得患者中所述經(jīng)突變的CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物失去活性的試劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變是導(dǎo)致人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子(SEQID NO 3)和第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)不翻譯的突變。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變是導(dǎo)致經(jīng)突變的人CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物中不含有(I)第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO 3)所編碼的多肽或其部分；以及⑵第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)所編碼的多肽或其部分的突變。在特別的實(shí)施方式中，所述突變?yōu)榉謩e位于或包含人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)以及第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)的突變。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變包括人CYP4V2基因中IVS8-2A和IVS6-8dell7bp 的突變。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，所述突變包括人CYP4V2基因中的IVS8-2A — G和IVS6-8dell7bp/insGC 突變。
在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述治療劑可以進(jìn)一步含有能夠糾正其它常見(jiàn)RP致病基因(例如但不限于RHO，RDS, RP1，RP2，RPGR(包括0RF15，此基因的突變熱區(qū))，ROMl，RPE65和TULPl基因等)中的突變的試劑。治療方法本發(fā)明還涉及治療視網(wǎng)膜色素變性的方法，所述方法包括如下步驟向有需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的所述治療劑。特別地，本發(fā)明的治療劑施用方式可以是傳統(tǒng)的施用途徑，包括靜脈滴注、肌肉注射、陰道、口服、口腔、舌下、眼球、局部、腸胃外、直腸、葉鞘內(nèi)、內(nèi)胞漿網(wǎng)槽內(nèi)、腹股溝、膀胱內(nèi)、局部(如，粉劑、藥膏或滴劑)，或鼻腔途徑，但不僅局限于此。


圖1RP家系系譜圖。黑色實(shí)心代表患者，空心代表正常人。圓形代表女性，正方形代表男性。箭頭指向代表先證者。斜線代表已去世的成員。圖2.家系的臨床檢查結(jié)果。(A)眼底周邊視網(wǎng)膜色素沉著、視網(wǎng)膜血管變細(xì)，視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮等典型的RP表現(xiàn)。(B)FFA也可見(jiàn)雙眼視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮。(C)OCT顯示視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄。(D)ERG波幅消失。(E)裂隙燈下可見(jiàn)晶體前囊膜下點(diǎn)狀渾濁，如箭頭所示。(F)B超顯示雙眼后部眼環(huán)向后隆起，表現(xiàn)為鞏膜后葡萄腫，為高度近視。圖3CYP4V2基因的突變分析。在III8和其他3位患者上均發(fā)現(xiàn)CYP4V2基因的IVS6-8dell7bp/insGC 和 IVS8-2A — G 處的復(fù)合雜合突變。其中 IVS6_8dell7bp/insGC 突變由母親112所攜帶。IVS8-2A — G突變由IIl的兄弟113所攜帶。這意味著此突變十分可能在IIl上也存在。另一內(nèi)含子上的變異IVS6-7C — T與疾病無(wú)關(guān)聯(lián)。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“突變”是指基因序列或DNA序列中一個(gè)或數(shù)個(gè)(例如幾個(gè))堿基的添加、缺失和/或置換。當(dāng)用于描述基因所編碼的產(chǎn)物或者蛋白質(zhì)時(shí)，“突變”指的是所述蛋白質(zhì)或編碼產(chǎn)物中一個(gè)或數(shù)個(gè)(例如幾個(gè))氨基酸殘基的添加、缺失和/或置換。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“雜合突變”是指突變僅存在于一對(duì)等位基因中的一個(gè)基因中。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“復(fù)合雜合突變”是指是指同一基因的不同位置出現(xiàn)2處或2處以上的雜合突變。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“非同義改變”是指突變引起了改變后的密碼子編碼不同的氨基酸的改變。在本發(fā)明中，“單鏈構(gòu)象異構(gòu)多態(tài)分析技術(shù)(Single-strandconformationpoIymorphism, SSCP) ”是指一種基于DNA構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。相同長(zhǎng)度的單鏈DNA，如果堿基序列不同，形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。單鏈DNA片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對(duì)等分子內(nèi)相互作用力來(lái)維持的，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過(guò)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構(gòu)象上有差異的分子分離開(kāi)。這種方法就被稱作單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-Strand Conformation Polymor-phism, SSCP)分析。在 PCR-SSCP 技術(shù)中，進(jìn)一步提高了檢測(cè)突變方法的簡(jiǎn)便性和靈敏性，其基本過(guò)程是1)PCR擴(kuò)增靶DNA ；2)將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性，而后快速?gòu)?fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；3)將適量的單鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；4)最后通過(guò)放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果。若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA的遷移率與正常對(duì)照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變。另外，SSCP方法可通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈DNA分離，并且還可以進(jìn)一步提純.用這種方法可以 最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA片段。在本發(fā)明中，“引物延伸(Primer Extension,PEX) ”的原理是將引物合成到突變位點(diǎn)之前的一個(gè)堿基，然后與基因組DNA退火，分別于兩管中加入一種同位素或非放射性標(biāo)記的野生型和突變型的互補(bǔ)堿基，使各自的引物得以延伸一個(gè)或幾個(gè)堿基，經(jīng)電泳鑒定該堿基是否已摻入，從而分別判斷樣品是屬于野生型還是突變型的。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“ IVS8-2A — G突變”是指人CYP4V2基因第8號(hào)內(nèi)含子中_2位處A —G的堿基突變。在本發(fā)明中，“IVS6-8dell7bp/insGC突變”是指位于人CYP4V2基因第6號(hào)內(nèi)含子與第7號(hào)外顯子中的突變，其中從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位開(kāi)始的17個(gè)堿基被GC取代，而被取代的17個(gè)堿基為從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位到第7號(hào)外顯子第9位的堿基。在本發(fā)明中，“PCR引物”指用于在PCR反應(yīng)中擴(kuò)增靶標(biāo)核酸的多核苷酸片段，其通常為寡核苷酸，例如含有至少5個(gè)堿基，例如5-10、5-15、5-20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50個(gè)或者更多個(gè)堿基的多核苷酸片段。在本發(fā)明中，“互補(bǔ)核酸”指與所引述的核酸序列完全互補(bǔ)的核酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指本領(lǐng)域所熟悉的參數(shù)。對(duì)核酸，被稱為嚴(yán)格的雜交條件典型的是在低離子強(qiáng)度和恰好低于DNA雜交復(fù)合物熔點(diǎn)(Tm)(典型地，低于雜交物Tm約3°C)的溫度下。更高的嚴(yán)格性限定了探針序列和靶之間更專一的相關(guān)性。核酸雜交中所用的嚴(yán)格條件在本領(lǐng)域中眾所周知，可在匯編這類方法的參考文獻(xiàn)中找到，例如MolecularCloning A Laboratory Manual, J. Sambrook 等編，SecondEdition, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold SpringHarbor, New York,1989, 或 Current Protocols inMolecularBiology, F. M. Ausubel 等編，John Wiley & Sons, Inc.，New York. “嚴(yán)格條件”的實(shí)例是在6xSSC中于65°C下雜交。另一嚴(yán)格條件的實(shí)例是在雜交緩沖液中于65°C下雜交，雜交緩沖液由3. 5xSSC，0. 02% Ficoll,0. 02%聚乙烯吡咯烷酮，0. 02%牛血清白蛋白，2. 5mMNaH2P04[pH7], 0. 5% SDS,2mM EDTA 組成(SSC 是 0. 15M 氯化鈉/0. 15M檸檬酸鈉，pH7 ；SDS是十二烷基硫酸鈉；而EDTA是乙二胺四乙酸)。雜交之后，轉(zhuǎn)上DNA的膜在2xSSC中于室溫下清洗，然后在最高68°C的溫度下于0. lxSSC/0.1xSDS中清洗。在進(jìn)一步的實(shí)施例中，雜交水溶液的使用的替代是雜交甲酰胺溶液的使用。應(yīng)用例如50%甲酰胺溶液和42°C，嚴(yán)格的雜交條件能因此被實(shí)現(xiàn)。有其它能被應(yīng)用的條件、試劑等，并將導(dǎo)致類似的嚴(yán)格程度。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑可以進(jìn)一步以標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。所述標(biāo)記物可以是放射性同位素如1251、酶、酶的底物、發(fā)光物質(zhì)如異魯米諾和吖啶酯、熒光物質(zhì)如熒光素和羅丹明、生物素和有色物質(zhì)如乳膠顆粒和膠體金等。標(biāo)記用的酶可以是過(guò)氧化物酶(如辣根過(guò)氧化物酶HRP)、堿性磷酸酶、3半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。對(duì)于這些反應(yīng)中合適的底物有2，2'-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、魯米諾-過(guò)氧化氫、鄰苯二胺-過(guò)氧化氫(針對(duì)過(guò)氧化物酶)、對(duì)硝基苯磷酸鹽、4-甲基磷酸傘型酮、3-(2'-螺旋金剛烷)-4_甲氧基-4-(3"-磷酰基)苯基-1，2-二乙氧基烷(針對(duì)堿性磷酸酶)、對(duì)硝基苯-P-D-半乳糖和甲基傘形酮-P-D-半乳糖(針對(duì)P半乳糖苷酶)。其它的標(biāo)記包括量子點(diǎn)標(biāo)記、生色團(tuán)標(biāo)記、酶標(biāo)記、親和配體標(biāo)記、電磁自旋標(biāo)記、重原子標(biāo)記、標(biāo)記有納米微粒光散射標(biāo)記或其它納米微粒的探針、異硫氰酸熒光素(FITC)、TRITC、羅丹明、四甲基羅丹明、R-藻紅蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy_7、得克薩斯紅、Phar-Red、異藻紅蛋白(APC)、以及酶標(biāo)記如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶或乙·酰膽堿酯酶和半抗原偶聯(lián)物如洋地黃毒苷或二硝基苯酚、或能夠形成配合物的結(jié)合配對(duì)如鏈霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗體配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG ;突光基團(tuán)如傘形三糖(umbelIiferone)、突光素、異硫氰酸突光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、綠熒光蛋白、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、二苯乙烯、熒光黃、Cascade藍(lán)、二氯三嗪基熒光素、丹磺酰氯、藻紅蛋白、熒光鑭系絡(luò)合物如包括銪和鋱、Cy3、Cy5、分子信標(biāo)(molecular beacons)和其突光衍生物、發(fā)光材料如魯米諾；光散射或細(xì)胞質(zhì)基因組共振材料如金或銀顆?；蛄孔影?quantum dot):或放射性材料如14C、1231、1241、m1、Tc99m、35S或3H ;或球珠(spherical shell)，以及標(biāo)記有本領(lǐng)域已知的任何其它信號(hào)產(chǎn)生標(biāo)記物的探針。例如，可檢測(cè)的分子包括但不限于熒光基團(tuán)以及前面所述其它已知的，如在 Joseph R. Lakowicz (Editor)所編的 Principles of Fluorescence Spectroscopy,PlenumPub Corp,第二版(July 1999)和 Richard P. Hoagland 的第六版的 MolecularProbes Handbook所描述的。在某些實(shí)施方式中，標(biāo)記物包括半導(dǎo)體納米微晶如量子斑(即Qdots),參見(jiàn) U. S. P 6,207,392。Qdots 可從 Quantum Dot Corporation 購(gòu)得。用于本發(fā)明的半導(dǎo)體納米微晶包括Group I1-V半導(dǎo)體的納米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS, SrSe, SrTe, BaS、BaSe, BaTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe 和其混合物以及Group II1-V半導(dǎo)體的納米微晶如GaAs、InGaAs、InP、InAs和其混合物。GroupIV半導(dǎo)體如鍺或硅的使用，或有機(jī)半導(dǎo)體的使用，在某些條件下可能是方便可行的。半導(dǎo)體納米微晶也可以包括合金，其含有兩種或多種選自于Group II1-V化合物、Group I1-VI化合物、Group IV元素和其組合物的半導(dǎo)體。在本發(fā)明中，核酸的堿基序列的同一性可應(yīng)用多種由NCBI (Bethesda, Maryland)開(kāi)發(fā)的公開(kāi)可得的軟件工具計(jì)算得到。示例的工具包括Altschul SF等的啟發(fā)式算法(JMol Biol, 1990，215 :403-410)，也稱為 BLAST。Pairwise 和 Clustalff 比對(duì)(BL0SUM30 矩陣設(shè)置)以及Kyte-Doolittle水療分析可應(yīng)用公開(kāi)(EMBL, Heidelberg, Germany)和商業(yè)(例如來(lái)自 Oxford MolecularGroup/Genetics Computer Group, Madison, WI 的 MacVector序列分析軟件)的類型而獲得。前述核酸的Watson-Crick互補(bǔ)鏈也被本發(fā)明所包括。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“診斷工具”指任何可能用于診斷的試劑、試劑盒、包含所述試劑或試劑盒的其它裝置、設(shè)備或機(jī)器等。本發(fā)明的試劑、試劑盒或診斷工具中可進(jìn)一步包含不會(huì)影響活性物質(zhì)效力的其它緩沖液、載體或媒介等，例如一種或多種水、生理鹽水、磷酸緩沖液、左旋糖、甘油、乙醇和其他類似物，以及上述物質(zhì)的組合。所述其它緩沖液、載體或媒介等可進(jìn)一步包括能提高所述試劑(例如PCR引物)的保存期限或效用的微量輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液等。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“糾正”基因中的突變是指，將突變基因中經(jīng)突變的堿基回復(fù)至野生型基因中相應(yīng)位置的堿基，或者使得經(jīng)“糾正”的基因所編碼的產(chǎn)物與相應(yīng)野生型基因所編碼的產(chǎn)物具有相同的氨基酸序列、功能和/或活性。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述能夠糾正患者中的基因突變的試劑包括但不限于，例如突變基因的特異性RNAi試劑、突變蛋白的特異性抗體、特異性的核酸分子或在DNA修復(fù)中起作用的酶，及其組合。 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“失去活性”是指核酸分子或蛋白質(zhì)分子不再能夠參與細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)，不再能夠影響包含其的宿主細(xì)胞的功能和/或在體外的各種測(cè)試中不再顯示出區(qū)別于空白對(duì)照的任何顯著性差異。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指其中可導(dǎo)入核酸或蛋白質(zhì)的任何細(xì)胞，其包括但不限于，例如大腸桿菌或枯草菌細(xì)胞等原核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或曲霉菌等真菌細(xì)胞，如S2果蠅細(xì)胞或Sf9等昆蟲細(xì)胞，或者如纖維原細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，NSO細(xì)胞，HeLa細(xì)胞，BHK細(xì)胞，HEK293細(xì)胞或人細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞。下面結(jié)合具體實(shí)施例與附圖，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明加以闡釋。應(yīng)理解，這些實(shí)施例并不應(yīng)在任何方面構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。除非另有說(shuō)明，本申請(qǐng)中所用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞都表達(dá)的是在本發(fā)明涉及領(lǐng)域里的普通技術(shù)人員所理解的通常含義。這里所用的命名和在遺傳分析、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)操作中的步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)命名和步驟。實(shí)施例實(shí)施例1鑒別RP家系的患者中與疾病相關(guān)的突變發(fā)明人用Agilent SureSelect Human All Exon 試劑盒(Agilent 公司)結(jié)合Solexa高通量測(cè)序技術(shù)(即使用Illumina公司的測(cè)序儀Hiseq2000依照生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明進(jìn)行操作，其介紹或產(chǎn)品手冊(cè)可見(jiàn)http://www.1llumina. com/)對(duì)該家系中的三名患者(1112，1114，III6)和一名家系內(nèi)正常人(112)的外顯子組序列進(jìn)行了測(cè)序。所使用的方法和步驟均是根據(jù)生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明書和本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行的，簡(jiǎn)要地實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下I)將從所述患者或正常人的血液樣品中提取的基因組DNA隨機(jī)打斷成150_200bp左右的片段，隨后在片段兩端分別連接上接頭而制備雜交文庫(kù)，此實(shí)驗(yàn)是根據(jù)http://WWW.1llumina. com/support/documentation, ilmn 處提供的 Illumina/Solexa 標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù)說(shuō)明書進(jìn)行的；2)使按照Illumina/Solexa標(biāo)準(zhǔn)建庫(kù)說(shuō)明書建好的文庫(kù)與SureSelect Biotinylated RNA Library (BAITS)(使用 SureSelect HumanAll Exon Kit)進(jìn)行雜交富集(實(shí)驗(yàn)方法參照 http://www. genomics, agilent. com 提供的 G3360_90020_SureSelect_Indexing_l. 0 (I). pdf 實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行)，再經(jīng)過(guò) LM-PCR(Iigationmediated PCR)的線性擴(kuò)增后在測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，所使用的測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2000，讀取長(zhǎng)度為90bp，每個(gè)樣本的平均測(cè)序深度最少為30。3)測(cè)序后獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina basecalling Software1. 7進(jìn)行處理,經(jīng)過(guò)過(guò)濾去污染、使用 SOAPaligner 2. 20 (Li R, Li Y, Kristiansen K, et al, SOAP short oligonucleotide alignmentprogram. Bioinformatics 2008,24(5) :713-714 ;LiR, Yu C, Li Y, eaal, S0AP2 an improved ultrafast tool for short read alignment.Bioinformatics 2009,25(15) :1966-1967.)比對(duì)參考基因組(hgl8/build36. 3)，獲得比對(duì)到基因組上的獨(dú)特定位讀出結(jié)果(Uniquemapped reads)。祀?yún)^(qū)域的基因型由SOAPsnp (Li R, Li Y, Fang X, YangH, et al, SNP detection for massively parallelwhole-genomeresequencing. Genome Res 2009,19 (6) :1124-1132.)確定。結(jié)果，在三位患者中均發(fā)現(xiàn)有32216個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和2477處的插入/缺失。隨后對(duì)結(jié)果通過(guò) dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www. ncb1.nlm.nih. gov/projects/SNP/snp_ summary, cgi),千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(www. 1000genomes.org/), HapMap8 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hapmap. ncb1. nlm. nih. gov/)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)的過(guò)濾,去掉所有已知的變異。在正常對(duì)照112上出現(xiàn)的相同變異也進(jìn)行過(guò)濾處理。最終得到了 26個(gè)只存在于三位患者身上，而不存在于正常對(duì)照中的雜合變異。實(shí)施例2 :視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)復(fù)合雜合突變的進(jìn)一步鑒定如上文的描述可知，本發(fā)明中所檢測(cè)的RP家系一共有4位患者，均為第三代，第二、四代無(wú)患者。這意味著遺傳方式應(yīng)為隱性遺傳，即只有出現(xiàn)純合突變或復(fù)合雜合突變(同一基因不同位置出現(xiàn)2處雜合突變)時(shí)才會(huì)發(fā)病。然而，在實(shí)施例1中過(guò)濾后得到的26個(gè)變異均為雜合突變，這使得發(fā)明人開(kāi)始尋找復(fù)合雜合突變的可能性。在實(shí)施例1中所鑒別的26個(gè)雜合突變所對(duì)應(yīng)的基因中，CYP4V2據(jù)報(bào)道與結(jié)晶樣視網(wǎng)膜色素變性(Bietti crystalline corneoretinaldystrophy, BCD)有關(guān)(Li A, JiaoX, Munier FL, Schorderet DF, etal. Bietti crystalline corneoretinal dystrophy iscaused bymutations in the novel gene CYP4V2. Am J Hum Genet. 2004，74 :817-826.)。CYP4V2 基因(cytochrome P450, family 4, subfamily V, polypeptide 2) (0MIM 608614)位于4q35.1，包含11個(gè)外顯子，編碼525個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，主要功能結(jié)構(gòu)域與CYP450家族4的蛋白質(zhì)同源。Li等人分析了 25個(gè)B⑶家系的CYP4V2基因，在23個(gè)家系發(fā)現(xiàn)突變。在BCD患者中發(fā)現(xiàn)的所有CYP4V2基因突變均以隱性方式存在突變。而據(jù)上文的分析可知，本發(fā)明鑒定的突變很可能是復(fù)合雜合突變，即不同于關(guān)于BCD所鑒定的隱性突變。有文獻(xiàn)報(bào)道(ShanM, Dong B, Zhao X,等人 Novel mutations in theCYP4V2gene associated with Bietti crystalline corneoretinaldystrophy. Mol Vis. 2005,11 :738-743 ；Lin J, Nishiguchi KM, Nakamura M, et al.) (Recessive mutationsin the CYP4V2 gene inEast Asian and Middle Eastern patients with BietticrystalIinecorneoretinal dystrophy.J Med Genet.2005,42 e38.), CYP4V2 的IVS8-2A —G突變會(huì)引起B(yǎng)⑶。經(jīng)比對(duì)，該突變位于CYP4V2基因第8號(hào)內(nèi)含子(SEQ ID NO:1)剪接位點(diǎn)的受體位點(diǎn)(Acc印tor site)，所得到的突變后的相應(yīng)序列如SEQ ID NO :2所示。比較突變后的序列(SEQID NO 2)與原序列(SEQ ID NO 1)可見(jiàn)，人CYP4V2基因第8號(hào)內(nèi)含子中-2位的堿基由A突變?yōu)榱?G(A — G)。通過(guò)Berkeley Drosophila的剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具和NetGene2剪接位點(diǎn)預(yù)測(cè)工具對(duì)這個(gè)剪接位點(diǎn)突變進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果均顯示，突變?cè)斐稍摷艚游稽c(diǎn)消失，以致第九外顯子(SEQID N03)不翻譯。為了驗(yàn)證本發(fā)明中使用的RP家系是否符合復(fù)合雜合突變模式，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)重新進(jìn)行了過(guò)濾，尋找患者在同一基因上有2個(gè)變異位點(diǎn)，而對(duì)照只有其中一個(gè)變異位點(diǎn)的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)非同義改變，分別是c. 775C — A (CYP4V2基因編碼區(qū)第775位C — A的突變)和IVS6-8dell7bp/insGC (此突變位于CYP4V2基因第6內(nèi)含子中，其中從第_8位開(kāi)始的17個(gè)堿基被GC取代，被替代的17個(gè)堿基為從第6號(hào)內(nèi)含子區(qū)-8位到第7號(hào)外顯子第9位)。突變 c. 775C — A據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Lin J, Nishiguchi KM, Nakamura M, Dryja TP, Berson EL,等人(2005)Recessive mutations inthe CYP4V2 gene in East Asian and Middle Easternpatients withBietti crystalline corneoretinal dystrophy. J Med Genet 42 e38.)無(wú)致病性，而突變IVS6-8dell7bp/insGC是一個(gè)17個(gè)堿基的缺失(即由兩個(gè)插入的堿基GC 取代該17個(gè)堿基)，缺失的這17個(gè)堿基中包括7號(hào)外顯子的剪接受體位點(diǎn)，導(dǎo)致7號(hào)外顯子不翻譯。關(guān)于IVS6-8dell7bp/insGC，突變前的序列如SEQ ID NO :4所示，突變后的序列如 SEQ ID NO 5 所示。在下面的序列中進(jìn)一步標(biāo)示了所述突變，其中用下劃線標(biāo)記的部分為突變位點(diǎn)，小寫字母為內(nèi)含子序列，大寫字母為外顯子序列。 IVS8-2A — G 所在序列cttctttgttgggtatttgatgggtatttagcatgccatgccttgatccacctgttctttttagatgtctgcacccccagcccccactgctctttcaggtcatcttatctacttgctttcatcagGGAAGTCTGACCGTCCCGCTACAGTAGAAGACCTGAAGAAACTTCGGTATCTGGAATGTGTTATTAAGGAGACCCTTCGCCTTTTTCCTTCTGTTCCTTTATTTGCCCGTAGTGTTAGTGAAGATTGTGAAGTGGgtaagtatgctatacctaaagtagaagggagagggaaactttctaatgtctaccttgctccggtctcataatgtattgactacttcttgacagcaggttacagagttctaaaaggcactgaagccgtcatcattccctatgcattgcacagagatccgag(SEQ ID NO 10)IVS6-8de 117bp/insGC 所在序列taaatgaaagaaactagcatattttataagaaaatgtgttaactagggtgcatccaagtccaaacagaaRcatRtRattatcattcaaatcatacaRGTCATCGCTGAACGGGCCAATGAAATGAACGCCAATGAAGACTGTAGAGGTGATGGCAGGGGCTCTGCCCCCTCCAAAAATAAACGCAGGGCCTTTCTTGACTTGCTTTTAAGTGTGACTGATGACGAAGGGAACAGGCTAAGTCATGAAGATATTCGAGAAGAAGTTGACACCTTCATGTTTGAGgtattgtatattgttaggttcagatatcattaaacaaatttcagttattgttagaatctttagcattattttttaaaacaatcaaattttaaagtagtttaactaaagaagattcattatattttaattagaaatta(SEQ ID NO 11)實(shí)施例3突變IVS8-2A — G與IVS6_8dell7bp/insGC可用于鑒別RP的患病者
為了進(jìn)一步驗(yàn)證所鑒別的突變能夠用于鑒定RP疾病的發(fā)生，發(fā)明人進(jìn)一步分別對(duì)4名家系內(nèi)患者、11名家系內(nèi)正常人和7名家系外正常人的基因進(jìn)行了檢測(cè)，通過(guò)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，測(cè)序的方法獲得CYP4V2有關(guān)序列，根據(jù)序列測(cè)定的結(jié)果是屬于突變型還是野生型，來(lái)驗(yàn)證所述CYP4V2突變與視網(wǎng)膜色素變性的相關(guān)性，具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下3.1樣品制各。分別采取了 4名家系內(nèi)患者、11名家系內(nèi)正常人和7名家系外正常人外周靜脈血,從所述受試者中提取外周血2ml，根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明用Qiagen血DNA抽提試劑盒(Qiamp Blood DNA mini Kit, Qiagen,Hilden,Germany)提取基因組 DNA。通過(guò) 1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提取的DNA進(jìn)行鑒定，條帶清晰單一無(wú)雜帶，含量均足以進(jìn)行PCR反應(yīng)。3. 2通過(guò)桑格法測(cè)序驗(yàn)證。按照3.1中所述方法提取基因組DNA，通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量DNA的含量，并稀釋至 20ng/u L ；2)弓丨物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)a)引物序列根據(jù)突變IVS8-2A — G所在序列設(shè)計(jì)如下的引物正向引物5'CCACTGCTCTTTCAGGTCATC 3' (SEQ ID NO 6)反向引物5'GGTCAAACCAATTCAGATGGA 3' (SEQ ID NO :7);根據(jù)IVS6_8dell7bp/insGC所在序列設(shè)計(jì)如下的引物正向引物5'AACTAGGGTGCATCCAAGTC 3' (SEQ ID NO 8)反向引物5'CAAATGTGTCTACTGCTGTGC 3' (SEQ ID NO 9)；b)反應(yīng)體系IOii LLA Taq 酶(5U/ U L)0.1 U L2XGC Buffer I (加入了 Mg2+)5u L2mM dNTP0. 4 u L正向引物(100ng/iiL)0. 2u L反向引物(100ng/iiL)0. 2 U LDNA 模板I u LdH20加至 10 u Lc)反應(yīng)條件94 0C 5 分鐘
940C 30 秒 I
63°C 30秒 [35個(gè)循環(huán)
720C 45 秒 -72 0C 5 分鐘4 0C 保持3)將步驟2中獲得的獲自4名家系內(nèi)患者、11名家系內(nèi)正常人和7名家系外正常人PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行DNA測(cè)序。
結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示4名家系內(nèi)患者同時(shí)共有IVS8-2A —G與IVS6-8dell7bp/insGC這兩種突變。3名家系內(nèi)正常人有突變IVS8-2A —G，5名家系內(nèi)正常人有突變IVS6-8dell7bp/insGC，2名家系內(nèi)正常人沒(méi)有這兩個(gè)突變。家系外正常人均無(wú)這兩個(gè)突變。圖3中顯示了部分的測(cè)序結(jié)果作為示例，其它的測(cè)序圖譜與之類似。因此，上面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的CYP4V2中的隱性復(fù)合雜合突變可以用于視網(wǎng)膜色素變性病變的檢測(cè)。實(shí)施例4檢測(cè)試劑盒A.試劑盒的組成·a)其中含有檢測(cè)突變IVS8-2A — G的引物對(duì)正向引物5'CCACTGCTCTTTCAGGTCATC 3' (SEQ ID NO 6)反向引物5'GGTCAAACCAATTCAGATGGA 3' (SEQ ID NO :7);b)以及檢測(cè)突變IVS6_8dell7bp/insGC的引物對(duì)正向引物5'AACTAGGGTGCATCCAAGTC 3' (SEQ ID NO 8)反向引物5'CAAATGTGTCTACTGCTGTGC 3' (SEQ ID NO 9)；其中a)部分與b)部分中的組分不相混合。B.使用方法I)將試劑盒的組成部分a)與b)中的組分分別與適量的待測(cè)DNA樣品混合，隨后進(jìn)行PCR反應(yīng)；2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，將所得到的序列與CYP4V2正?；蛐蛄斜葘?duì)，確定所得到的序列是否有IVS8-2A — G和IVS6-8dell7bp/insGC復(fù)合突變。
序列表
<110〉深圳華大基因科技有限公司
<120>視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)基因的鑒別以及弓其相關(guān)的產(chǎn)品、方法及用途
<130>IDC110153
<160>12
<170>PatentIn version 3. 5
<210〉I <211>125
<212〉DNA
<213>智人
<400〉 I
cttctttgttgggtatttga tgggtattta gcatgccatg ccttgatcca cctgttcttt 60
ttagatgtctgcacccccag cccccactgc tctttcaggt catcttatct acttgc.tttc 120
atcag125
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<400〉 2
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ttagatgtctgcacccccag cccccactgc tctttcaggt catcttatct acttgc.tttc 120
atcgg125
<210>3
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<212〉DNA<213〉智人
<400> 3
ggaagtctgaccgtcccgct acagtagaag acctgaagaa acttcggtat ctggaatgtg60
ttattaaggagacccttcgc ctttttcctt ctgttccttt atttgcccgt agtgttagtg120
aagattgtgaagtgg135
<210〉4
<211>34
<212>DNA
<213>智人
<400> 4
attatcattc aaatcataca ggtcatcgct gaac34
<210>5
<211>19
<212〉DNA<213>人工序列
<400> 5
allaLcallc aaagcgaac19
<210>6
<211>21
<212〉DNA<213>人工序列
<400> 6
ccacLgclxL LlxaggLcaL c21

權(quán)利要求
1.突變的人CYP4V2基因，其特征在于，含有所述突變的人CYP4V2基因和/或其翻譯產(chǎn)物的受試者患有視網(wǎng)膜色素變性(RP)疾病； 優(yōu)選地，所述突變導(dǎo)致人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO 3)和第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)不翻譯； 優(yōu)選地，所述突變導(dǎo)致經(jīng)突變的人CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物中不含有(I)第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO 3)所編碼的多肽或其部分；以及(2)第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)所編碼的多肽或其部分； 優(yōu)選地，所述突變分別位于或包含人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)以及第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)； 優(yōu)選地，所述突變的人CYP4V2基因包含IVS8-2A和IVS6_8dell7bp的突變，其中所述IVS8-2A突變是指人CYP4V2基因第8號(hào)內(nèi)含子中-2處堿基A的突變；IVS6-8dell7bp突變指位于人CYP4V2基因第6號(hào)內(nèi)含子與第7號(hào)外顯子中的突變，其中從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位開(kāi)始的17個(gè)堿基缺失，所述缺失的17個(gè)堿基為從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位到第7號(hào)外顯子第9位的堿基； 優(yōu)選地,所述突變的人CYP4V2基因包含IVS8-2A — G和IVS6_8dell7bp/insGC突變，其中所述IVS8-2A — G突變是指人CYP4V2基因第8號(hào)內(nèi)含子中-2位處A — G的堿基突變；IVS6-8dell7bp/insGC突變指位于人CYP4V2基因第6號(hào)內(nèi)含子與第7號(hào)外顯子中的突變，其中從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位開(kāi)始的17個(gè)堿基被GC取代，而被取代的17個(gè)堿基為從所述第6號(hào)內(nèi)含子的-8位到第7號(hào)外顯子第9位的堿基。
2.權(quán)利要求1所述的突變的人CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物，或者包含權(quán)利要求1所述的突變的人CYP4V2基因和/或其翻譯產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。
3.試劑，其能夠鑒別出人CYP4V2基因中是否存在突變，含有具有所述突變的人CYP4V2基因的受試者患有視網(wǎng)膜色素變性疾??； 優(yōu)選地，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子(SEQ IDNO 3)和第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)是否被翻譯； 優(yōu)選地，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物中是否含有(I)第9號(hào)外顯子(SEQ ID NO 3)所編碼的多肽或其部分；以及(2)第7號(hào)外顯子(SEQ ID NO 12)所編碼的多肽或其部分； 優(yōu)選地，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)以及第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)處的突變； 優(yōu)選地，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A和IVS6_8dell7bp突變； 優(yōu)選地，所述試劑能夠鑒別出人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A — G和IVS6_8del 17bp/insGC突變； 優(yōu)選地，所述試劑進(jìn)一步包含能夠檢測(cè)出其它常見(jiàn)RP致病基因(例如但不限于RH0，RDS, RPl, RP2, RPGR(包括0RF15，此基因的突變熱區(qū))，R0M1，RPE65和TULPl基因等)中的突變的試劑。
4.權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于，所述試劑包含PCR引物； 優(yōu)選地，每一個(gè)所述PCR引物均為多核苷酸，其含有至少5個(gè)堿基，例如5-10、5-15、5-20、21、22、23、24、25-30、31-40、41-50 個(gè)或者更多個(gè)堿基； 優(yōu)選地，每一個(gè)所述PCR引物均與人CYP4V2基因序列中至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸在嚴(yán)格條件下雜交； 優(yōu)選地，每一個(gè)所述PCR引物均與人CYP4V2基因序列中至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸有至少60%的序列同一性，例如65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性； 優(yōu)選地，所述試劑包含至少兩對(duì)PCR引物，其中第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在導(dǎo)致人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子(SEQID NO 3)不被翻譯的突變；而其中第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在導(dǎo)致人CYP4V2基因的第7號(hào)外顯子(SEQ IDNO 12)不被翻譯的突變； 優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中人CYP4V2基因的第9號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)處是否存在突變；而所述第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中人CYP4V2基因的第7號(hào)外顯子的剪接位點(diǎn)是否存在突變； 優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在人CYP4V2基因中的所述IVS8-2A突變；而第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在人CYP4V2基因中的所述 IVS6-8dell7bp 突變； 優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在所述IVS8-2A — G突變；而所述第二對(duì)引物的擴(kuò)增產(chǎn)物指示待測(cè)樣品中是否存在所述IVS6-8dell7bp/insGC突變；優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物與第二對(duì)引物不相混合； 優(yōu)選地,所述第一對(duì)引物中的每一個(gè)引物均與SEQ ID NO : 10所示序列中的至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸在嚴(yán)格條件下雜交；并且所述第二對(duì)引物中的每一個(gè)引物均與SEQ ID NO :11所示序列中的至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸在嚴(yán)格條件下雜交；優(yōu)選地,所述第一對(duì)引物中的每一個(gè)引物均與SEQ ID NO :10所示序列中的至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸有至少60%的序列同一性，例如65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100% 的序列同一性;并且所述第二對(duì)引物中的每一個(gè)引物均與SEQ ID NO :11所示序列中的至少一個(gè)相應(yīng)長(zhǎng)度的片段或其互補(bǔ)核酸有至少60%的序列同一性，例如65%、70%、75%、80%、85%、90%、91 %、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性； 優(yōu)選地，所述第一對(duì)引物的序列分別如SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7所示； 優(yōu)選地，所述第二對(duì)引物的序列分別如SEQ ID NO 8和SEQ ID NO 9所示。
5.試劑盒，其包含 權(quán)利要求1所述的突變的人CYP4V2基因、權(quán)利要求2所述的翻譯產(chǎn)物或宿主細(xì)胞、權(quán)利要求3或4所述的試劑；和 任選地，緩沖液、洗滌液和/或酶(例如DNA聚合酶)。
6.權(quán)利要求1所述的突變的人CYP4V2基因、權(quán)利要求2所述的翻譯產(chǎn)物或宿主細(xì)胞的用途，其用于產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素變性動(dòng)物模型，或用作藥物靶點(diǎn)，或用于制備試劑盒，所述試劑盒用于產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素變性動(dòng)物模型，或用作藥物靶點(diǎn)。
7.權(quán)利要求1所述的突變的人CYP4V2基因、權(quán)利要求2所述的翻譯產(chǎn)物或宿主細(xì)胞、權(quán)利要求3或4所述的試劑或權(quán)利要求5所述的試劑盒用于制備診斷工具的用途，所述診斷工具用于診斷視網(wǎng)膜色素變性。
8.診斷受試者是否患有視網(wǎng)膜色素變性或處于患有視網(wǎng)膜色素變性的風(fēng)險(xiǎn)中的方法，所述方法包括下列步驟 從受試者中采取樣品，檢測(cè)所述樣品中是否存在權(quán)利要求1所述的人CYP4V2基因中的突變； 優(yōu)選地，所述方法包括下列步驟 1)從受試者中采取DNA樣品(其可來(lái)自于例如組織、血液如外周血、體液等)； 2)從所述樣品中提取基因組DNA并任選地通過(guò)例如凝膠電泳對(duì)所提取的DNA進(jìn)行鑒定; 3)將權(quán)利要求3或4所述的試劑與所述DNA樣品相混合； 4)進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)并根據(jù)反應(yīng)的結(jié)果判斷所述樣品中是否含有權(quán)利要求1所述的突變； 優(yōu)選地，所述方法包括下列步驟 1)從受試者中采取DNA樣品(其可來(lái)自于例如組織、血液如外周血、體液等)； 2)從所述樣品中提取基因組DNA并任選地通過(guò)例如凝膠電泳對(duì)所提取的DNA進(jìn)行鑒定; 3)針對(duì)人CYP4V2基因的序列設(shè)計(jì)分別用于鑒定權(quán)利要求1中所述突變的引物； 4)將所述引物加入樣品中，并任選地加入適當(dāng)?shù)拿?例如，DNA聚合酶)和/或緩沖液；并在PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)； 5)對(duì)由步驟5)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序； 6)將測(cè)序結(jié)果與正常人CYP4V2基因的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，判斷是否存在所述突變； 優(yōu)選地，所使用的引物是權(quán)利要求4所述的PCR引物。
9.一種治療劑，其用于在有需要的受試者中治療視網(wǎng)膜色素變性，所述治療劑包含選自下列的試劑 1)能夠糾正患者中CYP4V2基因中的突變而使其回復(fù)為野生型的試劑，其中所述突變?yōu)闄?quán)利要求1中所述的人CYP4V2基因中的突變； 2)使得患者中所述經(jīng)突變的CYP4V2基因不能被轉(zhuǎn)錄或不能被翻譯的試劑； 3)使得患者中所述經(jīng)突變的CYP4V2基因的翻譯產(chǎn)物失去活性的試劑； 其中所述經(jīng)突變的CYP4V2基因?yàn)楦鶕?jù)權(quán)利要求1所述的突變的人CYP4V2基因；優(yōu)選地，所述治療劑可以進(jìn)一步含有能夠糾正其它常見(jiàn)RP致病基因(例如但不限于RHO, RDS, RPl，RP2, RPGR(包括 0RF15，此基因的突變熱區(qū))，ROMl，RPE65 和 TULPl 基因等)中的突變的試劑。
10.治療視網(wǎng)膜色素變性的方法，所述方法包括如下步驟 向有需要的受試者施用治療有效量的權(quán)利要求9所述的治療劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及復(fù)合雜合突變的鑒定，特別是視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)的復(fù)合雜合突變的鑒定。具體而言，本發(fā)明提供了鑒定視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)復(fù)合雜合突變的方法，所鑒定出的基因和/或突變用于鑒別視網(wǎng)膜色素變性的用途，以及用于診斷視網(wǎng)膜色素變性的產(chǎn)品及其用途。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102994507SQ20111026836
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月13日
發(fā)明者劉旭陽(yáng), 王云, 郭力恒, 閆乃紅, 付金, 郭鑫武, 韓鵬飛, 汪建, 楊煥明 申請(qǐng)人:四川大學(xué)華西醫(yī)院, 深圳華大基因科技有限公司